Caracterizacion_de_ADN_plasmidico_de_bac

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V o l .ZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA2 2 N o . 3 , p . 1 3 1- /3 5 . 1 9 9 6 .
REVISTA COLOMBIANA
DE ENTOMOLOGIA
Caracterización de ADN plasmídico de
bacterias nativas útiles en ei control
biológico de mosquitos transmisores de
ma arial
P la s m id D N A c h a ra c te r iz a t io n o f in d ig e n o u s b a c te r ia u s e fu l in
b io lo g ic a l c o n tro l o f m o s q u ito e s v e c to rs o f m a la r ia
ResumenonmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
Se aislaron269 cepas de bacilos esporofor-
madores de diferentes regiones de Colombia
(Llanos Orientales, Pacífico, Costa Atlántica
y Sabana de Bogotá). Para evaluar la toxici-
dad de las cepas se realizaron bioensayos en
larvas de tercer instar deC u L e x q u in q u e fa s -
c ia tu s , A n o p h e L e s a L b im a n u s y A e d e s a e g y p t i ;
22 cepas presentaron mortalidad del80-100%
entre las24 y 72 horas, de las cuales19 se
clasificaron comoB a c iL L u s s p h a e r i c u s y tres
comoB . th u r in g i e n s i s . Para determinar la au-
sencia o presencia del ADN plasmídico en
estas cepas patógenas, se realizó su extrac-
ción y al correr la electroforesis en gel de
agarosa se observó que20 de las 22 cepas
presentaron plásmidos de alto peso molecular,
Para correlacionar la presencia de estos
plásmidos con la toxicidad presente en estas
20 cepas se realizó un ensayo de curaje por
temperatura. Se encontró que cuatro cepas
nativas presentan plásmidos asociados a la
toxicidad y que existe una variabilidad en
cuanto a la estabilidad de estos plásmidos en
las diferentes cepas.
Palabras claves: B a c i l l u s s p h a e r i c u s ,
B a c i l l u s t h u r in g i e n s i s , Plásmidos, Bacte-
rias entomopatógenas, Control biológico,
Toxicidad.
P a r t e d e la t e s i s d e g r a d o p a r a o p ta r a l t í t u l o d e
M a e s t r í a e n M ic r o b io lo g ía .
R e s p e c t i v a m e n t e , M . Se. e n M ic r o b io lo g ía y M .
S e e n M ic r o b io lo g ía , P r o f e s o r y S u b d i r e c to r .
C e n t r o d e I n v e s t i g a c io n e s M ic r o b io ló g i c a s
C lM IC U n iv e r s id a d d e lo s A n d e s . C r a . l a . E s t e
N o . 1 8 A - IO . S a n ta j e d e B o g o tá , C o lo m b ia .
Diana AncJracJe2
Lucía Lozano
Jenny Dussán
Summary
From different zones of Colombia (Llanos
Orientales, Pacífico, Costa Atlántica y Sabana
de Bogotá)269 strains of sporulated bacilii
were isolated, In order to evaluate the toxic-
ity of selected strains, a biological assay
against third-instar larvae ofC u le x q u in q u e -
. f a s c ia tu s , A n o p h e L e s a lb im a n u s and A e d e s
a e g y p t i was made. Twenty two strains showed
80-100% of mortality between 24 and 72
hours, of which19 were c1assified asB a c iL -
L u s s p h a e r i c u s and three asB . th u r in g i e n s i s .
For determination of the absence or presence
of the plasmidic DNA in these pathogenic
strains a plasmid isolation and electrophore-
sis in agarose gel were made in which it was
observed that20 of 22 strains had large plas-
mids. To corre late the presence of these plas-
mids with the toxicity of the20 strains a
treatement of curing using high temperature
was undertaken. It was found that four indig-
enous strains have plasmids linked with tox-
icity and there is a variability in the stability
of plasmids among different strains.
Introducción
Históricamente, la malaria ha sido la en-
fermedad con mayor mortalidad en la hu-
manidad (Porter et al. 1993). Esta enfer-
medad es causada por el protozoario pa-
rásito P la s m o d iu m ja l c ip a r u m , el cual es
transmitido por la picadura de mosquitos
del género A n o p h e l e s spp. (Diptera:
Culicidae), y se encuentra distribuida,
principalmente, en Africa, Centro y Sur
América, oriente del Mediterráneo y
suroriente de Asia (Faust y RussellI957).
Por otra parte, aproximadamente el 90%
de la fiebre amarilla, el dengue y la fila-
riasis en el mundo, ocurre en los trópi-
cos, donde las condiciones ambientales
favorecen al vector y a los insectos trans-
misores de éstas enfermedades.
La aplicación del control biológico hacia
diferentes especies de mosquitos como
A n o p h e l e s sp., C u le x sp. y A e d e s sp.
(Diptera: Culicidae), ha arrojado buenos
resultados con la utilización deB a c i l l u s
s p h a e r i c u s Nerde yB a c i l l u s th u r in g i e n s i s
Berliner. Estas bacterias entomopatóge-
nas son una buena alternativa por sus ca-
racterísticas fisiológicas y por su especi-
ficidad patogénica. Ambos microorganis-
mos forman esporas, las cuales los hacen
resistentes a condiciones adversas, y su
patogenicidad es debida a la producción
de un complejo de proteínas toxicogéni-
cas durante la esporulación. Estos baci-
los esporoformadores son bacterias resis-
tentes a condiciones adversas, especial-
mente al calor y a la luz ultravioleta (Me
Donald et al. 1983) Y tienen determinada
capacidad para reciclarse en ciertos há-
bitats naturales que les confiere una gran
ventaja sobre otros microorganismos; por
tanto, estas especies de bacilos se con-
vierten en una esperanza para la dismi-
nución de la transmisión de las filarias,
de los' virus del dengue y de la fiebre
amarilla y del parásito de la malaria, en
las zonas endémicas de Colombia.
El análisis de las toxinas ha revelado la
existencia de genes relacionados, los cua-
les en B , th u r in g i e n s i s se han localizado
a nivel plasmídico, mientras que enB .
s p h a e r i c u s no está claro si estos genes es-
tán localizados en el cromo soma o en los
plásmidos (Liu et al. 1993; Priest 1992;
Singer 1987). El hecho de que estos gene s
se encuentren localizados en los plásrni-
dos constituye una ventaja para el con-
trol de plagas, puesto que una sola célu-
la, al presentar más de una copia plasmí-
dica, puede producir las toxinas en con-
centraciones más altas con respecto a las
cepas con los genes en el ADN cromo-
somal.
Además de la expresión plasmídica, otro
factor importante en el estudio de los
plásmidos es la posibilidad de transferir
esta información genética a otras células
que no la contengan, permitiendo la ex-
presión de toxinas en otros tipos de bac-
Paula
Texto tecleado
https://doi.org/10.25100/socolen.v22i3.9939
REVISTA COLOMBIANA
DE ENTOMOLOGIA D,ana Andrade . LUCIOLozano . JennyonmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBADussánZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA1 3 2
terias y ampliando así el rango de acción.
Con base en lo planteado anteriormente,
este trabajo tuvo como objetivo principal
la caracterización del ADN plasmídico de
bacilos nativos útiles en el control bioló-
gico de mosquitos.
Materiales y Métodos
Muestras y selección. Se tomaron mues-
tras de agua, tierra, hojarasca y larvas de
diferentes regiones de Colombia (Chocó,
Llanos Orientales, Costa Atlántica y Sa-
bana de Bogotá). Estas muestras se ho-
mogenizaron y filtraron para luego reali-
zarles un choque térmico a 90°C durante
20 minutos, con el fin de eliminar las bac-
terias que no poseen esporas. Las mues-
tras procesadas se sembraron en SPC
(DlFCO) y se incubaron durante 48 ho-
ras.
A partir de las colonias seleccionadas se
evaluó la actividad toxicogénica en lar-
vas de tercer instar deTSRQPONMLKJIHGFEDCBAC u l e x q u in q u e fa s -
c ia tu s Say (colonia delC IM IC ) ,A n o p h e -
l e s a lb im a n u s Wiedemann y A e d e s
a e g y p t i (L.) (donadas por la Unidad de
Entomología del Instituto Nacional de
Salud), utilizando un inóculo de lOe6
células/mI y corno controles positivos las
cepasB . s p h a e r i c u s 2362 yB . th u r in g i e n -
s i s IPS 82 (donadas por el Instituto Pas-
teur, Francia). Se evaluó el porcentaje de
mortalidad cada 24 horas hasta comple-
tar los cinco días.
Identificación y taxonomía. Por obser-
vación microscópica con coloración de
Gram y verde de malaquita se clasifica-
ron las diferentes cepas aisladas como
similares aB . s p h a e r i c u s o B . th u r in g i e n -
s i s acorde con la forma y ubicaciónde la
espora. Para confirmar la especie se rea-
lizaron observaciones bioquímicas espe-
cíficas para bacilos esporulados según el
Manual de identificación Bergey.
Aislamiento del ADN plasmídico. La
minipreparación de plásmidos se realizó
con las cepas aisladas que presentaron
más del 70% de mortalidad en larvas de
mosquitos. El método de extracción uti-
lizado fue lisis alcalina modificado (Ma-
niatis et al. 1982). La presencia del plás-
mido se determinó por la visualización
de una banda fluorescente en la electro-
foresis de agarosa al 0,7%.
Curaje con temperatura. Las cepas
toxicogénicas que presentaron ADN plas-
mídico se sometieron a curaje por tem-
peratura a 41°C, con el fin de eliminar
los plásmidos. En este tratamiento todas
las cepas se sometieron a pases sucesivos
en medio fresco (SPC agar) cada 48 ho-
ras hasta completar 20 ciclos.
Evaluación de las cepas curadas. Para
determinar si las cepas después de 20 ci-
clos de curaje perdieron el plásmido o no
y si éste se encuentra asociado a la toxi-
cidad, se realizaron bioensayos en larvas
de tercer instar de C.q u in q u e fa s c ia tu s y
la extracción de plasmidos a partir de las
colonias curadas y de los controles no
curados.
Resultados
Muestreo y Bioensayos. En los cuatro
sitios seleccionados: Llanos Orientales,
Sabana de Bogotá, Costa del Pacífico y
Costa Atlántica, se tomaron muestras de
agua, suelo, material vegetal y larvas de
mosquitos vivas y muertas, y se aislaron
278 cepas de bacilos, de las cuales 269
correspondieron al grupo 1 de clasifica-
ción de B a c i l l u s sp. esporulados, según
el Manual de Bergey de bacterias.
El bioensayo de la capacidad toxicogénica
para larvas de tercer instar de C.q u in -
q u e fa s c ia tu s , A . a lb im a n u s y A . a e g y p t i ,
mostró que de las 269 cepas esporuladas
de bacilos, 22 (8,19%) presentaron mor-
talidad del 80-100% entre las 24 y 72
horas (Fig. 1) Y las 247 restantes
(91,81 %) no patogénicas para mosquitos
(Fig.2).
Identificación y taxonomía. Una vez
seleccionadas las cepas con potencial de
controladores biológicos de mosquitos,
según los resultados de los bioensayos,
los microorganismo se clasificaron hasta
especie por la forma y posición de la es-
pora (Fig. 3). En la Figura 4 se observa
que de las 22 cepas patógenas analizadas
por microscopía de luz con tinción de
Gram y verde de malaquita, el 86% se
agrupan como B . s p h a e r i c u s ( B s ) y el
14% como B . th u r in g i e n s i s ( B t ) .
Aislamiento de plásmidos, curaje de
plásmidos y correlación con la capaci-
dad toxicogénica. En la Figura 5 se pre-
sentan los resultados de un corrido
electroforético de los plasmidos aislados.
En 20 de las 22 cepas probadas se esta-
bleció la presencia de ADN plasmídico y
en cuatro de las 20 cepas nativas se en-
contró una relación entre ausencia de ban-
da (Fig. 6) Yel carácter toxicogénico para
larvas de mosquitos (Fig. 7).
Discusión
De los bacilos aislados, sólo una baja pro-
porción (8,19%) presentó actividad lar-
vicida, como era de esperarse, puesto que
sólo se han reportado cepas deB . s p h a e -
r i c u s y B . th u r in g i e n s i s como controla-
dores de larvas de mosquitos, además de
poseer un rango específico en cuanto a
las especies que controlan (Burges 1982;
Dumusois et al. 1993; Sattabongkot et al.
1990 y Pantuwatana 1990).
Con relación a la actividad larvicida eva-
luada de los aislamientos, se observó una
alta patogenicidad (80-100%) de diferen-
tes cepas de bacilos hacia larvas de C.
q u in q u e fa s c ia tu s , A . a lb im a n u s y A .
a e g y p t i , en un corto tiempo (24-72 ho-
ras), lo cual sugiere que estas cepas son
candidatas potenciales para evaluar su
actividad en el campo.
.i
En cuanto a la distribución de bacilos es-
porulados, B . s p h a e r i c u s se recuperó en
un número mayor queB . th u r in g i e n s i s ,
lo que confirma lo reportado en cuanto a
recic1aje y permanencia de estos dos ba-
cilos en la naturaleza (Bernhard et al.
1979; Burges 1982; Dumusois y Priest
1993).
Entre estas dos especies de bacilos se
observó diferencia en cuanto al porcen-
taje de mortalidad en larvas, aunque en
todas estuvo por encima del 70%. El títu-
lo utilizado para los bioensayos fue
estándar (l Oe" celulas/rnl) con el fin de
seleccionar las cepas potencialmente
patógenas para el estudio a nivel plasmí-
dico.
Dos de las 22 cepas analizadas no pre-
sentaron plásmidos, lo que sugiere que su
patogenicidad está codificada por genes
que se encuentran en el cromosoma; no
obstante, la mayoría de cepas toxicogé-
nicas de B . s p h a e r i c u s y todas las deB .
C o to c t e o z o c to o d e A D N ZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBAp la s m íd ic a 133onmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
•
F ig u ra 1 . L a rv a s d e C u /e x q u in q u e fa s c ia tu s , d e s p u é s d e 2 4 h o ra s d e in o c u la c ió n .
No. de cepas
300
Bacilos aislados
Lij E s p o ru la d a s ~ P a tó g e n a s m N o p a tó g e n a s
F ig u ro 2 . C a p a c id a d to x ic o g é n ic a d e lo s b a c ilo s e s p o ro fo rm a d o re s s e g ú n s u a c t iv id a d s o b re la rv a s
d e m o s q u ito s .
t h u r in g i e n s i s presentaron plásmidos de
alto peso molecular, el cual fue similar
entre sí. Estas cepas que contenían
plasmidos, se sometieron a un tratamien-
to de curaje por temperatura, el cual ha
sido reportado como efectivo para curar
cepas deB . th u r in g i e n s i s (Miteva et al.
J 986); con éste tratamiento se intentó, por
pases sucesivos a medio fresco, desesta-
bilizar la replicación del plásmido por un
crecimiento acelerado de la bacteria y así
obtener células libres de ADN plasmídi-
co.
La respuesta de las cepas al curaje por
temperatura fue diferente. Tres cepas per-
dieron el plásmido sin perder la toxici-
dad y tres perdieron la actividad larvicida
y presentaron una banda muy tenue en la
electroforesis, pero después de hacer pa-
ses de estas cepas, volvieron a presentar
actividad larvicida y ADN plasmídico.
Acorde con este resultado se decidió rea-
lizar otras veinte rondas de curaje alter-
nando los pases con choques térmicos
(90°C por 20 min.), puesto que se ha re-
portado que en el proceso de esporulación
de los bacilos una gran proporción de
ADN extracromosomal (plásmidos) se
pierde (Cook et al. 1993). Después de este
tratamiento se logró obtener y mantener
sin actividad larvicida y sin ADN
plasmídico a dos cepas, lo que indica que
en estas cepas los genes involucrados en
la patogenicidad se encuentran ubicados
en sus plásmidos,y por lo tanto la infor-
mación de la toxicidad puede ser transfe-
rible a otras bacterias no patógenas que
adquieran el plásmido, y esto conlleva a
que en la naturaleza se mantenga por más
tiempo la acción toxicogénica, debido a
una mayor proporción de la población
nativa bacteriana portadora de estosplás-
midos con capacidad de transferirlo a
otras especies de bacilos .
Después del curaje por temperatura en las
tres cepas en las que se observó una ban-
da plasmídica tenue y pérdida de la toxi-
cidad, la recuperación de la patogenicidad
indica que existe una alta estabilidad del
plásmido, con lo cual basta que unas po-
cas células lo posean para que aumente
su número de copias y el bacilo recupere
su actividad y tal vez de alguna manera
pueda ser transferible (por conjugación o
movilización) hacia otras células libres de
plásmido; esta estabilidad plasmídica es
de gran ventaja en la aplicación de con-
troladores porque asegura una continua
expresión de los genes delplásmido, evi-
tando la pérdida de este ADN como con-
secuencia de factores ambientales como
temperatura y radiación ultravioleta.
El hecho que hallan quedado una gran
cantidad de cepas sin curar (aprox. 12),
es decir que despuésd e l tratamiento si-
guen conservando el plásmido, demues-
tra que este ADN plasmídico es muy es-
table en su huésped y posiblemente vital
para la célula; y apesar que la mayoría
de estos plásmidos presentó un peso
molecular similar, hay diferencias en
cuanto a su estabilidad, lo que hace que
algunos plásmidos sean más difíciles de
curar que otros.
Conclusiones
Es importante anotar que el hecho de ha-
ber aislado cepas nativasd e B s p h a e r i c u s
y B . th u r in g i e n s i s con plásrnidos muy
estables y con actividad larvicida contra
REVISTA COLOMBIANA
DE ENTOMOLOGIAZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA D ia n aTSRQPONMLKJIHGFEDCBAA n d r a d e - L u c io L o z a n o - J e n n y D u s s á n 134
F ig u ra 3 . B a c ilo s e s p o ru la d o s c o n h n c ió n d e v e rd e d e m a la q u ita .
86%
1 4 %
L/] B .s rn 1 B .t
F ig u ra 4 . C la s if ic a c ió n d e la s c e p a s p a tó g e n a s s e g ú n la m o r fo lo g ía y p o s ic ió n d e la e s p o ro .
F ig u ra 5 . E le c lro fo re s is e n g e l d e a g a ro s a d e A D N p la s m íd ic o a is la d o d e la s c e p a s p a tó g e n a s .
~ B a n d aonmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBAplosmídrco
~ P a tró n d e p e s o m o le c u la r d e A D N d e fa g o la m b d a d ig e r id o c o n P s t l
tres especies de mosquitos, indica que es
prornisoria la utilización de estas cepas,
y para ello es importante determinar en
el laboratorio, por estudios de bioensayos,
la LDso y la dosis letal mínima en la cual
presentan alta toxicidad (Burges 1982;
Davidson et al. 1993; Lord et al. 1990),
como también la producción a gran esca-
la y pruebas en campo, para en un futuro
ser implementadas dentro de un manejo
integrado de plagas para el control de
mosquitos vectores de enfermedades en
Colombia.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Colciencias por
la financiación de la investigación y al
Instituto Nacional de Salud (LNS), en es-
pecial al Dr. Víctor Alberto Olano, Jefe
de la Unida de Entomología, por la ase-
soría en el montaje de la colonia deC u le x
q u in q u e fa s c ia tu s y por el aporte de lar-
vas de A n o p h e l e s a lb im a n u s y A e d e s
aegypti para la realización de los bioen-
sayos.
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-a " C e p a s c u ra d a s c o n te m p e ra tu ro ~ C e p a s c o n t . " le s n o c u ra d a s
P re s e n c ia p ló s rn id o y p a to g e n ic id a d
1 0 0 %
8 0 %
6 0 %
4 0 %
2 0 %
0 %
B.s B.t
C e p a s p a tó g e n a s
~ P o s it iv o ~ T o x ic o g é n ic o
F ig u ra 7 . R e la c ió n d e la p re s e n c ia d e l p ló s r ru d o c o n la to x ic id a d d e la s c e p a s e v a lu a d a s d e s p u é s d e
2 0 c ic lo s d e c u ra je c o n te m p e ra tu ra