Bioquímica - Técnicas Bioquímicas

Vista previa del material en texto

Hablemos de…
TécnicasTécnicas
BioquímicasBioquímicas
Br. Yojan Monserrat
Fraccionamiento Subcelular
Conjunto de métodos y técnicas que tienen como
objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas de un
determinado componente celular.
Etapas: 
 
• Ruptura de las células o tejidos Fracción deseada 
 
• Separación de la fracción deseada del resto de los componentes celulares 
 
1) Identificar el objetivo (célula, organela, molécula) 
 
2) Fuente Facilidad de obtención 
Abundancia del tejido en la muestra 
 
3) Definir método Condiciones (temperatura y pH) 
Homogenización
Rompimiento de las células o el tejido del cual se pretende
extraer la organela o molécula de interés. Ruptura de las
estructuras que sostienen y unen las células, además de los
mismos elementos subcelulares, liberándolos en suspensión
con el mínimo daño funcional y estructural.
Procedimientos de homogenización más comunes:
❖ Sonicación: ruptura celular mediante ultrasonido
❖ Detergentes: tensoactivos
❖ Filtro a presión
❖ Homogenizadores: por mortero o con embolo. Fuerza de
fricción
❖ Licuadoras (disruptor de cuchillas de alta velocidad)
Centrifugación: Conceptos
Imprime un movimiento rotatorio con una fuerza
mayor a la fuerza de gravedad, provocando la
sedimentación de las partículas más densas.
❖ Fuerza centrífuga: fuerza que genera el eje
❖ Fuerza de resistencia del medio líquido a ser
desplazado por la partícula: densidad del líquido
❖ Fuerza de fricción de la partícula con el medio liquido
al moverse: depende de la velocidad y forma del
cuerpo y de las propiedades del líquido.
𝑭𝒏 = 𝑭𝒄 – 𝑭𝒓 – 𝑭𝒇
Centrifugación: Conceptos
Coeficiente de Sedimentación: Velocidad a la que se desplaza una partícula en
el campo centrífugo.
❖ Rotor basculante: se mueve la muestra.
❖ Rotor fijo: posee cavidades para las muestras.
Centrifugación diferencial: Separación por
peso mediante ciclos cortos de velocidad.
Centrifugación por gradiente de densidad:
Separa sólidos de líquidos de diferente
densidad mediante una fuerza centrífuga, la
cual es impartida por una maquina centrifuga
o centrifugadora.
Cromatografía
Proceso que se caracteriza por el paso uniforme de una mezcla
diluida (fase móvil) a través de otra sustancia relativamente
inmovilizada (fase estacionaria). Se utiliza para separar proteínas o
moléculas pequeñas, mas no células.
• Diferencia de carga.
• Tamaño.
• Afinidad de unión.
• Fase móvil: líquido o gas que es arrastrado a
través de la fase estacionaria.
• Fase estacionaria (FE): solido o liquido fijado a
un sólido por el cual pasa la fase móvil.
Tipos de Cromatografía
1. Muestra depositada sobre el lecho cromatográfico.
2. Muestra penetra en el lecho.
3. Se añade fase móvil.
4. Comienza la separación de los componentes de la
muestra.
5. Eluye el primer componente.
6. Eluye el segundo componente.
PLANA EN COLUMNA
❑ En papel
❑ En capa fina
❑ Intercambio iónico.
❑ Por afinidad.
❑ Por exclusión 
molecular.
Intercambio Iónico
Aprovecha las diferencias en el signo y la magnitud de las
cargas eléctricas netas de las proteínas a un pH
determinado. las resinas cargadas negativamente fijan
fuertemente los cationes y se denominan resinas de
intercambio catiónico, mientras que las resinas cargadas
positivamente fijan fuertemente los aniones y se
denominan resinas de intercambio aniónico.
✓ Intercambio catiónico: resina negativa
✓ Intercambio aniónico: resina positiva
Afinidad
Separa las proteínas según su especificidad de
unión. Utiliza una resina (FE) que tenga un grupo
específico (prostético). Una proteína afín a este
grupo específico se unirá a él, lo que retardará la
migración.
F.E: soporte inerte (microesferas de vidrio o plástico,
gel de agarosa) al que se une covalentemente el ligando de
afinidad.
✓ Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor
de una enzima, anticuerpo, antígeno, hapteno,
sustancia transportada, hormona, oligosacáridos,
lectinas (proteínas con afinidad por oligosacáridos).
Exclusión Molecular
Separa las proteínas según su tamaño. La matriz
de la columna (FE) está formada por un polímero
entrecruzado con poros de tamaños
determinados para el paso de moléculas
pequeñas.
Las proteínas pequeñas, se retrasan al
atravesar los poros y su marcha a lo largo de
la columna será más lenta. Como
consecuencia, las moléculas de mayor peso
molecular son eluidas antes que las de
menor peso molecular.
Electroforesis
Es una técnica para la separación de moléculas
que consiste en el desplazamiento proporcional
de moléculas cargadas a través de un campo
eléctrico. La electroforesis es muy útil como
método analítico.
Permite la determinación de propiedades
importantes de una proteína tales como su
punto isoeléctrico y su masa molecular
aproximada Pero los métodos electroforéticos
pueden afectar la estructura (y por tanto, la
función) de las proteínas.
Tipos de Electroforesis
TIPOS DEFINICIÓN
Gel de Poliacrilamida Separa a las proteínas según su peso molecular.
Gel SDS Page
Las muestras se desnaturalizan en presencia de
agentes desnaturalizantes (beta- mercaptoetanol, que
destruye los puentes disulfuro, SDS (dodecilsulfato
sódico) que desnaturaliza y recubre a la proteína).
Gel de Agarosa
Solo para ácidos nucléicos de bajo peso molecular. Los
ácidos nucléicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza
carga negativa.
Isoelectroenfoque
Procedimiento usado para determinar el pI de una 
proteína. 
Bidimensional
Consiste en realizar dos separaciones electroforéticas
consecutivas del mismo espécimen en dos direcciones
distintas
Espectrofotometría
Técnica analítica que permite determinar la concentración
de un compuesto en solución aprovechando su capacidad
de absorber la luz. Las moléculas pueden absorber energía
luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto
permite poner en funcionamiento ciclos vitales (como la
fotosíntesis en plantas y bacterias).
Cuando la luz (considerada como energía)
es absorbida por una molécula, se origina
un salto desde un estado energético basal
o fundamental (E1) a un estado de mayor
energía (estado excitado o E2).
Elementos de la 
Espectrofotometría
❖ Transmitancia: fracción de potencia de
luz que es transmitida por la cubeta una
vez que el analito ha experimentado el
proceso de absorción.
❖ Absorbancia: cantidad de potencia
radiativa absorbida por el analito presente
en la cubeta una vez que ha
experimentado el proceso de absorción.
Elementos de la 
Espectrofotometría
❑ Ley de Beer: la cantidad de luz absorbida
por un cuerpo depende de la
concentración en la solución.
❑ Ley de Lambert: la cantidad de luz
absorbida por un cuerpo depende de la
distancia recorrida por la luz.
El fundamento del Espectrofotometría está basado en la Ley de Lambert-Beer,
que relaciona la intensidad de luz incidente y la de la luz transmitida, cuando es
atravesada una longitud de onda de un medio que absorbe
Gracias por su Atención
Recuerden dejar sus dudas, pregunten lo que gusten
	Diapositiva 1
	Diapositiva 2
	Diapositiva 3
	Diapositiva 4
	Diapositiva 5
	Diapositiva 6
	Diapositiva 7
	Diapositiva 8
	Diapositiva 9
	Diapositiva 10
	Diapositiva 11
	Diapositiva 12
	Diapositiva 13
	Diapositiva 14
	Diapositiva 15
	Diapositiva 16
	Diapositiva 17