tesis767

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PONTIFICIA UNIVERISAD JAVERIANA 
FACULTAD DE CIENCIAS 
CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL 
 
 
 
 
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CON PRESUNTIVO 
POTENCIAL PROBIOTICO A PARTIR DE HECES DE ANIMALES DE PRODUCCION 
INDUSTRIAL 
 
 
 
 
JORGE ENRIQUE RODRÍGUEZ OGLIASTRI 
 
TRABAJO DE GRADO 
 
Presentado como requisito parcial para optar al título de 
 Microbiólogo Industrial 
 
Directora 
ANDREA CAROLINA AGUIRRE 
Codirectora 
SANDRA JANETH SANTOS 
 
 
 
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA 
FACULTAD DE CIENCIAS 
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL 
BOGOTÁ, D.C. 
2011 
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CON PRESUNTIVO 
POTENCIAL PROBIOTICO A PARTIR DE HECES DE ANIMALES DE PRODUCCION 
INDUSTRIAL 
 
 
 
 
JORGE ENRIQUE RODRÍGUEZ OGLIASTRI 
 
 
 
APROBADO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA 
FACULTAD DE CIENCIAS 
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL 
BOGOTÁ, D.C. 
2011 
Dra. INGRID SCHULER GARCÍA Ph.D 
Decana académica 
Dra. JANETH ARIAS PALACIOS M.Sc-
M.Ed 
Directora de carrera 
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS CON PRESUNTIVO 
POTENCIAL PROBIOTICO A PARTIR DE HECES DE ANIMALES DE PRODUCCION 
INDUSTRIAL 
 
 
 
 
JORGE ENRIQUE RODRÍGUEZ OGLIASTRI 
 
 
 
ANDREA CAROLINA AGUIRRE M.Sc 
Directora 
 
 
 
SANDRA JANETH SANTOS 
Codirectora 
 
 
 
LUIS DAVID GÓMEZ M.Sc 
Jurado 
 
 
 
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA 
FACULTAD DE CIENCIAS 
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL 
BOGOTÁ, D.C. 
2011 
 
 
 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en 
sus trabajos de tesis. Sólo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la 
moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona 
alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. 
Artículo 23 de la Resolución No 13 de Julio de 1946. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
A Andrea Aguirre, Carval de Colombia, Sandra Janeth Santos, al laboratorio de Biotecnología 
Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana y en su nombre, Balkys Quevedo, por su ayuda, sin 
la cual este proyecto no hubiera sido posible. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TABLA DE CONTENIDO 
Página 
1. RESUMEN 7 
2. INTRODUCCIÓN 8 
3. MARCO TEÓRICO 9 
4. JUSTIFICACIÓN Y PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 11 
5. OBJETIVOS 12 
5.1 OBJETIVO GENERAL 12 
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 12 
6. METODOLOGÍA 12 
6.1 RECOLECCIÓN DE MUESTRAS 12 
6.2 MUESTREO INICIAL 12 
6.3 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS 13 
6.4 CONSERVACIÓN INICAL DE CEPAS 13 
6.5 IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA 14 
6.6 CONSERVACIÓN FINAL DE CEPAS 14 
7. RESULTADOS 15 
7.1 MUESTREO INICIAL 15 
7.2 MUESTREOS 16 
7.2.1 RECUENTO DE MUESTREOS 16 
7.2.2 COLORACIONES DE GRAM 20 
7.3 IDENTIFICACIONES BIOQUÍMICAS 22 
8. DISCUSIÓN 26 
9. CONCLUSIONES 33 
10. RECOMENDACIONES 34 
11. BIBLIOGRAFÍA 35 
12. ANEXOS 40 
 
1. RESUMEN 
 
Los probióticos han entrado en auge en los últimos años por su aplicación como medicina 
preventiva y en el campo agrícola se ha buscado reducir el uso de antibióticos promotores de 
crecimiento (APCs), mejorar la alimentación de los animales y también, evitar las enfermedades 
causadas por patógenos entéricos. En este estudio se aplicaron metodologías para el aislamiento 
de microorganismos con presuntiva capacidad probiótica a partir de heces de vertebrados como 
aves (gallinas de engorde), ganado porcícola (cerdos de engorde), ganado vacuno (rumiantes de 
engorde) y caninos (como mascotas domésticas). Se identificaron un total de 60 microorganismos 
mediante pruebas bioquímicas usando baterías API (Biomerieux®) obteniendo bacterias Ácido 
Lácticas como Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus rhamnosus, L. pentosus, L. paracasei ssp. 
paracasei y L. brevis. Bacilos esporulados como Bacillus subtilis/amyloliquefaciens, B. megaterium 
y B. licheniformis. Se identificaron levaduras sin reportes bibliográficos encontrados en cuanto a 
probiosis Geotrichum sp., Kloeckera sp., Cryptococcus terreus y varias especies de Candida. Los 
resultados obtenidos son preliminares para la futuros estudios que permitan la evaluación de la 
capacidad probiótica de estas cepas tanto in vitro como In vivo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. INDTRODUCCIÓN 
Los probióticos son microorganismos vivos que, cuando son suministrados en cantidades 
adecuadas, confieren un beneficio sobre el huésped (1). Dentro de las aplicaciones que se les ha 
dado a estos productos están medicinales como antialérgicas (2), contra la diarrea, contra 
infecciones urinarias, contra el cáncer de colon, entre otras (3). 
Quizá la aplicación más estudiada y comercial es la de colonización intestinal para la defensa 
contra patógenos entéricos como Shigella, Salmonella y Escherichia coli. Existen productos 
derivados de la leche, como el yogurt, que contienen Bacterias Ácido Lácticas como las 
Bifidobacterias y Lactobacilos que al colonizar el tracto digestivo humano, previenen 
enfermedades causadas por ciertos patógenos (4). 
Se ha sugerido que le eficiencia en la nutrición animal se debe principalmente a los 
microorganismos nativos del tracto digestivo (5). Se han descrito dos mecanismos de acción 
principales que emplean los probióticos responsables del beneficio para el huésped animal y 
humano: 1) El efecto nutricional caracterizado por la reducción de reacciones metabólicas que 
producen sustancias tóxicas, estimulación de enzimas propias del huésped, producción de 
vitaminas y minerales y secreción de antimicrobianos. 2) El efecto de salud distinguido por el 
incremento en la resistencia de colonización contra patógenos mediante la competencia de 
adhesión a la superficie intestinal, competencia por sustrato, secreción de bacteriocinas y 
estimulación de la respuesta inmune (5, 6). 
Los probióticos son común denominador en dietas recomendadas por nutricionistas y ahora se 
conoce que consumir productos a base de microorganismos estudiados con fines probióticos 
optimizan las funciones que ejerce el aparato digestivo, bien sea de humanos o de animales. El 
futuro de los probióticos está direccionado hacia el mercado del cuidado personal y de la salud 
animal. Se busca que éstos puedan ser usados en la prevención o alivio de síntomas o 
enfermedades específicas, especialmente para la población de recién nacidos, la tercera edad o 
personas inmunosuprimidas (2). 
En el presente estudio se tuvo como objetivo aislar e identificar bioquímicamente 
microorganismos con potencial de capacidad probiótica presuntiva (Bacterias Ácido Lácticas, 
Levaduras y Bacilos esporulados) a partir de muestras fecales de animales de interés agroindustrial 
y doméstico. 
3. MARCO TEÓRICO 
3.1 Probióticos 
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), los probióticos son microorganismos vivos que 
cuando son suministrados en cantidades adecuadas, confieren un efecto benéfico sobre el 
huésped (1). El concepto de probiosis también abarca la exclusión competitiva para mejorar una 
ecología microbiana específica. Existen diferentes tipos de microorganismos que son considerados 
probióticos; entre ellos están las bacterias Ácido Lácticas, los bacilos formadores de espora 
(Bacilos Esporulados) y las levaduras (7, 8). 
Estos microorganismos se le han atribuido también efectos de estimulación en la digestión y 
mantenimiento en la flora intestinal tanto de humanos como animales. De esta manera ayudan a 
contrarrestar el estrés causado por cambios en la dieta y proveen una línea de defensa contra 
patógenos. 
Ciertos microorganismos probióticos secretan enzimas, vitaminasy otras sustancias consideradas 
como factores de crecimiento que llevan a aumentas la eficiencia en la producción animal (9). Se 
ha estudiado la capacidad de estos microorganismos de producir sustancias antimicrobianas 
conocidas como bacteriocinas, que inhiben el crecimiento y reproducción de patógenos entéricos 
(10). 
3.2 Bacterias Ácido Lácticas 
Son denominadas de ésta manera por su capacidad de producir ácido láctico a partir de 
carbohidratos como la glucosa, fructosa, manosa, etc. Tienen morfología microscópica cocoíde o 
bacilar y reaccionan positivamente ante los colorantes de Gram (8). Entre las bacterias de este 
tipo, las más reportadas y comúnmente empleadas están: Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. 
crispatus, L. gasseri, L. paracasei, L. reuteri y L. rhamnosus (3). 
3.3 Bacilos esporulados 
Existen bacterias capaces de formar una estructura denominada espora que le permite asegurar 
su supervivencia en condiciones adversas o extremas como insuficiencia de agua o nutrientes, 
temperaturas elevadas, niveles de pH ácidos o alcalinos, etc. Presentan morfología bacilar al 
microscopio y reacción positiva a los colorantes de Gram (3). Estos microorganismos, aunque 
existen especies consideradas patógenas, también existen otros con reportes y usos por sus 
capacidades probióticas. El más ampliamente conocido en este campo es Bacillus subtilis (5). 
3.4 Levaduras 
Ciertos hongos presentan una morfología llamada levaduriforme. Esta se caracteriza por ser de 
mayor tamaño que las bacterias y presenta una reacción positiva ante los colorantes de Gram, 
aunque a diferencia de las bacterias, esta se debe por la afinidad al colorante Cristal Violeta y no 
por la presencia de peptidoglicano en la pared como ocurre en las bacterias Gram positivas (8). 
Saccharomyces cerevisiae y S. boulardii se han usado durante muchos años como suplemento 
alimenticio por su alto contenido proteico, además ser utilizado como agente anti diarreico en 
humanos. 
Las características atribuidas a estos microorganismos para ser utilizados en animales son: su 
producción de minerales, vitaminas hidrosolubles y enzimas; mejora en la eficiencia alimentaria 
dada por la mejora en la absorción de nutrientes en el huésped (por el control de la diferenciación 
y proliferación de células epiteliales en el intestino), control la flora intestinal y reducción de 
olores en las excretas (9). 
3.5 Mecanismos de acción implicados en la probiosis 
Principalmente, los probióticos son conocidos como una línea de defensa contra patógenos 
causantes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs) (10) por varias razones: su adhesión 
a las células del intestino causa una competencia por espacio y nutrientes contra los patógenos, 
producción de bacteriocinas que afectan el crecimiento de éstos, modulación de la respuesta 
inmune causada como respuesta a la pared de las bacterias Ácido Lácticas (ácido lipoteícoico) que 
ayuda a los antígenos de membranas celulares de las células epiteliales causando una interacción 
que desencadena una producción de citoquinas, proliferación de células mononucleares, 
macrófagos y células NK (natural killers) (3). 
Bajo estas razones es que se hace interesante el uso de estos microorganismos como sustitución a 
la terapia antibiótica en animales por terapias probióticas, puesto que tienen efectos similares en 
cuanto a la defensa del animal y su crecimiento saludable, sin embargo, los probióticos ofrecen 
una mejor alternativa por menores costos de producción y salubridad tanto humana como del 
animal. 
4. JUSTIFICACIÓN Y PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
4.1 JUSTIFICACIÓN 
Los probióticos han entrado en auge en los últimos años con ventas de preparados a base de leche 
con adición de una carga de Bifidobacterias, Lactobacilos y Lactococos con los cuales se busca la 
colonización del tracto digestivo, eviten la enfermedad de patógenos entéricos y ayuden a regular 
el metabolismo (7-10). Esto ha sido aplicado, en gran parte para humanos, sin embargo, en 
Colombia no ha habido grandes estudios respecto a la producción de biopreparados para la 
industria agropecuaria. 
Se ha encontrado que en la producción industrial de animales, como la avicultura y la porcicultura, 
ocurren condiciones en donde los mayores costos y pérdidas económicas son causados por 
infecciones con virus, bacterias, hongos y protozoos y por la inversión de antibióticos profilácticos 
y como factor de crecimiento empleados (7). Los antibióticos promotores del crecimiento (APC) se 
usan para aumentar la eficiencia en la absorción de nutrientes en las aves y para el aumento en 
peso corporal. Bajo reglamentación, se establece que los APC no deben causar daño al consumidor 
y no deben dejar residuos de compuestos relacionados bien sea en la carne o en los huevos. Sin 
embargo, no se conoce un estudio fiable que cuantifique con exactitud dichos compuestos (8, 9). 
El uso de los APC ha llevado a una pérdida del balance de la flora intestinal y desarrollo de 
resistencias a antibióticos por parte de los microorganismos que pueden ser patógenos para 
animales o humanos (5). Con la tendencia global a evitar consumir lo que se ha inundado con 
químicos, en este caso siendo los APC, los productos a base de probióticos como Bactocell® (7, 11) 
son una alternativa que puede proveer nuevas tendencias en la agricultura. 
En la industria de ganado vacuno, se ha encontrado que los antibióticos suministrados a estos 
animales reducen de manera drástica la población microbiana en el intestino inferior lo que causa 
dificultades en asimilación de nutrientes para el animal y establecimiento de patógenos (12). Se 
conoce que para la digestión de nutrientes en estos animales se necesitan de microorganismos, en 
especial para la degradación de celulosa (13) 
 Es por esto que es adecuado aplicar métodos para el aislamiento de microorganismos con 
capacidad probiótica presuntiva para su posterior caracterización e implementación en el mercado 
agropecuario. 
4.2 Pregunta de investigación 
¿Es posible aislar géneros de microorganismos de presuntiva capacidad probiótica a partir de 
heces de ganado bovino, porcícola, avícola y de caninos? 
5. OBJETIVOS 
5.1 Objetivo general: 
Aislar e identificar microorganismos con capacidad probiótica presuntiva a partir de muestras 
fecales de animales de producción industrial y de comercio agrícola. 
5.2 Objetivos específicos: 
- Aislar microorganismos a partir de heces bovinas, avícolas, porcícolas y caninas. 
- Identificar bioquímicamente los microorganismos previamente aislados 
 
 
6. METODOLOGÍA 
6.1 Recolección de muestras 
Se recolectaron muestras de: 
- Heces caninas 
- Heces bovinas 
- Heces porcícolas 
- Heces avícolas 
Las muestras provinieron de granjas ubicadas en el Valle del Cauca, Colombia. Se enviaron para su 
procesamiento en refrigeración bajo correo certificado. 
 
6.2 Muestreo inicial 
Previo al muestreo se realizó un estudio para tener una aproximación a la población microbiana 
capaz de crecer en los medios MRS, YGC y Plate Count. Es este último se dio un tratamiento 
térmico para así limitar el crecimiento a microorganismos esporulados (80°C durante 10 minutos y 
choque en frío a 20°C durante 10 minutos) (14). 
Se procesaron muestras de cada animal al momento de la recepción de cada una. Se realizaron 
diluciones seriadas en base 10, hasta obtener una dilución correspondiente a 10-15. Se sembraron 
todas las diluciones por superficie (0.1mL) y se incubó a 37°C para bacterias (medios MRS y Plate 
Count) y 30°C para levaduras (medio YGC), durante 48 horas. 
También se realizó un estudio para evaluar si las condiciones aeróbicas afectaban el crecimiento 
de los microorganismos crecidos en el medio de cultivo MRS. 
A partir de los resultados del muestreo inicial, se tomaron las muestras que arrojaron el recuento 
mayor contable y se sembraron las diluciones 10-5 y 10-6 por duplicado,incubando un duplicado en 
condiciones de microaerofilia, generado por el sistema GENEBOX de Biomerieux® y el otro en 
condiciones aeróbicas. 
6.3 Procesamiento de muestras 
De cada muestra se pesaron 10 gramos que fueron diluidos en 90mL de agua peptonada. Se 
realizaron diluciones seriadas en base 10 hasta 10-8 tomando como referencia los resultados del 
muestreo inicial realizado previamente. Se sembró 0,1 mL por en agar MRS, YGC y Plate Count. En 
este último se le dio un tratamiento térmico para así limitar el crecimiento a microorganismos 
esporulados (80°C durante 10 minutos y choque en frío a 20°C durante 10 minutos) (13). Se 
incubó a 37°C para bacterias (medios MRS y Plate Count) y 30°C para levaduras (medio YGC), 
durante 48 horas. 
A cada morfotipo de colonia crecida se le realizó coloración de Gram y se purificaron según los 
siguientes criterios (anexo 2, tabla VII): 
 Colonias crecidas en MRS: cocos o bacilos Gram positivos 
 Colonias crecidas en YGC: levaduras ligeramente ovoides de gemación única 
 Colonias crecidas en Plate Count: bacilos Gram positivos esporulados 
 
6.4 Conservación inicial de las cepas 
Las colonias aisladas se conservaron realizando repiques cada 30 días en los medios originales para 
posteriores trabajos y conservación de las mismas (8). 
Se realizó un banco de transporte correspondiente a 3 viales por microorganismo purificado, 
creciendo las colonias en tubos de 13x100 con 5mL del medio de cultivo correspondiente, 100rpm, 
37°C para bacterias y 30°C para levaduras por 16 horas. Posterior al crecimiento se agregaron con 
un volumen final de 1mL a un tubo eppendorf con glicerol para obtener una concentración final de 
glicerol al 10% (v/v). Los viales se conservaron a -70°C y se reactivaron una semana después de 
preparado el banco, en el mismo medio en donde originalmente ser aisló cada microorganismo. 
6.5 Identificación bioquímica 
Los microorganismos se identificaron mediante las pruebas de API 50 CHL (para colonias crecidas 
en agar MRS), API 20C AUX (para colonias crecidas en agar YGC) y API 50 CHB (para colonias 
crecidas en Plate Count), siguiendo las instrucciones y protocolos de la casa comercial Biomerieux® 
y se ingresaron al software APIWEB de la misma casa comercial para su identificación. 
6.6 Conservación final de las cepas 
Aquellos microorganismos cuyo perfil bioquímico resultado de API arrojó la identificación de 
género referenciado en literatura como posible microorganismo probiótico fue conservado en 
glicerol al 10% (v/v) siguiendo la siguiente metodología: 
A partir de una colonia pura, se sembró en caldos MRS, YPG o Plate Count (para bacterias aisladas 
de MRS, YGC o Plate Count respectivamente). Se incubó a 37 o 30°C para bacterias y levaduras 
respectivamente, por 16 horas a 100 rpm (15). 
Posterior al periodo de incubación, se realizaron dos lavados celulares usando agua destilada 
estéril. Finalizado los lavados celulares, se resuspendió el pellet en glicerol al 10% y se congeló a 
-20°C. 
 
 
 
 
7. RESULTADOS 
 
7.1 Muestreo inicial 
A partir de las muestras recibidas, se obtuvieron diferentes recuentos que principalmente 
variaron por el medio de cultivo utilizado para la siembra. A excepción de la muestra de heces 
porcícolas, en MRS se obtuvieron recuentos del mismo orden logarítmico de 107 (Tabla 1). La 
mayoría de otros crecimientos se encontraron en concentraciones suficientes para continuar con 
el estudio. 
 
Tabla I: Recuento en placa de muestreo inicial de heces de diferentes animales. 
Procedencia de la 
Muestra 
Medio de 
cultivo 
Recuento 
 (UFC/g) 
Heces 
bovinas 
MRS 6,50E+07 
Plate Count 1,50E+05 
YGC 2,30E+04 
Heces 
porcícolas 
MRS 3,10E+09 
Plate Count 3,60E+05 
YGC 4,00E+07 
Heces 
 avícolas 
MRS 3,60E+07 
Plate Count 4,60E+05 
YGC 3,40E+06 
Heces 
caninas 
MRS 1,80E+08 
Plate Count 3,60E+05 
YGC 1,10E+04 
Fuente: elaboración propia 
 
 Figura I: Gráfico de barras del logaritmo natural de los recuentos iniciales en LN UFC/g. 
Fuente: elaboración propia 
Los resultados de los crecimientos de microaerofilia y aerobiosis fueron en ambos casos, mayor a 
2,60E+8 lo que indicó que no había interferencias en cuanto a densidad microbiana en los 
resultados por condiciones de oxígeno en la incubación. 
7.2 Muestreos 
7.2.1 Recuento de muestreos 
Los resultados obtenidos para recuento en placa de las muestras analizadas fueron coherentes con 
el muestreo inicial en tanto que dieron cerca del mismo valor logarítmico (Anexo 2, Tabla XI) 
(Figuras II, III, IV, V, VI, VII y VIII). Sugiero mostrar la grafica y poner en anexos las tablas. 
Se procesaron 10 muestras de cada vertebrado seleccionado separado en dos grupos de 5 
exceptuando canes, para lo que se procesaron solamente 5 en total. 
0 
5 
10 
15 
20 
25 
Heces 
bovinas 
Heces 
porcícolas 
Heces 
avícolas 
Heces caninas 
LN
 U
FC
/g
 
Muestra 
Recuento de muestreo inicial 
MRS 
Plate Count 
YGC 
 
Figura II: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas 
(M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia 
 
 
Figura III: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales avícolas 
(M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0 
5 
10 
15 
20 
M1 M2 M3 M4 M5 
LN
 U
FC
/g
 
Número de muestra 
Población microbiana crecida en 
Heces Avícolas 1 
MRS 
Plate Count 
YGC 
0 
5 
10 
15 
20 
25 
M1 M2 M3 M4 M5 
LN
 U
FC
/g
 
Número de muestra 
Población microbiana crecida en 
Heces Avícolas 2 
MRS 
Plate Count 
YGC 
 
 
 
Figura IV: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales 
porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia 
 
 
Figura V: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales 
porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia 
 
0 
5 
10 
15 
20 
25 
M1 M2 M3 M4 M5 
LN
 U
FC
/g
 
Número de muestra 
Población microbiana crecida en 
Heces Porcícolas 1 
MRS 
Plate Count 
YGC 
0 
5 
10 
15 
20 
25 
M1 M2 M3 M4 M5 
LN
 U
FC
/g
 
Número de muestra 
Población microbiana crecida en 
Heces Porcícolas 2 
MRS 
Plate Count 
YGC 
 
Figura VI: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales caninas 
(M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia 
 
 
Figura VII: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales bovinas 
(M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia 
 
0 
2 
4 
6 
8 
10 
12 
14 
16 
M1 M2 M3 M4 M5 
LN
 U
FC
/g
 
Número de muestra 
Población microbiana crecida en 
Heces Caninas 
MRS 
Plate Count 
YGC 
0 
5 
10 
15 
20 
25 
M1 M2 M3 M4 M5 
LN
 U
FC
/g
 
Número de muestra 
Población microbiana crecida en 
Heces Bovinas 1 
MRS 
Plate Count 
YGC 
 
Figura VIII: Gráfico de resultados de recuentos de recuento en placa de 5 muestras fecales 
porcícolas (M1, M2, M3, M4 y M5). Fuente: elaboración propia 
 
 
 
7.2.2 Coloraciones de Gram 
Las morfologías y reacciones ante los colorantes de Gram se observan en la tabla II. Aunque el 
medio YGC contiene un antimicrobiano de amplio espectro, se observaron morfologías de 
bacterias como bacilos y cocos Gram negativos 
 
Tabla II: Coloraciones de Gram de la diferentes morfologías macroscópicas observadas en las 
siembras en placa. M(#): Muestra, BGP: Bacilo Gram Positivo, BGPE: Bacilo Gram Positivo 
Esporulado, BGN: Bacilo Gram Negativo, CGP: Coco Gram Positivo, CGN: Coco Gram Negativo, LS: 
Levadura Silvestre, LGM: Levadura ovoide con Gemación Múltiple, LGU: Levadura ovoide con 
Gemación Única, C(#): Colonia *Repicada. 
Muestra 
 
MRS Plate Count YGC 
M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5 
Heces 
avícolas 1 
C1: 
BGP
* 
C2: 
CGP 
C3: 
BGP
* 
C1: 
BGP* 
C2: 
BGP*
* 
C1: 
CGN 
C2: 
BGN 
 
C1: 
BGN 
C2: 
BGNC1: 
CGN 
C2: 
CGN 
C1: 
BGN 
C2: 
BGP 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGN 
C3: 
BGN 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGP 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGN 
C3: 
CGP 
C1: 
BGPE* 
C2: 
CGP 
C3: 
CGP 
C1: 
LS 
C2: 
LS 
C1: 
LS 
C2: 
BGN 
C3: 
LS 
C1: 
LS 
C2: 
LGU
* 
C1: 
LS 
C2: 
LS 
C3: 
LS 
C4: 
C1: 
BGN 
C2: 
LS 
C3: 
LS 
0 
5 
10 
15 
20 
M1 M2 M3 M4 M5 
LN
 U
FC
/g
 
Número de muestra 
Población microbiana crecida en 
Heces Bovinas 2 
MRS 
Plate Count 
YGC 
C4: 
BGP 
BGN 
Heces 
avícolas 2 
C1: 
BGP
* 
C2: 
BGN 
C1: 
BGP*
* 
C2: 
CGN 
C1: 
BGN 
C1: 
CGN 
C2: 
BGN 
C1: 
CGN 
C2: 
BGN 
C3: 
BGP
* 
C4: 
BGN 
C5: 
BGN 
C1: 
BGP 
C2: 
BGN 
C3: 
BGN 
C1: 
BGN 
C2: 
BGN 
C1: 
BGP 
C2: 
BGPE
* 
C3: 
BGPE
* 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGP 
 
C1: 
BGPE* 
C2: 
BGPE*
* 
C3: 
BGPE* 
C1: 
BGN 
C2: 
LS 
C1: 
LS 
C1: 
LGM 
C2: 
LS 
C3: 
LS 
C1: 
BGP 
C2: 
LGM 
C1: 
LGM 
C2: 
LS 
Heces 
porcícola
s 1 
C1: 
BGN 
C2: 
BGN 
C3: 
CGN 
C1: 
CGP* 
C2: 
BGN 
 
C1: 
CGN 
C2: 
BGN 
C1: 
BGP
* 
C2: 
BGN 
C3: 
BGN 
C1: 
BGN 
C2: 
BGN 
C3: 
BGN 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGP 
C3: 
BGPE
* 
C4: 
BGN 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGP 
C3: 
BGPE
* 
C4: 
BGP 
C5: 
BGP 
C6: 
BGN 
C1: 
BGN 
C2: 
BGN 
C3: 
BGPE
* 
C1: 
BGP 
C2: 
BGPE
* 
C3: 
BGP 
C4: 
BGP 
C1: 
BGPE* 
C2: 
BGPE* 
C3: 
BGP 
C1: 
LS 
C2: 
LS 
C3: 
LGU
* 
 
C1: 
LG
M 
C2: 
LG
M 
C1: 
LGM 
C1: 
LS 
C2: 
BGN 
C1: 
LS 
C2: 
LS 
C3: 
LGU
* 
C4: 
LS 
C5: 
LGM 
 
Heces 
porcícola
s 2 
C1: 
BGN 
C2: 
BGN 
C3: 
BGP
* 
C4: 
BGN 
C5: 
BGP
* 
C6: 
CGN 
C1: 
BGP* 
C2: 
BGN 
C1: 
BGN 
C2: 
BGN 
C3: 
BGN 
C4: 
BGP
* 
C1: 
BGN 
C2: 
BGP
* 
C1: 
BGN 
C2: 
BGN 
C3: 
CGN 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGN 
C3: 
CGP 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGPE
* 
C3: 
BGPE
* 
C4: 
BGP 
C5: 
BGN 
C6: 
BGP 
C1: 
BGN 
C2: 
BGN 
C3: 
BGP 
C4: 
BGP 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGN 
C3: 
BGP 
C4: 
BGPE
* 
C1: 
BGPE* 
C2: 
BGP 
C3: 
BGN 
C4: 
BGN 
C1: 
LS 
C2: 
BGN 
C3: 
LS 
C4: 
LS 
C5: 
LGU
* 
C1: 
LG
M 
C2: 
LS 
C3: 
LS 
C1: 
LS 
C1: 
LS 
C2: 
LS 
C3: 
LS 
C4: 
BGN 
C1: 
LS 
C2: 
LS 
C3: 
LS 
C4: 
BGN 
C5: 
LGU
* 
Heces 
caninas 
C1: 
BGN 
C2: 
C1: 
BGN 
C2: 
C1: 
CGN 
C2: 
C1: 
CGN 
C2: 
C1: 
BGP
* 
- - - - - - - - - - 
CGP
* 
C3: 
BGP
* 
BGN 
 
BGN BGN 
Heces 
bovinas 1 
C1: 
BGN 
C2: 
BGN 
C3: 
CGP
* 
C4: 
BGN 
C5: 
BGN 
C1: 
BGM 
C2: 
BGN 
C3: 
BGN 
C4: 
BGN 
C1: 
BGN 
C2: 
CGN 
C3: 
CGN 
C4: 
BGN 
C5: 
BGN 
C1: 
BGN 
C2: 
BGN 
C3: 
BGN 
 
C1: 
CGP
* 
C2: 
CGP
* 
C1: 
BGP 
C2: 
CGP 
C3: 
BGN 
C4: 
BGN 
C1: 
BGP 
C2: 
BGN 
C3: 
BGP 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGP 
C3: 
BGP 
C4: 
BGN 
 
C1: 
BGP 
C2: 
BGN 
C3: 
BGPE
* 
C1: 
BGP 
C2: 
BGP 
C3: 
BGP 
- - - C1: 
LGU
* 
C2: 
LGM 
C3: 
LGU
* 
C4: 
LGM 
C1: 
LGM 
Heces 
bovinas 2 
C1: 
BGP
* 
C2: 
BGN 
C3: 
BGN 
C4: 
BGN 
C1: 
BGP* 
C2: 
BGN 
C3: 
CGN 
C4: 
BGN 
C1: 
BGN 
C2: 
CGN 
C3: 
BGN 
C1: 
BGP
* 
C2: 
BGN 
C1: 
BGP
* 
C2: 
CGN 
C3: 
BGN 
C1: 
BGP 
C2: 
BGP 
C3: 
BGN 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGP 
C3: 
BGP 
 C1: 
BGP 
C2: 
BGP 
C3: 
BGP 
C4: 
BGP 
C1: 
BGPE
* 
C2: 
BGP 
C3: 
BGN 
C4: 
BGN 
C1: 
BGP 
C2: 
BGP 
C3: 
BGP 
C4: 
BGP 
C5: 
CGP 
C1: 
LS 
C2: 
LS 
C1: 
1 
- 
 
C1: 
LS 
C2: 
LS 
- 
Fuente: elaboración propia 
7.3 Identificación bioquímica 
 
La identificación de los microorganismos purificados se llevo a cabo mediante las baterías de API 
(Biomerieux®). Se organizaron según el tipo de microorganismo (Bacterias Ácido Lácticas, Bacilos 
Esporulados y Levaduras) su procedencia para tener claridad del ambiente en donde se 
encontraban los microorganismos. 
 
 
 
 
 
Tabla III: Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 50CHL 
(para microorganismos obtenidos en MRS). 
Bacterias Ácido Lácticas 
Microorganismo Procedencia 
Lactococcus lactis ssp. lactis Heces bovinas 
Lactobacillus pentosus Heces bovinas 
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces avícolas 
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces bovinas 
Lactobacillus brevis Heces bovinas 
Lactobacillus pentosus Heces avícolas 
Lactobacillus pentosus Heces avícolas 
Lactococcus lactis ssp. lactis Heces caninas 
Lactococcus lactis ssp. lactis Heces bovinas 
Lactococcus lactis ssp. lactis Heces bovinas 
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces porcícolas 
Lactobacillus rhamnosus Heces porcícolas 
Lactobacillus rhamnosus Heces bovinas 
Lactobacillus rhamnosus Heces bovinas 
Lactobacillus pentosus Heces bovinas 
Lactobacillus rhamnosus Heces avícolas 
Lactobacillus rhamnosus Heces caninas 
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces porcícolas 
Lactococcus lactis ssp. lactis Heces porcícolas 
Lactobacillus rhamnosus Heces bovinas 
Lactobacillus pentosus Heces bovinas 
Lactobacillus pentosus Heces avícolas 
Lactobacillus rhamnosus Heces avícolas 
Lactobacillus rhamnosus Heces caninas 
Lactobacillus pentosus Heces porcícolas 
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei Heces avícolas 
Bacilos esporulados 
Microorganismo Procedencia 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces bovinas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas 
Bacillus pumilus Heces porcícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas 
Tabla IV: Resultados obtenidos de identificaciones mediante la técnica API 
50CHB® (para microorganismos obtenidos en Plate Count). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla V: Resultados de las identificaciones bioquímicas mediante el uso de la técnica API 20C 
AUX® (para levaduras obtenidas en YGC). Fuente: Elaboración propia 
 
 
 
 
 
 
 
Fuente: Elaboración propia 
 
En las figuras IX, X y XI se resume las identificaciones obtenidas por las diferentes pruebas API®, 
diferenciando entre tipo de microorganismo obtenido (según el medio de cultivo utilizado para su 
aislamiento). 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces avícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces bovinas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces bovinas 
Bacillus pumilus Heces porcícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas 
Bacillus pumilus Heces porcícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces bovinas 
Bacillus megaterium Heces porcícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas 
Bacillus pumilus Heces porcícolas 
Bacillus licheniformis Heces porcícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas 
Bacillus licheniformis Heces porcícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas 
Bacillus subtilis / amyloliquefaciens Heces porcícolas 
Bacillus pumilus Heces porcícolas 
Levaduras 
Microorganismo Procedencia 
Candida zeylanoides Heces porcícolas 
Candida dubliniensis Heces porcícolas 
Kloeckera sp. Heces bovinas 
Candida rugosa Heces bovinas 
Cryptococcus terreus Heces porcícolas 
Candida parapsilosis Heces Avícola 
Geotrichum sp. Heces porcícolas 
 
Figura IX: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 
50CHL® (para bacterias obtenidas en MRS). Fuente: Elaboración propia. 
 
Figura X: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 
50CHB® (para bacterias esporuladas obtenidas en Plate Count). Fuente: Elaboración propia 
0 
12 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
N
ú
m
er
o
 d
e 
ce
p
a
s 
Microorganismos 
Bácterias Ácido Lácticas identificadas 
Lactobacillus rhamnosus 
Lactobacillus pentosus 
Lactococcus lactis ssp. lactis 
Lactobacillus paracasei ssp. 
paracasei 
Lactobacillus brevis 
0 
2 
4 
6 
8 
10 
12 
14 
16 
18 
20 
N
ú
m
er
o
 d
e 
ce
p
a
s 
Microorganismos 
Bacterias esporuladas identificadas 
Bacillus subtilis / 
amyloliquefaciens 
Bacillus pumilus 
Bacillus licheniformis 
Bacillus megaterium 
 
Figura XI: Nombre y cantidad de microorganismos identificados mediante el uso de la técnica API 
20C AUX® (para levaduras obtenidas en YGC). Fuente: Elaboración propia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0 
0.2 
0.4 
0.6 
0.8 
1 
1.2 
N
ú
m
er
o
 d
e 
ce
p
a
s 
Microorganismos 
Levaduras identificadas 
Candida parapsilosis 
C. rugosa 
C. dubliniensis 
C. zeylanoides 
Kloeckera sp. 
Geotrichum sp. 
Cryptococcus terreus 
8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 
En cuanto a la prueba de crecimiento de microorganismos obtenidos en el medio de cultivo MRS 
bajo las diferentes condiciones de oxígeno (aerobiosis y microaerofilia), se encontró que los 
recuentos fueron muy parejos y las características microscópicas y macroscópicas fueron muy 
similares (resultados no escritos). Las bacterias Ácido Lácticas son generalmente anaeróbicas 
facultativas o microaerofílicas, lo que les permite crecer tanto en condiciones de anoxia o en la 
presencia de oxígeno (8, 14, 15). Por esta razón se decidió continuar el estudio en condiciones 
aeróbicas para todos los muestreos. Diversos autores han trabajado en condiciones de 
anaerobiosis estrictas para el aislamiento de este tipo de microorganismos; esto puede ser una de 
las razones que expliquen que la diversidad microbiana encontrada fue diferente de la que se halló 
en este estudio, además de la diversidad microbiana atribuida a geografía y/o alimentación del 
animal huésped (4, 5, 12, 16). 
Los recuentos encontrados para las muestras sembradas en MRS de este estudio (7 – 9 unidades 
logarítmicas) son similares a las reportadas en bibliografía (12, 14, 16, 17), lo cual indica una 
metodología de siembras apropiadas (Tabla 1 y 2). 
Ningún medio de cultivo utilizado en este estudio fue selectivo para microorganismos probióticos; 
se usaron medios de cultivo referenciados en bibliografía (8, 14, 15) para el aislamiento de 
microorganismos con capacidades de probiosis presuntivas a partir de las muestras procesadas. 
Por esta razón es que se encontraron una gran variedad de morfologías tanto microscópicas como 
macroscópicas (morfologías macroscópicas no tabuladas). El medio MRS es un medio enriquecido 
que favorece el crecimiento de bacterias Ácido Lácticas, pero no tiene inhibidores de flora 
acompañante, el medio Plate Count es un medio enriquecido, sin embargo, el tratamiento térmico 
dado a las muestras sembradas en este medio, limita (hasta cierto punto) el crecimiento de 
microorganismos no termoresistentes; B. subtilis (microorganismo de interés) es un 
microorganismo capaz de tolerar temperaturas elevadas (como a la cual fue expuesto) gracias a su 
característica de ser una bacteria esporulada. El medio YGC tiene 0.1 g/L de cloranfenicol, que 
ayuda a eliminar la flora acompañante de bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas, 
pues este se une a la subunidad 50s del ribosoma bacteriano impidiendo así la síntesis proteica 
(18). De esta manera se logran obtener principalmente hongos levaduriformes en el medio. Como 
fue mencionado anteriormente, el criterio de selección inicial para la purificación de 
microorganismos fue su morfología microscópica y la reacción en su pared celular ante los 
colorantes de Gram. 
Bajo el contexto explicado de los medios de cultivo utilizados para el procesamiento de las 
muestras, se entiende la razón por la cual las morfologías microscópicas que presentaron los 
microorganismos crecidos en los nuestros fueron tan diversas. Con lo anterior mencionado, cabe 
resaltar de nuevo que los microorganismos de interés para este estudio tenían características 
específicas microscópicas (colonias crecidas en MRS: cocos o bacilos Gram positivos; Plate Count: 
bacilos Gram Positivos esporulados y YGC: levaduras ligeramente ovoides de gemación única). 
Estas características fueron el criterio de selección para la purificación de los mismos. 
Las identificaciones de los microorganismos aislados mediante las pruebas bioquímicas se 
muestran en la tabla 4. Se identificaron un total de 60 microorganismos: 26 a partir de bacterias 
aisladas del medio de cultivo MRS, 27 a partir de bacterias aisladas del medio de cultivo Plate 
Count (muestras con tratamiento térmico) y 7 levaduras a partir del medio de cultivo YGC. 
A partir de las colonias obtenidas en el procesamiento de todas las muestras en el medio de 
cultivo MRS, se obtuvieron un total de 26 microorganismos: 5 cepas de Lactococcus lactis ssp. 
Lactis: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas y 1 una de heces caninas; 8 cepas de Lactobacillus 
rhamnosus: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas, 2 de heces caninas y 2 de heces avícolas; 5 
cepas de L. paracasei ssp. paracasei: 1 de heces bovinas, 3 de heces porcícolas y 1 de heces 
avícolas; 7 cepas de L. pentosus: 3 de heces bovinas, 1 de heces porcícolas y 3 de heces avícolas; y 
1 cepa de L. brevis a partir de heces bovinas. En su mayoría, los perfiles bioquímicos de las aquellas 
cepas encontradas, fueron diferentes, incluyendo aquellas que arrojaron la misma identificación 
(resultados no mostrados). 
Diversos autores han realizado trabajos con estas cepas, tanto en el campo de probióticos, como 
en alimentos como quesos madurados, procesos de extracción, purificación, identificación y 
evaluación de bacteriocinas y extracción de proteinasas (15 - 17, 19 - 23). 
Para que un microorganismo se considere probiótico a escala in vitro debe cumplir ciertas 
características que se evalúan mediante pruebas de laboratorio entre las cuales están: tolerancia a 
sales biliares que son moléculas anfipáticas que emulsifican grasas y de esta manera alteran la 
tensión superficial, en especial la de las paredes celulares de bacterias (24), dada por la actividad 
bilis hidrolasa que detoxifica la acción de las sales biliares y aumenta la supervivencia y 
persistencia intestinal (16). Deben ser capaces de tolerar pHs bajos y concentraciones de jugos 
gástricos para también asegurar su transición del estomago al intestino y una vez se encuentre en 
el intestino, tenga la capacidad de adherirse a las células epiteliales (14, 15). 
De los microorganismos identificados, quizá el más estudiado para aplicaciones probióticas es L. 
rhamnosus (19), además de ser uno de los cuatro Lactobacilos autorizados en la legislación 
europea (Directive 70/524/EEC, JLO 297:15/11/2001) (25). Guo y colaboradores en su estudio del 
2010 mostraron que de las cepas aisladas a partir de heces porcícolas, aquellas que obtuvieron 
mejores resultados en cuanto a características probióticas in vitro fueron las identificadas como L. 
rhamnosus (identificada mediante API 50CHL y corroboradas secuenciando la subunidad 16s 
ribosomal) obteniendo tolerancias a concentraciones de sales biliares de 0.3 y 1.0 % (m/v), 
supervivencia a pH de 2 durante 3 horas (sin disminución de unidad logarítmica poblacional) (16). 
Bernardeau y colaboradores en su estudio del 2002 también concluyeron que esta bacteria (L. 
rhamnosus) tenía un gran potencial probiótico, sin embargo, abordado desde otro ángulo: “Las 
cepas L. MA27/6B y MA27/6R (dos cepas de L. rhamnosus) son no patógenas y seguras para el 
consumo animal y tienen un efecto benéfico sobre el crecimiento en ratones (17, 26). 
Los autores mencionados concluyen que estos microorganismos tienen diversas aplicaciones como 
su uso en la industria porcícola como aditivos en la alimentación del animal, por sus toleranciasa 
factores adversos encontrados en el tracto gastrointestinal y actividad antimicrobiana (16). Otros 
sugieren profundización en estudios, en cuanto a consorcios y pruebas in vivo por los resultados in 
vitro obenidos (17) y no sólo se demostró la bioseguridad en cuanto al consumo de éstos 
microorganismos usando ratones, sino también la mejora en el crecimiento (26). 
Otro de los microorganismos identificados en este estudio que está actualmente siendo objeto de 
estudio para aplicaciones probióticas es Lactobacillus brevis. Entre las características probióticas 
demostradas para este microorganismo están la adherencia fuerte a células Henle o Caco-2 (lo que 
permite inferir que podrían adherirse al intestino del huésped), viabilidad estable a pH de 4, 
tolerancia a concentraciones de sales biliares de 1.0 % (m/v) en un periodo de 4 horas y actividad 
antimicrobiana efectiva contra patógenos como Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida 
albicans (27, 28). Además de estas características, existe una cepa de este microorganismo en la 
lista GRAS (generalmente reconocido como seguro): L. brevis KB290 (de la International Patent 
Organism Despositary Accession Number, FERM BP-4693) lo cual incrementa el interés por 
implementar este microorganismo en dietas (29). 
Lactobacillus paracasei ssp. paracasei ha sido estudiado por autores como Maragkoudakis y 
colaboradores en el 2006 encontrando que de 29 cepas de Lactobacilos aisladas en investigación, 
una sub especie de este microorganismo se destacó frente a los demás en cuanto a las pruebas 
probióticas in vitro, como tolerancia a pHs de 1 y 2 , teniendo una ligera disminución poblacional, 
no obstante dicha disminución fue menor con respecto a los demás microorganismos evaluados 
(entre los cuales estaban varias cepas de L. acidophilus y L. plantarum), tolerancia a pepsina 
(componente de sales biliares) a pH 2, inmunomodulación (estimulación de producción de 
interluquinas 10 y 12, TNFα e interferón γ) e inhibición destacada contra patógenos entéricos 
como E. coli y Salmonella sp. (17). 
Por otro lado, Lactococcus lactis ssp. lactis ha tenido un enfoque de estudio diferente al campo 
probiótico. Este microorganismo ha tenido aplicaciones en la industria de alimentos para la 
maduración de quesos y extracción de proteinasas específicas de cisteína para el mejoramiento de 
textura y sabor de quesos duros y semi-duros (22, 30). Sin embargo, una aplicación interesante en 
el campo de antimicrobianos, más específicamente, las bacteriocinas. Estos compuestos han sido 
definidos como proteínas o complejos proteicos antagónicos a bacterias estrechamente 
relacionadas genéticamente al organismo productor. Investigadores han reconocido a L. lactis ssp. 
lactis como productor de nisina Z (bacteriocina). Rilla y colaboradores (2003) evaluaron la 
capacidad de éste microorganismo para inhibir al patógeno Clostridium tyrobutyricum. Los autores 
señalan que la inhibición se debe gracias a la bacteriocina producida puesto que evaluaron tanto el 
extracto crudo de la bacteria sembrada en pozos en agar con C. tyrobutyricum como la bacterias 
enfrentadas en queso evaluando la viabilidad de cada microorganismo (23). 
Además de L. lactis ssp. lactis, la bacteria Lactobacillus pentosus también se le ha atribuido la 
producción de bacteriocinas. Liv en su estudio sobre bacteriocinas (2008) y Delgado en su estudio 
del aislamiento de L. pentosus a partir de aceitunas (2007) concluyeron que este microorganismo 
es el responsable de la producción de la bacteriocina capaz de inhibir un amplio espectro de 
bacterias como Listeria monocytogenes, L. ivanovii, L. inocua, E. coli, Staphylococcus aureus y 
Bacillus cereus (6, 22). 
En el caso de las bacterias aisladas en el medio de cultivo Plate Count, se obtuvieron un total de 27 
bacterias: 19 cepas de Bacillus subtilis/amyloliquefaciens (las pruebas bioquímicas no diferencian 
estas dos especies) provenientes de: 4 de heces bovinas, 9 de heces porcícolas y 4 de heces 
avícolas; 5 cepas de B. pumilus todas aisladas a partir de muestras de heces porcícolas; 2 cepas de 
B. licheniformis a partir de heces porcícolas y 1 de B. megaterium de heces porcícolas (tabla 4). 
Para diferenciar entre la identificación de B. subtilis/amyloliquefaciens con precisión, se sugieren 
pruebas moleculares como secuenciación de la subunidad 16S del mRNA. 
Las especies de Bacillus han sido usados como suplementos alimentarios hace más de 50 años con 
el producto italiano Enterogermina® (31). Entre las especies más estudiadas están B. subtilis, B. 
clausii, B. coagulans y B. licheniformis (32 - 34). Las esporas de estos bacilos le otorgan una ventaja 
sobre las bacterias Ácido Lácticas por su estructura de resistencia, pues ayuda la supervivencia en 
el tracto gastrointestinal confiriéndole tolerancias a pH bajos y tensores como las sales biliares. 
Esta estructura también otorga un interés comercial, pues una vez el preparado haya sido 
desecado no hay pérdidas de viabilidad aun si se almacena en temperatura ambiente, ahorrando 
costos de refrigeración que pueden tener los demás biopreparados (31). 
Algunos de los productos más comercializados que contienen esporas de B. subtilis son: Bio-Kult®, 
biopreparado comercializado en el Reino Unido, Biosporin® de Ucrania, Medilac-Vita® de China y 
Primal Defense de los Estados Unidos (31). 
En Japón se comercializa un producto de la fermentación de soja conocida como Natto. Este 
alimentos se ha caracterizado por tener esporas viables de una cepa de B. subtilis con la que se 
han realizado estudios revelando que tiene la capacidad de reducir la coagulación de la sangre por 
fibrilosis causada por la secreción de la enzima Natoquinasa (enzima reconocida como GRAS en los 
Estados Unidos) (35). 
Para la agricultura, este microorganismo está teniendo gran auge pues se ha demostrado que 
reduce la infección en cerdos y aves de Salmonella enterica, Clostridium perfringes y E. coli 
078:K80 por competencia de espacio y nutrientes (36, 37), además de producir Amicoumacina, un 
antibiótico con actividad demostrada in vitro contra el patógeno tropical Helicobacter pylori (38). 
Por otro lado, se ha cuestionado mucho la capacidad de estos microorganismos de ser probióticos, 
puesto que se conoce que en ciertas bacterias, la espora es un factor de patogenicidad como en 
especias de Clostridium. Especies de Bacillus como las aisladas en este estudio (B. licheniformis y B. 
pumilus) han tenido recientes estudios en cuanto a su toxicidad en la veterinaria. Nieminen y 
colaboradores (2007) encontraron 4 bacterias que pertenecían a las especias de B. pumilus y B. 
licheniformis produjeron toxinas termo estables no proteicas en la leche bovina. Mencionaron que 
las cepas de B. licheniformis eran similares genéticamente (en genes codificando para la 
producción de toxinas) a B. cereus productor de toxina entérica termo estable causante de 
diarreas y vómitos (39, 40). 
Sin embargo, no todas las bacterias esporuladas aisladas en este estudio diferentes de B. subtilis 
son reportados como patógenos; B. megaterium tiene aplicaciones agrícolas de gran interés 
diferentes de probiosis. Padgham y Sikora en el 2007, Kildea y colaboradores en el 2008 y Kong y 
colaboradores en el 2010 han demostrado que este microorganismo puede ser usado como 
biocontrolador en diferentes cultivos contra fitopatógenos. Padgam y Sikora encontraron que B. 
megaterium tiene actividad antagónica contra Meloidogyme gramicola, nematodo que afecta 
cultivos de arroz aerobios (no inundados), reduciendo la atracción del nematodo a penetrar las 
raíces del cultivo previniendo así la infección (41). Kildea y colaboradores revelaron que B. 
megaterium también puede ser usado para reducir la enfermedad del trigo conocida como 
Septoriosis que evidenciada por manchas en el área foliar. En el estudio mostraron como la 
mancha foliar se reducía inoculandoal bacilo Esporulado en plantas infectadas con el fitopatógeno 
Mycosphaerella graminícola (42). En China, Kong y colaboradores (2010) mostraron que otro 
fitopatógeno (Aspergillus flavus) se veía inhibido tanto in vitro como in vivo por B. megaterium 
reduciendo la incidencia de la enfermedad causada por A. flavus en los granos de maní (43). 
En cuanto a levaduras, el microorganismo objetivo eran especies de Saccharomyces, más 
específicamente S. boulardii o Saccharomyces cerevisiae. Por el contrario, sólo se identificaron 
levaduras de los géneros Candida, Geotrichum, Kloeckera y Cryptococcus. Esto se debe 
principalmente a que las levaduras no son microorganismos propios del intestino animal, sino que 
generalmente su presencia es transitoria dependiendo de la dieta suministrada. 
Ninguna de las cepas identificadas en este estudio ha tenido reportes de capacidad o aplicabilidad 
probiótica. La gran mayoría son objeto de estudio clínico, pues se consideran patógenos, o 
patógenos oportunistas (44, 45). 
Candida dubliniensis ha sido asociada a estomatitis protésica (proceso inflamatorio de la mucosa 
oral asociada a especies de Candida) junto con C. albicans (44). C. parapsilosis es la segunda 
levadura más comúnmente aislada en muestras de sangre en hospitales de Estados Unidos, 
Canadá y América Latina. A pesar de su baja patogenicidad, este microorganismo tiene capacidad 
de destrucción de tejidos epidérmicos y orales (45). 
Otros géneros de levaduras también considerados patógenos aislados e identificados en este 
estudio son Geotrichum y Cryptococcus. El primero está asociado a infecciones sistémicas que 
resultan graves especialmente para la población inmunosuprimida con una tasa de mortalidad 
entre el 60 y el 80% de la población infectada en condiciones de baja inmunidad. Cryptococcus es 
una levadura encapsulada sin discriminación en huéspedes de infección (40). 
Kloeckera es junto con Saccharomyces cerevisiae la levadura que se encuentra más 
frecuentemente en los mostos para la producción del vino. Está relacionada con fermentaciones 
no deseables en la bebida alcohólica puesto que produce muchos ácidos volátiles (46). 
Por otro lado, ciertas levaduras aisladas en este estudio tienen aplicación industrial como es el 
caso de Candida rugosa. Domínguez de María y colaboradores (2006) publicaron un reporte en 
cuanto a las lipasas producidas por esta levadura. Estas lipasas han sido ampliamente usadas en 
tecnologías de fermentaciones, ensayos biocatalíticos, detergentes y solventes (47). 
Levaduras ampliamente reportadas en el campo probiótico son Saccharomyces cerevisiae y S. 
boulardii. Ortiz y Reuto en su estudio del 2007 mostraron mediante la evaluación in vitro de S. 
cerevisiae su capacidad de tolerancia a sales biliares desde 0.5% hasta 3.0%, estabilidad ante 
enfrentamiento a jugos gástricos, reducción de 54% de colesterol en 12 horas y adherencia celular 
con la línea celular Caco-2 (48). 
De manera similar, Le Bon y colaboradores en el 2010 investigaron la influencia de S. cerevisiae 
ssp. boulardii en la salud intestinal de cerdos de edad temprana enfocado a los valores de 
producción animal en cuanto al destete del cerdo. Encontraron que la adición de este 
microorganismo en la dieta del animal beneficia a la flora de las bacterias Ácido Lácticas y reduce 
la población de E. coli (49). 
 
 
9. CONCLUSIONES 
 Las muestras procesadas presentaron una alta carga microbiana, especialmente la 
evidenciada en el medio de cultivo MRS (entre 104 y 108 UFC/mL) mostrando un amplio 
potencial para el trabajo con estos microorganismos hacia el beneficio de la industria 
agropecuaria. 
 Se aislaron bacterias Ácido Lácticas reportadas con capacidad probiótica (8 Lactobacillus 
rhamnosus, 7 Lactobacillus pentosus, 5 Lactococcus lactis ssp. lactis y 5 Lactobacillus 
paracasei ssp. paracasei) 
 Se aislaron bacterias Esporuladas reportadas con capacidad probiótica (19 Bacillus subtilis 
/ amyloliquefaciens) 
 No se hallaron géneros de levaduras reportadas como probióticas. 
 
 
10. RECOMENDACIONES 
 
 Para dar continuación al proyecto se sugieren pruebas de capacidad probiótica in vitro 
como adhesión celular, producción de bacteriocinas, tolerancia a pH, tolerancia a sales 
biliares, tolerancia a jugos gástricos, reducción de colesterol y antagonismo contra 
patógenos. 
 Con el fin de tener una mayor precisión en cuanto a la identificación de los 
microorganismos, se sugiere la secuenciación de la subunidad 16s del RNA. 
 Si se desea obtener una variedad mayor de bacterias Ácido Lácticas se sugiere el uso de 
cámaras de anaerobiosis para el aislamiento de microorganismos con el fin de obtener 
aquellos que sean anaerobios estrictos. 
 
 
 
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11. ANEXOS 
Anexo 1: 
 
Tabla VI: Resultados de recuento en placa de las muestras analizadas. M(#): Muestra. Fuente: 
Elaboración propia 
Muestr
a 
 
MRS Plate Count YGC 
M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5 M1 M2 M3 M4 M5 
Heces 
avícolas 
1 
5,2E
7 
8,2E
7 
9,8E
6 
2,1E
7 
4,8E
7 
5,2E
3 
1,8E
3 
8,0E
3 
7,9E
2 
2,7E
3 
4,7E
5 
5,8E
5 
2,7E
5 
5,1E
6 
8,6E
5 
Heces 
avícolas 
2 
3,9E
7 
4,9E
8 
1,1E
8 
2,5E
8 
4,3E
7 
4,5E
4 
5,9E
4 
6,2E
3 
5,2E
4 
8,2E
3 
2,9E
5 
9,6E
4 
5,6E
4 
4,9E
5 
6,6E
5 
Heces 
porcícol
as 1 
2,2E
9 
5,8E
8 
2,9E
8 
6,9E
9 
4,1E
9 
5,9E
5 
4,1E
3 
8,6E
5 
3,2E
4 
4,8E
3 
8,5E
6 
6,0E
5 
1,9E
6 
9,2E
5 
9,8E
6 
Heces 
porcícol
as 2 
8,9E
8 
4,6E
8 
2,9E
9 
5,5E
8 
1,2E
9 
2,5E
3 
6,5E
4 
2,4E
4 
5,8E
3 
3,0E
4 
2,8E
7 
4,5E
7 
9,2E
7 
5,0E
6 
4,7E
7 
Heces 
caninas 
6,9E
5 
1,6E
4 
1,6E
6 
4,1E
5 
2,0E
6 
<1,0
E1 
<1,0
E1 
<1,0
E1 
<1,0
E1 
<1,0
E1 
<1,0
E1 
<1,0
E1 
<1,0
E1 
<1,0
E1 
<1,0
E1 
Heces 
bovinas 
1 
9,0E
5 
9,6E
6 
1,1E
7 
2,9E
6 
6,3E
9 
1,2E
6 
7,0E
4 
8,9E
4 
3,8E
5 
3,2E
5 
4,0E
4 
6,2E
3 
7,4E
3 
2,0E
4 
7,7E
3 
Heces 
bovinas 
2 
1,3E
8 
5,5E
7 
5,1E
7 
1,3E
8 
4,4E
7 
1,2E
6 
7,1E
4 
4,9E
5 
1,3E
5 
3,2E
5 
4,0E
3 
1,2E
4 
2,1E
4 
5,6E
4 
2,2E
3 
 
 
 
 
 
 
 
Anexo 2 
Tabla VII: Ejemplos de criterios de selección según morfologías y coloraciones de Gram para la 
purificacion de microorganismos obtenidos en los muetreos. 
Tipo de microorganismo Morfología 
Bacteria Ácido Láctica 
 
Bacilo Gram Positivo 
 
Coco Gram Positivo 
Bacteria Esporulada 
 
Bacilo Gram Positivo con espora central 
Levadura 
 
Levadura ligeramente ovoíde de gemación única