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EVALUACIÓN DEL EFECTO LARVICIDA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE Zingiber officinale (jengibre) SOBRE LARVAS DE CUARTO ESTADIO DE Aedes aegypti EN CONDICIONES DE LABORATORIO. MARÍA CAMILA BAQUERO HUÉRFANO CLAUDIA GEOVANNA MESA ALBARRACÍN UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES TECNOLOGÍA EN SANEAMIENTO AMBIENTAL BOGOTÁ D.C 2018 EVALUACIÓN DEL EXTRACTO DE LARVICIDA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE Zingiber officinale (jengibre) SOBRE LARVAS DE CUARTO ESTADIO DE Aedes aegypti EN CONDICIONES DE LABORATORIO. CLAUDIA GEOVANNA MESA ALBARRACÍN 20142085074 MARÍA CAMILA BAQUERO HUÉRFANO 20151085034 TRABAJO DE GRADO EN MODALIDAD DE INVESTIGACIÓN PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE TECNÓLOGAS EN SANEAMIENTO AMBIENTAL. DIEGO TOMAS CORRADINE MORA Médico Veterinario – MSc. Salud Pública Director UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES TECNOLOGÍA EN SANEAMIENTO AMBIENTAL BOGOTÁ D.C. 2018 Nota de aceptación: ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________ ______________________________ Firma del director ______________________________ Firma del jurado. Bogotá D.C. 2018 DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS Y entonces, observamos paso por paso lo realizado en años anteriores hasta llegar al día de hoy y vemos que todo el esfuerzo, sacrificio, dedicación, dolores, días sin dormir y sin descansar, valieron toda la pena del mundo por el gran logro que hoy hemos culminado y que tan sólo es uno de los tantos grandes éxitos que nos esperan. Esta investigación es dedicada indudable y principalmente a nuestras familias, primordialmente a nuestros padres y hermanas que, sin su apoyo, amor, paciencia, cariño, siempre siendo incondicionales; no hubiéramos podido culminar esta meta. A nuestros padres Cilia, Jhon, Juan Manuel y Luvia; a nuestras hermanas Luisa y Magaly; a nuestros gatos Luna y Marox; que son nuestro motor y guía, a todos ellos les queremos decir de todo corazón GRACIAS TOTALES. También queremos dedicar y agradecer infinitamente al profesor y nuestro director DIEGO TOMÁS CORRADINE MORA por su eterna paciencia, por brindarnos siempre todo su conocimiento y sabiduría, igualmente a la UNIVERSIDAD FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS por brindarnos los espacios e implementos para la realización de esta investigación. A todos los profesores que compartieron su conocimiento, enseñanzas y que hicieron parte de nosotras a lo largo de nuestra carrera. A nuestros compañeros, amigos y a cada una de las personas que de alguna u otra manera nos aportaron su granito de arena e hicieron que esto fuera posible. TABLA DE CONTENIDO RESUMEN................................................................................................................................ 8 ABSTRACT .............................................................................................................................. 9 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 10 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 12 2.1 Objetivo general ....................................................................................................................................................12 2.2 Objetivos específicos ..........................................................................................................................................12 3. MARCO TEÓRICO .......................................................................................................... 13 3.1 Mosquito Aedes aegypti .....................................................................................................................................13 3.1.1 Ciclo vital ............................................................................................................................................................13 Huevo ................................................................................................................................................................13 Larva .................................................................................................................................................................13 Pupa ...................................................................................................................................................................14 Adulto ...............................................................................................................................................................15 3.1.2 Distribución Geográfica del Mosquito Aedes aegypti ...........................................................................16 3.1.3 Distribución de Aedes aegypti en Colombia ............................................................................................16 3.1.4 Acción patógena ................................................................................................................................................16 Dengue ..............................................................................................................................................................16 Fiebre Amarilla ..............................................................................................................................................17 Chikungunya ...................................................................................................................................................17 3.1.5 Clases de control ...............................................................................................................................................18 Control químico .............................................................................................................................................18 Control integrado ..........................................................................................................................................19 Control Biológico ..........................................................................................................................................19 3.2 Zingiber officinale (Roscoe) .............................................................................................................................19 3.2.1 Taxonomía ..........................................................................................................................................................19 3.2.2 Descripción anatómica ....................................................................................................................................20 3.2.3 Principios activos ..............................................................................................................................................20 3.2.3 Antecedentes ......................................................................................................................................................21 4. METODOLOGÍA .............................................................................................................. 25 5. RESULTADOS .................................................................................................................. 27 5.1 Eficiencia del extracto natural de Zingiber officinale (jengibre) como larvicidaa las diferentes concentraciones experimentales ..............................................................................................................................27 5.1.1 Análisis de mortalidades en los distintos tratamientos experimentales en relación con el tiempo de exposición ..................................................................................................................................................28 5.2 Análisis de Probit para el cálculo de las concentraciones letales CL 50 y CL 90 ...........................29 5.3. Análisis de tiempo letal TL 50 ........................................................................................................................30 5.4. Análisis estadístico (Anova) ............................................................................................................................30 6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ..................................................................................... 32 7. CONCLUSIONES.............................................................................................................. 33 8. RECOMENDACIONES ................................................................................................... 35 9. BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................ 36 TABLA DE FIGURAS Y TABLAS Figura 1. Estadio larvario del mosquito Aedes aegypti en fase IV con descripción anatómica. ............................................................................................................................... 14 Figura 2. Pupa de Aedes aegypti con descripción anatómica ............................................. 15 Fuente: Modificado de University of Florida, 2015 ............................................................ 15 Figura 3. Porcentajes de mortalidad corregidos con Abbott en vínculo con el Tiempo . 28 Figura 4. Determinación de las concentraciones letales CL 50 y CL 95 mediante la evaluación del efecto larvicida del extracto etanólico de Zingiber Officinale (Roscoe) ... 29 Figura 5. Determinación del tiempo letal CL 50 mediante la evaluación del efecto larvicida del extracto etanólico de Zingiber Officinale (Roscoe) ....................................... 30 Tabla 2. Resultados del análisis de varianza ANOVA........................................................ 31 Figura 6. Puntos de dispersión de concentración en contraste a mortalidades ANOVA 31 8 RESUMEN En búsqueda de soluciones y alternativas que no afecten el medio ambiente, se pretende encontrar la forma más efectiva para lograr un control de reproducción del mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), conociendo su importancia en la salud pública, puesto que éste es el transmisor de enfermedades como el dengue, la fiebre amarilla, el chikungunya, el zika, entre otros; en donde se evaluó la eficiencia del extracto etanólico de Zingiber officinale (Roscoe) comúnmente llamado jengibre, como larvicida en las larvas estadio IV de dicho mosquito. La investigación consistió en realizar bioensayos en condiciones de laboratorio sometiendo a las larvas estadio IV del mosquito Aedes aegypti (Linnaeus) a concentraciones de 1000, 2000, 3000, 4000 y 5000 ppm del extracto etanólico de Zingiber officinale (Roscoe). Se realizaron cuatro repeticiones y un testigo de 25 larvas cada una, procediendo a hacer lecturas de 12, 24, 48, 60 y 72 horas, con el fin de evaluar las mortalidades a las diferentes concentraciones. Los resultados obtenidos evidenciaron que el extracto puede ser utilizado como larvicida, sin embargo, la mortalidad no es alta, debido que con la concentración más alta evaluada (Concentración de 5000 ppm), al final de las 72 horas sólo se obtiene el 56% de mortalidad. Con esto se concluye que el Zingiber officinale (Roscoe) al ser probado como larvicida en laboratorio tiene una eficiencia media y de ser utilizado en pruebas de campo, seguramente no va a realizar un control eficiente en la reproducción del Aedes aegypti (Linnaeus) y así mismo, no se reducirán los casos de enfermedad por culpa de dicho mosquito. Palabras claves: Aedes aegypti, bioensayo, control biológico, larvicida, Zingiber officinale 9 ABSTRACT In search of solutions and alternatives that do not affect the environment, we intend to find the most effective way to achieve a control of Aedes aegypti (Linnaeus) mosquito reproduction, knowing its importance in public health, since this is the transmitter of diseases such as dengue, yellow fever, chikungunya, zika, among others; where the efficiency of the ethanolic extract of Zingiber officinale (Roscoe) commonly called ginger, as a larvicide in the stage IV larvae of said mosquito was evaluated. The investigation consisted of carrying out bioassays in laboratory conditions, subjecting stage IV larvae of the Aedes aegypti (Linnaeus) mosquito to concentrations of 1000, 2000, 3000, 4000 and 5000 ppm of the ethanol extract of Zingiber officinale (Roscoe). Four repetitions and a control of 25 larvae each were performed, proceeding to readings of 12, 24, 48, 60 and 72 hours, in order to evaluate the mortalities at the different concentrations. The results obtained showed that the extract can be used as a laricide, however, the mortality is not high, because with the highest concentration evaluated (Concentration of 5000 ppm), at the end of 72 hours only 56% mortality is obtained. With this it is concluded that the Zingiber officinale (Roscoe) to be tested as larvicide in laboratory has an average efficiency and to be used in field tests, surely will not perform an efficient control in the reproduction of Aedes aegypti (Linnaeus) and thus same, will not reduce cases of disease because of that mosquito. Keywords: Aedes aegypti, bioassay, biologic control, larvicide, Zingiber officinale 10 1. INTRODUCCIÓN El mosquito Aedes aegypti (Linnaeus) es originario del continente africano. Se cree que llegó al continente americano con el transporte de barriles de agua cuando se llevaron a cabo las primeras exploraciones y colonizaciones europeas. Vive en hábitats urbanos y se reproduce principalmente en recipientes artificiales que contengan agua dulce y no posea un alto grado de contaminación. Es un vector de diversas enfermedades como la fiebre amarilla, el zika, el dengue y chikungunya (Nelson, 1986). El dengue es una enfermedad que se presenta en todas las regiones tropicales y subtropicales del planeta, es un importante tema de salud pública debido a que se ha convertido en una de las causas principales de muertes y hospitalizaciones de niños en América Latina y Asia. En Colombia en el año 2017 se encontraron 17.302 casos de dengue según el Instituto Nacional de Salud (Instituto Nacional de Salud INS, 2017). El chikungunya es una enfermedad endémica del África, Sudeste de Asia y el Subcontinente de la India. En enero de 2014 la Organización Mundial de la Salud reportó los primeros casos de dicha enfermedad en América Latina y en Colombia en la semana epidemiológica 31 del año de 2016 se notificaron 777 casos (Organización Mundial de la Salud OMS, 2016). El zika fue descubierto en 1947 para un estudio de fiebre amarilla siendo una enfermedad similar al dengue. Los primeros brotes fuera de Asia o África se dieron en el año 2007 en la isla de Yap, en Micronesia. Se estima que llegó entre los años 2015 y 2016 a América Central siendo una enfermedad que no tiene vacunas ni tratamientos y su prevención consiste en la protección frente a picaduras de mosquitos. En Colombia según el Instituto Nacional de Salud se notificaron 1,617 casos en el año 2017 (INS, 2017). La fiebre amarilla es una enfermedad vírica aguda, el virus es endémico de zonas tropicales de África y AméricaLatina. Esta enfermedad se encuentra en aumento debido a la disminución de la inmunidad en la población (OMS, 2009). Siendo conveniente encontrar soluciones efectivas contra el vector y que además no resulten ser nocivos, se busca contribuir a las campañas para la prevención de los casos de incidencias de enfermedades anteriormente mencionadas en lo cual el proyecto pretende a partir de un extracto etanólico del jengibre (Zingiber officinale Roscoe), evaluar su efecto insecticida sobre las larvas de cuarto estadio del mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), partiendo de la idea de sus múltiples propiedades utilizadas en la medicina alternativa (INS, 2017). Se utilizó el extracto etanólico para diferenciar el presente trabajo de las investigaciones anteriores, Abdul, Venkatesan, Getha, & Getha, 2008 y Shabab y otros, 2015, las cuales utilizaron éter de petróleo debido a que el jengibre tiene compuestos no polares, que al ser diluidos en este medio hacen que la obtención del mismo sea más eficiente y rápida, también se justifica el uso del disolvente etanólico por sus características de adquisición y economía. 11 La importancia de la investigación se basa en realizar un adecuado control de reproducción del mosquito vector del dengue, debido que, al pasar los años y las constantes exposiciones de las larvas del mosquito a larvicidas químicos, conllevan a que éstas creen resistencia a los mismo, por lo cual se deben de buscar nuevas soluciones de larvicidas naturales o biológicos que hagan un adecuado control de larvas y así mismo la propagación del mosquito. 12 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo general Evaluar el efecto larvicida del extracto etanólico de Zingiber officinale para el control biológico de larvas de Aedes aegypti en condiciones de laboratorio. 2.2 Objetivos específicos ● Evaluar el efecto larvicida del extracto etanólico de jengibre (Zingiber officinale) a concentraciones de 1000, 2000, 3000, 4000 y 5000 ppm ● Identificar el efecto de las concentraciones letales LC 50 y LC 90 del extracto etanólico de Zingiber officinale sobre las larvas de Aedes aegypti de estadio cuatro. ● Determinar los tiempos letales TL 50 y TL 90 del extracto etanólico de Zingiber officinale, para larvas de Aedes aegypti de estadio cuatro. 13 3. MARCO TEÓRICO 3.1 Mosquito Aedes aegypti El mosquito transmisor de enfermedades como la fiebre amarilla, el chikungunya y el dengue es un Culícido, descubierto por el científico cubano Carlos Finlay, quien expuso su teoría en 1881 sobre dicha especie como vector en la Academia de Ciencias Físicas y Naturales de la Habana (García, 2004). 3.1.1 Ciclo vital Huevo El huevo del Aedes aegypti (Linnaeus) es blanco al momento de la postura, pasado el tiempo toma una coloración oscura hasta quedar negro, su forma es similar a la de un cilindro alargado con uno de los extremos redondo y el otro cónico. Algunas hembras pueden hacer posturas de hasta 200 huevos. El desarrollo embrionario generalmente es completado en 48 horas si el ambiente es húmedo y cálido, pero puede prolongarse por temperaturas bajas, incluso resisten a la desecación (Nelson, 1986). Larva Las larvas del A. aegypti (Linnaeus) son exclusivamente acuáticas, en esta fase pasan la mayor parte del tiempo alimentándose de la materia orgánica que se encuentre en el terreno de desarrollo, para esta actividad poseen cerdas bucales (Nelson, 1986). Poseen antenas cuyo tamaño se aproxima a la mitad del largo de su cabeza, su tórax y abdomen están compuestos por 9 segmentos, el segmento anal tiene 4 branquias lobuladas para la regulación osmótica y un sifón para la respiración en la superficie del agua, (ver figura 1). La posición de reposo en el agua en el estado larval es casi vertical, su desplazamiento acuático es realizado a través de un movimiento serpenteante, son fotosensibles y realizan desplazamiento al fondo del medio cuando existe alguna perturbación en éste (Nelson, 1986). El desarrollo larval está subordinado a la temperatura, la disponibilidad de alimento y la densidad de las larvas en el medio en que se encuentren. Las condiciones óptimas para el crecimiento de éstas con respecto a la temperatura, se encuentra entre los 25°C y los 29°C, por otro lado, su metamorfosis a pupa tiene una duración habitual de 5 a 7 días (Eiman, Introini, & Ripoll, 2013). 14 Figura 1. Estadio larvario del mosquito Aedes aegypti en fase IV con descripción anatómica. Fuente: Autores 1. Ojo 2. Antena 3. Cerdas bucales 4. Cabeza 5. Tórax 6. Abdomen 7. Segmentos Abdominales 8. Cabellos laterales Pupa En la fase de pupa se realiza el cambio entre larva y adulto, durante este periodo no existe alimentación, presentan reacción mediante desplazamiento a los estímulos como vibraciones y la mayor parte del tiempo permanece en la superficie. Este estado tiene un tiempo aproximado de 2 a 3 días (Nelson, 1986). La pupa presenta dos tubos respiratorios que atraviesan la superficie del agua permitiendo así su respiración. En el abdomen poseen paletas nadadoras y cerdas robustas bien desarrolladas en los vértices de los segmentos abdominales 2 a 6 (ver figura 2) (Nelson, 1986). 15 Figura 2. Pupa de Aedes aegypti con descripción anatómica Fuente: Modificado de University of Florida, 2015 1. Abdomen 2. Cefalotorax 3. Ojo 4. Tromepeta respiratoria 5. Paleta respiratoria Adulto El mosquito A. aegypti (Linnaeus) en su fase adulta es el encargado de la reproducción. Su tamaño es mediano, presenta algunos contrastes blancos en cabeza, piernas y abdomen siendo fácilmente reconocible por estas características. La probóscide es oscura, el mesonotum presenta líneas de escamas plateadas presenciando así una similitud con una lira, sus patas son oscuras con fémures y tibias revestidas de escamas claras, el abdomen posee franjas basales y manchas baso laterales a partir del segundo tergito (Becker, y otros, 2010). Los machos pueden distinguirse de las hembras por sus antenas plumosas y palpos más largos. Cuando el insecto adulto emerge se posa sobre las paredes del medio en el que se encuentre permitiendo así el endurecimiento del exoesqueleto y las alas. Después de emerger el macho puede aparearse en las 24 horas siguientes y las hembras pueden tener alimentación sanguínea; el apareamiento es realizado durante el vuelo en la mayoría de ocasiones. El propósito primordial de la alimentación sanguínea es proporcionar una fuente de proteína para el desarrollo de los huevos, esto y la postura se llevan a cabo generalmente durante las primeras horas de la mañana (Nelson, 1986). Cuando los mosquitos no están apareándose en busca de un huésped o en vuelo, buscan un sitio oscuro y tranquilo para reposar, generalmente en superficies verticales. Tienen un periodo de vida aproximado a un mes, el periodo de vida se ve afectado por las propiedades climáticas como la humedad y la temperatura, debido a que condicionan sus actividades de alimentación, reproducción y reposo. A una temperatura inferior a 4ºC o superior a 40ºC generalmente no sobreviven (Nelson, 1986). 16 3.1.2 Distribución Geográfica del Mosquito Aedes aegypti El Aedes aegypti (Linnaeus) se originó en África. En esta región se encuentran las tres formas de la especie el A. aegypti (Linnaeus), el A. aegypti queenslandensis (Mattingly) y el A. aegypti formosus (Walker), el cual es un mosquito selvático de color más oscuro y de tamaño más pequeño (Nelson, 1986). El Aedes aegypti (Linnaeus) llegó al nuevo continente en los siglos XV al XVII mediante barcos transportadores de esclavos (Rey, 2015). Se considera una especie invasora, puesto que ha colonizado exitosamente muchos sitios fuera de su lugar de origen, una de las característicasque contribuye a esto, es que los huevos se hacen más resistentes a la desecación, favoreciendo su transporte en humanos. Actualmente se encuentra en las regiones tropicales y subtropicales de América, África y Asia, así como sudeste de los EE.UU, las Islas del Océano Índico y el norte de Australia (Rey, 2015). 3.1.3 Distribución de Aedes aegypti en Colombia En Colombia para el año 2014, 718 municipios por debajo de 2200 msnm registraron la presencia del mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), esto sin incluir al departamento de Chocó que sólo tiene registro hasta el año 2006 (OMS, 2014). 3.1.4 Acción patógena El mosquito Aedes aegypti (Linnaeus) es el principal vector de enfermedades como fiebre amarilla, dengue y chikungunya. El ser humano se infecta a través de las picaduras de las hembras infectadas, las cuales se infectan por succionar sangre de personas infectadas. El virus infecta el intestino del mosquito y se extiende a su extremo probóscide en un periodo de 8 a 12 días (OMS, 2014). Dengue El dengue es una enfermedad que afecta a personas de cualquier edad, es causada por un virus llamado Flavivirus transmitido a través de la picadura del mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), el agente causal del virus pertenece a la familia Flaviviridae arbovirus, y se presenta en el sudeste asiático, sur de China, Taiwán, Australia, Somalia, Sudán, Arabia Saudita, Yemen, América Tropical, América Central, el Caribe y Norte de Sudamérica (INS, 2014). El dengue fue identificado por primera vez en la isla de Java en 1779; en el siglo XX surge la primera epidemia de dengue clásico en América, fue comprobada en un laboratorio y se asocia con el serotipo DEN-3. Actualmente se conocen cuatro serotipos distintos del virus DEN-1, DEN-2, DEN-3 Y DEN-4. En Colombia en los años 90 se presentaban anualmente 30.000 reportes en promedio. Durante los últimos años ese índice se elevó a 50.000 donde el 76.1% 17 de los casos de dengue proceden de 10 entidades territoriales: Tolima, Valle, Santander, Norte de Santander, Cundinamarca, Meta, Cesar, Huila, Antioquia y Putumayo (INS, 2014). Esta enfermedad tiene un periodo de incubación de cinco a ocho días, inicia con un cuadro clínico en forma brusca, se caracteriza principalmente por fiebre, dolores musculares, cefalea, dolor retroorbitario, congestión conjuntival, edema de párpados, dolor lumbosacro, posteriormente aparecen lesiones cutáneas, mialgias, puso lento, artralgias, dolor de huesos, tos, dolor de garganta, rinitis, algunas petequias y equimosis. La forma más grave de dengue es el hemorrágico, se produce por el serotipo DEN-1, con la aparición de fenómenos hemorrágicos, petequias, equimosis, epistaxis, hematemesis, melena, shock y muerte (Cabello, 2007). Fiebre Amarilla La fiebre amarilla es producida por un Flavivirus, el cual posee genotipos con diferente distribución de geográfica, el genotipo I es el encontrado en América Latina. Este virus afecta principalmente el hígado, riñón, corazón y el sistema nervioso central, es una enfermedad febril, hemorrágica, aguda e inmunoprevenible, de gravedad variable y alta mortalidad. El término "amarilla" alude a la ictericia que presentan algunos pacientes. La mortalidad de los casos graves no tratados puede llegar al 50% (OMS, 2014). La fiebre amarilla sólo se encuentra en Sudamérica Tropical y África Sub-Sahariana, se presenta en los meses con mayor precipitación, humedad y alta temperatura. Es transmitido por el mosquito Aedes aegypti (Linnaeus) se inocula a través de la picadura (Cabello, 2007). El periodo de incubación del virus es de tres a seis días, sus inicios tienden a confundirse con una gripe, debido a que inicia con fiebre, cefalea, dolor lumbosacro, mialgias generalizadas, náuseas, mareos, eritemas oculares y faciales y sangrados en el tubo digestivo. Posteriormente, la mayoría de los pacientes mejoran y los síntomas desaparecen en 3 o 4 días (Cabello, 2007). El 15% de los pacientes entran a una segunda fase más nociva para la salud, entre los síntomas más comunes se encuentran la fiebre elevada y se ven afectados diferentes sistemas orgánicos. El paciente se vuelve ictérico rápidamente y se queja de dolor abdominal con vómitos. Puede presentarse hemorragias orales, nasales, oculares o gástricas, con presencia de sangre en vómito o heces (OMS, 2014). Chikungunya El chikungunya se origina en África, Asia y el Subcontinente Indio. Los mosquitos transmisores de esta enfermedad son el Aedes aegypti (Linnaeus) y el Aedes albopictus (Skuse), tanto Aedes aegypti (Linnaeus) como A. albopictus (Skuse) se han visto implicados en grandes brotes de fiebre chikungunya. El chikungunya se ha detectado en más de 60 países de Asia, África, Europa y Américas (OMS, 2017). 18 El virus es de tipo alfavirus y es transmitido de una persona a otras por la picadura de mosquitos hembra infectados, la enfermedad suele aparecer entre 4 y 8 días después de la picadura de un mosquito infectado, aunque el intervalo puede oscilar entre 2 y 12 días (OMS, 2017). La fiebre chikungunya se caracteriza por la aparición súbita de fiebre, generalmente acompañada de dolores articulares, dolores musculares, dolores de cabeza, náuseas, cansancio y erupciones cutáneas. Los dolores articulares suelen ser muy debilitantes, pero generalmente desaparecen en pocos días, aunque también pueden durar semanas. Así puesto que el virus puede causar una enfermedad aguda, subaguda o crónica. La mayoría de los pacientes se recuperan completamente, en algunos casos los dolores articulares pueden durar varios meses o incluso años (OMS, 2017). 3.1.5 Clases de control La OMS en el año 2004 definió el control de vectores de cómo la planificación, organización, implementación y monitoreo de actividades para la modificación y manipulación de factores que permitan prevenir y/o minimizar la propagación de vectores. Aproximadamente el 80% de los brotes de mosquitos se encuentran dentro de los hogares, patios u otros lugares en los que pueden afectar la salud de la población, es importante saber cuáles son los mecanismos de control que se pueden efectuar en para la eliminación del mosquito Aedes aegypti (Linnaeus): Control químico Se basa en la aplicación de productos químicos como insecticidas y larvicidas, regulándolos a la sensibilidad de los mosquitos. Dentro de las desventajas de este tipo de control se puede mencionar que este tipo de control debe repetirse constantemente y su costo puede llegar a ser elevado, además, tiene muy poca residualidad debido a la capacidad del vector de generar resistencia a los insecticidas y a que produce muchos efectos secundarios no deseados, dañinos para el ecosistema y la salud humana (Ministerio de Salud y Protección Social Minsalud, 2014). Larvicidas Es un método complementario de la gestión ambiental, dicho método debe limitarse a aquellos recipientes que no puedan eliminarse o tratarse de ninguna otra forma, los larvicidas aplicados en los recipientes de almacenamiento de agua deben tener baja toxicidad para otras especies y no han de modificar de forma significativa el sabor, el olor o el color del agua (Minsalud, 2014). Insecticidas Los métodos de control químico de vectores adultos tienen por objeto reducir la 19 densidad y la longevidad de los mosquitos. Los insecticidas se aplican bien como tratamientos de superficies con efecto residual o como tratamientos de espacios (Organización panamericana de la salud OPS, 2011). Control integrado Es la unión de todos los métodos de control disponibles de la manera más eficaz, económica y segura para mantener las poblaciones de vectores en niveles aceptables, este tipo de control incluye todas las acciones que puedan realizarse con el fin de disminuir las poblaciones de mosquitosinfectantes y de larvas en las áreas de mayor riesgo (Minsalud, 2014). Control Biológico Se basa en la utilización de otros seres vivos que sirven como depredadores del mosquito, entre los cuales se encuentran mosquitos que en estado larval depredan otras larvas (Toxorhynchites (Theobald)), peces larvívoros (Gambussi aaffinis (Baird y Girard), Poecilica reticulata (Peters), tilapia), bacterias productoras de la muerte de larvas (Bacillus thuringiensis (Berliner)) y organismos microscópicos como protozoarios (López, 2012). 3.2 Zingiber officinale (Roscoe) El jengibre es un tubérculo destacado por su importancia medicinal, aromática y condimentaria en diversos lugares del mundo. Investigaciones sobre su origen y domesticación manifiestan que su procedencia es del Sudeste de Asia E. (Kizhakkayil & Sasikumar, 2010). Actualmente es utilizada en la medicina tradicional en países como India, Japón, China, Grecia, Roma y el mediterráneo debido a que se le otorgan propiedades antioxidantes, antiinflamatorias y anticancerígenas (Baliga, y otros, 2011). La planta posee tallos rojizos, hojas alternas, sésiles lanceoladas y muy agudas en su ápice, su flor posee una coloración blanquecina con espinas y está rodeada por una delgada bráctea (Duran, 2006). 3.2.1 Taxonomía El género es Zingiber (Mill), es el que cuenta con el mayor consumo y consta de 4 especies, Zingiber Officinale (Roscoe), Zingiber Mioga (Thunberg), Zingiber Cassumunar (Roxburgh), Zingiber Zerumbet (Roscoe ex Sm). Reino: Vegetal Clase: Angiospermae SubClase: Monocotyledoneae Orden: Escitamineas Familia: Zingiberaceae 20 Género: Zingiber Especie: Officinale Nombre científico: Zingiber Officinale (Roscoe) Nombres populares: Jengibre, Gingembre, Ginger, Gengibre. Nombre común: Jengibre 3.2.2 Descripción anatómica El jengibre es una planta formada a partir de un rizoma subterráneo del que parten ramas en posición inclinada, cubiertos por vainas envolventes de las hojas, su frondosidad es de color verde pálido y puede llegar a alcanzar el metro de altura (León, 1987). Su rizoma es irregular y alargado, se encuentra entre los 10 a 30 cm, está constituido por una capa externa también llamada capa de corcho, producida en la hipodermis la cual forma de 4 a 8 estratos de células de parénquima que se renuevan constantemente, su aspecto es seco. La región cortical o región media posee una capa oscura y grisácea compuesta por un tejido de parénquima poseedor de células que contienen oleorresinas. La parte central o interna es un sector más claro y cuyas células no poseen almidón, su tejido básico es el parénquima y se encuentran abundantes granos de oleorresinas. Los tallos de estos rizomas pueden ser estériles con hojas o fértiles sin hojas, su altura aproximada es de 1.50 m (León, 1987). Sus flores son amarillo verdosas e irregulares, rodeadas por brácteas color verde claro con bordes amarillentos, sus hojas poseen un vaina envolvente y en su terminación presentan una lígula pequeña (León, 1987). 3.2.3 Principios activos Numerosos ingredientes activos están presentes en el jengibre, entre ellos se incluyen los terpenos y la oleorresina que se conoce comúnmente como aceite de jengibre, también posee compuestos acuosos no volátiles. Los principales componentes identificados del terpeno son los hidrocarburos sesquiterpénicos y los compuestos fenólicos que son gingerol y shogaol y los extractos de rizoma lipófilo, produjeron gingeroles potencialmente activos, que pueden convertirse en shogaoles, zingerona y paradol, el jengibre es además muy rico en antioxidantes, tiene enzimas como la proteasa y el zingibaina y fito nutrientes como los flavonoides o los carotenos (ver Figura 3), (Arshad, 2014). Tabla 1. Tabla de los grupos de los compuestos activos del jengibre y su actividad biológica. Compuesto activo del jengibre Actividades biológicas Compuesto relacionado con gingerol La actividad antioxidante. Actividad antitumoral mediante la inducción de la apoptosis, la modulación de la actividad genética y otras actividades biológicas. 21 Actividad antiinflamatoria y antialgésica Actividad antimicrobiana. Actividad hepatoprotectora Paradol Actividad antioxidante y anticancerosa Actividad antimicrobiana. Shogoal Actividad antioxidante y antiinflamatoria. Shogaol mostró actividades anticancerígenas a través de la inhibición de la invasión celular, reducción de la expresión de la metaloproteinasa-9 de la matriz, actividad antiproliferación y antiinvasión Zingerone Actividad antioxidante. Acción antiinflamatoria. Actividad antibacterial. Zerumbone Actividad antitumoral Actividad antimicrobiana. 1-Dehydro-gingerdione Regulación de genes inflamatorios. Terpenoides Ver anexo 1 Flavonoides de jengibre Actividad antioxidante. Fuente: Arshad, 2014. 3.2.3 Antecedentes El jengibre es originario del Asia Tropical, desde China y Japón hasta India y Malasia. Se cultiva en lugares tropicales: principalmente China, India, Antillas y Nigeria (Fonnegra & Jiménez, 2007). Desde un principio el jengibre ha sido un ingrediente importante en la medicina especialmente en las medicinas chinas, ayurvédicas y unani, siendo usado para tratamiento de artritis, reumatismo, gingivitis, asma y diabetes, en algunos países el jengibre también es usado para alimentos (Ali, Blunden, Tanira, & Nemmar, 2008). En cuanto al estudio del jengibre como insecticida, larvicida o repelente han sido muy pocas las investigaciones que se han realizado, pero con los siguientes artículos realizados en diferentes investigaciones sobre mosquitos Aedes albopictus (Skuse), Aedes aegypti (Linnaeus) y Culex quinquefasciatus (Say), se obtuvieron los siguientes resultados: En la investigación “Actividad larvicida de mosquito de compuestos aislados del rizoma de Zingiber officinale” Abdul, Venkatesan, Getha, & Getha, 2008 en la cual se evaluó la actividad larvicida del Zingiber officinale (Roscoe) contra Aedes aegypti (Linnaeus) y Culex quinquefasciatus (Say). En esta investigación se usó para la extracción extracto de éter de petróleo de Zingiber officinale (Roscoe), con un fraccionamiento guiado por bioensayos con el fin de obtener el aislamiento de 4-gingerol (1), (6)-deshidrogingerdiona (2) y (6)- dihidrogingerdiona (3); este último no se tiene previamente información de Z. officinale 22 (Roscoe). Las estructuras se establecieron desde infrarrojo (IR), ultravioleta (UV), 1 Resonancia magnética nuclear H (RMN), 13C-RMN y datos espectrales de masa. En los tratamientos realizados después de una exposición de 24 horas, los compuestos 1, 2 y 3 exhibieron actividades larvicidas contra larvas de cuarto estadio de A. aegypti con unos LC 50 4.25, 9.80 y 18.20 ppm; LC 90 13.14, 37.42 y 96.33 ppm y C. quinquefasciatus (Say) con LC 50 5.52, 7.66 y 27.24 ppm; LC 90 25.68, 30.71, 70.38, respectivamente. Los resultados muestran que el compuesto más efectivo fue 4-gingerol (Abdul, Venkatesan, Getha, & Getha, 2008) La investigación “Bioactividad de aceites de plantas medicinales contra etapas inmaduras del mosquito dengue Aedes aegypti” Shabab, y otros, 2015, se realizó con el fin de evaluar la eficacia de los aceites esenciales extraídos de las ramas y hojas de eucalipto (Eucalyptus globules Labill.), neem (Azadirachta indica A. Juss), menta (Mentha piperita Linneo.), albahaca (Ocimum basilicum Linneo.) y de rizoma de jengibre (Zingiber officinale Roscoe) contra las larvas estadio I, II, III y IV y pupas de Aedes aegypti (Linnaeus). Los aceites esenciales se extrajeron con aparato Soxhlet utilizando éter de petróleo como disolvente. Los resultados mostraron que la mayor mortalidad fue observada en etapas inmaduras del mosquito, siendo el jengibre el más eficaz con la LC 50 más baja en larvas de estadioI de 8 h (142 ppm) y 16 h (8.5ppm) seguido de menta LC 50 8h (274 ppm) y 16 h (184 ppm); albahaca LC 50 8 h (323 ppm) y 16 h (396 ppm); eucalipto LC 50 8 h (581 ppm) y 16 h (189 ppm); y neem LC 50 8 h (652 ppm) y 16 h (566 ppm); sin embargo, en las larvas estadio IV se puede observar que el que tiene más efecto es el eucalipto con LC 50 8 h (172 ppm) y 16 (810 ppm) seguido de menta LC 50 8 h (262 ppm) y 16 h (285 ppm); albahaca LC 50 8 h (326 ppm) y 16 h (887 ppm); neem LC 50 8n h (500 ppm) y 16 h (471 ppm) y finalmente terminar con el jengibre LC 50 8 h (589 ppm) y 16 h (400 ppm). De igual forma en la investigación denominada “Propiedades larvicidas y repelentes de algunos aceites esenciales contra Culex tritaeniorhynchus Giles y Anopheles subpictus Grassi” de Govindarajan, 2011; consistió en la comparación de cuatro especies de plantas, tales como, limonaria Cymbopogan citrates (Stapf), canela Cinnamomum zeylanicum (J. Presl), romero Rosmarinus officinalis (Linneo) y jengibre Zingiber officinale (Roscoe) contra las larvas estadio III de los mosquitos Culex tritaeniorhynchus (Giles) y Anopheles subpictus (Grassi), en donde los aceites esenciales se obtuvieron mediante el método de hidro-destilación. Los resultados mostraron que los cuatro aceites esenciales de las plantas produjeron una mortalidad larval significativa contra las especies de mosquitos, sin embargo, la actividad larvicida más alta se observó 24 h después de exposición en el aceite esencial de jengibre contra C. tritaeniorhynchus (Giles) y A. subpictus (Grassi) con los valores LC 50 y LC 90 de 98.83, 57.98 ppm y 57.98, 104.23 ppm, respectivamente; seguida de romero LC 50 y LC 90 de 115.38 ppm, 211.53 y 64.50, 113.74 ppm; canela LC 50 y LC 90 124.70, 225.36 ppm y 71.96, 123.02 ppm y limonaria LC 50 y LC 90 136.58 243.18 ppm y 77.24, 128.39 ppm, todo lo anterior respecto a C. tritaeniorhynchus (Giles) y A. subpictus (Grassi). El jengibre Zingiber officinale (Roscoe) no ha sido el único material natural utilizado para una actividad larvicida y control de mosquitos de importancia de salud pública. En la Universidad 23 Francisco José de Caldas también se han hecho diversas investigaciones con diferentes materiales naturales para dicha función, como lo son: EVALUACIÓN DEL EFECTO LARVICIDA DEL EXTRACTO ETÉREO DE Allium sativum (ajo) SOBRE LARVAS DE Culex quinquefasciatus EN CONDICIONES DE LABORATORIO en donde se obtuvieron los resultados de LC 50 y LC 90 2500 y 3423.07 ppm al cabo de 72 h de exposición al larvicida respectivamente. Los LT 50 y LT 90 se alcanzaron a las 45.9 y 66.5 horas, respectivamente (Piragua & Ballen, 2016). EVALUACIÓN DEL EFECTO LARVICIDA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DEL TALLO DE Polygonum hydroperoides Michx (Polygonaceae); SOBRE LARVAS DE IV ESTADIO DE Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) EN CONDICIONES DE LABORATORIO. En esta investigación se evalúo el efecto larvicida del extracto etanólico de los tallos de la planta tradicionalmente como Barbasco de pantano con un LC 50 y LC 95 de 1787.5 y 2405.7 ppm respectivamente. La concentración que presenta mayor letalidad es la de 2000 ppm con una mortalidad de 60% a las 48 h de exposición al larvicida (Chiguasuque & Laverde, 2015). EVALUACIÓN DEL EFECTO LARVICIDA DE EXTRACTOS ACETÓNICOS DE Ruta graveolens L. (RUDA), SOBRE LARVAS DE IV ESTADIO DEL MOSQUITO Aedes aegyptiL. EN CONDICIONES DE LABORATORIO. Con este extracto natural se obtuvo que la LC 50 fuera de 52.875 ppm y la LC 95 de 120.399 ppm. Los TL 50 y TL 95 se encuentran a las 36 h con una mortalidad de 53% en la concentración de 90 ppm y a las 48 h con una mortalidad de 97% en la concentración de 100 ppm, respectivamente (Galiano & Calvo, 2014). EVALUACIÓN BIOINSECTICIDA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LA SEMILLA DE Annona muricata (GUANÁBANA) SOBRE LARVAS DE IV ESTADIO DE Aedes aegypti A CONDICIONES DE LABORATORIO. En esta investigación se puede establecer que la LC 50 y LC 95 se estiman en 152 ppm y 461 ppm respectivamente. Los TL 50 y TL 95 se encuentran a las 12 h con concentraciones de 200 y 500 ppm respectivamente (Cárdenas & Vargas, 2014). EVALUACIÓN DEL EFECTO LARVICIDA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE Syzygium aromaticum (CLAVO DE OLOR) SOBRE LARVAS DE CUARTO ESTADIO DE Aedes aegypti EN CONDICIONES DE LABORATORIO publicada por Manrique y Suárez en el año 2015, donde se obtuvieron los LC 50 y LC 90 137.34 y 387.43 ppm respectivamente. El TL 50 fue alcanzado en los seis tratamientos realizados con 200 ppm a las 44 h, 300 ppm a las 22 h y en 400 a las 7 h, mientras que los tratamientos con concentraciones de 500 y 600 ppm, se alcanzó en menos de la 1 hora de exposición al tratamiento. El tiempo letal TL 90 fue alcanzado con las concentraciones de 400 ppm a las 11 h, 500 ppm a las 3 h y en 600 ppm a las 2 h de tratamiento (Manrique & Suarez, 2015). EVALUACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD DE LARVAS DEL IV ESTADIO DE LA ESPECIE Aedes aegypti Linaeus (díptera: culicidae) A UN INSECTICIDA ALTERNATIVO A BASE DEL EXTRACTO DE COLILLAS DE CIGARRILLO EN CONDICIONES DE 24 LABORATORIO es una investigación que no consintió en utilizar un agente natural obteniendo LC 50 y LC 95 de 632.02 y 1424.09 ppm respectivamente, los TL 50 y TL 95 fueron alcanzados a las 24 y 48 h de exposición. En el efecto residual post-aplicado 30 días después en donde se observa que la concentración más alta, que es de 1000 ppm sólo se observa una letalidad del 16% (Medina & Torres, 2015). VALORACIÓN DEL EFECTO LARVICIDA DEL EXTRACTO ACETONICO DE Coriandrum sativum, SOBRE LARVAS DE Aedes aegypti EN CONDICIONES DE LABORATORIO de los autores Patiño, Salgado y Vega del año 2015, donde se utilizó como material base y natural el cilantro, a unas concentraciones distintas desde 200 hasta 1500 ppm en donde se determinó que el LC 50 y LC 90 son de 425 y 1425 ppm respectivamente; con TC 50 y TL 90 a las 30 y 48 h respectivamente (Patiño & Vega, 2015). EVALUACIÓN LARVICIDA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LA SEMILLA DE Carica papaya SOBRE LARVAS DEL IV ESTADIO DE Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE) EN CONDICIONES DE LABORATORIO. En la cual determinó que la LC 50 es de 48.8 ppm y LC 90 es de 151.2 ppm. Para los tiempos letales del 50% (TL50) fue de 5 a 8 horas y del 90% (TL90) entre 10 a 12 horas de exposición al tratamiento. En cuanto al efecto residual utilizado 15 días después, las mortalidades fueron menores a las iníciales, debido a que con la concentración más alta (1000 ppm) sólo se llega al 23% de mortalidad a las 48 horas (Gómez, 2015). 25 4. METODOLOGÍA La presente investigación se realizó a partir de cinco fragmentos comunicados todos entre sí. La valoración del efecto larvicida del Zingiber officinale (Roscoe) se llevó a cabo a partir de la obtención de larvas del mosquito Aedes aegypti (Linnaeus) cepa Rockefeller en el laboratorio Zoovector de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas. 1. Obtención de larvas Partiendo de la colonia ya establecida en el laboratorio, se recolectaron la mayor cantidad de huevos a través de un proceso de desecación, se procedió a introducir los huevos en recipientes de polietileno con agua a una temperatura aproximada a 27°C – 30°C por el tiempo necesario hasta alcanzar el estadio 4 de desarrollo. Las larvas se alimentaron a base de comida para peces (pescadina), debido a que ésta contiene los nutrientes necesarios para su desarrollo. 2. Obtención y preparación del extracto natural de Zingiber officinale (Roscoe): El extracto natural se realizó tomando 2 kilos de material base de Zingiber officinale (Roscoe). El material se adquirió en la plaza de mercado de Abastos en la cuidad de Bogotá, procurando garantizar la cadena de custodia, es decir, un mismo lugar de origen o procedencia. A partir de esto se procedió a realizarla técnica de secado, el cual se basa en la trituración de la raíz ya pelada para así tener un secado más eficiente y rápido, dejando el material a la sombra y a temperatura ambiente sobre bandejas con papel periódico. La extracción de los principios activos del material seco, se realizó a partir del método caliente con extractor Soxhlet, utilizando 500 gramos del material vegetal seco. El material seco se colocó en bolsas filtrantes buscando que cada bolsa pesara lo mismo, para finalmente colocarlas en el extractor con etanol al 96% a una temperatura aproximada de 350°C, hasta que el alcohol contenido en el tubo Soxhlet fuera traslúcido. El resultado del proceso de extracción en caliente, se concentró en un Rotaevaporador IKA RV10 con baño maría a 40 ºC con una velocidad de rotación de 100 rpm y presión reducida de 140 milibares, esta especificidad es otorgada por el equipo con el fin de que la extracción sea más eficiente, para evaporar y destilar el etanol y así de esta manera obtener la mezcla de agentes activos. Luego de obtener el extracto natural se almacenó en un frasco color ámbar a una temperatura de 4°C para evitar cambios en su composición por influencia de la luz o cambios térmicos. 3. Preparación de las disoluciones 26 Para concentración de 1000 ppm se tomó un balón aforado de 1L y se introdujo 1 mL del extracto junto con 1 mL de emulsificante Tween 80, posteriormente, se llenó el balón con agua destilada hasta el aforo y se agitó hasta tener certeza de que todo el contenido fuera homogéneo. Para las demás concentraciones, se realiza el mismo proceso anterior aumentando un 1mL de extracto y de emulsificante por concentración. 4. Bioensayos Se utilizaron 750 Larvas de IV estadio de A. aegypti (Linnaeus); que fueron distribuidas en 25 larvas para cada repetición de cada una de las cinco diluciones, la misma cantidad de larvas se utilizó en el blanco, con cuatro repeticiones en cada uno, en donde se evaluó la mortalidad a diferentes tiempos (12, 24, 36, 48, 60 y 72 horas) sobre las larvas de estadio de IV del mosquito A aegypti (Linnaeus). 5. Análisis Para lograr un análisis completo se hizo una evaluación estadística que fue posible con algunas herramientas y programas que permitieron un análisis preciso y detallado. Primero se obtuvieron los datos completos (tiempo, concentraciones y mortalidad) durante cada bioensayo; posteriormente, se tabularon los datos en Excel y se les aplicó la ecuación de Abbott para conocer si la mortalidad es causada por el estímulo de tratamiento y no por causas naturales. Se procedió a utilizar un software que permitiera la realización de la prueba Probit con el fin de determinar los tiempos letales y concentraciones letales. Posteriormente, para el análisis de varianza ANOVA cuyo objetivo es la comparación de datos numéricos que pueden ser significativamente distintos a los valores de otro o más conjuntos de datos, la realización de este tipo de análisis requiere que el número de réplicas por tratamiento sea superior a tres y que todos los tratamientos, en este caso, que las concentraciones tengan el mismo número de réplicas. En este procedimiento se utilizó el mismo software estadístico que en la prueba Probit, para lo cual se plantearon las siguientes hipótesis: Hipótesis nula (Ho): Al hacer las comparaciones entre los promedios de mortalidad de los diferentes tratamientos experimentales no se encuentran diferencias significativas. Hipótesis alternativa (H₁ ): Los promedios de mortalidad de los tratamientos o por lo menos un par tienen diferencia significativa. 27 5. RESULTADOS 5.1 Eficiencia del extracto natural de Zingiber officinale (jengibre) como larvicida a las diferentes concentraciones experimentales Al finalizar los bioensayos establecidos para la realización del larvicida de extracto etanólico de Zingiber officinale (Roscoe) sobre larvas de IV estadio de Aedes aegypti (Linnaeus), se procedió a organizar los resultados de las mortalidades a diferentes concentraciones en una tabla en Excel, con lo cual se quería lograr una mejor visualización de los tiempos de exposición a las diferentes concentraciones. Teniendo los resultados plasmados en las tablas, a los promedios se les aplicó la fórmula de Abbott para ajustar la mortalidad con base al grupo testigo. Éste es un método utilizado para determinar el efecto letal de una sustancia descartando la mortalidad natural por otras causas. Donde, %𝑀𝐶 = %𝑀𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 − %𝑀𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 100 − %𝑀𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 % M. tratamiento: mortalidad acumulada del tratamiento % M. testigo: Mortalidad acumulada del testigo % M. C: Mortalidad corregida en porcentaje Es de anotar que la mortalidad natural registrada en el grupo testigo es baja, menor al 5%. Los resultados obtenidos en los diferentes tratamientos sólo fueron relevantes en dos de las cincos diferentes concentraciones que están expuestos en el Anexo 2, donde se observa que los resultados obtenidos en el cuarto y quinto bioensayo, en los que se usaron las concentraciones de 4000 y 5000 ppm, respectivamente, indicaron que estas concentraciones con respecto a las anteriores a éstas, son más eficientes, debido a que en las primeras 12 horas se logra obtener más del 30% de mortalidad y en donde a las 60 horas del tratamiento, se consigue el primer resultado esperado, una mortalidad cercana al 50%. Al ser comparados todos los resultados obtenidos de las diferentes concentraciones evaluadas con sus respectivas lecturas, se evidencia que éstas son los únicos tratamientos en los que se puede observar una mortalidad acumulada final efectiva superior al 50% de los individuos evaluados, siendo satisfactoria pero lejana de la mortalidad del 100%. El bajo nivel de toxicidad del extracto es corroborado en cada una de las concentraciones de los anteriores bioensayos (ver anexo 2), siendo el mejor resultado otorgado a la concentración más altas del estudio, sobrepasando la concentración letal 50, pero aun así es baja, puesto a que la mortalidad acumulada esperada al finalizar los tratamientos debe ser de al menos un 90%, lo que indica que se requerirían concentraciones excesivamente altas para alcanzar dicho porcentaje de letalidad. Puesto que los protocolos para evaluación de larvicidas formulados por la Organización Mundial de Salud recomiendan no trabajar con concentraciones superiores a 5.000 ppm, no se evaluaron concentraciones superiores. 28 5.1.1 Análisis de mortalidades en los distintos tratamientos experimentales en relación con el tiempo de exposición Figura 3. Porcentajes de mortalidad corregidos con Abbott en vínculo con el Tiempo Fuente: Autores En la figura 3 se observan en paralelo las mortalidades acumuladas evaluadas a diferentes concentraciones determinadas mediante el factor tiempo, en donde claramente, se evidencia cómo a medida que las concentraciones se incrementan en cada uno de los bioensayos, igualmente aumentan las mortalidades en cada una de éstas, siendo así la concentración de 5000 ppm la que tiene el resultado de individuos fallecidos más satisfactorio. 0 10 20 30 40 50 60 0 HORAS 12 HORAS 24 HORAS 36 HORAS 48 HORAS 60 HORAS 72 HORAS N ° d e m u er te s MORTALIDAD ACUMULADA CORREGIDOS CON ABBOTT. 1000 2000 3000 4000 5000 TESTIGO 29 5.2 Análisis de Probit para el cálculo de las concentraciones letales CL 50 y CL 90 Figura 4. Determinación de las concentraciones letales CL 50 y CL 95 mediante la evaluación del efecto larvicida del extracto etanólico de Zingiber Officinale (Roscoe) Fuente: Autores. Los resultados corregidos mediante el modelo estadístico Probit, realizados a través de la asistencia de un software Statgraphics para las concentraciones letales (LC 50 y LC 90)del extracto etanólico de Zingiber officinale (Roscoe) en las larvas estadio IV de Aedes aegypti (Linnaeus), evidenciados en la figura 5, determinaron que la concentración letal LC 50 se encuentra en una concentración de 3986.73 ppm con un límite de confianza entre 3434.26 y 4855.24 ppm y por otro lado, la concentración letal LC 90 se encuentra en una concentración de 10057.2 con un límite de confianza entre 8070.66 y 14436.2 ppm. 3986.73 10057.2 0 20 40 60 80 100 120 0 5000 10000 15000 20000 P O R C E N T A JE D E M O R T A L ID A D ( % ) CONCENTRACION (PPM) PRUEBA PROBIT PARA LA CONCENTRACION LETAL 30 5.3. Análisis de tiempo letal TL 50 Figura 5. Determinación del tiempo letal CL 50 mediante la evaluación del efecto larvicida del extracto etanólico de Zingiber Officinale (Roscoe) Fuente: Autores. El tiempo letal TL 50 es alcanzado en la concentración de 4000 ppm, está estimado para ser efectivo después de transcurridos 60.47 horas de exposición al tratamiento y como se puede observar en la figura 5, se desarrolla una estimación en la que a partir de esta concentración se alcanza el tiempo letal TL 90 a las 112.17 horas, usando la misma concentración siempre y cuando, se mantenga el mismo comportamiento de efecto larvicida de manera creciente constante. 5.4. Análisis estadístico (Anova) Este análisis se realiza a partir de la comparación de dos hipótesis, una hipótesis nula (Ho) y una hipótesis alternativa (H1), donde la hipótesis nula se enfoca en hacer comparaciones entre los promedios acumulados de mortalidad de los cinco tratamientos, donde entre ellos no difieren significativamente; la hipótesis alterna se basa en que al menos dos de los tratamientos tienen diferencia significativa entre ellos. La hipótesis nula es rechazada al momento de obtener los resultados correspondientes al análisis efectuado, es decir, cuando el valor de Valor-P es menor a 0,05 denota que las diversas concentraciones si inciden en el porcentaje de mortalidad de las larvas, por otro lado, cuando Valor-P es mayor a 0,05 infiere que la concentración en los tratamientos no tiene variabilidad significativa para el porcentaje de mortalidad. 60.4704 112.171 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 150 200 M O R T A L U D A D ( % ) TIEMPO (h) TIEMPO LETAL 50 31 Tabla 2. Resultados del análisis de varianza ANOVA Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P Entre grupos 0,26348 4 0,06587 11,06 0,0002 Intra grupos 0,0893 15 0,00595333 Total (Corr.) 0,35278 19 Fuente: Autores. En la tabla 3 se evidencia cómo el valor de P-valor es de 0.0002, siendo menor a 0.05; esto manifiesta que la hipótesis nula (Ho) es rechazada dando a conocer que no se puede confirmar estadísticamente que no exista disimilitud significativa entre las diferentes concentraciones. El análisis estadístico corrobora la información obtenida en las pruebas de laboratorio realizadas puesto a que a mayor concentración mayor mortalidad, es decir, los tratamientos si inciden en el porcentaje de mortalidad de larvas. Figura 6. Puntos de dispersión de concentración en contraste a mortalidades ANOVA Fuente: Autores. En la figura 6 se evidencian los porcentajes de las mortalidades mediante el factor de concentración, se puede observar cómo las concentraciones de 1000 y 2000 ppm no difieren significantemente, a pesar que sólo se superpone un valor, sin embargo, las demás cifras de la concentración de 1000 ppm se encuentran en un rango inferior a éste; con respecto a la concentración de 3000 ppm se superpone un valor a la concentración de 2000 ppm en donde se observa que dicho valor es el más bajo, a partir de esta concentración se demuestra la transición para mortalidades superiores debido a que al ser comparadas con las concentraciones más altas, se puede hacer evidente una considerable diferencia, demostrando así que a mayor concentración mayor mortalidad; la concentración de 4000 ppm comparte cifras con la concentración inferior y con la concentración mayor, manifestando mayor similitud esta última, es decir, la de 5000 ppm, pese a que esta tiene valores superiores. 1000 2000 3000 4000 5000 Dispersión por Código de Nivel 0,18 0,28 0,38 0,48 0,58 0,68 A .r e s p u e s ta concentracion 32 6. DISCUSIÓN DE RESULTADOS Para la fiabilidad de los datos en la evaluación del efecto larvicida del extracto etanólico de Zingiber officinale (Roscoe) sobre larvas de IV estadio de Aedes aegypti (Linnaeus) en condiciones de laboratorio, se toman los resultados corregidos mediante la fórmula Abbott puesto que ésta permite evaluar la efectividad de un insecticida, descartando la mortalidad natural presentada en las larvas del grupo testigo. En el anexo 2 se pueden observar los resultados obtenidos de la mortalidad a la exposición del tratamiento, en donde se evidencia que el extracto empieza a hacer efecto sobre las larvas a las 12 horas de exposición sólo en la concentración más alta, que en este caso fue de 5000 ppm. De acuerdo a como se avanza en la concentración, se puede observar que el extracto empieza a surgir mayor efecto. Sólo en las concentraciones de 4000 y 5000 ppm se evidencian resultados medios en cuanto al LC 50. A pesar de que en las 24, 36 y 48 horas, la concentración de 4000 ppm tiene más efecto comparada con la de 5000 ppm, ésta es sobrepasada en las 60 horas y siendo menos efectiva en las 72 horas de exposición al tratamiento, con un resultado del sólo 51.09% de mortalidad a comparación con el porcentaje de mortalidad de 5000 ppm que es de 56.35%. Para poder obtener una mortalidad del 100% en la exposición de las larvas, se necesitaría una concentración superior de 10000 ppm, la cual no es recomendada según los lineamientos para la clasificación y directrices de uso de larvicidas y plaguicidas de la Organización Mundial de la Salud. De igual forma para los tiempos letales se toman los resultados corregidos, en donde podemos observar en la figura 5 que la letalidad del 50% comienza a surgir efecto después de las 2.5 días de exposición del extracto, comenzando con la concentración de 4000 ppm; así mismo, para poder tener una letalidad del 90% se necesita que hayan transcurrido más de 4.5 días en la exposición del tratamiento, el cual es realmente alto con respecto al tiempo requerido con otros extractos probados en investigaciones previas y a su vez es excesivo y permitiría el paso de larva a pupa e incluso el nacimiento de individuos adultos de mosquito antes de alcanzar a estar el tiempo suficiente de exposición. En cuanto al análisis estadístico ANOVA de un factor, el cual realiza la comparación de los promedios entre los tratamientos realizados, obteniendo que el valor de significancia fue menor de P-valor 0.05, por lo tanto, la hipótesis nula (Ho) es rechazada dando a conocer que los tratamientos con las concentraciones utilizadas sí inciden en los porcentajes de la mortalidad de las larvas. Lo que significa que, a mayor concentración de los tratamientos, mayor será el porcentaje de mortalidad de las larvas del mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), como se demuestra en el análisis anterior. Al comparar la presente investigación con los resultados obtenidos de los artículos realizados con el extracto Zingiber officinale (Roscoe), se evidencia que con las investigaciones realizadas por Abdul, Venkatesan, Getha, & Getha, 2008 y Shabab, y otros, 2015 sobre larvas del mosquito Aedes aegypti (Linnaeus) usando los productos del fraccionamiento y purificación del extracto de éter de petróleo del jengibre, se obtiene el LC 50 a concentraciones muy 33 inferiores a las utilizadas en el presente estudio. En la experiencia de Abdul et al (2008), a las 24 horas de exposición de las larvas estadio IV en el tratamiento, alcanza el LC 50con una concentración de 4.25 ppm con el compuesto 4-gingerol; 9.80 ppm con (6)- deshidrogingerdiona y 18.20 ppm con (6)-dihidrogingerdiona. En la investigación de Shabab et al (2015), la LC50 después de 8 horas es de 142 ppm y a las 16 horas es de 8.5 ppm contra larvas de I estadio. De igual forma, en la investigación de Govindarajan, 2011 recalcando de que el estudio se realizó con las especies de C. tritaeniorhynchus (Giles) y A. subpictus (Grassi), se obtiene un LC 50 con una concentración de 98.83 y 57.98 ppm después de 24 horas de exposición respectivamente. La diferencia en resultados obtenidos en la presente investigación respecto a las de Abdul et al. (2008) y Shabab et al (2015), radica en que la presente investigación se realizó utilizando como solvente el etanol al 96%, el cual está orientado a obtener una separación de productos con alta polaridad, mientras que como se muestra en la experiencia de Abdul y Shabab, se utiliza éter de petróleo como solvente, el cual permite remover compuestos no polares, que seguramente son los responsables del mejor efecto larvicida. Adicionalmente en esta investigación no se trabajó con concentraciones de cada componente por separado, sino que se trabajó con el extracto etanólico crudo sin ser sometido a un proceso de fraccionamiento y purificación, debido a que no se contó con la disponibilidad de recursos, equipos específicos y el dominio de la técnica para poder realizar el aislamiento adecuado de los componentes esenciales del extracto de jengibre. También hay una diferencia en la etapa de desarrollo de las larvas con respecto a la investigación de Shabab, donde se trabaja con larvas de I estadio que son mucho más sensibles que las larvas de IV estadio. Por todo esto, la notable y significativa diferencia en las concentraciones evaluadas y que demostraron en los resultados de Abdul, y Shabab alta letalidad, mientras que en el presente estudio se requirieron concentraciones notoriamente más altas para obtener la misma eficacia. En lo referente de la toxicidad de los diferentes estudios realizados en la Universidad Francisco José de Caldas con larvicidas biológicos, se puede concluir que todos han tenido alta letalidad sobre las larvas de los diferentes mosquitos a los cuales se les realizó la exposición, siendo así el más efectivo el de Gómez, 2015, debido a que sólo se necesita una concentración de 48.8 ppm de semillas de Carica papaya para obtener una mortalidad media (LC 50) donde se necesita un tiempo de 5 a 8 horas para alcanzar dicha mortalidad. En cuanto a los demás estudios, los larvicidas produjeron una mortalidad larvaria significativa contra las especies de mosquitos, siendo sólo en el estudio de Piragua & Ballen, 2016, que se necesitó una concentración letal media (LC 50) de 2500 ppm donde tuvo un tiempo letal (TL 50) a las 46 horas después de puesto el tratamiento, es decir, se requiere la mitad de la concentración para obtener mortalidades iguales a menores tiempos de exposición que la presente investigación. Todas las diferentes investigaciones de los diferentes estudios dieron resultados realmente satisfactorios. 7. CONCLUSIONES 34 El extracto etanólico de Zingiber officinale (jengibre) mostró efecto larvicida sobre larvas de IV estadio del mosquito Aedes aegypti en condiciones de laboratorio. A mayor concentración del extracto etanólico de Zingiber officinale (jengibre) se observó un mayor incremento gradual en las mortalidades de las larvas de IV estadio de Aedes Aegypti. Al cabo de 72 horas se registró mortalidad de 14,25% para la concentración de 1000 ppm, 32,3% para la concentración de 2000 ppm, 37,5% para la concentración de 3000 ppm, 51% para la concentración de 4000 ppm y 56,3% para la concentración de 5000 ppm. Lo anterior queda confirmado mediante los resultados de la prueba de Análisis de Varianza (ANOVA) aceptando la hipótesis alterna, la cual reitera que a mayor concentración del extracto etanólico de Zingiber officinale (jengibre) existe mayor letalidad. Ninguna de las concentraciones evaluadas tuvo como resultado una mortalidad del 100%, sin embargo, con los datos alcanzados se procedió a realizar el análisis probit con el cual se definieron las concentraciones letales LC50 y LC90 arrojando resultados de 3986,73 ppm y 100057,2 ppm respectivamente. A partir de las concentraciones letales se hallaron los tiempos letales TL50 y TL90 los cuales son alcanzados en los 2 días y medio y 4 días y medio respectivamente con la concentración de 4000 ppm, siendo un tiempo realmente excesivo que permitiría el paso a etapa de pupa o incluso a la eclosión de mosquitos adultos. 35 8. RECOMENDACIONES A partir de la realización del presente trabajo, en donde se determinaron las concentraciones letales y el tiempo de letalidad del extracto de Zingiber Officinale (Roscoe), se recomienda evaluar la eficiencia de este mismo en larvas de otras especies de mosquitos e insectos plaga que sean de importancia en salud pública como lo son Aedes albopictus (Skuse), Culex quinquefasciatus (Say) y Anopheles albimanus (Wiedemann); también podría evaluarse el efecto larvicida del extracto etanolico de Zingiber officinale (Roscoe), utilizando un cromatógrafo con el objetivo de poder separar los principios activos que demuestren propiedades larvicidas. Se aconseja no mantener mucho tiempo el extracto en refrigeración, ya que se cree que puede perder los principios activos que permiten que su eficacia al momento de ser utilizado como larvicida, se recomienda realizar una investigación evaluativa sobre el tiempo de volatilidad de los principios larvicidas del Zingiber Officinale (Roscoe) y a partir de esto realizar una evaluación del efecto de repelencia el extracto etanólico sobre mosquitos adultos de la especie Aedes aegypti. Realizar una evaluación y comparación gráfica de las mortalidades a partir del extracto de Zingiber officinale (Roscoe) puro, utilizando distintos solventes hexano, tolueno, benceno, acetona, etanol y éter de petróleo en las mismas condiciones de laboratorio, y siguiendo una estricta cadena de custodia para tener la certeza de cuál de estos disolventes posee mayor efectividad de extracción de los principios activos del jengibre. 36 9. BIBLIOGRAFÍA Ali, B. H., Blunden, G., Tanira, M. O., & Nemmar, A. (2008). 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Disponible en: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/aquatic/aedes_aegypti.htm 10. ANEXOS Anexo 1. Terpenoides identificados por GC-MS en SDGE aislados de tres lotes separados de jengibre. Compound Relative percentage of the identified terpenes Batch from India Batch 1 from Wisconsin Batch 2 from Wisconsin α-pinene 2.7 1.4 3.2 Camphene 8.1 4.3 8.6 β-pinene 0.4 0.2 0.3 β-myrcene 2.2 1.5 2.3 β-phellandrene 11.0 4.7 9.0 1, 8-cineole 5.6 6.8 6.2 α-terpenoline 0.2 0.1 0.1 2-nonanone 0.2 0.5 0.2 Linalool 1.5 2.2 0.8 Borneol 2.6 0.7 1.0 α-terpineol 1.7 1.0 0.7 Citronellol 1.8 3.1 2.2 Neral 14.8 20.2 15.4 Geraniol 3.6 3.2 3.0 Geranial 21.6 28.1 20.1 bornyl acetate 0.5 1.3 0.8 geranyl acetate 1.8 0.1 0.3 ar-curcurmene 2.0 1.7 2.1 Zingiberene 9.2 6.5 12.3 germancrene-D 0.2 4.8 0.8 β-bisabolene 4.8 4.8 6.0 β- sesquiphellandrene 3.6 2.8 4.6 Fuente: (Liu, y otros, 2012) Anexo 2. Porcentajes de mortalidad corregidos con la fórmula de Abbott. TRATAMIENTO PROMEDIOS DADOS EN PORCENTAJE 0 HORAS 12 HORAS 24 HORAS 36 HORAS 48 HORAS 60 HORAS 72 HORAS 1000 0 0 4 6,27272727 8,35629017 9,4619666 14,2518939 2000 0 0 8 14 21,2121212 21,4285714 32,2916667 3000 0 0 19 22 28,2828283 30,6122449 37,5 4000 0 0 36,8589744 40,8653846 42,2915048 42,6838043 51,0884081 5000 0 14,1025641 22,1153846 27,0833333 33,3883709 48,0801936 56,3468216 TESTIGO 0 0 0 0 1 2 4 Fuente: Autores Anexo 3. Límites de confianza y predicciones inversas para concentración LC Inferior 95,0% LC Superior 95,0% Porcentaje concentracion Límite Conf. Límite Conf. 0,1 -10651,3 -19160,3 -6832,45 0,5 -8214,55 -15222,4 -5063,61 1,0 -7032,78 -13313,5 -4204,75 2,0 -5741,52 -11229,0 -3265,16 3,0 -4922,26
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