Bacteriologia_Molecular_Uso_de_las_tecni

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Memorias del Instituto de Biología Experimental vol.6:49-52 (2012)  Ediciones IBE 
 
Bacteriología Molecular: Uso de las técnicas moleculares y 
bioinformáticas 
 
ADRIANA CHALBAUD, LAYNET PUENTES, ANA PEÑUELA, YUSIBESKA RAMOS, 
GIOVANNY ANGIOLILLO, CARLOS GOMES, PHENELOPE RIVAS, CARLOS REDONDO 
 Y GUILLERMINA ALONSO
Laboratorio de Biología de Plásmidos, Centro de Biología Celular. 
Instituto de Biología Experimental, 
Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Caracas - Venezuela 
Email: guillermina.alonso@ciens.ucv.ve 
 
La bacteriología molecular utiliza las herramientas bacteriológicas clásicas complementadas con las técnicas para el 
aislamiento y caracterización del material genético. Todas las metodologías basadas en la Reacción en Cadena de la 
Polimerasa han permitido importantes avances en la identificación de los genes responsables de muchos fenotipos 
bacterianos. La correcta identificación de los elementos genéticos accesorios también ha permitido caracterizar las 
bacterias aisladas de ambientes naturales y de ambientes hospitalarios, permitiendo definir los mecanismos de trasmisión 
de los determinantes que confieren propiedades beneficiosas a los microorganismos. También, el desarrollo de la 
bioinformática y los análisis in silico ha permitido notables avances en el área microbiológica. 
 
 
 
Introducción 
En bacteriología la identificación y caracterización 
de las propiedades de los microorganismos son el 
paso inicial para un estudio. La suma de los 
procedimientos para lograr alcanzar estos objetivos 
se denomina tipificación. Los métodos para la 
tipificación de microorganismos pueden clasificarse 
en dos grandes grupos: fenotípicos y genotípicos. 
Los métodos fenotípicos constituyen una 
herramienta de suma importancia, no obstante, el 
alcance de estos procedimientos puede encontrar 
serias restricciones. Los métodos genotípicos están 
basados en la detección del material genético del 
organismo, por lo tanto son independientes de los 
cambios en el patrón de expresión genética y de las 
influencias ambientales, ofreciendo una alternativa 
con mayor estabilidad y reproducibilidad. No 
requieren necesariamente el aislamiento y cultivo de 
los microorganismos, siendo posible obtener los 
resultados en tiempos más cortos y, usualmente con 
mayor poder de resolución, sensibilidad y 
especificidad que los métodos fenotípicos, 
complementando estos últimos. 
En el Laboratorio de Biología de Plásmidos se ha 
establecido una línea de investigación de 
Bacteriología Molecular, para la caracterización de 
bacterias aisladas de ambientes hospitalarios, o de 
ambientes naturales e intervenidos por el hombre, 
utilizando herramientas de Genética Molecular y 
bioinformática. 
 
Caracterización microbiológica y molecular de 
bacterias causantes de infecciones nosocomiales y 
sus integrones. 
Las infecciones nosocomiales representan un 
problema de salud pública ya que aumentan la 
mortalidad y la morbilidad. En el presente trabajo se 
realizó la caracterización de bacterias responsables de 
infecciones nosocomiales. Durante un año, fueron 
colectadas muestras bacterianas del Hospital 
Universitario de Caracas. Los microorganismos 
fueron identificados, determinando los géneros 
bacterianos, los perfiles de resistencia a antibióticos y 
caracterizando los elementos genéticos móviles (2). 
El 67,5% de los aislados de pacientes fueron 
resistentes al menos a 7 antibióticos, y los aislados 
ambientales también presentaron multiresistencia. 
Este alto porcentaje de resistencia sugiere la 
necesidad de terapias más racionales y controladas. 
En los últimos años se ha estado investigando la 
participación de estructuras genéticas tipo integrones, 
como elementos genéticos que contribuyen a la 
adquisición de genes de resistencia en bacterias. Los 
integrones se han identificado como elementos que 
actúan como un vector natural de clonamiento y 
expresión, porque pueden incorporar un número 
indefinido de genes de resistencia. La posibilidad que 
se generen diversos arreglos de genes en los 
integrones, ha contribuido al surgimiento de cepas 
multirresistentes. En este estudio se caracterizaron los 
integrones Clase I presentes en estos aislados 
bacterianos, en los cuales la multirresistencia puede 
estar asociada a estas estructuras (6). Analizando las 
cepas de A. baumannii portadoras de plásmidos, se 
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determinó una frecuencia de 90% de integrones clase 
I, en las cepas provenientes de pacientes con 
infecciones nosocomiales y un 40% de integrones 
clase I en las cepas provenientes de ambientes 
inanimados. También se determinó la frecuencia de 
integrones clase I en las cepas de S. maltophilia, 
evidenciándose una frecuencia de 57% en las cepas 
provenientes de ambiente, y 33% en las cepas 
provenientes de pacientes con infecciones 
nosocomiales. La secuenciación de las regiones 
variables de algunos integrones, permitió conocer que 
en los aislados bacterianos de P. aeruginosa, los 
integrones Clase I portan genes aadA, no reportados 
previamente en el país. En A. baumannii, se detectó 
un integrón clase I, homólogo al integrón de una isla 
de patogenicidad de este género bacteriano (2,3,6). La 
alta incidencia de elementos génicos móviles, resaltan 
la importancia de planes de vigilancia a largo plazo y 
mejoras en las rutinas de limpieza del recinto 
hospitalario. 
 
Estudio de cepas bacterianas aisladas del Embalse 
Pao-Cachinche 
La contaminación de aguas por las descargas 
continuas de materia orgánica representa un problema 
de salud pública. Estos ambientes contaminados son 
un nicho favorable para el desarrollo de diversos 
microorganismos. Ante estas situaciones de estrés, las 
bacterias adquieren mecanismos de resistencia, y una 
de las principales vías para la adquisición de genes de 
resistencias es a través de plásmidos movilizables. El 
uso de los antimicrobianos en las prácticas agrícolas y 
con propósitos veterinarios, junto con las descargas 
de aguas cloacales, han producido en los ambientes 
acuáticos un incremento significativo de bacterias 
resistentes a múltiples antibióticos, desinfectantes e 
incluso a metales pesados. En este estudio nos 
propusimos continuar los estudios microbiológicos 
del Embalse Pao-Cachinche comenzados hace varios 
años en el laboratorio (5). En las muestras del año 
2005, cuando se encontraba en funcionamiento 
sistemas de aireación para la recuperación del 
embalse, se obtuvieron títulos menores que en las 
muestras de agua del año 2007. En las muestras del 
año 2007, la diversidad de géneros encontrados fue 
mayor que entre las cepas bacterianas identificadas en 
las muestras del año 2005, resaltando en los aislados 
del 2007 varios géneros de la familia 
Enterobacteriaceae. Los aislados bacterianos del 
Embalse portan determinantes de resistencia que en el 
25% de los aislados, están codificados en plásmidos 
transferibles bajo las condiciones ensayadas, 
permitiendo inclusive la diseminación entre géneros 
bacterianos diferentes (5). Estos resultados deben ser 
considerados por las autoridades competentes, ya que 
nos permiten recomendar que se deben implantar 
medidas de mitigación para lograr combatir los 
niveles recientes de contaminación en el Embalse 
Pao-Cachinche. 
 
Evaluación de la distribución de los genes qac de 
resistencia a desinfectantes en cepas de origen 
hospitalario 
Los antisépticos y desinfectantes son utilizados 
extensivamente en el control de las infecciones 
hospitalarias. Entre los más utilizados se encuentran 
los compuestos catiónicos de amonio cuaternario 
(QACs). El uso cotidiano de estos compuestos ha 
conllevado a la selección de cepas bacterianas 
resistentes, que aumentan el riesgo de la adquisición 
de infecciones nosocomiales. Se ha reportado que la 
resistencia a estos agentes puede estar codificada en 
plásmidos, aumentando el riesgo de la diseminaciónde este fenotipo. Esta resistencia está generalmente 
asociada a bombas de eflujo, codificadas por la 
familia de los genes qac. El objetivo de este estudio 
fue evaluar la distribución de los genes de resistencia 
a antisépticos y desinfectantes (qacA, qacB, qacC, 
qacE, qacE1, qacF, qacG, qacH y qacJ) y su 
asociación con el fenotipo de resistencia en cepas 
aisladas de ambientes hospitalarios (3,7). Para evaluar 
el fenotipo de resistencia se utilizaron las pruebas 
recomendadas por la Asociación Oficial de Análisis 
Químicos (AOAC), la Determinación de Suspensión 
Cuantitativa (recuento del número de colonias 
viables), y la prueba de Rapidez de Muerte Celular 
(medida de la turbidez en medio líquido). Para 
evaluar la distribución de los genes qac, se utilizó la 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se 
encontró un alto porcentaje de los aislados evaluados 
que exhibían fenotipos de resistencia a agentes 
desinfectantes cuyo agente activo es un compuesto de 
amonio cuaternario. De estas cepas, el 7 % presentó 
el gen qacA, el 65% el gen qacB, el 3% el gen qacC, 
el 65% el gen qacEΔ1, el 28% el gen qacF y el 7% 
los genes qacG y qacH. En ninguna de las cepas se 
encontraron los genes qacE ni qacJ. En varios 
aislados bacterianos evaluados se obtuvieron 
resultados positivos de la PCR para más de dos genes 
de manera simultánea (3,7). Este estudio constituye el 
primer reporte en el país que evalúa la presencia de 
estos genes, destacando la prevalencia alta de los 
genes qacB y qacEΔ1, distribuidos tanto en los 
aislados provenientes del ambiente como de pacientes 
con infecciones intrahospitalarias, representando un 
aviso para las autoridades de salud a fin de evitar la 
diseminación de estos determinantes de resistencia, 
dado que la presencia de estos genes involucra una 
ventaja selectiva que aumenta la supervivencia de 
51 
estos aislados multirresistentes en el ambiente 
hospitalario. 
 
Caracterización molecular de β-lactamasas tipo 
CTX-M presentes en cepas de E. coli y K. 
pneumoniae aisladas en el área metropolitana de 
Caracas 
Los β-lactámicos son los antimicrobianos mas 
prescritos en el tratamiento de las infecciones 
adquiridas en la comunidad y en los centros 
hospitalarios. La aparición de la resistencia a las 
cefalosporinas de amplio espectro está mediada 
principalmente por la producción de BLEE. El 
presente trabajo tuvo como propósito determinar la 
prevalencia de las BLEE tipo CTX-M, su diversidad 
y patrones de susceptibilidad (8). Se recolectaron en 
total 97 cepas productoras de BLEE. Mediante PCR 
se detectó que el 43% de las cepas eran portadoras de 
genes blaCTX-M. Los alelos blaCTX-M detectados fueron 
los tipo 1 (66, 7%), tipo 2 (28,6%) y tipo 9 (4,7%). 
Las cepas portadoras de este gen se localizaron en 
todos los diferentes centros de salud estudiados, 
asociados a paciente hospitalizados (59,5%) y 
pacientes ambulatorios (40,5%). Los resultados 
indican un incremento en la prevalencia de las BLEE 
tipo CTX-M, constituyéndose en el más alto 
porcentaje reportado en nuestro país. El alelo blaCTX-M 
tipo 1 se detectó con mayor frecuencia (8). Los 
antimicrobianos tipo carbapemen se mantienen como 
las mejores opciones terapéuticas para el tratamiento 
de cepas BLEE. 
 
Caracterización del fenotipo de resistencia a Vanadio 
en aislados bacterianos creciendo en forma libre en 
fase estacionaria 
El vanadio (V) ocupa una posición excepcional 
dentro de los biometales, ya que participa en los 
procesos biológicos en forma de anión o catión. En el 
ámbito nacional existen pocos datos sobre la 
presencia de bacterias con capacidad de resistencia a 
V. Continuando estudios previos, se caracterizó el 
fenotipo de resistencia a V en aislados bacterianos 
creciendo en forma libre en estado estacionario de la 
curva de crecimiento (1). Se emplearon diversos 
aislados de E.coli, A. baumannii, P. aeruginosa, S. 
maltophilia, P. putida, P. fluorescens, S. marcescens, 
C. freundii, Enterobacter sp, crecidos con V
+5
 
(NaVO3). Se obtuvo que el 88,4% creció a 10 mM V, 
73,9% a 25 mM V, 58% a 50 mM, 18,8% a 100 mM, 
8,7 % a 150-200 mM. De los aislados que crecieron, 
el 42% formó colonias negras con un halo gris. Estos 
datos sugieren la presencia de al menos dos 
mecanismos distintos de destoxificación del V, siendo 
de particular interés los aislados que formaron 
colonias negras con halo gris, ya que sugiere un 
proceso de modificación del V, lo que pudiera 
contribuir a su recuperación en ambientes 
contaminados. 
 
Regulación de la dispensación de medicamentos y su 
efecto en el consumo de antibióticos en Venezuela. 
La pérdida de la eficacia de los antibióticos se 
atribuye principalmente a su consumo indiscriminado, 
que ocasiona la selección de bacterias patógenas 
resistentes. Para controlar este problema, en enero de 
2006 se reguló la dispensación del algunos 
antibióticos en Venezuela. Utilizando herramientas 
bioinformáticas, realizamos un estudio para 
determinar las variaciones en la tendencia de 
consumo de los antibióticos regulados y no regulados 
en Venezuela, entre el período antes (2005) y después 
(2006–2008) de la regulación de su venta por receta 
(9,10). Se obtuvo información sobre el consumo de 
antibióticos de los datos aportados por International 
Marketing Services. El consumo se expresó en dosis 
diarias definidas por 1000 habitantes por día. Se 
realizaron análisis de varianzas (ANOVA) con un 
intervalo de confianza de 95% para conocer las 
diferencias entre los períodos estudiados. Los 
antibióticos regulados de mayor consumo fueron 
ciprofloxacina y azitromicina. Las clases de 
antibióticos no regulados de mayor consumo fueron 
penicilinas y cefalosporinas de 1ra. generación, 
aminoglucósidos, diaminopiridinas-sulfamidas y 
tetraciclinas. El consumo total de las categorías de 
antibióticos de libre dispensación fue el doble del de 
las categorías de venta regulada, antes y después de la 
regulación. No se encontraron diferencias 
estadísticamente significativas en el consumo de 
antibióticos, ya fueran regulados o de libre 
dispensación, ni antes ni después de aplicarse la 
medida regulatoria de dispensación de antibióticos 
(9,10). Venezuela es uno de los primeros países 
latinoamericanos que ha puesto en efecto una medida 
regulatoria de dispensación de antibióticos; sin 
embargo, cinco años después los resultados de este 
trabajo ponen en evidencia la ausencia de cambios en 
las tendencias de consumo de antimicrobianos. Se 
deben implementar estrategias complementarias a la 
regulación de la dispensación de antibióticos en 
Venezuela para lograr el éxito de dicha medida. 
 
Efecto de la regulación de la dispensación de 
antibióticos en Venezuela sobre la resistencia 
bacteriana 
Para relacionar la medida regulatoria con la 
resistencia bacteriana, se consultó la base de datos del 
Programa Venezolano de Vigilancia de la Resistencia 
a los Antimicrobianos (PROVENRA). La conexión 
entre las variables consumo/resistencia antes y 
52 
después de la regulación de la venta, se estableció 
mediante un análisis de correlación (4,9). Los 
resultados nos permiten concluir que en el lapso 
estudiado la medida regulatoria ha resultado 
infructuosa, puesto que tanto el consumo como la 
resistencia bacteriana total a estos antimicrobianos se 
incrementaron significativamente durante el período 
posterior a la promulgación de la medida. La 
resistencia bacteriana a muchas de las clases de 
antibióticos estudiadas está sólo parcialmente 
influenciada por su consumo, destacando la 
participación de otros factores en la prevalencia de 
cepas bacterianas resistentes. Estos resultados nos 
permiten sugerir que es necesario supervisar y 
ampliar la aplicación de esta medida a todos los 
antibióticos de uso en humanos y animales, además 
de concientizar al personal médico prescriptor de 
estos medicamentos así como a la población engeneral. 
 
Diseño de estrategias para controlar la resistencia a 
los antimicrobianos utilizando herramientas de 
bioinformática y modelado molecular 
El éxito del tratamiento de las enfermedades 
infecciosas de los seres humanos se ha visto 
comprometido en los últimos años debido a la 
diseminación de genes de resistencia a antibióticos 
entre las bacterias patógenas. Estos genes de 
resistencia a antibióticos son transportados por 
plásmidos, los cuales son transferidos de una bacteria 
a otra mediante el proceso de conjugación. Para 
contribuir a la solución de este grave problema de 
salud pública, este trabajo se planteó la búsqueda de 
inhibidores de la conjugación bacteriana (4). La 
identificación de proteínas de estructura y ligandos 
conocidos, reportados en los Bancos de Datos, que a 
su vez presentaran similitud en su secuencia de 
aminoácidos con las proteínas de los sistemas de 
transferencia de los plásmidos R27 y R478, permitió 
reconocer entre estos ligandos a algunos inhibidores 
potenciales de la transferencia por conjugación de 
estos plásmidos. Luego del análisis in silico de 31 
proteínas de transferencia, se logró determinar en 
algunas ciertas regiones con secuencia similar a 
proteínas de humanos que utilizan este dominio para 
metabolizar medicamentos. Mediante ensayos de 
conjugación se probaron estos compuestos, que 
demostraron ser capaces de inhibir la frecuencia de 
transferencia de plásmidos prototipos y silvestres (4). 
En la actualidad se continúan los estudios con más 
muestras y concentraciones para definir el efecto. 
 
 
 
 
Referencias 
1. Angiolillo, G. (2011). Caracterización fenotípica y 
molecular de la resistencia a Vanadio en aislados 
bacterianos. Estudio en crecimiento libre y en 
biopelículas. Proyecto Tesis Doctoral. Postgrado 
Biología Celular, Fac. Ciencias, UCV. 
2. Chalbaud, A. (2010). Caracterización 
epidemiológica de bacterias causantes de 
infecciones nosocomiales (Estudio en el Hospital 
Universitario de Caracas). Tesis Doctoral, 
Postgrado Biología Celular, USB. 
3. Chalbaud, A., Ramos, Y. y Alonso, G. (2011). 
Antibiotic and Disinfectant Resistance in 
Acinetobacter baumannii genotyped isolates from 
the Caracas University Hospital. Aceptado, 
Proceedings IV International Conference on 
Environmental, Industrial and Applied 
Microbiology. 
4. Gomes, C. (2011). Diseño de estrategias para 
controlar la resistencia a los antimicrobianos 
utilizando herramientas de bioinformática y 
modelado molecular. Tesis Doctoral. Postgrado 
Farmacología. Fac. Farmacia. UCV. 
5. Peñuela, A. (2008). Estudio de cepas bacterianas 
aisladas del Embalse Pao-Cachinche. Licenciatura 
en Biología. Fac. Ciencias. UCV 
6. Puentes, L. (2009). Caracterización de integrones 
clase I en cepas de A. baumannii y S. maltophilia 
aisladas del Hospital Clínico Universitario. 
Licenciatura en Biología. Facultad de Ciencias. 
7. Ramos, Y. (2011). Avance Tesis Doctoral 
“Estudio Fenotípico, Funcional y Molecular de la 
resistencia a desinfectantes expresada por aislados 
bacterianos clínicos creciendo en forma 
planctónica y en biopelículas”. Postgrado Biología 
Celular, Fac. Ciencias, UCV. 
8. Redondo, C. (2010). Caracterización molecular de 
β-lactamasas tipo CTX-M presentes en cepas de E. 
coli y K. pneumoniae aisladas en el área 
metropolitana de Caracas, y su relación 
epidemiológica con elementos genéticos móviles. 
Tesis Doctoral, Postgrado en Biología Celular, 
Fac. Ciencias, UCV. 
9. Rivas, P. (2010). Estudio de los cambios en la 
tendencia de consumo de antibióticos y su relación 
con la resistencia bacteriana en Venezuela, durante 
el período 2005-2008. Licenciatura en Biología. 
Facultad de Ciencias. 
10. Rivas, P. y Alonso, G. (2011). Regulación de la 
dispensación y su efecto en el consumo de 
antibióticos en Venezuela. Rev. Panam. Salud 
Pública 30(6): 592–597. 
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https://www.researchgate.net/publication/235990751