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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA SEDE CUENCA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTÉCNIA Trabajo de titulación previo a la obtención del título de Médica Veterinaria Zootecnista. TRABAJO EXPERIMENTAL: “ANTIBIOGRAMA DE LOS AGENTES CAUSALES DE LAS DERMATOPATÍAS BACTERIANAS EN CANINOS” AUTORA: ADRIANA BERNARDA UDAY BAYOLIMA. TUTOR: DR. JUAN LEONARDO MASACHE MASACHE CUENCA- ECUADOR 2018 CESIÓN DE DERECHOS DE AUTOR Yo, Adriana Bernarda Uday Bayolima con cédula de identidad, número 010655663-2, manifiesto mi voluntad y cedo a la Universidad Politécnica Salesiana a la titularidad sobre los derechos patrimoniales en virtud de que soy autora del trabajo de titulación: “ANTIBIOGRAMA DE LOS AGENTES CAUSALES DE LAS DERMATOPATÍAS BACTERIANAS EN CANINOS”, mismo que ha sido desarrollado para optar por el título de Médica Veterinaria Zootecnista, en la Universidad Politécnica Salesiana, quedando la Universidad facultada para ejercer plenamente los derechos citados anteriormente. En aplicación a lo determinado en la Ley de Propiedad Intelectual, en mi condición de autor me reservo los derechos morales de la obra antes citada. En concordancia, suscribo este documento en el momento que hago entrega del trabajo final en formato impreso y digital a la Biblioteca de la Universidad Politécnica Salesiana. Cuenca, mayo del 2018. Adriana Bernarda Uday Bayolima C.I. 010655663-2 CERTIFICACIÓN Yo, Juan Leonardo Masache Masache, declaro que bajo mi tutoría fue desarrollado el trabajo de titulación: “ANTIBIOGRAMA DE LOS AGENTES CAUSALES DE LAS DERMATOPATÍAS BACTERIANAS EN CANINOS”, realizado por Adriana Bernarda Uday Bayolima, obteniendo el Trabajo Experimental que cumple con todos los requisitos estipulados por la Universidad Politécnica Salesiana. Cuenca, mayo del 2018. Juan Leonardo Masache Masache. C.I. 110310900-3 DECLARATORIA DE RESPONSABILIDAD Yo, Adriana Bernarda Uday Bayolima con número de cédula 010655663-2, autora del trabajo de titulación: “ANTIBIOGRAMA DE LOS AGENTES CAUSALES DE LAS DERMATOPATÍAS BACTERIANAS EN CANINOS”, certifico que el total contenido del Trabajo Experimental es de mi exclusiva responsabilidad y autoría. Adriana Bernarda Uday Bayolima, C.I. 010655663-2 DEDICATORIA Este trabajo está dedicado a mis abuelitos Manuel y Rosario, a mis tías, tíos; y a mis padres Miguel y Esthela, que me han enseñado a luchar, a no rendirme por más difícil que sea el camino, a aprender a levantarme y continuar de pie, que me han enseñado que por encima de todo que la familia es lo más importante. AGRADECIMIENTO Principalmente a Dios por guiarme y cuidar de mi familia todos los días, por darme fortaleza en los momentos difíciles de mi vida, a mis abuelitos, a mis tíos, a mis padres y hermanas y a toda mi familia que estuvieron apoyándome en el transcurso de mi vida estudiantil; a la Dra. Mónica Espadero por brindarme su valioso tiempo y compartir sus conocimientos siempre con amabilidad, a todos los docentes y al Dr. Juan Masache, mi tutor por guiarme en la realización de este proyecto. 9 RESUMEN El presente trabajo experimental tuvo como objetivo determinar la sensibilidad o resistencia de las principales bacterias presentes en dermatopatías en perros independientemente de su edad y sexo, la investigación se realizó con muestras de 100 animales de distintas Clínicas Veterinarias. El procedimiento se realizó con muestras bacterianas aisladas en cajas Petri que con la ayuda de una cámara de flujo se procedió a sembrar en agar Mueller Hinton y a colocar los discos de antibióticos para su posterior incubación por 18 horas, tiempo en el cual se produce el crecimiento bacteriano y la formación de los halos de inhibición. La susceptibilidad se determinó de acuerdo a los documentos VET01-A4 (M31-A3, CLSI 2008) y M100-S27 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing (CLSI 2017) del Clinical and Labortory Standards Institute (CLSI) para microorganismos aerobios y anaerobios, entre los antibióticos utilizados están: Gentamicina 10mcg, Cefalotina 30mcg, Sulfametoxazol+Trimetoprim 1.25/23.75, Vancomicina 30mcg, Eritromicina 15mcg, Amoxicilina+Ácido Clavulánico 30mcg, Amikacina 30mcg, Fosfomicina 50 mcg, Ceftazidima 30mcg, Piperacilina+Tazobactam 110mcg, Ciprofloxacina 5mcg, Ticarcilina 75 mcg. Cefotaxima 30mcg. El diseño estadístico consistió en una estadística básica gráfica porcentual. Se determinó la sensibilidad, valor intermedio y resistencia de cada bacteria y se graficó en barras. Los resultados que se obtuvieron fueron: los organismos grampositivos presentaron una sensibilidad alta hacia Betalactámicos, Aminoglucósidos y Cefalosporinas; y una resistencia general a Fosfomicina y Ticarcilina. Los Gram negativos además de los antes mencionados lograron buenos resultados con Ticarcilina, Fosfomicina y Ciprofloxacina. La resistencia se produjo con Eritromicina, Sulfametoxazol + Trimetoprim y Vancomicina. 10 ABSTRACT The current objective of this experiment was to determine the sensitivity or resistance of the main bacteria presented in dermatopatias in dogs with regard to their age and gender. This investigation was conducted on 100 animals from distinctive Veterinary Clinics. The procedure was achieved with bacteria samples in petri dishes, with the help of a flow chamber the procedure continued by planting in agar Mueller Hinton and placing the antibiotic petri dishes in incubation for 18 hours, during this time there is an increase in bacterial production and the formation of the inhibition halos. The susceptibility was determined according to the following documents: VET01-A4 (M31-A3, CLSI 2008) and M100-S27 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing (CLSI 2017) from Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) for microorganismos aerobicos and anaerobios. The antibiotics that were utilized were: Gentamicina 10mcg, Cefalotina 30mcg, Sulfametoxazol+Trimetoprim 1.25/23.75, Vancomicina 30mcg, Eritromicina 15mcg, Amoxicilina+Ácido Clavulánico 30mcg, Amikacina 30mcg, Fosfomicina 50 mcg, Ceftazidima 30mcg, Piperacilina+Tazobactam 110mcg, Ciprofloxacina 5mcg, Ticarcilina 75 mcg. Cefotaxima 30mcg. The statistic design consisted with a statistical basic percentile. The sensitivity, the intermediate value and the resistance of each bacteria were determined and was graphed in bars. The results that were obtained are: grampositivs organisms presented a high sensitivity for Betalactamicos, Aminoglucosidos, and Cefalosporinas; and a general resistance to Fosfomicina and Ticarcilina. Gram negatives, also the ones that were mentioned before, produced good results with Ticarcilina, Fosfomicina and Ciprofloxacina. The resistance was produced with Eritromicina, Sulfametoxazol + Trimetoprim and Vancomicina. 11 ÍNDICE GENERAL ABSTRACT ............................................................................................................................... 8 RESUMEN ................................................................................................................................ 7 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 16 1.1 PROBLEMÁTICA ............................................................................................................ 17 1.2 3 Delimitación Académica ................................................................................................ 18 1.2 DELIMITACIÓN ..............................................................................................................18 1.2.1 Delimitación Temporal ................................................................................................... 18 1.2.2 Delimitación Espacial ..................................................................................................... 18 1.3 EXPLICACIÓN DEL PROBLEMA ................................................................................. 18 1.3.1 HIPÓTESIS .................................................................................................................... 19 1.3.1.1 Hipótesis alternativa .................................................................................................... 19 1.3.1.2 Hipótesis nula .............................................................................................................. 19 1.4 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 19 1.4.1 Objetivo General. ........................................................................................................... 19 1.4.2 Objetivos Específicos. .................................................................................................... 19 1.6 FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA ................................................................................... 19 2. REVISION BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 20 2.1 Piel ..................................................................................................................................... 20 2.2 Estructura de la piel ........................................................................................................... 21 2.2.1 Tegumento ...................................................................................................................... 21 2.2.2 Epidermis ........................................................................................................................ 21 2.2.3 Dermis ............................................................................................................................ 24 2.2.4 Anejos cutáneos .............................................................................................................. 24 2.2.5 Hipodermis ..................................................................................................................... 25 12 2.2.6 Vasos y receptores sensoriales de la piel ........................................................................ 25 2.2.7 Receptores sensoriales de la piel .................................................................................... 25 2.3 Funciones de la piel ........................................................................................................... 25 2.4 Dermatitis .......................................................................................................................... 26 2.4.1 Dermatopatías comunes en caninos ................................................................................ 26 2.4.2 Clasificación ................................................................................................................... 31 2.4.2.1 Piodermas de superficie y superficiales ...................................................................... 33 2.4.2.2 Dermatitis de los pliegues cutáneos o Intertrigo ......................................................... 33 2.4.2.3 Síndrome de sobrecrecimiento bacteriano ................................................................... 34 2.4.2.4 Impétigo ....................................................................................................................... 34 2.4.2.5 Foliculitis bacteriana ................................................................................................... 35 2.4.3 Piodermas profundos ...................................................................................................... 35 2.4.3.1 Foliculitis/forunculosis/celulitis .................................................................................. 36 2.4.3.2 Dermatitis o forunculosis acral .................................................................................... 36 2.5 Bacterias ............................................................................................................................ 37 2.5.1 Morfología bacteriana .................................................................................................... 38 2.5.2 Clasificación de las bacterias .......................................................................................... 39 2.5.3 Microflora bacteriana presente en la piel ....................................................................... 39 2.5.3.1 Cocos Gram positivos. ................................................................................................. 40 2.5.3.1.1 Staphylococcus spp .................................................................................................. 40 2.5.3.1.2 Staphylococcus aureus .............................................................................................. 41 2.5.3.1.3 Staphylococcus epidermidis ..................................................................................... 41 2.5.3.1.3 Streptococcus spp ..................................................................................................... 42 2.5.3.1.4 Staphylococcus intermedius ..................................................................................... 41 2.5.3.1.5 Staphylococcus pseudointermedius .......................................................................... 42 13 2.5.3.2 Bacterias Gram negativos ............................................................................................ 43 2.5.3.2.1 Pseudomona aeruginosa ........................................................................................... 43 2.5.3.2.2 Enterobacterias ......................................................................................................... 44 2.5.3.2.3 Escherichia coli ........................................................................................................ 44 2.5.3.2.4 Proteus spp ................................................................................................................ 45 2.5.4. Cultivo de Microorganismos ......................................................................................... 45 2.5.5. Crecimiento bacteriano .................................................................................................. 45 2.6. Medios de cultivo ............................................................................................................. 49 2.7. Pruebas de sensibilidad ..................................................................................................... 51 2.7.1. Antibiograma mediante método de difusión de disco Kirby- Bauer. ............................ 51 2.7.2. Interpretación del antibiograma y lectura interpretada del antibiograma ...................... 53 2.7.3. Interpretación de los Halos de Inhibición ...................................................................... 53 2.7.4. Medios para pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos .......................................... 54 2.7.4.1. Agar Mueller-Hinton .................................................................................................. 54 2.7.4.2. Agar Mueller Hinton con adición de sangre (5% de sangre ovina) ........................... 54 2.7.4.3. Escala o Patrón de McFarland .................................................................................... 55 2.7.5. Discos de sensibilidad ................................................................................................... 56 2.8. Agentes antimicrobianos y resistencia. ............................................................................ 57 2.9.Resistencia bacteriana ...................................................................................................... 57 2.9.1. Staphylococcus meticilin-resistentes ............................................................................. 58 2.10. Antimicrobianos ............................................................................................................. 59 2.11. Selección del antibiótico ................................................................................................. 60 2.12. Betalactámicos ................................................................................................................ 61 2.12.1. Penicilinas .................................................................................................................... 62 2.12.2. Betalactámicos inhibidores de Betalactamasa ............................................................. 64 14 2.12.3. Cefalosporinas ............................................................................................................. 66 2.13. Glucopéptidos ................................................................................................................. 69 2.14. Macrólidos ...................................................................................................................... 70 2.15. Quinolonas ...................................................................................................................... 72 2.16. Fosfomicina .................................................................................................................... 73 2.17. Aminoglucósidos ............................................................................................................ 73 2.18. Sulfas .............................................................................................................................. 75 2.19. RESUMEN DEL ESTUDIO DEL ARTE ...................................................................... 77 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................ 78 3.1 Materiales Físicos .............................................................................................................. 78 3.1.2. Materiales Químicos ...................................................................................................... 79 3.1.3. Materiales Biológicos .................................................................................................... 79 3.2. MÉTODO ......................................................................................................................... 80 3.2.1. Preparación de Medios .................................................................................................. 80 3.2.2. Elaboración del Antibiograma ....................................................................................... 82 3.2.3. Medición de Halos. ........................................................................................................ 83 3.3 DISEÑO ESTADISTICO .................................................................................................. 84 3.4 POBLACIÓN Y MUESTRA ............................................................................................ 84 3.5 CONSIDERACIONES ÉTICAS ....................................................................................... 84 4.RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................... 86 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................ 101 5.1. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 101 5.2. RECOMENDACIONES ................................................................................................ 102 6. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................... 103 7. ANEXOS ........................................................................................................................... 114 15 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Células dendríticas que conforman el segundo tipo celular de la epidermis……… 23 Tabla 2. Clasificación de las piodermas según las lesiones clínicas……………………………31 Tabla 3. Composición del agar Mueller Hinton……………………………………………………………..54 Tabla 4. Turbidez de una población bacteriana expresada en UFC/mL., en la Escala de McFarland………………………………………………………………………………………………55 Tabla 5. Clasificación de las Penicilinas. ………………………………………………………...62 Tabla 6. Equipo de Oficina………………………………………………………………………...78 Tabla 7. Equipo de campo……………………………………………………………………………..78 Tabla 8. Materiales Químicos……………………………………………………………………...79 Tabla 9. Materiales Biológicos……………………………………………………………………..79 Tabla 10. Prevalencia general de los microorganismos implicados en las Dermatopatías en caninos. ………………………………………………………………………………………………86 Tabla 11. Resultados obtenidos del Staphylococcus aureus frente a los antibióticos estudiados...………………………………………………………………………………………..…87 Tabla 12. Resultados obtenidos del Staphylococcus epidermidis frente a los antibióticos estudiados. …………………………………………………….……………………………………..89 Tabla 13. Resultados obtenidos del Staphylococcus intermedius frente a los antibióticos estudiados. …………………………………………………….……………………………………..91 Tabla 14. Resultados obtenidos del Streptococcus spp frente a los antibióticos estudiados..93 Tabla 15. Resultados obtenidos del Escherichia coli. frente a los antibioticos estudiados..95 16 Tabla 16. Resultados obtenidos del Pseudomona aeruginosa frente a los antibioticos estudiados. …………………………………………………….……………………………………97 Tabla 17. Resultados obtenidos del Proteus spp. frente a los antibióticos estudiados……..99 Tabla 18. Resultados obtenidos de los antibiogramas realizados a 100 caninos con Dermatopatías Bacterianas…………………………………………………………………………114 17 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Diagrama simplificado que muestra la estructura de la piel………………………21 Figura 2. Capas que conforman la piel………………………………………………………22 Figura 3. Lesiones Cutáneas ………………………………………………………………...28 Figura 4. Morfología Bacteriana……………………………………………………………..38 Figura 5. Requerimiento para el crecimiento bacteriano…………………………………….47 Figura 6. Clasificación de los medios de cultivos…………………………………………………49 Figura 7. Procedimiento del Método Disco-Placa…………………………………………...52 Figura 8. Generalidades del Patrón de McFarland…………………………………………..56 Figura 9. Generalidades de los Macrolidos. ………………………………………………...71 Figura 10. Susceptibilidad antimicrobiana del Staphylococcus aureus………………………...88 Figura 11. Susceptibilidad antimicrobiana del Staphylococcus epidermidis…………………..90 Figura 12. Susceptibilidad antimicrobiana del Staphylococcus intermedius…………………..92 Figura 13. Susceptibilidad antimicrobiana del Streptococcus spp………………………………94 Figura 14. Susceptibilidad antimicrobiana del Escherichia coli………………………….....96 Figura 15. Susceptibilidad antimicrobiana del Pseudomona aeruginosa………………………98 Figura 16. Susceptibilidad antimicrobiana del Proteus spp……………………………………100 Figura 17. Flujograma……………………………………………………………………...113 18 1. INTRODUCCIÓN Los antibióticos sistémicos son extremadamente importantes en el cuidado de la salud animal y el desarrollo de resistencias genera gran preocupación. Un uso racional de los antibióticos es importante para mantener su eficacia clínica y disminuir el desarrollo y propagación de resistencias microbianas. Las infecciones bacterianas cutáneas son una de las causas más frecuentes del empleo de antibióticos sistémicos en perros y gatos, por lo que el manejo apropiado de estas infecciones es crucial en cualquier protocolo de uso responsable de los antibióticos(Beco, y otros, 2013, p. 4). No existe hasta el momento una regla única para la utilización correcta de un antimicrobiano, ya que el antibiótico idóneo no existe y ninguno hasta el momento está exento de peligro, si a esto le añadimos la tendencia cada vez mayor de muchas bacterias a hacerse resistentes, nos parece indicar que el uso inadecuado de los antibióticos puede conducir a graves consecuencias no solo en el área de salud sino también en el aspecto económico, de ahí radica la importancia de elegir el antibiótico adecuado para un determinado microorganismo, el cual podemos lograr con la ayuda de pruebas de susceptibilidad in vitro o el antibiograma. 19 1.1 PROBLEMA Los perros al ser animales que disfrutan de su libertad, están predispuestos a contraer un sinnúmero de patologías que afectan a distintos órganos y tejidos, como es el caso de las dermatopatías, que en ocasiones son consideradas como una de las enfermedades más complicadas de tratar. Las enfermedades cutáneas en caninos se han convertido en uno de los problemas con más relevancia dentro de la Medicina Veterinaria, existen diversas causas tanto externas como internas que pueden ocasionar su presencia; y el desarrollo y mejoría de la misma dependen plenamente del tratamiento que ésta tenga. El uso empírico de antibióticos, la administración indiscriminada de corticoides y la resistencia bacteriana son considerados como ejecutores del agravamiento de las dermatopatías y de la producción de problemas iatrogénicos en el animal. Con el fin de evitar su propagación nos vemos en la necesidad de recurrir a métodos de laboratorio específicos para obtener un diagnóstico más acertado y un tratamiento oportuno asegurando la recuperación completa del paciente. 20 1.2 DELIMITACIÓN 1.2.1 Delimitación Temporal La presente investigación se realizó en un periodo de 400 horas. 1.2.2 Delimitación Espacial El desarrollo práctico de la investigación se realizó en la Ciudad de Cuenca provincia del Azuay, la cual está ubicada entre la latitud 2º 53’ 57" sur y longitud 79º 00’ 55" oeste; y una altitud aproximada de 2.583 metros sobre el nivel del mar, con una temperatura de 7 a 25 °C. 1.2 3 Delimitación Académica La investigación fue efectuada dentro del campo académico que hace referencia a Laboratorio Clínico. 1.3 EXPLICACIÓN DEL PROBLEMA Los agentes antimicrobianos son la principal herramienta terapéutica para controlar las infecciones bacterianas en humanos y animales. Sin embargo, desde el comienzo de su utilización se sabe que las bacterias poseen mecanismos para resistir a la acción de estos agentes (Pantozzi, Moredo, & Giacoboni, 2010, p. 49). A través del tiempo y con el uso indiscriminado de antibióticos la resistencia bacteriana ha ido creciendo en gran proporción al momento de tratar infecciones, jugando un papel de gran importancia dentro de la medicina, limitando al veterinario al momento de realizar un tratamiento efectivo, algunas dermatopatías se pueden tratar de forma empírica, el problema se presenta cuando los microorganismos responsables de dichas infecciones son resistentes a los antibióticos regularmente usados, en estos casos es indudable el uso del antibiograma. 21 1.3.1 HIPÓTESIS 1.3.1.1 Hipótesis alternativa Existe sensibilidad o resistencia de los principales agentes causales de las dermatopatías bacterianas en caninos. 1.3.1.2 Hipótesis nula No existe sensibilidad o resistencia de los principales agentes causales de las dermatopatías bacterianas en caninos. 1.4 OBJETIVOS 1.4.1 Objetivo General. -Realizar e interpretar el antibiograma por el método de difusión disco placa (Kirby Bauer). 1.4.2 Objetivos Específicos. -Realizar el antibiograma por el método de difusión en agar disco- placa. -Medir sensibilidad y resistencia de las bacterias a los antibióticos. 1.6 FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA Es importante conocer la sensibilidad o resistencia de las bacterias a la presencia de diferentes tipos de antibióticos lo cual nos ayudará a realizar un correcto diagnóstico y un tratamiento más certero. 22 2. REVISION BIBLIOGRÁFICA 2.1 Piel La piel es el órgano más grande del organismo y, según la especie y la edad, puede representar el 12-24% del peso corporal de un animal. La piel tiene varias funciones, entre ellas actuar como barrera envolvente y proporcionar protección frente al medio ambiente, regular la temperatura, producir pigmentos y vitamina D, realizar la percepción sensorial (Kahn, y otros, 2007, p. 659). La piel en todos los mamíferos tiene rangos de pH, que es una de las características protectivas contra los agentes externos. El perro tiene un rango normal de pH, entre 5,8 y 7,2, variando de acuerdo al lugar en donde se mida, por ejemplo, entre los dedos de las patas el pH es alcalino (Paucara Galdos, 2011, p. 17). La capa córnea de la piel, en la que se encuentran, los queratinocitos y la sustancia intercelular, tiene una función protectora antibacteriana muy importante. El ácido linoleico, uno de los componentes de esta sustancia, es un potente antibacteriano. Las células dendríticas, los linfocitos T y las citosinas e inmunoglobulinas producidas, se encuentran en la emulsión interactuando para lograr un equilibrio en el ecosistema de la piel (Machicote Goth, 2011, pp. 61-80). El queratinocito es una célula que participa activamente en el proceso de la inflamación cutánea, interviniendo en la patogénesis de algunas enfermedades como la dermatitis atópica, donde se ha demostrado su actividad pro-inflamatoria. Además, algunos componentes de las bacterias son capaces de estimular la proliferación de los queratinocitos y la producción de mediadores de la inflamación a partir de estos ( Navarro Combalía & Verde, 2010, p. 41). 23 2.2 Estructura de la piel Figura 1. Diagrama simplificado que muestra la estructura de la piel. Fuente: (Rang, Ritter, Flower, & Henderson, 2016). 2.2.1 Tegumento El tegumento recubre la totalidad del cuerpo y está formado por la piel y sus derivados. La piel está compuesta por epidermis, dermis e hipodermis. Entre los derivados de la piel se encuentran los pelos, las uñas (escamas y plumas en el caso de los vertebrados no mamíferos) y aquellas glándulas que liberan su producto de secreción a la superficie externa corporal (Megías, Molits, & Pombail, 2016, p. 13). 2.2.2 Epidermis La capa más externa o epidermis, se considera como un ejemplo típico de epitelio plano poliestratificado queratinizado, no sólo contiene las células implicadas en la queratinización, queratinocitos, sino otros tipos celulares que desempeñan funciones diversas, el espesor de las capas es variable según la región anatómica que se estudie. Los melanocitos sintetizan 24 melanina, las células de Langerhans están relacionadas con la captación de antígenos y las células de Merkel con terminaciones nerviosas (Geneser, 1998, p. 89). Figura 2. Capas que conforman la piel. Estrato basal: constituido por células cilíndricas o cúbicas, basófilas, que se apoyan sobre la membrana basal que separa la dermis de la epidermis. Estrato germinativo tiene abundancia de células madre de la epidermis. Presenta actividad mitótica y es la encargada, (con el estrato espinoso) de renovar constantemente la epidermis. Estrato espinoso: Formado por células cuboides o aplanadas, tienen núcleo central y citoplasmas con protuberancias cortas que contienen filamentos de queratina (tonofilamentos). Se compone también de células madre de los queratinocitos, y en él se produce una parte de la mitosis y en un número menor en el espinoso. Estrato granuloso: compuesto de células poliédricas aplanadas, con núcleo central y citoplasma cargado de queratohialina (gránulos basófilos). Contiene gránulos o cuerpos laminares los cualesse fusionan con la membrana plasmática, depositando el material lipídico en el espacio intercelular y así poder impermeabilizar la piel. Estrato lúcido: consta de una capa delgada de células aplanadas, eosinófilas y translúcidas. Estrato córneo: tiene un espesor variable y se compone de células aplanadas, muertas y sin núcleo, pero con citoplasma repleto de queratina, la cual contiene, al menos 6 polipéptidos diferentes cuyo peso molecular varía entre 40 y 70 kDa. Los monofilamentos se aglutinan junto con la matriz formada por los gránulos de queratohialina. Fuente: (Junqueira & Carneiro, 2015). En medicina humana, se ha demostrado que alteraciones en los lípidos y proteínas que forman el estrato córneo, reducen la función de barrera epidérmica permitiendo una mayor 25 penetración de alérgenos a través de la piel y aumentando el riesgo de sensibilización. Esta alteración es evidente en perros jóvenes y en áreas en las que hay una predisposición a desarrollar lesiones atópicas (axilas, ingles, carpos, interdigitales) ( Navarro Combalía & Verde, 2010, p. 42). Tabla 1. Células dendríticas que conforman el segundo tipo celular de la epidermis. Melanocitos Llamados células claras o células de Masson. Se observan a nivel de la capa basal como células de citoplasma claro y núcleo pequeño y oscuro. Se encuentrran intercalados entre las células basales. Sus proyecciones dendríticas permiten el paso de la melanina a los queratinocitos basales. Células de Langerhans Se originan en la médula ósea y se localizan en la piel y otros sitios como la mucosa oral, vagina, ganglios linfáticos y timo. Se ubican en zonas superbasales de la epidermis y ocasionalmente en la dermis. Células de Mekel Son mecanorreceptores de adaptación lenta. Presentan vacuola citoplasmática que desplaza al núcleo. Regulan el flujo sanguineo de la piel y la producción de sudor a través de la producción del péptido vasoactivo. Coordinan la proliferación de queratinocitos y controlan el ciclo del pelo ya que mantienen y estimulan la producción de células madre del folículo piloso. Fuente: (Ortega Rojas, 2012, p. 27). 26 2.2.3 Dermis La dermis es el componente estructural de la piel, proporciona una matriz para las estructuras de soporte y las secreciones que mantienen e interaccionan con la epidermis y sus anejos. Éstas incluyen: tejido conjuntivo, vasos sanguíneos y linfáticos, nervios y receptores, y componentes celulares. Es una estructura termorreguladora y sensorial importante, que contribuye significativamente al almacenamieto del agua en el cuerpo. En los animales con áreas muy pobladas de pelo, la dermis es gruesa y la epidermis, delgada; en zonas con menos pelo, la dermis es delgada y la epidermis es gruesa (Gaytan Miranda, 2014, p. 8). Folículos pilosos y las glándulas sebáceas y sudoríparas están integrados en la dermis. Los primeros se encuentran revestidos por células especializadas, que producen queratina, y por melanocitos asociados, que generan el pigmento necesario para el crecimiento del tallo del pelo (Rang et al., 2016, p. 337).. “En la dermis existen vasos sanguíneos responsables de la termorregulación, plexos nerviosos relacionados con la sensibilidad cutánea y nervios mielínicos y amielínicos. Los nervios motores son principalmente adrenérgicos, e inervan los vasos sanguíneos y los músculos erectores de los pelos” (Rang et al., 2016, p. 337). 2.2.4 Anejos cutáneos El crecimiento del pelo está controlado por varios factores, como nutrición, hormonas y el fotoperiodo. Las hormonas ejercen un efecto importante sobre el crecimiento del pelo. La tiroxina estimula el crecimiento y los glucocorticoides lo inhiben. Las funciones primordiales del pelaje o capa son proporcionar una barrera mecánica, proteger al hospedador de las lesiones actínicas y realizar la termorregulación (Kahn et al., 2007, p. 659). 27 2.2.5 Hipodermis Formada por tejido conjuntuvo laxo que une de manera poco firme la dermis a los órganos subyacentes. Es la responsable del deslizamiento de la piel sobre las estructuras en las que se apoya. Puede tener una carpa variable de tejido adiposo que, constituye el panículo adiposo el cuál reserva energía y proteje del frío (Junqueira et al., 2015, p. 360). 2.2.6 Vasos y receptores sensoriales de la piel La piel posee un soporte vascular muy desarrollado, el riego cutáneo se realiza a partir de tres grandes plexos; el plexo vascular superficial, el plexo vascular profundo, el plexo vascular medio y de los músculos piloerectores, interrelacionando con los anteriores. Paralelamente a los plexos sanguíneos se distribuye una red de vasos linfáticos que parten desde la dermis superficial y anejos cutáneos y drenan, tras sucesivas anastomosis, a un plexo linfático subcutáneo (Gaytan Miranda, 2014, p. 9). 2.2.7 Receptores sensoriales de la piel Son receptores encapsulados y no encapsulados en la dermis y la hipodermis, pero son frecuentes en las papilas dérmicas. Los receptores encapsulados son los corpúsculos de Ruffini, Vater-Pacini, Meissner y Krause. Hay indicios de que éstos, no son necesarios para la sensibilidad cutánea, muchas áreas de la piel carecen de los mismos pero tienen sensibilidad, funcionan como mecanorreceptores. También están presentes en el tejido conjuntivo de órganos situados en las partes profundas del cuerpo, dónde es probable que sean sensibles a los movimientos y la presión de los órganos (Junqueira et al., 2015, p. 361). 2.3 Funciones de la piel La piel es el órgano sensorial primario encargado de registrar el dolor, la temperatura y la presión ejercida en la superficie corporal. 28 Actúa como una armadura impidiendo el contacto directo de esos tejidos y órganos con microorganismos patógenos (parásitos, bacterias y virus), sustancias tóxicas y otros agentes que, sin la piel, ocasionarían lesiones sumamente graves exponiendo con peligro la salud o la vida del individuo (Montalvo Arenas, 2008, p. 27). 2.4 Dermatitis Se sabe que el canino tiene mayor susceptibilidad a las infecciones cutáneas que el ser humano, posiblemente por tener la epidermis más delgada, por la escasez de lípidos intercelulares, por la falta de un tapón de queratina y sebo en el infundíbulo folicular y por tener un pH cutáneo más alcalino (esto último es discutible ya que hay una gran variación en el pH cutáneo entre razas y en las diferentes áreas de la piel) (Balazs Mayanz, 2012, p. 4). Una dermatitis, es la inflamación de la piel, que puede ser producida por numerosos agentes, entre los que se incluyen irritantes externos, quemaduras, alérgenos, traumatismos e infecciones (bacterianas, víricas, parasitarias o fúngicas). Puede ir acompañando a una enfermedad interna o sistémica concomitante; también pueden estar relacionados factores hereditarios. Las alergias forman un grupo importante de factores etiológicos, especialmente en animales pequeños (Kahn et al., 2007, p. 660). 2.4.1 Dermatopatías comunes en caninos “La dermatitis (pioderma) bacteriana canina es uno de los problemas dermatológicos más comunes hallados en caninos. La diversidad de síndromes clínicos que se observa es cuantiosa y los efectos de las lesiones varían desde un simple prurito hasta las que pueden poner en riesgo la vida del animal” (Antúnez A, Calle E, Morales C, Falcón P, & Pinto J, 2009, p. 333). Es importante reconocer las áreas involucradas en cada enfermedad (dermograma) y las lesiones elementales (primarias o secundarias), ya que esto constituye una ayuda invalorable en 29 el momento de emitir una lista de diagnósticos diferenciales. Los pasos a considerar en el diagnóstico de las dermatopatías son: Realizar reseña y una buena anamnesis. Identificar lesiones primarias, secundarias y mixtas. Determinarun patrón de distribución. Hacer una lista de diagnósticos diferenciales. Utilizar con criterio los métodos complementarios de diagnóstico (Ortega Rojas, 2012, pp. 35-36). Las lesiones por dermatopatías se pueden dividir en: Lesiones primarias: Están directamente asociadas con el proceso de la enfermedad. No son patognomónicas, pero proporcionan una clave muy valiosa sobre el tipo de proceso morboso que se está desarrollando. Lesiones secundarias: con frecuencia son el resultado de un traumatismo, del tiempo, o de algún grado de agresión de la piel. A menudo las lesiones primarias evolucionan a lesiones secundarias. (Harvey & McKeever, 2010, pp. 8-10). 30 Figura 3. Lesiones Cutáneas Primarias. Pápulas Placa Nódulo Un nódulo es una elevación solida de la piel en un diámetro superior a 1cm. Lesión plana, sólida y elevada de más de 1cm de diámetro. Lesiones pequeñas y solidad elevadas, tienen un diámetro de hasta 1cm. Son áreas planas de decoloración de un diámetro de hasta 1cm. Pústula Elevación cutánea pequeña y circunscrita que contiene material purulento. Habón Es una zona irregular edematosa y elevada de la piel, que a menudo cambia de tamaño y de perfil. Se pueden clasificar en agudos, transitorios y de etiología desconocida. Quiste Un quiste es una cavidad cerrada con un recubrimiento membranoso que contiene un material líquido o semi sólido Vesícula Una vesícula es una elevación de la piel de un diámetro hasta 1 cm lleno de suero Máculas 31 Figura 3. Lesiones Cutáneas Secundarias (Continuación). Escamas Resultado de la acumulación de células epidérmicas superficiales muertas, que se desprenden de la piel. Una costra se compone de células y exudado de secado de suero o sangre. Un eritema es un enrojecimiento de la piel. Se produce al perder la parte superficial de la epidermis, curan sin formación de cicatriz. Erosiones Eritema Costras Úlcera Una úlcera es más profunda que una erosión y se produce al perder la epidermis y quedar al descubierto los tejidos más profundos de la dermis Liquenificación La liquenificación se produce tras la inflamación crónica, hay un engrosamiento de la piel asociada a una acentuación de los márgenes cutáneos normales Comedones Son el resultado de residuos sebáceos y epidérmicos que bloquean un folículo. Fisura Una fisura es lo que sucede cuando la piel engrosada, a menudo liquenificada o con una intensa formación de costra, se abre 32 Figura 3. Lesiones Cutáneas Secundarias (Continuación). Fuente: (Harvey & McKeever, 2010). Hiperpigmentación Es un aumento de la pigmentación cutánea, acostumbra a producirse tras una inflamación crónica, también se puede observar en los cambios cutáneos asociados con una endocrinopatía. Hipopigmentación La hipopigmentación, una reducción en la pigmentación cutánea, a veces aparece tras una inflamación El vitíligo, un cuadro raro no inflamatorio, se caracteriza por una hipopigmentación simétrica. 33 2.4.2 Clasificación “Es fundamental insistir en que las piodermas son casi siempre complicaciones secundarias a otras enfermedades subyacentes por lo que debemos buscar la causa que la originó” (Machicote Goth, 2011, p. 61). Se clasifican en función de la profundidad de la infección bacteriana: Tabla 2. Clasificación de las piodermas según las lesiones clínicas. Naturaleza de la pioderma Mecanismo Aspecto clínico Piodermas de Superficie (Superficie de la capa córnea). Intertrigo Infección de pliegues de la piel: Labios Cara Cola Vulva Eritema. Erosión. Supuración. Humedad. Liquenificación. Pigmentación. Sobrecrecimiento bacteriano Afecta generalmente a perros alérgicos. Principalmente en la zona ventral del cuello, periné y región inguinal. Eritema. Hiperpigmentación Liquenificación. Olor rancio. Piodermas superficiales (intraepidérmica y anexos). Impétigo Pequeñas pústulas intraepidérmicas de localización variable, más frecuente en la zona ventral del abdomen. Pústulas Collaretes. Eritema. Costras. 34 Tabla 2. Clasificación de las piodermas según las lesiones clínicas (Continuación). Fuente: (Machicote Goth, 2011) Piodermas superficiales (intraepidérmica y anexos). Foliculitis Pequeñas pústulas en folículos pilosos Pápulas (con pelo en el centro). Pústulas (con pelo en el centro). Collaretes epidérmicos. Costras. Piodermas de la unión Infección de uniones en: Eritema. monocutánea Labios. Erosión. Párpados. Úlceras. Trufa. Costras. Vulva. Despigmentación. Prepucio. Ano. Piodermas profundas (epidermis, dermis hasta el tejido subcutáneo). Foliculitis/Forunculosis localizada: Rotura de folículos pilosos con afección de la dermis y reacción de cuerpo extraño. Eritema. Fisuras. Pústulas. Nódulos. Forúnculos. Podal. Mentón. Nasal. Callos. Costras. Foliculitis/Forunculosis localizada celulitis generalizada Coalescencia de forúnculos en zonas más extensas. Afección del panículo adiposo. Eritema. Fisuras. Pústulas. Forúnculos. Nódulos. Costras. Úlceras. Forunculosis acral Zonas de lamido. Necrosis. Abscesos Zonas variadas del cuerpo. Cavidades de pus. Eritema. Úlceras. 35 2.4.2.1 Piodermas de superficie y superficiales “Afectan exclusivamente a la epidermis y no profundizan por debajo de la membrana basal. Son típicamente exudativos y es muy frecuente la presencia de prurito” (Beco, y otros, 2013, p. 5). “En la dermatitis superficial uno de los agentes patógenos presentes con mayor frecuencia en la piel es Staphylococcus spp. Afecta a las capas superficiales de la epidermis, no produce cicatriz y no causa linfadenopatía” (Paucara Galdos, 2011, p. 21). “Las causas más habituales subyacentes a la pioderma superficial son las infestaciones ectoparasitarias, hipersensibilidades y endocrinopatías” (Harvey & McKeever, 2010, p. 108). “Generalmente, requiere un mínimo de 21 días de tratamiento antibacteriano sistémico y al menos hasta 7 después de la curación clínica. En cambio, el pioderma profundo requiere un mínimo de 42 días de tratamiento y al menos hasta 14 días después de la curación clínica” (Patel & Forsythe, 2010, p. 340). 2.4.2.2 2.4.2.2 Dermatitis de los pliegues cutáneos o Intertrigo La infección se produce en zonas de pliegues poco aireados como el facial, labial, vulvar interdigital y el de la cola. Es importante evitar la humedad de la zona afectada. En casos extremos o con complicaciones asociadas (queratitis) puede ser necesario el empleo de cirugía (Machicote Goth, 2011, p. 66). Las razas braquicéfalas están predispuestas a lesiones de intertrigo en los pliegues de la cara, las razas Cocker Spaniel, San Bernardo y Setter están predispuestas al intertrigo del pliegue labial y el Terrier de Boston y el Bulldog Inglés a la dermatitis del pliegue del rabo (de tirabuzón). Las perras obesas pueden manifestar un intertrigo en el pliegue vulvar. El Sharpei chino suele presentar lesiones de dermatitis de los pliegues, más generalizadas, asociadas a un exceso de mucina dérmica (Balazs Mayanz, 2012, p. 8). 36 “Aparece como resultado de la inflamación de una zona de la piel en íntimo contacto con otra. Se produce una abrasión local, inflamación y acúmulo de secreciones superficiales, que dan lugar a una maceración con infección secundaria” (Harvey & McKeever, 2010, p. 36). Tratamiento Pelar bien toda la zona afectada eliminando cualquierpelo sucio que haya, y limpiarla con champú a base de clorhexidina o lactato de etilo, o bien con un gel con peróxido de benzoilo. Si las lesiones tienen un aspecto húmedo, se pueden tratar dos o tres veces al día durante 5 minutos con una solución secante que contenga acetato de aluminio (solución de Burrow) (Harvey & McKeever, 2010, p. 36). 2.4.2.3 Síndrome de sobrecrecimiento bacteriano Se caracteriza por la presencia de eritema difuso, descamación y exudado grasiento queratoseborreico. Los animales afectados suelen presentar prurito y mal olor. El abdomen, los espacios interdigitales y los pabellones auriculares son las zonas más comúnmente afectadas. Las enfermedades primarias asociadas suelen ser alérgicas o endocrinas. La citología de las zonas afectadas muestra la presencia de un gran número de bacterias en ausencia o escaso número de neutrófilos (Beco et al., 2013, p. 6). 2.4.2.4 Impétigo Aparecen microabcesos situados debajo de la capa corneal de la epidermis. En animales jóvenes, se caracteriza por la presencia de pústulas situadas principalmente en la parte ventral del cuerpo y se suele asociar a factores como la falta de higiene, parasitosis, mala alimentación. El impétigo en animales adultos cursa generalmente con la aparición de pústulas de mayor tamaño (bullas) y hay que buscar siempre una enfermedad subyacente (Hiperadrenocorticismo, Hipotiroidismo, diabetes) (Salo, Fraile, Ríos , & Sancho Forrellad, 2013, p. 17). 37 El tratamiento del impétigo del cachorro se basa en eliminar los factores predisponentes, como el parasitismo, mala nutrición y hacinamiento y en la limpieza tópica con antisépticos como la clorhexidina y aplicación de antibacterianos. Los antibióticos sistémicos, rara vez necesarios, se pueden emplear por 7 a 14 días, en casos recalcitrantes (Balazs Mayanz, 2012, p. 12). 2.4.2.5 Foliculitis bacteriana Son dermatosis muy frecuentes en dermatología canina. Están principalmente causadas por Staphyloccocus intermedius, bacteria Gram + y residente ocasional en la piel del perro. La bacteria se transporta pasivamente a través de los lamidos desde la cavidad oral o de la región anal, se caracteriza por el desarrollo de microabcesos en los folículos pilosos. Produciéndose una pústula centrada sobre un pelo. Las pústulas se rompen con mucha facilidad produciéndose collaretes epidérmicos y costras (Salo et al., 2013, p. 16). La forunculosis se produce habitualmente como complicación de la foliculitis. Se rompe la membrana basal de la epidermis y se disemina la infección por la dermis. Se producen pústulas de mayor tamaño con presencia de pus sanguinolento. La coalescencia de varios focos de forunculosis produce la celulitis, que se caracteriza por la triada de necrosis, fistulización y supuración (Salo et al., 2013, p. 16). “Puede presentar un aspecto focal o multifocal dando una apariencia de apolillamiento del pelo. Suele afectar a diversas regiones del cuerpo, aunque frecuentemente se observa en la zona dorsolumbar y en las nalgas” (Machicote Goth, 2011, p. 68). 2.4.3 Piodermas profundos Penetran por debajo de la membrana basal hasta la dermis y tejidos más profundos, puede ser consecuencia de infecciones superficiales tratadas inadecuadamente, presencia de cuerpos extraños y parásitos. En este tipo de dermatitis se produce una inflamación grave que 38 involucra a todas las 22 capas de la piel y a los folículos pilosos. Se observan pápulas y linfadenopatia generalizada (Paucara Galdos, 2011, p. 22). 2.4.3.1 Foliculitis/forunculosis/celulitis “Infección cutánea que alcanza la dermis profunda y hasta el panículo adiposo, provocando celulitis. Puede ser localizada o generalizada. El microorganismo S. pseudointermedius tiene un papel central, puede existir colonizaciones de otras bacterias principalmente gram negativas” (Machicote Goth, 2011, p. 69). Se hipotetiza que se originaría por acción traumática, al frotar el hocico y mentón sobre superficies duras. Si bien la presentación clínica es bastante típica, ocasionalmente puede ser necesario diferenciar este cuadro de la demodicosis localizada y de la celulitis juvenil. En ocasiones, la dermatofitosis puede ser un diagnóstico diferencial adicional. El raspado profundo, el cultivo fúngico, la ausencia de signos clínicos sistémicos y la respuesta al tratamiento, confirma el diagnóstico (Balazs Mayanz, 2012. p. 23). 2.4.3.2 Dermatitis o forunculosis acral La dermatitis acral por lamido canina es un trastorno que se caracteriza por una placa firme, alopécica, con frecuencia úlcerada, que se localiza en la parte distal de la extremidad o extremidades que está causada por el lamido causado por varios trastornos orgánicos pruriginosos o dolorosos, a veces con un componente psicógeno y generalmente se complica por una infección bacteriana secundaria (Patel & Forsythe, 2010, p. 265). Las lesiones suelen ser sobre el carpo o tarso, si son inducidas por alteraciones sistémicas, pueden ubicarse en más de un miembro, mientras que si el factor es local se observan en un solo miembro. Es común en perros de razas grandes, de mediana edad o ancianos, especialmente Doberman Pinsher, Gran Danés, Golden Reteiever, Pastor alemán, Boxer (Ortega Rojas, 2012, p. 151). 39 “La infección bacteriana secundaria, con más frecuencia por Staphylococcus intermedius, y a veces también por microorganismos gramnegativos, es una complicación frecuente cualquiera que sea la etiología subyacente. La infección exacerba aún más los signos clínicos” (Patel & Forsythe, 2010, p. 265). 2.5 Bacterias Son las células vivientes más pequeñas (0.1 a 10 μm), tienen una membrana citoplásmica rodeada por una pared celular; el peptidoglucano, que es un polímero entretejido de naturaleza única, hace que la pared sea rígida. La estructura de una célula procariota simple no incluye mitocondrias, lisosomas, retículo endoplásmico y otros organelos, se dividen mediante fisión binaria y se pueden criar en cultivos artificiales, a menudo en menos de un dia (Ahmad, Drew, & Plorde, 2010, p. 5). “Pertenecen a un grupo diverso de microorganismos unicelulares, procariotas, que se pueden encontrar prácticamente en cualquier ambiente (suelos, aguas, aire, y como simbiontes, parásitos, o patógenos del hombre, otros animales y plantas” (Garcés & Saravia, 2008, p. 5). La mayoría son de vida libre, a excepción de algunas que son de vida intracelular obligada, integran el reino procariota (pro de primitivo y cariota de núcleo). Tienen estructuras en común como la membrana celular, los ribosomas encargados de la síntesis proteica y el ácido desoxirribonucleico (ADN) portador de la información genética (Pírez M & Mota, 2008, pp. 23-24). Presentan una envoltura que rodea exteriormente a las bacterias Gram positivas y las Gram negativas, esta estructura presenta una disposición de adentro hacia afuera comenzando con la membrana citoplasmática, pared celular y una sustancia extracelular denominada glicocálix, a su vez, el interior de la bacteria presenta el citoplasma, ribosomas y el ADN 40 cromosómico, estructuras que son elementos permanentes e imprescindibles para la vida de la bacteria (Lucana Nina & Huanca Espinoza, 2014, p. 2589). 2.5.1 Morfología bacteriana “Las bacterias en condiciones normales se desarrollan con formas definidas, las cuales son proporcionadas por la rigidez de la pared celular” (Rojas Triviño, 2011, p. 56). Tienen forma esférica u ovoide se denominan cocos, cuando los cocos se agrupan en cadenas, se les denomina estreptococos y cuando lo hacen en racimos, se les llama estafilococos; también se pueden agrupar en pares que reciben el nombre de diplococos, las bacterias en forma de bastón reciben el nombre de bacilos. Los bacilos curvados que presentan espirales se llaman espirilos (Molina López & Uribarren Berrueta, 2015, p. 1). Figura4. Morfología Bacteriana Formas bacterianas: Cocos; 2. diplococo; 3. cocos en cadenas; 4. cocos en racimos; 5. cocos en tetradas; 6. cocobacilos; 7. bacilos; 8. bacilos bordes redondeados; 9. bacilos bordes rectos; 10. Bacilos fusiformes; 11, 12. bacilos curvos; 13 al 15. Espiroquetas. Fuente: (Pírez.M & Mota, 2008, p. 25). 41 2.5.2 Clasificación de las bacterias Quizá una de las maneras más didácticas de clasificar a las bacterias es atendiendo a las características de la pared celular, que está constituida por una o más capas que recubren la membrana citoplasmática. Monodérmicas: Mono = una; dermis = piel. La membrana citoplásmica de estas bacterias está protegida por un entramado glucoproteico (péptidos y glucanos), que retiene los colorantes violeta (violeta de genciana, cristal violeta). Se engloban aquí bacterias y bacilos Gram +. Didérmicas: Di = dos; dermis = piel. La capa de péptido glucano es más estrecha y está cubierta, a su vez, por una capa lipídica. No retiene colorantes violeta. Engloban los bacilos Gram – (Carbonell Baldoví, Fagoaga García, & Sapiña Grau, 2016, p. 53). 2.5.3 Microflora bacteriana presente en la piel La piel posee una flora bacteriana que está constituida por microorganismos saprófitos cuya población permanece latente y en permanente mutualismo, pero, además, existe otra correspondiente a microorganismos transitorios que puede llegar a la piel lesionada a partir de las mucosas superficiales del animal o desde el medio ambiente, generándose un desequilibrio que permite la proliferación de microorganismos oportunistas y la instalación de la infección (Antúnez et al., 2009, p. 333). Entre la flora residente normal de la piel de los cánidos también pueden encontrarse estafilococos coagulasa negativos, estreptococos, Micrococcus spp y Aanetobacter spp. Entre las bacterias pasajeras de la piel de los cánidos se incluyen Bacillus spp, Corynebacterium spp, Escherichia coli, Proteus mirabilis y Pseudomonas spp. Estos organismos pueden desempeñar un papel como agentes patógenos secundarios (Kahn, y otros, 2007, p. 684). 42 2.5.3.1 Cocos Gram positivos. 2.5.3.1.1 Staphylococcus spp Son células esféricas grampositivas por lo general dispuestas en racimos irregulares parecidos a las uvas. Se desarrollan rápidamente a una temperatura de 37 °C en muchos tipos de medios y tienen actividad metabólica, fermentan carbohidratos y producen pigmentos que varían desde un color blanco hasta amarillo intenso. Los estafilococos patógenos suelen producir hemólisis, coagular el plasma, producir diversas enzimas y toxinas extracelulares, desarrollan con rapidez resistencia a muchos antimicrobianos y pueden plantear problemas terapéuticos difíciles (Brooks G. F., Carroll, Butel, Morse, & Mietzner, 2011, p. 185). Se reconocen 32 especies y varias subespecies, según produzcan o no la enzima coagulasa, Se dividen en dos grandes grupos: Staphylococcus coagulasa positivos (ECP) y Staphylococcus coagulasa negativos (ECN). En el grupo de ECP se incluyen S. aureus, S. intermedius, S. hyicus, S. delphini y S. schleiferi subsp. coagulans (Parra Moreno, 2009, p. 22). “Las especies de estafilococos coagulasa positivos (>90%) son consideradas como patógenas primarias y más virulentas que las especies coagulasa negativas (<10%). Los estafilococos coagulasa negativos han sido asociados con infecciones en personas y caninos, y por ello son de importancia zoonótica” (Castellanos L, Rodríguez M, & Santos A, 2011, p. 22). “Algunos estafilococos forman parte de la microbionta normal de la piel y las mucosas de mamiferos y aves; otros estan asociados con procesos supurativos, infecciones óseas, genitourinarias, de piel, tejidos blandos y oportunistas, septicemias e intoxicaciones alimentarias” (Figueroa Dávila, 2016, p. 6). 43 “La flora residente varía con la zona corporal y el estrato de la piel. Sobre los tallos del pelo, los estafilococos se encuentran más distalmente (hacia las puntas), mientras que los organismos Gram (–) se encuentran más proximalmente (hacia el folículo)” (Mueller & Guaguére, 2009, p. 1). 2.5.3.1.2 Staphylococcus aureus “Es el patógeno predominante en humanos, mientras el S. intermedius y el S. schleiferi son los patógenos primarios en los caninos. Las especies coagulasa variable afectan a humanos y parecen ser patógenas emergentes en medicina veterinaria” (Castellanos L. et al., 2011, pp 21-30). “S. aureus suele formar colonias de color gris a amarillo dorado profundo” (Brooks G. F. et al., 2011, p. 185). “Staphylococcus aureus produce una gran variedad de infecciones supurativas en heridas, endometritis, cistitis, piodermas en corderos, perros, gatos y en aves se produce también en abscesos” (Lagunas Bernabé & Vega Castillo, 2013, p. 33). 2.5.3.1.3 Staphylococcus epidermidis “Es un comensal caracterizado en que no produce coagulasa. no fermenta el manitol, no produce toxina a ni nucleasas termoestables, por general elabora un pigmento blanco aporcelanado. No es patógeno, pero puede comportarse como un germen oportunista” (Pumarola, 1987, p. 338). “Las colonias de S. epidermidis por lo general son grises a blancas en el aislamiento primario; muchas colonias forman pigmento sólo tras una incubación prolongada, No se produce pigmento en condiciones anaerobias o en caldo” (Brooks G. F. et al., 2011, p. 185). 2.5.3.1.4 Staphylococcus intermedius 44 “Es un microorganismo residente en las narinas, orofaringe y alrededor del ano de los perros (Mueller & Guaguére, 2009, p. 2). En perros y gatos causa diferentes infecciones, abcesos, piodermas, otitis, conjuntivitis, mastitis e infección de heridas” (Gentilini, 2007, p. 213). Han sido consideradas los principales patógenos de las infecciones bacterianas de la piel y el oído en caninos y son el origen de la población encontrada en la superficie de la piel y el pelo posiblemente por transporte desde estos sitios donde pueden causar la contaminación de la piel durante la peluquería o debido a comportamientos pruríticos (Castellanos L. et al., 2011, p. 23). 2.5.3.1.5 Staphylococcus pseudointermedius. Es el patógeno más frecuente. Desde el 2007 se ha clasificado en el grupo de S. intermedius junto con S. delphini y S. intermedius. Otros estafilococos coagulasa positivo que también se consideran patógenos son S. aureus, S. hyicus y S. schleiferi subsp. coagulans. Cuando S. pseudintermedius es resistente a 3 o más tipos de antibióticos se considera un estafilococo multirresistente (Oliveira, 2015, p. 29). Actualmente se considera como el principal agente causal de las piodermas cutáneas, vive normalmente en la piel del canino y prolifera, pasando a ser patógeno, solamente cuando se altera la inmunidad cutánea, producto de alguna patología primaria, se ubica en las uniones mucocutáneas anal, nasal y oral. Cuando el perro se lame, debido al prurito causado por una alergia u otra patología pruriginosa, la bacteria se distribuye al resto del cuerpo (Balazs Mayanz, 2012, p. 4). 2.5.3.1.3 Streptococcus spp Son un grupo grande de microorganismos con forma esférica u ovoide con un tamaño entre 0,5 y 2 µm de diámetro están agrupados en pares o cadenas. Son inmóviles y no 45 esporulados, y algunas especies pueden presentar cápsula. Son grampositivos, anaerobios facultativos y requieren para su crecimiento medios ricos en nutrientes, siendo necesario algunos casos incubarlos en atmosfera enriquecida con CO2. Son quimiorganotrófos y presentan un metabolismo fermentativo sobre los hidratos de carbono con producción de ácido, pero no de gas. (Denamiel, 2007, p. 179). Caracteristicas bioquimicas y de cultivo Los estreptococos crecen mejor en medios enriquecidos en condiciones aerobias y anaerobias (facultativas). Prefieren el agar sangre debido a que satisface las necesidades de crecimiento y tambiénsirve como un indicador de hemolisis. Las colonias son pequeñas, 2 mm de diametro y es posible que estén rodeadas por una zona donde se han hemolizado los eritrocitos suspendidos en el agar. Cuando la zona está clara se denomina betahemólisis pero cuando ésta zona es nebulsa con decoloracion verdosa, recibe el nombre de alfahemólosis (Ryan & Drew, 2011, p. 342). 2.5.3.2 Bacterias Gram negativos 2.5.3.2.1 Pseudomona aeruginosa Bacilos rectos o curvados, no vibrioides; tamaño 0,5-1,0 µm por 1,5-4,0 µm; no productores de esporas; gram negativos; flagelos polares: únicos o múltiples; móvil (siempre), sin cubiertas, apéndices o yemas; metabolismo respiratorio, nunca fermentativo, aunque pueden producir pequeñas cantidades de ácido a partir de glucosa aeróbicamente. Las pseudomonas tiene requisitos nutricionales muy sencillos y crecen quimiorganotróficamente a pH neutro y a temperaturas en el rango de los mesófilos (Madigan, Martinko, Dunlap, & Clark, 2009, p. 456). La Pseudomona aeruginosa es la más importante dentro de su clasificación, sus colonias son positivas para oxidasa, no requiere de medios enriquecidos para su cultivo, crece en un 46 medio aerobio y puede sobrevivir y multiplicarse en un amplio intervalo de temperatura (20 a 42 °C) en casi cualquier ambiente, lo que incluye entornos ricos en sales. Muestra resistencia a los antimicrobianos de manera más consistente que todas las demás bacterias de importancia médica (Ryan & Drew, 2011, p. 470). “Las Pseudomonas corresponden a la familia de las pseudomonadáceas, un grupo de Proteobacterias quimioorganótrofas con metabolismo respiratorio (anaerobias)” (Madigan et al., 2009, p. 456). 2.5.3.2.2 Enterobacterias Constituyen una familia grande y diversa de bacilos gramnegativos, que pertenecen tanto a las formas de vida libre como a la flora normal de seres humanos y animales. Se encuentran entre las bacterias más grandes, miden 2 a 4 μm de longitud con bordes paralelos y extremos redondeados; su forma varía desde cocobacilos grandes hasta de bacilos elongados, filamentosos (Ahmad et al., 2010, p. 441-442). Todas las enterobacterias son bacilos Gram negativos, sin agrupación definida. Ninguna enterobacteria forma esporas. Son aerobias o anaerobias facultativas (Lagunas Bernabé et al., 2013, p. 26). 2.5.3.2.3 Escherichia coli Escherich = Theodor Escherich (1857-1911), médico pediatra y profesor austro-alemán que descubrió Escherichia coli, que lleva en su honor esta denominación. Ésta especie es ubicua y un oportunista universal (Carbonell Baldoví et al., 2016, p. 56). EI genero Escherichia y su principal especie, E. coli, están constituidos por enterobacterias móviles que fermentan la lactosa (bacilos coliformes) y la glucosa, con producción de gas y 47 ácidos diversos (fermentación acido-mixta), y presentan una respuesta característica al grupo de pruebas IMVIC (++--) (Pumarola, 1987, p. 435). Son poco exigentes en sus necesidades nutritivas y relativamente resistentes a los agentes externos, que se cultivan en medios comunes, incluso a temperaturas de 45°C, lo que permite diferenciarlos de los demás coliformes. Forman la mayor parte de la flora comensal aerobia y anaerobia facultativa del tubo digestivo, y se eliminan por las heces al exterior (Pumarola, 1987, p. 435). 2.5.3.2.4 Proteus spp. Proteo = dios menor griego que cambiaba de forma según las circunstancias. En realidad, este pleomorfismo es general en todas las enterobacterias. Se dividen en: P. vulgaris, P. mirabilis (Carbonell Baldoví et al., 2016, p. 56). Bacterias móviles gracias a flagelos perítricos. Son ureasa positiva, poseen antígeno flagelar H y somático O. Se pueden encontrar en el suelo, el agua y los vegetales. Es un patógeno oportunista, produce infecciones urinarias y otitis externa en perros y gatos. Son sensibles a los antibióticos betalactámicos más recientes, a los aminoglicosidos y las fluoroquinolonas (Parra Moreno, 2009, p. 25). 2.5.4. Cultivo de Microorganismos Las bacterias adaptadas al hombre y los animales tienen la capacidad de desarrollarse en medios nutritivos fuera del hospedador (in vitro). Los microorganismos en crecimiento y reproducción deben hacer réplicas de sí mismos, por lo que necesitan el aporte de todas las sustancias necesarias para recrear su composición química y realizar su metabolismo (Bautista & Stanchi, 2007, p. 62). 48 En definición: “El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al proporcionarles un entorno con condiciones apropiadas” (Brooks G. F. et al., 2011, p. 833). 2.5.5. Crecimiento bacteriano Cuando hablamos de crecimiento microbiano en realidad nos referimos al número de células, no al tamaño de las células. Los microbios que están en la etapa de "crecimiento" aumentan en cantidad y se agrupan en colonias (grupos de células lo suficientemente grandes como para ser observados sin el microscopio) de cientos de miles de células, o poblaciones de miles de millones de células (Totora, Funke, & Case, 2007, p. 159). 49 50 Figura 5. Requerimiento para el crecimiento bacteriano. Aspectos físicos Temperatura Ciertas bacterias pueden desarrollarse en temperaturas extremas que impedirían la supervivencia de casi todos los organismos eucariontes. Se clasifican en: Sicrófilos (afinidad por el frío). Mesófilos (temperatura moderada). Termófilos (afinidad por el calor). La mayoría de bacterias crecen sólo dentro de un espectro limitado de temperatura y las temperaturas de crecimiento máxima y mínima sólo están separadas por 30 °C. PH Acidez o alcalinidad de una solución. La mayoría de las bacterias crecen mejor en un rango de pH estrecho cercano a la neutralidad (entre 6,5 y 7,5) y muy pocas bacterias crecen en un pH ácido (por debajo de 4). Presión osmótica Casi todos los nutrientes que obtienen los microorganismos se encuentran disueltos en el agua circundante. Los microorganismos requieren agua para crecer y están constituidos por un 80-90% de la misma. La presión osmótica elevada tiene el efecto de eliminar el agua necesaria de una célula 51 Figura 5. Requerimiento para el crecimiento bacteriano (Continuación). Fuente: (Totora et al., 2007, pp. 159-164). Requerimientos químicos: Fuentes de carbono Necesario para todos los compuestos orgánicos y constituye la estructura básica de la materia viva. Oligoelementos Esencial para las funciones de ciertas enzimas, por lo general como cofactores. Presentes naturalmente en el agua de canilla, en la mayoría de aguas destiladas y otros componentes del medio. En ocasiones son agregados al medio de cultivo. Nitrógeno azufre, fósforo Nitrógeno (útil para formar el grupo amino de los aminoácidos de las proteínas) constituye cerca del 14% del peso seco de una célula bacteriana. Oxígeno Los microbios que utilizan oxígeno molecular (aerobios estrictos) producen más energía a partir de los nutrientes que los que no utilizan (anaerobios). Los anaerobios facultativos pueden utilizar oxígeno cuando está presente, pero pueden continuar creciendo mediante la fermentación o respiración anaeróbica cuando no lo hay. Azufre: sintetiza aminoácidos que contienen azufre y vitaminas como tiamina y la biotina. Junto con el fósforo constituyen un 4 %. 52 2.6. Medios de cultivo “Son preparaciones utilizadas para diferentes propósitos tales como: aislamiento e identificación de microorganismos, prueba de esterilidad, análisis de agua, ambientales, alimentos y productos bacteriológicos, prueba de sensibilidad a los antibióticos” (Cuervo Mulet, 2010, p. 33). Desde la época de Koch hasta hoy en díase ha incrementado enormemente el arsenal de medios de cultivo con que cuentan los microbiólogos. La responsable directa de tal incremento de los medios de cultivo es la expansión de la microbiología desde la medicina hacia la agricultura, la alimentación y la industria farmacéutica (Burguet Lago & Castillo Abraham, 2013, p. 156). Figura 6. Clasificación de los medios de cultivos. Según su estado físico Líquidos: Denominados caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado número de microorganismos. Ej. Caldo nutritivo. Sólidos: Se pueden preparar a partir de medios líquidos a los cuales se les añaden agentes solidificantes como agar, gelatina o sílica gel. Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo. 53 Figura 6. Clasificación de los medios de cultivos (Continuación). Según la naturaleza de sus constituyentes: Medios naturales o complejos: Constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, se complementan con la adición de minerales y otras sustancias. No se conocen todos sus componentes, ni las cantidades exactas en que están presentes. Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras. Medios sintéticos o químicamente definidos: Preparados a partir de ingredientes químicamente puros y por lo tanto se puede conocer exactamente su composición cuali y cuantitativa. Por su costo sólo se emplean en procedimientos especiales. Según sus propósitos de uso Medios de enriquecimiento: Se llama enriquecimiento a cualquier cultivo en medio líquido que produzca un incremento en el número dado de microorganismo en relación con el número de otros microorganismos que puedan estar en el inóculo. Puede contener sustancias que favorezcan el crecimiento del microorganismo de interés o que inhiban el crecimiento de los otros microorganismos presentes. Medios selectivos: Iguales a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios sólidos, diseñados para el aislamiento de microorganismos específicos. Medios diferenciales: No contienen sustancias inhibidoras, permiten el crecimiento de muchos tipos de microorganismos. Se utilizan para la identificación. Medios selectivos diferenciales: Combinación de las características de los medios selectivo y diferencial. Fuente: (Pedrique de Aulacio, Gutiérrez de Gamboa, Saravía , & Garcés, 2008, pp. 2-4). 54 2.7. Pruebas de sensibilidad Las pruebas de sensibilidad se basan en la evaluación in vitro de la capacidad que tienen los antibióticos o agentes antimicrobianos de inhibir el crecimiento bacteriano. Esta capacidad puede ser evaluada por métodos de dilución o difusión (Araya Díaz, Prat Miranda, & Ramírez Muñoz , 2015, p. 3). Las técnicas de dilución proporcionan resultados cuantitativos (concentración mínima inhibitoria CMI) y las de difusión cualitativos (sensible, intermedio, resistente). Ambos métodos son comparables ya que hay una correlación directa entre el diámetro del halo de inhibición con un disco y la CMI (Cercenado & Saavedra Lozano, 2009). Las primeras pruebas de sensibilidad se realizaron en la década de 1920 del siglo pasado ligadas al propio descubrimiento de los antimicrobianos, ya sea basadas en la difusión o en el cálculo de la concentración mínima inhibitoria (CMI), no se generalizaron hasta bien entrada la década de 1960 (Cantón, 2010, p. 376). 2.7.1. Antibiograma mediante método de difusión de disco Kirby- Bauer. De acuerdo al Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorios (Clinical and Laboratories Standards Institute), un antibiograma se define como “Un perfil general de los resultados de la susceptibilidad antimicrobiana de una especie microbiana frente a una batería de agentes antimicrobianos” (CLSI, 2008). Procedimiento Un medio con agar se inocula por diseminación uniforme de una suspensión de un cultivo puro, ajustada a una densidad definida, sobre la superficie del agar. 55 Entonces, se colocan sobre el agar inoculado discos de papel de filtro con una cantidad definida (en microgramos por disco) de un agente antimicrobiano. Después de un período determinado de incubación, se mide el diámetro de la zona de inhibición del crecimiento alrededor de cada disco. Los diámetros de la zona de inhibición se interpretan en categorías de sensibilidad en base al tamaño de la zona (Madigan et al., 2009, p. 1013). Figura 7. Procedimiento del Método Disco-Placa. Fuente: Autor. “Tiene por finalidad correlacionar el diámetro del halo de inhibición con la sensibilidad de un microorganismo a un antibiótico determinado en una infección clínica” (Riera, Chamorro, Zárate, Falcón, & Franco, 2008, p. 65). 56 Las técnicas de antibiogramas por difusión han sido normalizadas para microorganismos de crecimiento rápido, tales como Staphylococcus y Enterobacteriaceae pero no son confiables cuando se aplican a microorganismos de crecimiento lento, los cuales pueden mostrar zonas de inhibición mucho más grandes que aquéllos de crecimiento rápido (Bernal & Guzmán, 1984, p. 113). 2.7.2. Interpretación del antibiograma y lectura interpretada del antibiograma La interpretación de los resultados del antibiograma (sensible, intermedio o resistente) se realiza en función de los valores establecidos por diferentes comités, como el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) en Estados Unidos, el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) en Europa y la Mesa Española de Normalización de la Sensibilidad y Resistencia a los Antimicrobianos, los cuales determinan y establecen puntos de corte basados en propiedades microbiológicas, farmacocinéticas y de eficacia clínica, para definir la sensibilidad (éxito terapéutico) o resistencia de las diferentes especies bacterianas a cada antimicrobiano (Cercenado & Saavedra Lozano, 2009, p. 214). 2.7.3. Interpretación de los Halos de Inhibición A traves de los años se han realizado congresos especialmente en Europa para ir determinando las categorías clínicas utilizadas en los informes de sensibilidad, y no fue hasta hace poco que la International Organization for Standardization los redefinió, quedando establecidas en función de la probabilidad del éxito o del fracaso terapéutico como: Sensible: cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración de un antimicrobiano que se asocia a una alta probabilidad con el éxito terapeútico. Intermedio: cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración de un antimicrobiano que se asocia a un efecto terapéutico incierto. 57 Resistente: cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración de un antimicorbiano que se asocia a una alta probabilidad con el fracaso terapéutico (Cantón, 2010, p. 376). 2.7.4. Medios para pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 2.7.4.1. Agar Mueller-Hinton “Medio de cultivo recomendado universalmente, para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos. Muestra buena reproducibilidad lote a lote, su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclinas es bajo, y la mayoría de los patógenos crece satisfactoriamente” (Lopardo, 2016, p. 328). Puede ser de origen comercial o preparado localmente a partir del medio deshidratado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y debe cumplir con las características necesarias para obtener halos de inhibición dentro de los límites de aceptabilidad. pH con un rango entre 7,2 a 7,4 medido a temperatura ambiente y después de su solidificación. El espesor en las placas petri debe ser de 4 mm, lo que se logra con un volumen de AMH de 60 a 70 ml de medio para placas de 150 mm de diámetro y 25 a 30 ml para placas de 85-100 mm de diámetro (Riera et al.,
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