Acinetobacter baumannii: epidemiología, resistências e tratamento

•

Vicente Riva Palacio

Oswaldo A Bracho P

24/4/2024

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Microbiología

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FACULTAD DE BIOLOGÍA
Programa de doctorado en Microbiología
TESIS DOCTORAL
Acinetobacter baumannii: epidemiología, resistencias y
opciones de tratamiento
Cristina García Salguero
Madrid, 2022

Memoria de investigación presentada por

Cristina García Salguero

Para optar al grado de

Doctora en Microbiología
por la Universidad Autónoma de Madrid

Dentro del Programa de Doctorado en Microbiología

Trabajo dirigido por
Dra. Esther Culebras López
Facultativa Especialista de Área en el Hospital Universitario Clínico San
Carlos y Profesora asociada de la Universidad Complutense de Madrid

Trabajo realizado en el Laboratorio de Microbiología del Hospital
Universitario Clínico San Carlos

Madrid, Mayo 2022

Esther Culebras López, Facultativa Especialista de Área del hospital HCSC y
Profesora asociada de la Facultad de Medicina de la UCM

Informa

Que la presente tesis doctoral titulada “Acinetobacter baumannii:
epidemiología, resistencias y opciones de tratamiento”, ha sido realizada bajo
mi dirección por Dña. Cristina García Salguero. Considero que el trabajo
reviste las características de originalidad y calidad para ser defendida como
Tesis Doctoral para optar al grado de Doctora.

La directora de la tesis,

Dra. Esther Culebras López

A mis padres, hermanos y a Nuno

Agradecimientos

Me gustaría agradecer a todas las personas que, de una forma u otra, me han
apoyado y han hecho posible que este trabajo se realice con éxito.

En primer lugar, al Dr Juan J. Picazo quiero agradecerle haberme acogido en
su Servicio y haberme brindado la oportunidad de realizar en él mi trabajo de
investigación.

A mi directora de tesis, la Dra Esther Culebras, por haber compartido conmigo
sus conocimientos, su tiempo, su paciencia, su apoyo y por la dedicación con
la que ha dirigido este trabajo. Y, en fin, por no firmarme ni una prórroga más,
lo que ha sido clave para que este trabajo llegara a su fin.

A Álvaro Gómez, por enseñarme todo lo relacionado con la espectrometría de
masas y por su completa disponibilidad cuando he necesitado su consejo y
ayuda.

A Esther por su disponibilidad para escucharme y ayudarme cuando lo he
necesitado.

A todos los compañeros del Servicio de Microbiología por acompañarme tanto
en los cuatro años de residencia como en estos últimos años.

A mi familia española y portuguesa, por apoyarme en todos mis proyectos.

A Nuno, por ser mi mayor admirador, por creer en mí más que yo y por
apoyarme incondicionalmente.

ÍNDICE

RESUMEN/SUMMARY
ABREVIATURAS
INTRODUCCIÓN
Acinetobacter spp. ................................................................................1
 Importancia nosocomial ................................................................ 2
 Factores de riesgo y virulencia ...................................................... 4
 Mecanismo de resistencia y patogenicidad .................................... 7
- Enzimáticos ....................................................................... 9
- No enzimáticos ................................................................. 11
 Opciones terapéuticas .................................................................... 14
Espectrometría de masas MALDI-TOF ........................................... 18
 Identificación ................................................................................. 19
 Resistencias .................................................................................... 20
 Epidemiología ................................................................................ 22
Rep-PCR .............................................................................................. 23
OBJETIVOS ........................................................................................ 27
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislados ................................................................................................ 31
Estudios de sensibilidad ...................................................................... 33
 Método de dilución en agar ............................................................ 33
 Método de difusión disco ............................................................... 36
 Método de microdilución en caldo ................................................. 37
 Método de Epsilon test (E-test) ...................................................... 38
 Detección de resistencia a colistina ................................................ 39
Estudios de sinergia ............................................................................. 44
 Plazomicina ..................................................................................... 44
- Método de difusión disco ................................................... 44
- Técnica de tablero de ajedrez o checkerboard ................... 44

- Curvas de letalidad ............................................................. 49
 Estudio de sinergia imipenem-relebactam ....................................... 51
 Detección de la actividad sinérgica de dos carbapenémicos por
espectrometría de masas MALDI-TOF ........................................... 52
Métodos moleculares ............................................................................ 55
 Extracción de DNA de los aislados y su cuantificación .................. 55
 Detección de genes de resistencia a aminoglucósidos ..................... 56
 Detección OXA-23 .......................................................................... 58
Estudios de clonalidad .......................................................................... 59
 MALDI-TOF .................................................................................... 59
 DiversiLab ........................................................................................ 62
RESULTADOS
Aislados clínicos ..................................................................................... 67
Estudios de sensibilidad ........................................................................ 68
 Valoración de dos técnicas comerciales de detección de resistencia a
colistina .............................................................................................. 71
 Actividad in vitro de la combinación imipenem-relebactam ............. 74
Detección de genes de resistencia ........................................................... 76
 AMEs .................................................................................................. 76
 Detección OXA-23 ............................................................................. 78
Estudios de sinergia ................................................................................. 78
 Combinación de un aminoglucósido (plazomicina o amikacina) con
diferentes antibióticos .......................................................................... 78
- Difusión disco ........................................................................ 80
- Tablero de ajedrez .................................................................. 81
- Curvas de letalidad ................................................................. 86
 Combinación de dos carbapenémicos .................................................. 89
- Tablero de ajedrez .................................................................. 89

- Curvas de letalidad ................................................................. 90
- MALDI-TOF .......................................................................... 93Estudios de clonalidad ............................................................................. 97
 Espectrometría de masas MALDI-TOF .............................................. 97
- Biotyper ................................................................................. 97
- Bionumerics .......................................................................... 111
 Rep-PCR comercial (DiversiLab) ...................................................... 114
 Comparación de los resustados obtenidos mediante PFGE, DiversiLab y
MALDI-TOF ...................................................................................... 115
- Análisis Bionumerics ............................................................ 118
DISCUSIÓN ............................................................................................. 121
CONCLUSIONES ................................................................................... 139
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................... 143
ANEXOS .................................................................................................. 157

RESUMEN/SUMMARY

RESUMEN
Acinetobacter baumannii (AB) supone un problema de salud pública por su
capacidad de causar brotes, mantenerse en el ambiente hospitalario, adquirir
resistencias y por las escasas opciones terapéuticas disponibles para su
tratamiento. Está entre los microorganismos que la OMS ha considerado como
“patógenos prioritarios” por su resistencia a los antibióticos y sobre los que
intenta promover la investigación para poder así combatir el problema
acuciante de la falta de antibióticos con actividad frente a estos
microorganismos.
Aunque es esencial aumentar la investigación para el desarrollo de nuevos
compuestos que sean útiles para tratar las infecciones producidas por estas
bacterias, son necesarias también otras acciones para combatir su resistencia
antibiótica. Entre ellas, es importante tanto el uso apropiado de los antibióticos
existentes como el estudio y control de cualquier nuevo antibiótico que se
desarrolle.
Durante el desarrollo de este trabajo se han realizado diferentes experimentos
con el fin de facilitar el control de la infección producida por AB, buscando
tanto nuevas opciones de tratamiento basadas en moléculas novedosas,
plazomicina y relebactam, o el uso de combinaciones de antibióticos, como
métodos más sencillos de caracterización que permitan conocer la
epidemiología local de una forma rápida y sencilla.
En este estudio se evaluó la actividad de la plazomicina, un nuevo
aminoglucósido que ha mostrado su utilidad para tratar microorganismos
resistentes, como opción terapéutica frente a Acinetobacter spp. productores de
carbapenemasas. Se ha medido su actividad, tanto sola como en combinación
con otros antibióticos no aminoglucósidos (carbapenémicos, colistina,
tigeciclina, fosfomicina). Los mejores resultados se obtuvieron en las
combinaciones en las que participaban carbapenémicos.

Las combinaciones de dos carbapenémicos también mostraron resultados
prometedores, tanto por los métodos usados convencionalmente (tablero de
ajedrez y curvas de letalidad), como mediante el uso de la espectrometría de
masas MALDI-TOF. El uso de esta técnica para monitorizar la actividad de la
mezcla de estos dos antibióticos se ha revelado como una herramienta
novedosa y prometedora que puede facilitar la detección de sinergia cuando en
ella están implicados antibióticos β-lactámicos o carbapenémicos.
La combinación de imipenem con relebactam, por el contrario, no supuso
ninguna ventaja frente al uso de imipenem solo en el tratamiento de
Acinetobacter baumannii.
Debido a la escasez de moléculas para el tratamiento de microorganismos
multirresistentes, la colistina ha pasado a considerarse un antimicrobiano de
primera línea con el riesgo consiguiente de aumento de resistencias. El método
estándar para la detección de resistencias a este compuesto supone un tiempo
elevado, por lo que se realizaron estudios para evaluar dos técnicas comerciales
de detección rápida de resistencia a colistina. Los resultados resaltaron la clara
utilidad de uno de ellos (RAPID TEST POLYMYXIN ACINETOBACTER) y
la más dudosa de la otra (SUPERPOLYMYXIN).
En cuanto a los estudios epidemiológicos que se han llevado a cabo, se han
probado dos técnicas más sencillas y rápidas (rep-PCR y MALDI-TOF MS)
que la considerada “gold standart” (PFGE) para determinar su posible papel
en la identificación y control de los clones resistentes. Los resultados obtenidos
demuestran que, en este momento, ninguna de ellas es comparable al PFGE,
por lo que nuevos estudios y una estandarización más precisa de las diferentes
fases del proceso son necesarias si se quiere contar con un método más simple
para este control.

SUMMARY
Acinetobacter baumannii (AB) is a public health problem due to its ability to
cause outbreaks, remain in the hospital environment, acquire resistance, and
due to the few therapeutic options available for its treatment. It is among the
microorganisms that the WHO has considered as "priority pathogens" due to
their resistance to antibiotics and on which it tries to promote research in order
to combat the pressing problem of the lack of antibiotics with activity against
these microorganisms.
Although it is essential to increase research for the development of new
compounds that are useful for treating infections caused by these bacteria, other
actions are also necessary to combat their antibiotic resistance.
Among these, both the appropriate use of existing antibiotics and the study and
control of any new antibiotics that are developed are important.
During the development of this work, different experiments have been carried
out in order to facilitate the control of the infection caused by AB, seeking both
new treatment options based on novel molecules, termomycin and relebactam,
or the use of combinations of antibiotics, as well as methods simpler
characterization that allow to know the local epidemiology in a fast and simple
way.
This study evaluated the activity of plazomicin, a new aminoglycoside that has
shown its usefulness in treating resistant microorganisms, as a therapeutic
option against carbapenemase-producing Acinetobacter spp. Its activity has
been measured both alone and in combination with other non-aminoglycoside
antibiotics (carbapenems, colistin, tigecycline, fosfomycin). The best results
were obtained in the combinations in which carbapenems participated.
Combinations of two carbapenems also showed promising results by
conventionally used methods (checkerboard and lethality curves) and by using
MALDI-TOF mass spectrometry (MS). The use of this technique to monitor
the activity of the mixture of these two antibiotics has emerged as a novel and

promising tool that can facilitate the detection of synergy when β-lactam or
carbapenem antibiotics are involved.
The combination of imipenem with relebactam, on the other hand, did not show
any advantage over the use of imipenem alone in the treatment of Acinetobacter
baumannii.
Due to the scarcity of molecules for the treatment of multiresistant
microorganisms, colistin has come to be considered a first-line antimicrobial
with the consequent risk of increased resistance. The standard method for
detecting resistance to this compound takes a long time, so studies were carried
out to evaluate two commercial techniques for the rapid detection of colistin
resistance. The results highlighted the clear usefulness of one of them (RAPID
TEST POLYMYXIN ACINETOBACTER) and the more doubtful of the other
(SUPERPOLYMYXIN).
Regarding the epidemiological studies thathave been carried out, two simpler
and faster techniques (rep-PCR and MALDI-TOF MS) than the one considered
"gold standard" (PFGE) have been tested to determine their possible role in the
identification and control of resistant clones. The results obtained show that, at
this time, none of them is comparable to PFGE, so new studies and a more
precise standardization of the different phases of the process are necessary if a
simpler method for this control is to be obtained.

ABREVIATURAS

μg Microgramo
μL Microlitro
Ab antibiótico
AB Acinetobacter baumannii
ABE Acinetobacter bereziniae
ABRC Acinetobacter baumannii Resistente a Carbapenémicos
Acb A. calcoaceticus-A. baumannii
ADC Cefalosporinasa Derivada de Acinetobacter
AK Amikacina
AMG aminoglucósido
AME Enzima Modificadora de Aminoglucósido
BAS Broncoaspirado
BLEE β-Lactamasa de Espectro Extendido
BTS Bruker Bacterial Test Standard
CCI Composite Correlation Index
CMI Concentración Mínima Inhibitoria
CLSI Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio
COL Colistina
Css Concentración en el Estado Estacionario
Da Dalton
DL DiversiLab
DNA Ácido desoxirribonucleico
E-Test Epsilon test
ERT Ertapenem
ESKAPE Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella
pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y
Enterobacter spp.
FDA U.S. FOOD & DRUGS ADMINISTRATION
FIC Concentración Inhibitoria Fraccionada
FN Falso Negativo
FOS Fosfomicina

FP Falso Positivo
H Hora
HCSC Hospital Universitario Clínico San Carlos
IMP Imipenem
IN Infección Nosocomial
LPS Lipopolisacárido
MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time Of Flight
McF McFarland
MDR Multirresistente
mg Miligramo
MHA Mueller Hinton Agar
MHB Mueller-Hinton Caldo
Min Minuto
mL Mililitro
mm Milímetro
Mrp Meropenem
m/z masa/carga
M&M Materiales y Métodos
Nm nanometro
PBP Proteínas de Unión a Penicilinas
PCA Principal Component Analysis,
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa
PLZ Plazomicina
PolB Polimixina B
REL Relebactam
RNA Ácido ribonucleico
RT Acinetobacter Rapid Test Polymyxin Acinetobacter
Rpm revoluciones por minuto
Seg Segundo
STT Steady State Concentration
T2SS Sistema de secreción de tipo II

T6SS Sistema de secreción de tipo VI
TG Tigeciclina
UCI Unidad de Cuidados Intensivos
UFC Unidad Formadora de Colonia
VN Verdadero Negativo
VP Verdadero Positivo
VPN Valor Predictivo Negativo
VPP Valor Predictivo Positivo

INTRODUCCIÓN
Introducción

Acinetobacter spp
Acinetobacter es un género complejo que ha sufrido multitud de cambios en su
taxonomía desde su descubrimiento en 1991 por Rossau et al., (Rossau, R., et
al). Actualmente se clasifica dentro del dominio Bacteria o Eubacteria, filum
Proteobacteria, clase Gammaproteobacteria, orden Pseudomonadales y
familia Moraxellaceae, que incluye los géneros Acinetobacter, Phychrobacter,
Moraxella y Branhamella.
Hay descritas más de 50 especies, muchas de las cuales no tienen nombre
asignado y se denominan como diferentes especies genómicas.
Los principales representantes del género son la especie genómica 1 (A.
calcoaceticus), especie genómica 2 (A. baumannii), especie genómica 3 (A.
pitii) y especie genómica 13TU (A. nosocomialis). Debido a su proximidad
genética, se han agrupado bajo el nombre de complejo A. calcoaceticus-A.
baumannii (Acb). Dentro de este complejo (Acb), la especie A.
calcoaceticus no ha sido implicada en enfermedad clínica, mientras que las
otras tres especies del complejo son quizás las especies del género
Acinetobacter spp. clínicamente más significativas en infección adquirida en la
comunidad y nosocomial (Hart Casares, M., et al).
Todas las especies del género comparten ciertas características bioquímicas,
morfológicas y de crecimiento; son cocobacilos gram negativos (Figura 1A),
aerobios estrictos, inmóviles, no fermentadores de la lactosa, oxidasa negativa
y catalasa positiva. Forman colonias mucosas, no pigmentadas y de pequeño
tamaño (Figura 1B).
La mayoría de las especies crecen en los medios de cultivo convencionales sin
necesidad de factores especiales de crecimiento a temperaturas entre 20 y 37º
C, con una temperatura óptima de crecimiento 33-35 º C.

Introducción

Figura 1. A) Tinción de Gram. B) Aspecto macroscópico de colonias de Acinetobacter
baumannii (AB) en Columbia Agar con 5% de Sheep Blood.

Son bacterias ubicuas y se pueden encontrar en el suelo y el agua, en los
insectos y en especímenes de origen humano y animal (De Vos, D., et al). En
el entorno hospitalario se han aislado en todo tipo de superficies, además de
colonizar la piel de pacientes y del personal sanitario. Esto, unido a su elevada
capacidad de sobrevivir en condiciones hostiles, hace que su control resulte
extremadamente difícil y que se hayan asociado en numerosas ocasiones a la
producción de brotes hospitalarios.
A. baumannii puede causar una amplia variedad de infecciones. La mayoría de
los casos involucran el tracto respiratorio, pero se ha visto implicado en
infecciones urinarias, bacteriemia, meningitis e infección de heridas (Doi, Y.,
et al).
 Importancia nosocomial
La infección nosocomial (IN) es uno de los principales problemas sanitarios en
todo el mundo y supone una causa importante de morbi-mortalidad, aumento
de los días de ingreso y, por tanto, de los costes. Afecta al 5-10% de los
pacientes ingresados y un porcentaje elevado de aquellos casos es evitable
(Motbainor, H., et al; Ahmed Khan, H., et al).
Todos los patógenos pueden estar implicados en IN, sin embargo, los
problemas más graves se circunscriben a un número reducido de especies. Este
A B
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=De%20Vos%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27223476
Introducción

problema se ve agravado porque entre los microorganismos que más
frecuentemente producen IN nos encontramos a los que mayor resistencia a
antibióticos de uso común han desarrollado. Entre estos patógenos
nosocomiales, AB resistente a carbapenémicos (ABCR) merece especial
atención por su capacidad de propagación y por el escaso arsenal terapéutico
disponible para su tratamiento. Por ello, el 27 de febrero de 2017, la OMS
publicó una lista de patógenos prioritarios (Tabla 1) para promover el
desarrollo I+D de nuevos antibióticos en la que ha situado a ABCR como
prioridad 1, crítica (WHO, 2017).

Tabla 1. WHO patógenos prioritarios para promover el desarrollo I+D de nuevos
antibióticos.
*Enterobacteriaceae: Klebsiella pneumoniae, E. coli, Enterobacter spp., Serratia spp.,
Proteus spp., Providencia spp, Morganella spp.
Prioridad 1: Urgencia “Crítica”
Acinetobacter baumannii resistente a carbapenémicos
Pseudomonas aeruginosa resistente a carbapenémicos
Enterobacteriaceae*, resistente a carbapenémicos y cefalosporinas de 3ª
generación
Prioridad 2: Urgencia “Alta”
Enterococcus faecium resistente a vancomicina
Staphylococcus aureus meticilin-resistente y resistente o sensibilidad
disminuída a vancomicina
Helicobacter pylori resistente a claritromicina
Campylobacter y Salmonella spp. resistente a fluoroquinolonas
Neisseria gonorrhoeae resistente a cefalosporinas de 3ª generación y
fluoroquinolonas
Prioridad 3: Urgencia “Media”
Streptococcus pneumoniae resistente a penicilina
Haemophillus influenzae resistente a ampicilina
Shigella spp. resistente a fluoroquinolonas
Introducción

Su capacidad de supervivencia a largo plazo en el hospital, combinada con la
resistencia a los antibióticos y un potencial de reorganización genómica
dinámica bajo presión selectiva, hacen queAB y, en menor medida, las
especies estrechamente relacionadas A. pittii y A. nosocomialis sean
considerados como importantes agentes patógenos (De Vos, D., et al).
Además, el aumento del uso de nuevos tratamientos inmunosupresores y
técnicas de diagnóstico invasivas han permitido que AB haya podido llegar a
estructuras internas y pasar de ser un colonizador y patógeno ocasional a ser un
habitual en las infecciones nosocomiales.

 Factores de riesgo y virulencia
Se han identificado múltiples factores de riesgo para el desarrollo de
infecciones entre los que se incluyen: i) enfermedad de base grave, ii)
ventilación mecánica prolongada, iii) antibioterapia previa, iv) colonización
anterior por AB y v) estancia prolongada en las unidades de cuidados intensivos
(UCI) (Doi, Y., et al).
En cuanto a los factores de virulencia, hay pocos estudios sobre ellos, pero se
piensa que son varios los que contribuyen a potenciar la patogenicidad de este
microorganismo.
- Porinas
Son proteínas de membrana externa que modulan la permeabilidad celular
(Figura 2). OmpA es la proteína de membrana más abundante en AB (Lee,
CR., et al). Posee varias funciones biológicas y se considera uno de los
principales determinantes en su capacidad de virulencia (Nie, D., et al). OmpA
es esencial para la adhesión e invasión de células epiteliales, estimula la
respuesta inmune innata que desencadena edema, disfunción mitocondrial y,
finalmente, apoptosis. Está implicada en la resistencia al sistema del
complemento e induce la formación de biofilm, dos importantes mecanismos
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=De%20Vos%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=27223476
Introducción

que contribuyen a su supervivencia, tanto dentro como fuera del hospedador
(Rodríguez, RD., et al).

Figura 2. Porina que permite la entrada del antibiótico y bombas de eflujo que permiten su
expulsión. (Imagen modificada de Nature Reviews | Drug Discovery).

- Lipopolisacárido (LPS)
El LPS es el componente principal de la membrana externa en la mayoría de
las bacterias gram negativas. Junto con las fimbrias permite la adhesión a las
células epiteliales humanas, lo que desempeña un papel importante en su
virulencia y supervivencia (Barletta Farías, RC., et al).
- Fosfolipasas
Son enzimas lipolíticas esenciales para el metabolismo de los fosfolípidos y
han sido identificadas como factores de virulencia en múltiples bacterias.
Existen tres clases, A, C y D; son la C y la D identificadas en AB. La
degradación de los fosfolípidos afecta a la estabilidad de las membranas
celulares del huésped, permitiendo la entrada del microorganismo (Barletta
Farías, RC., et al; Lee CR et al).
Introducción

- Vesículas de membrana externa
Son secretadas por la membrana externa de varios microorganismos gram
negativos. Están compuestas por LPS, OmpA, proteasas, DNA o RNA, y
actúan como vehículo de entrada de factores de virulencia en las células del
hospedador sin un contacto cercano entre la bacteria y dichas células, lo que
las protege de la respuesta inmune (Barletta Farías, RC., et al).
- Sistemas de secreción de proteínas
Se han identificado varios sistemas de secreción de proteínas en AB (Lee, CR.,
et al). El sistema de secreción en AB descrito más recientemente es un sistema
de secreción de tipo II (T2SS). El T2SS es un complejo de múltiples proteínas
que transloca una amplia gama de proteínas desde el espacio periplásmico al
medio extracelular. AB también tiene un sistema de secreción de tipo VI
(T6SS). Muchas bacterias usan el T6SS para inyectar proteínas efectoras y
proporcionan una ventaja de colonización durante la infección de huéspedes
eucariotas o para matar bacterias competidoras (Lee, CR., et al).
- Proteínas de Unión a Penicilinas (PBP)
Estas proteínas se conocen principalmente por su función de inactivación de
antibióticos β-lactámicos, pero también participan en la biosíntesis de
peptidoglicano, componente principal de la pared celular bacteriana, lo que
contribuye a la estabilidad y persistencia de la célula bacteriana (Barletta
Farías, RC., et al).
- Formación de biofilm
La capacidad de AB para formar biopelículas le ha permitido su crecimiento y
supervivencia en condiciones desfavorables. Las bacterias en las biopelículas
son más resistentes a la desecación, la acción del sistema inmunitario, los
antibióticos y otros agentes antibacterianos. Algunos factores que contribuyen
a la formación de la biopelícula de AB incluyen pili, proteínas de la membrana
externa y polisacárido extracelular (Doi, Y., et al).
Introducción

- Sideróforos (acinetobactina)
Aunque el hierro es uno de los elementos más abundantes en los sistemas
ambientales y biológicos, el hierro férrico tiene una disponibilidad
relativamente baja para las bacterias, debido a su escasa solubilidad. Para
superar esta limitación, la mayoría de las bacterias aeróbicas producen un
quelante de hierro de alta afinidad conocido como sideróforo, que le permite
obtener del medio el hierro necesario para su crecimiento y supervivencia. La
acinetobactina es el sideróforo más estudiado en AB (Lee, CR., et al).
Dada la falta de nuevos antimicrobianos, los factores de virulencia se han
convertido en objetivos terapéuticos novedosos para el diseño de fármacos
(Doi, Y., et al).

 Mecanismos de resistencia y patogenicidad
Existen múltiples definiciones de multirresistencia. Probablemente, la
descripción más aceptada de AB multirresistente (MDR) sería: “aquel que
muestra resistencia al menos a dos de los siguientes antibióticos: cefalosporinas
antipseudomónicas (ceftazidima, cefepime), carbapenémicos
antipseudomónicos (imipenem, meropenem), fluoroquinolonas
(cicprofloxacino, levofloxacino), aminoglucósidos (gentamicina, tobramicina,
amikacina) o sulbactam” (Barletta Farías, RC., et al).
La resistencia a los antibióticos se podría clasificar en intrínseca o adquirida
(Figura 3).
Introducción

Figura 3. Diferentes ejemplos de mecanismos de resistencia a antibióticos. (Imagen
modificada de Nature Reviews | Drug Discovery).

La resistencia intrínseca de AB a los antibióticos se debe a la asociación de
múltiples factores:
- Posee una membrana externa de elevada impermeabilidad que se
asocia a la pérdida o disminución de la expresión de porinas y,
probablemente, también a la sobreproducción de bombas de eflujo
(Cayô, R., et al).
- Por otra parte, la plasticidad de su genoma (Figura 4) le permite
incorporar genes de resistencia a antibióticos ligados a plásmidos,
transposones y otros elementos genéticos móviles. Estas secuencias
grandes de DNA que se han adquirido de otros organismos se
denominan islas de resistencia y existen varias conocidas, que difieren
según el tipo de clon (Lee, Y., et al).

Las especies de Acinetobacter, además de adquirir genes de resistencia
procedentes de otros microorganismos, pueden desarrollar a lo largo del tiempo
mutaciones que ocasionan resistencia o, bajo presión antimicrobiana selectiva,
determinadas subpoblaciones con resistencia preexistente emergen y se hacen
dominantes. Estos tres procesos no son excluyentes y probablemente coexistan
en las cepas de Acinetobacter spp. resistentes (Rodríguez, RD., et al).
Introducción

Figura 4. Ilustración del genoma completo de AB (Korotetskiy, IS., et al).

Los diferentes mecanismos de resistencia adquirida se podrían agrupar en
enzimáticos (enzimas modificadoras de antimicrobianos) y no enzimáticos
(limitación del acceso y mutaciones de las dianas terapéuticas).
- Enzimáticos
Este mecanismo de resistencia conlleva la inactivación del agente
antimicrobiano a través de una modificación o hidrólisis del mismo. Los dos
sistemas enzimáticos más importantes en AB son:
 β-lactamasas
La mayoría de los aisladosclínicos de AB son resistentes a cefalosporinas,
incluidas las de 3ª y 4ª generación. Esto es debido a la producción de la β-
lactamasa AmpC (llamada ADC [Cefalosporinasa Derivada de
Acinetobacter]). En AB no se considera inducible; sin embargo, la expresión
de ADC β-lactamasa aumenta por la adquisición de ciertas secuencias de
inserción. Además, también pueden producir β-lactamasas de espectro
extendido (BLEE), las cuales también producen resistencia a cefalosporinas.
La resistencia a carbapenémicos es debida a la producción de carbapenemasas
que pueden ser intrínsecas o adquiridas. AB produce naturalmente
Introducción

carbapenemasas del grupo OXA-51, codificadas cromosómicamente a un nivel
bajo, pero la adquisición de un promotor más fuerte mediante la transposición
de una secuencia de inserción, análoga al caso con ADC, puede conducir a la
elevación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) de carbapenémicos.
Entre las adquiridas hay cinco grupos principales de carbapenemasas del grupo
OXA en AB, OXA-23, -40, -58, -143 y -235. También se han observado en
esta especie carbapenemasas no pertenecientes al grupo OXA, que se han
diseminado entre la familia Enterobacteriaceae. Entre ellas podemos destacar
las metalo-β-lactamasas, NDM, IMP-1, IMP-2, IMP-4, IMP-5, VIM-2, SIM y
las carbapenemasas del grupo KPC (Doi, Y., et al).

 Enzimas Modificadoras de Aminoglucósidos (AMEs)
El principal mecanismo de resistencia de las bacterias gram negativas y gram
positivas a los aminoglucósidos es la modificación enzimática de los grupos
amino o hidroxilo de estos antibióticos (Figura 5).
Las enzimas modificadoras se pueden clasificar en fosfotransferasas,
nucleotidiltransferasas y acetiltransferasas (Lee, CR., et al). Estas enzimas
están presentes principalmente en elementos transponibles y se transfieren
entre las diferentes bacterias patógenas, con lo que causan así una diseminación
de la resistencia. Pueden también tener localización cromosómica (Rodríguez,
RD., et al).
Las tres enzimas más prevalentes son: AAC(3)-II, AAC(6’)-I y APH(3´)-VI.
Figura 5. Grupos amino e hidroxilo de un antibiótico aminoglucósido sobre los que actúan
las diferentes AMEs.
Introducción

- No enzimático: impermeabilidad (bombas o pérdida de porinas) y
modificación de la diana terapéutica
Las bombas de eflujo son unos transportadores capaces de expulsar, de manera
más o menos inespecífica, un amplio número de sustratos. Podemos
clasificarlas en 5 familias (Tabla 2) que se diferencian principalmente en la
fuente de energía que utilizan para la expulsión de sustratos (Spinali, S., et al;
Rossau, R., et al):
- Superfamilia RND (“Resistance-nodulation-cell division”)
- Superfamilia MFS (“Major facilitator superfamily”)
- Familia MATE (“Multidrug and toxic compound extrusion”)
- Familia SMR (“Small multidrug resistance”)
- Transportadores ABC (“ATP-binding casette”)

Tabla 2. Principales representantes de las familias de bombas de eflujo.

La modificación de la diana terapéutica (modificación, protección o
hiperproducción) es otro de los mecanismos implicados en la resistencia a los
antimicrobianos. La alteración de la diana se traduce en una pérdida de afinidad
Familia Principales representantes
RND AdeABC, AdeIJK, AdeFGH
MFS
TetA, TetB, CmlA, CrA, AmvA,
AbaF
MATE AbeM
SMR AbeS
Introducción

y, por tanto, imposibilita que el antibiótico pueda terminar con el
microorganismo. Esta mutación se puede dar a distintos niveles, según el
antimicrobiano implicado.
Existen multitud de mecanismos de resistencia no enzimáticos y éstos varían
de unos antibióticos a otros.
En la tabla 3 se resumen los diferentes mecanismos de resistencia (enzimáticos
y no enzimáticos), clasificados por familia de antibiótico.

Tabla 3. Principales mecanismos de resistencia y proteínas implicadas por clase de
antimicrobiano.
Antimicrobiano Proteínas relacionadas Descripción
β-lactámicos ADC AmpC β-lactamasa intrínseca
(cromosómica)
CTX-M-2, CTX-M-43,
BEB-1, PER-1, PER-2,
TEM-92, TEM-116, GES
β-lactamasa de esprectro
extendido adquirida
OXA-51-Group Oxacilinasa (cromosómica)
OXA-23/40/58/143/235-
Group
Oxacilinasas
NDM, IMP-1, IMP-2, IMP-
4, IMP-5, VIM-2, SIM
Metalo-β-lactamasa
KPC Oxacilinasa
TEM-1 y TEM-2 β-lactamasa de espectro
ampliado
PBP2 Proteína de unión a penicilina
(reducción de la
expresión/alteración)
AdeABC Bombas de eflujo multifármaco
Introducción

Antimicrobiano Proteínas relacionadas Descripción
β-lactámicos CarO OMPs (proteínas de membrana
externas)
Rifampicina RpoB RNA polimerasa subunidad- β
Desconocido Bombas de eflujo
Arr ADP-ribosiltransferasa
Aminoglucósidos AAC N-acetiltransferasas
APH O-fosfotranferasas
AAD O-adeniltransferasa o O-
nucleotidiltransferasas
Aminoglucósidos ArmA Metil-transferasa. Metilación
del sitio 16S rRNA
RmtB Metil-transferasa. Metilación
del sitio 16S rRNA
AdeABC
AdeM
Bombas de eflujo multifármaco
Fluoroquinolonas GyrA DNA girasa (modificación de
aminoácidos)
ParC DNA Topoisomerasa IV
(modificación de aminoácidos)
AdeFGH (10) AdeABC y
AdeM (11)
Bombas de eflujo
Colistina PmrCAB Modificación de aminoácidos
LpxA/C/D Pérdida LPS
Tetraciclinas Tet(30)/(39)/(A)/(B) Bombas de eflujo
AdeABC/FGH/IJK Bombas de eflujo
Introducción

 Opciones terapéuticas
El tratamiento de las infecciones por microorganismos gram negativos
multirresistentes es uno de los mayores problemas de salud pública en la
actualidad y AB sigue siendo uno de los patógenos más complicados. Se
considera un patógeno único y forma parte del grupo ESKAPE (Enterococcus
faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter
baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter spp.), cuyos miembros
destacan por su resistencia y su asociación con resultados clínicos negativos
(Wenzler, E., et al).
El aspecto más importante a la hora de tratar pacientes infectados por AB es la
instauración temprana de una terapia antimicrobiana apropiada. Los retrasos se
han asociado con una mayor mortalidad (Wenzler, E., et al).
Debido a la resistencia intrínseca a la mayoría de β-lactámicos y la adquisición
de numerosos mecanismos de resistencia a otros antibióticos, los
carbapenémicos han sido considerados como los agentes de elección en las
infecciones causadas por estos microorganismos. Sin embargo, la resistencia a
estos antibióticos ha ido en aumento y se ha llegado a describir en 2011 un
porcentaje de Acinetobacter resistentes a carbapenémicos del 85% (Wenzler,
E., et al).
En este punto, muchos expertos recomiendan la terapia combinada, que,
además, podría ofrecernos la ventaja de un posible efecto sinérgico y evitar la
aparición de resistencias. La elección de una terapia combinada se basa en
resultados de estudios in vitro debido a la dificultad para realizar estudios
prospectivos y retrospectivos in vivo. Por ello, son necesarios nuevos estudios
in vitro que evalúen la eficacia y seguridad de las combinaciones de
antibióticos que podrían ser consideradas en la práctica clínica.

Introducción

- β-lactámicos
Son antibióticos que ejercen su actividad antimicrobiana mediante la inhibición
de la síntesis de la pared celular mediada por proteínas de unión a penicilina,
lo que conduce a la muerte celular.
La sensibilidad de AB a estos antibióticos es variable. Si conservan la
sensibilidad, podrían usarse cefalosporinas antipseudomónicas, como
ceftazidima y cefepime, piperacilina-tazobactam o carbapenémicos.
A pesar del aumento de resistencia anteriormente mencionado, los
carbapenémicos siguen siendo el tratamiento de elección, si los aislados son
sensibles.
El cefiderocol es una nueva cefalosporina sideróforo activa contra bacilos gram
negativos, que incluye cepasde enterobacterias y no fermentadores con
fenotipos de resistencia difíciles de tratar. Su notable espectro de actividad,
hasta ahora único, depende principalmente de dos características: 1) su
captación a través de la membrana externa bacteriana y a través de
transportadores de hierro, lo que mejora la acumulación del fármaco en el
espacio periplásmico, con lo que anula así la acción de las bombas de expulsión
y las alteraciones de las porinas; y 2) una notable estabilidad, probablemente
conferida por modificaciones en las cadenas laterales C-7 y C-3, frente a todas
las clases de β-lactamasas, incluidas las carbapenemasas (tanto
carbapenemasas de serina, como los tipos KPC y OXA, y metaloenzimas, como
NDM, VIM, IMP) (Giacobbe, DR., et al).

Introducción

- Aminoglucósidos
Los aminoglucósidos son una familia de antibióticos que ejercen su acción
mediante la unión a las subunidades 30S y 50S del ribosoma bloqueando la
lectura del RNA mensajero y como consecuencia la síntesis proteica.
La amikacina principalmente y la tobramicina son los más activos frente a
AB, pero no deben ser utilizados en monoterapia (Wenzler, E., et al).
La plazomicina es un nuevo antibiótico semisintético que tiene como ventaja
sobre el resto de aminoglucósidos que no es inhibido por enzimas
modificadoras de aminoglucósidos (principal mecanismo de resistencia frente
a estos antimicrobianos). Aun así, la plazomicina en monoterapia no ha
mostrado mejor actividad frente a AB que otros aminoglucósidos
(Karakonstantis, S., et al).
- Polimixinas
La colistina es un péptido catiónico cíclico que se une al lípido A para iniciar
su actividad bactericida. Es utilizada como último recurso para el tratamiento
de ABRC, y su resistencia se ha convertido en un problema grave, ya que no
existen alternativas terapéuticas disponibles (Fam, NS., et al). La mayoría de
los aislamientos siguen siendo susceptibles a la colistina, pero el uso creciente
de polimixinas como medicamentos de último recurso para el tratamiento de
infecciones por AB ha llevado a la aparición de resistencias (Doi, Y., et al;
Rodriguez, CH., et al).
- Tetraciclinas
Las tetraciclinas ejercen su acción mediante unión a la subunidad ribosómica
30S.
La minociclina es una molécula de alta efectividad y seguridad que tiene una
excelente actividad in vitro contra AB, incluidos los aislados que son MDR, y
mantiene la actividad antimicrobiana incluso contra cepas de AB resistentes a
otras tetraciclinas y gliciclinas.
Introducción

La doxiciclina presenta tasas de resistencia significativamente más altas y rara
vez se utiliza para el tratamiento de infecciones por AB.
La tigeciclina, un derivado semisintético de la minociclina, también mantiene
una excelente actividad in vitro y se ha utilizado con éxito tanto sola como en
combinación con colistina (Wenzler, E., et al).
La evaraciclina es una nueva tetraciclina más potente que la tigeciclina y
podría ser una opción en cepas de AB resistentes a tigeciclina
(Karakonstantis, S., et al).
- Ampicilina/sulbactam
Sulbactam es un inhibidor de la sulfona β-lactamasa del ácido penicilánico con
actividad intrínseca in vitro contra AB, aunque la CMI ha mostrado un aumento
constante en la última década.
Varias series de casos y de estudios observacionales han demostrado la eficacia
de la combinación de ampicilina y sulbactam contra las infecciones por AB.
Cuando el aislado de AB es susceptible a ampicilina-sulbactam, la eficacia
parece ser comparable a otros agentes, incluidos los carbapenémicos y las
polimixinas (Wenzler, E., et al).
- Rifampicina
La rifampicina ejerce su actividad uniéndose a la RNA polimerasa bacteriana
e inhibiendo el inicio de la transcripción. Ha mostrado actividad frente a AB
multirresitente en estudios in vivo e in vitro (Wenzler, E., et al).
Como se ha indicado anteriormente, los problemas a la hora de tratar las
infecciones por AB han hecho que muchos expertos recomienden la terapia
combinada para evitar fracasos terapéuticos y la aparición de resistencias.
Las combinaciones sinérgicas basadas en polimixina (con rifampicina,
carbapenémicos, ampicilina/sulbactam, fosfomicina, glicopéptidos, tigeciclina
y minociclina) son las más estudiadas, pero se han probado predominantemente
Introducción

contra AB sensible a polimixina y resistente a carbapenémicos
obteniéndose beneficio clínico (Jinxin, Z., et al; Karakonstantis, S., et al).
Se ha visto también la existencia de sinergia entre la colistina y agentes que no
son activos contra las bacterias gram negativas (como linezolid y
vancomicina), lo que sugiere que la colistina puede ejercer un efecto de
permeabilización que permite una mayor entrada de otros fármacos en las
bacterias (Karakonstantis, S., et al).
También se han propuesto combinaciones a base de tigeciclina y
ampicilina/sulbactam, pero se han estudiado principalmente contra cepas
sensibles a estos antibióticos (Karakonstantis, S., et al).

MALDI TOF
El espectrómetro de masas MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption-
Ionization Time Of Flight) (Figura 6) es un dispositivo de diagnóstico clínico
empleado en los laboratorios de microbiología, que en pocos años ha
reemplazado las técnicas convencionales de identificación en muchos
laboratorios de todo el mundo. Se compone de tres unidades principales: i) una
fuente de iones, ii) un analizador de masas que permite la separación de iones
según la relación masa/carga (m/z) y, por último, iii) un dispositivo de
detección para monitorear iones separados.
Actualmente hay disponibles dos sistemas MALDI-TOF: MALDI Biotyper
System (Bruker Daltonics, Heidelberg, Alemania) y VITEK MS (bioMerieux,
Marcy l’Etoile, Francia). Ambos han sido acreditados para fines de
identificación en laboratorios de microbiología clínica en varios países
europeos.

Introducción

 Identificación
La identificación de microorganismos se basa en la determinación de los
analitos cocristalizados con una matriz apropiada que, tras la acción de un láser
UV, son convertidos en iones de distintos tamaños. Estos iones atraviesan un
acelerador, vuelan a través de un tubo y son separados en función de su relación
m/z (Figura 6). Cuando los iones alcanzan el final del tubo, llegan a un detector
de vuelo (TOF; Time Of Flight) que se utiliza para calcular la masa de los iones.
Con estos datos se crea un espectro y se analizan con respecto a la frecuencia,
posición e intensidad de los picos en el espectro. El espectro desconocido se
convierte en una lista de picos de masa y sus intensidades correspondientes.
Más tarde, estos espectros se comparan con los espectros principales en la base
de datos Biotyper. El sistema Biotyper asigna una puntuación entre cero y tres
al espectro de acuerdo con la comparación de la lista de picos desconocidos
con la lista de picos de espectros de referencia de la base de datos. Los
resultados de la identificación MALDI Biotyper se basan en la interpretación
del score o puntuación (Tabla 4) de la mejor coincidencia.

Tabla 4. Score para la interpretación de resultados de identificación obtenidos mediante
MALDI-TOF.
Valor de Score Interpretación
0.000-1.699
1.700-1.999
2.000-2.299
2.300-3.000
Identificación no fiable
Identificación probable en género
Identificación de género segura, probable de especie
Identificación con alta probabilidad en el género y
especie

Introducción

Figura 6. Esquema funcionamiento MALDI-TOF

Además de su uso con fines de identificación, la espectrometría de masas
MALDI-TOF tiene otras posibles aplicaciones en el campo de la
microbiología, entre las que cabe destacar la detección de resistencia a
antibióticos y la tipificación.
Se están realizando numerosos ensayos y, aunque la tipificación todavía se
encuentraen desarrollo, existen métodos comercializados actualmente para la
detección de resistencia a antibióticos.

 Resistencia a antibióticos
La detección temprana y el perfil de resistencia a los antibióticos son cruciales
para controlar la infección por bacterias multirresistentes, ya que permiten la
administración de una terapia adecuada y el establecimiento de medidas de
control de infección específicas.
Hasta ahora, la detección microbiológica se basaba en pruebas fenotípicas que
podían demorar el resultado hasta 18-24 horas y muchas veces son insuficientes
Introducción

para detectar ciertos mecanismos de resistencia. Los métodos genotípicos son
más rápidos, específicos y sensibles, pero también son más costosos y
laboriosos.
En este contexto, el uso del MALDI-TOF para estos fines puede suponer un
importante avance para los laboratorios de microbiología. El análisis de la
resistencia antibiótica mediante espectrometría de masas puede realizarse con
distintos enfoques.
- Detección de mecanismos de resistencia basados en degradación
enzimática
Durante los últimos años se ha producido un progreso significativo en la
identificación de mecanismos de resistencia basada en la degradación
enzimática, sobre todo en la detección de β-lactamasas. Los antibióticos β-
lactámicos, después de la hidrólisis del anillo de β-lactámicos por β-lactamasas,
generan productos de diferente masa que resultan de la adición de una molécula
de agua (Sparbier, K., et al).
- Detección de resistencias mediante el estudio del perfil proteico
bacteriano
Se basa en identificar las diferencias en el espectro de proteínas entre
microorganismos resistentes y microorganismos susceptibles de la misma
especie. Esta técnica se ha utilizado con éxito en una serie de estudios
realizados en laboratorios clínicos (S. aureus meticilin-resistente), aunque
necesita optimización y validación (Spinali, S., et al).
- Detección de resistencias por marcación con isótopo radiactivo
estable
Recientemente, se ha desarrollado un nuevo método basado en MALDI-TOF
para la detección de resistencia mediante el uso de medios de cultivo marcados
con isótopos estables. Solo los microorganismos resistentes pueden crecer en
presencia de antimicrobianos. Los microorganismos resistentes incorporan
aminoácidos marcados isotópicamente, lo que aumenta las masas de proteínas
Introducción

y, por lo tanto, conduce a cambios de masa de sus picos provocando un cambio
en el espectro con respecto a los microorganismos susceptibles (SEIMC
Procedimiento 65).

 Epidemiología
El método más eficaz para la prevención y el correcto manejo de las IN pasa
por el diseño, desarrollo y validación de las técnicas microbiológicas para la
detección precoz de los patógenos nosocomiales y el tipado de las cepas
implicadas con objeto de determinar su relación epidemiológica (Spinali, S.,
et al). Las técnicas de las que se dispone actualmente, aunque útiles, son muy
laboriosas. Por ello, el desarrollo de métodos simples y eficaces que permitan
agilizar estos procesos es prioritario. La rapidez con la que la espectrometría
de masas es capaz de analizar los aislados bacterianos hace que, a priori,
aparezca como una herramienta interesante en este campo. La aplicación de
esta técnica en los estudios de tipado se basa en el uso de un algoritmo que
determina la relación existente entre determinaciones individuales de cada
aislado. Los distintos espectros se representan en forma de dendograma, donde
la distancia entre los distintos brazos está directamente relacionada con la
similitud entre los espectros y, por tanto, la similitud entre los aislados. Esta
aplicación está en fase de desarrollo y el número de estudios al respecto sigue
aumentando.

Introducción

Rep-PCR
Es un método de tipificación molecular muy utilizado en los brotes. Esta
técnica utiliza cebadores que hibridan con secuencias específicas de DNA
repetitivas (secuencias rep), de función desconocida, que se encuentran
dispersas por el genoma de muchas bacterias. Existen 3 tipos de familias de
secuencias repetitivas: las secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas
(secuencias REP), las secuencias consenso repetitivas intragénicas de
enterobacterias (secuencias ERIC), y las secuencias o elementos BOX. Las
secuencias REP son las más utilizadas (Fernández Cuenca, F., et al).
Es una técnica sencilla, rápida, reproducible y económica. Además, existen
diferentes sistemas de rep-PCR comerciales, como el sistema DiversiLab (DL)
(BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia, el cual ya no está disponible en nuestro
país), que es un sistema de PCR semiautomático basado en secuencias
repetitivas diseñado para la genotipificación rápida y de alto rendimiento
(Deplano, A., et al).

OBJETIVOS

Objetivos

Los objetivos que se han planteado para este trabajo son:

1- Evaluar la actividad in vitro de la plazomicina sola o en combinación
con antibióticos de otras familias.

2- Identificar y caracterizar molecularmente la presencia de enzimas
modificadoras de aminoglucósidos y metilasas frecuentes (armA) y
relacionar las enzimas que se detecten con el fenotipo de resistencia a
aminoglucósidos, incluida la plazomicina.

3- Evaluar la capacidad de detección de la resistencia a la colistina en
Acinetobacter spp. de dos técnicas comerciales.

4- Valorar la capacidad sinérgica de los carbapenémicos cuando se
combinan entre sí frente a aislados de Acinetobacter baumannii
productores de carbapenemasas.

5- Determinar si el relebactam mejora la actividad del imipenem contra
aislados de Acinetobacter baumannii resistentes a este antibiótico.

6- Comparar distintos métodos de tipado de microorganismos y el
análisis de relaciones clonales entre aislados.

7- Establecer factores que condicionen el análisis epidemiológico de
Acinetobacter baumannii por espectrometría de masas MALDI-TOF.

8- Estudiar la aplicabilidad de la espectrometría de masas MALDI-TOF
para el estudio de sinergias con combinaciones de carbapenémicos

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y Métodos
31

Aislados clínicos

Se utilizó una colección de cepas de Acinetobacter spp. parcialmente
caracterizadas (Anexo I), a la que se añadieron nuevos aislados con
características relevantes para algunos de los ensayos realizados (aislados con
sensibilidad reducida a colistina y/o con resistencia a carbapenémicos y
portadores de la enzima OXA-23).
Para los estudios de sensibilidad a antibióticos se emplearon como controles 3
cepas de la colección ATCC: i) Escherichia coli 25922, ii) Enterococcus
faecalis 29212 y iii) Pseudomonas aeruginosa 27853.
También se incluyeron dos cepas de K. pneumoniae portadoras de la enzima
carbapenemasa KPC en los ensayos de combinación de imipenem con
relebactam.
Todas las cepas utilizadas, tanto las nuevas como las pertenecientes a la
colección, volvieron a identificarse mediante espectrometría de masas
MALDI-TOF. Para ello, se utilizó un pase fresco del microorganismo en una
placa agar sangre (Biomerieux). Se trabajó a partir de colonia aislada
empleándose una porción de la misma equivalente a 104 - 105 unidades
formadoras de colonias (UFC).
Esta cantidad, se depositó directamente sobre una placa metálica (Bruker
Daltonik GmbH) para, posteriormente, añadir 1µL de una solución saturada de
ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en acetonitrilo 50% y solución de ácido
trifluoroacético al 2,5%. Esta solución, denominada matriz, facilita la
ionización de las proteínas utilizadas para la identificación. La combinación
muestra-matriz se dejó secaral aire y se introdujo en el espectrómetro de masas
para proceder al análisis de la muestra (Maldonado, N., et al). Los espectros
obtenidos se recogieron usando un Microflex LT controlado por el software
FlexControl (Bruker Daltonik) en modo lineal positivo y con un rango de masa
de 2-20 kDa (Figura 7).

Materiales y Métodos
32

Los datos se adquirieron automáticamente mediante el software de control de
adquisición AutoXecute y se importaron al software Biotyper (Bruker Daltonik
GmbH); la identificación se realizó en base a la coincidencia con los espectros
de las especies de la base de datos de referencia de Biotyper. La identificación
se consideró válida a nivel de especie cuando el score obtenido fue ≥2 (Tabla
4).

Figura 7. Espectro AB (superior) y K. pneumoniae (inferior) obtenido por MALDI-TOF.

Materiales y Métodos
33

Estudios de sensibilidad
Se utilizaron diferentes técnicas para llevar a cabo los estudios de sensibilidad
a antimicrobianos. Los antibióticos empleados (Tabla 5) fueron aquellos que
presentaban interés para el desarrollo de los ensayos posteriores.

Tabla 5. Lista de antibióticos incluidos en el estudio y disolventes usados de acuerdo al
CLSI.
Antibióticos Disolvente
Aminoglucósidos
Kanamicina
Neomicina
Netilmicina
Gentamicina
Tobramicina
Amikacina
Plazomicina
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Agua
Carbapenémicos / Carbapenémicos-inhibidor
Imipenem
Meropenem
Relebactam
Buffer fosfato pH 7.2, 0.01mol/L
Agua
Agua
Otros
Tigeciclina
Fosfomicina
Colistina
Agua
Agua
Agua

Materiales y Métodos
34

 Método de dilución en agar
Es una técnica que permite medir la actividad in vitro de un antimicrobiano a
varios aislados a la vez.
Se utilizó para determinar la concentración mínima inhibitoria a los diferentes
aminoglucósidos: plazomicina, amikacina, gentamicina y tobramicina,
siguiendo los métodos y criterios establecidos por el Instituto de Normas
Clínicas y de Laboratorio (CLSI).
Para su ejecución se llevaron a cabo los siguientes pasos:

1. Preparación de las soluciones madre de los diferentes antibióticos
La actividad de un antimicrobiano puede variar entre los diferentes productores
y entre los distintos lotes de un mismo productor; por ello, es importante
conocer la potencia y en base a ella calcular la cantidad necesaria para las
diferentes diluciones. El cálculo de la cantidad de antibiótico necesario para las
diluciones se realizó mediante la aplicación de la siguiente fórmula:

Peso (mg) = Volumen (mL) x Concentración (μg/mL)/Potencia
(μg/mg)

Para la preparación de las soluciones madre se utilizaron los solventes
recomendados por el CLSI (Tabla 5).

2. Preparación de las placas
Se prepararon placas de concentraciones crecientes de los diferentes
antibióticos, utilizando como medio de cultivo Mueller Hinton Agar (MHA) en
una proporción 1:9 (1 parte de dilución de antimicrobiano por 9 de medio de
cultivo atemperado). Las concentraciones que se ensayaron fueron desde
0,12µg/mL hasta 1024µg/mL. El esquema de diluciones se realizó de acuerdo
con los protocolos del CLSI.
Materiales y Métodos
35

3. Preparación del inóculo
Se preparó una dilución 1:10 a partir de una suspensión de cada cepa en suero
salino con una turbidez de 0,5 McFarland (McF). Las diluciones así preparadas
se depositaron en los correspondientes pocillos del replicador.

4. Inoculación de las placas
Para inocularlas se usó un replicador automático de Steers (Figura 8). Este
dispositivo permite aplicar, de manera rápida y simultánea, hasta 36
microorganismos diferentes sobre la superficie del agar. En todos los ensayos
se incluyeron placas sin antibiótico al principio y al final de cada serie con el
fin de controlar el crecimiento y la posibilidad de contaminación en el proceso.
Se utilizaron como control interno 3 cepas ATCC (E. coli, E, faecalis, P.
aeruginosa).

Figura 8. Replicador automático de Steers y placa inoculada.

5. Incubación
Una vez inoculadas las placas, se incubaron durante 18-24 horas a 35 ± 2ºC en
atmósfera aerobia.

Materiales y Métodos
36

6. Lectura e interpretación
Se consideró la CMI como la menor concentración de antimicrobiano que
inhibió el crecimiento visible de cada cepa.
Para clasificar nuestros aislados como sensibles o resistentes se utilizaron los
criterios del CLSI que se detallan en la tabla 6.

Tabla 6. Tabla de puntos de corte clínicos CLSI.

CMI
(µg/mL)
Contenido
del disco
(µg)
Diámetro del halo (mm)
S≤ I R> S≥ I R<
Carbapenémicos/Carbapenémicos-inhibidores
Imipenem 2 4 4 10 22 19-21 18
Imipenem-
relebactam 1 2 4 10-25 25 - 21-24
Meropenem 2 4 8 10 18 15-17 14
Aminoglucósidos
Amikacina 16 32 64 30 17 15-16 14
Gentamicina 4 8 16 10 15 13-14 12
Tobramicina 4 8 16 10 15 13-14 12
Kanamicina 16 32 64 30 18 14-17 13
Neomicina** NA NA NA 30 16 - -
Netilmicina*** 8 16 32 30 16 - -
Plazomicina 2 4 8 - NA NA NA
Otros antimicrobianos
Tigeciclina* 2 - 8 - NA NA NA
Tetraciclina 4 8 16 30 11 - 15
Minociclina 4 8 16 30 12 - 16
Fosfomicina NA NA NA - NA NA NA
Colistina 2 - 4 - NA NA NA
NA: No aplica.
*FDA
**No hay puntos de corte establecidos. Se utilizaron los publicados previamente por
Bessa, GR., et al.
***Comité de l´antibiogramme de la société Française de Microbiologie.

 Método de difusión en disco
Se utilizó el método de difusión en disco para determinar la sensibilidad de los
aislados a tres aminoglucósidos (kanamicina, neomicina y netilmicina) de los
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Rationale_documents/Imipenem_EUCAST_Rationale_Document_1.3_090601.pdf
http://mic.eucast.org/SearchController/search.jsp?action=performSearch&BeginIndex=0&Micdif=mic&NumberIndex=50&Antib=52&Specium=-1
https://mic.eucast.org/Eucast2/SearchController/search.jsp?action=performSearch&BeginIndex=0&Micdif=mic&NumberIndex=50&Antib=865&Specium=-1
https://mic.eucast.org/search/
http://mic.eucast.org/SearchController/search.jsp?action=performSearch&BeginIndex=0&Micdif=mic&NumberIndex=50&Antib=177&Specium=-1
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Rationale_documents/Amikacin_rationale_1.2_0906.pdf
http://mic.eucast.org/SearchController/search.jsp?action=performSearch&BeginIndex=0&Micdif=mic&NumberIndex=50&Antib=243&Specium=-1
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Rationale_documents/Gentamicin_rationale_1.2_0906.pdf
http://mic.eucast.org/SearchController/search.jsp?action=performSearch&BeginIndex=0&Micdif=mic&NumberIndex=50&Antib=49&Specium=-1
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Rationale_documents/Amikacin_rationale_1.2_0906.pdf
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Rationale_documents/Gentamicin_rationale_1.2_0906.pdf
http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Rationale_documents/Tobramycin_rationale_1.2_0906.pdf
http://mic.eucast.org/SearchController/search.jsp?action=performSearch&BeginIndex=0&Micdif=mic&NumberIndex=50&Antib=50&Specium=-1
Materiales y Métodos
37

que no se disponía de sustancia valorada ni de paneles comerciales en los que
estuviesen incluidos. Se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito por el
CLSI:
i) Se preparó una suspensión bacteriana 0,5 McF de cada cepa en
suero salino y se sembraron formando un césped las placas de
MHA.
ii) En cada placa se colocaron los discos de antibiótico y se incubaron
las placas a 35 ± 2ºC durante 18-24 horas.
Esta técnica permite clasificarlos en sensibles o resistentes según el diámetro
del halo sin crecimiento que se forma alrededor del disco (Tabla 6).

 Método de microdilución en caldo
- Placas microtiter preparadas en el laboratorio
La determinación de la CMI a imipenem, meropenem, amikacina, plazomicina
y colistinase realizó utilizando el método de dilución en caldo descrito por el
CLSI. Para ello se prepararon 11 concentraciones (diferentes según el
antibiótico) crecientes de cada uno de los antibióticos objeto de ensayo y se
dispensaron en placas microtiter de fondo en U. A continuación, se inocularon
las suspensiones bacterianas (0,5 McF) preparadas en caldo Mueller-Hinton
(MHB). En cada determinación se incluyó además un control de crecimiento
de cada aislado. La lectura de la CMI se realizó tras 18-24 horas de incubación
de las placas a 35 ± 2ºC. El valor de la CMI se consideró el correspondiente a
la concentración de antibiótico del primer pocillo en el que el crecimiento
bacteriano era claramente menor que el del pocillo control.
- Sistemas semiautomáticos comerciales
Se recurrió a sistemas semiautomáticos, Vitek-2 (BioMerieux, Marcy L´Etoile,
Francia) y Wider (Francisco Soria Melguizo, Madrid, España), para el estudio
de la sensibilidad de las cepas no caracterizadas recogidas entre los años 2016
y 2018. Con ambos sistemas se partió de una suspensión bacteriana 0,5 McF.
En el sistema Vitek-2 esta suspensión se inoculó en una tarjeta suministrada
Materiales y Métodos
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por la casa comercial (tarjeta GNS, BioMerieux) y se incubó dentro del equipo
un mínimo de 16 horas antes de su lectura.
En el caso del sistema Wider (panel 5W, Francisco Soria Melguizo), se
inocularon todos los pocillos del panel con un dispositivo semiautomático y se
incubaron en estufa a 35±2ºC durante 16-24 horas. Pasado el tiempo de
incubación se realizó la lectura automática en el equipo correspondiente.
Ambos sistemas pueden utilizarse también para la identificación de
microorganismos mediante galerías de pruebas bioquímicas.

 Método de Epsilon Test (E-Test)
Para la determinación de las CMIs a imipenem, meropenem y colistina de los
aislados utilizados de la colección y de los recogidos posteriormente para los
estudios de sensibilidad a colistina se usaron tiras de gradiente E-test (AB
Biodisk, Solna, Suecia).
Se preparó una suspensión bacteriana con cada cepa en suero salino ajustando
a 0,5 McF y se sembró formando un césped uniforme en placas de MHA. Se
colocó una tira de celulosa que incorpora un gradiente del antibiótico
equivalente a 15 diluciones seriadas y se incubó a 35 ± 2ºC durante 18-24 horas.
Como podemos ver en la figura 9, la CMI corresponde al punto de intersección
del halo de inhibición del crecimiento con la tira.
Figura 9. Representación de una tira de gradiente E-test en la que la CMI (punto de
intersección entra la zona de inhibición y la tira) es igual a 0,5µg/ml.
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 Detección de resistencia a la colistina: test colorimétrico y placas
selectivas
La sensibilidad/resistencia a colistina, además de por los métodos descritos, se
realizó mediante el uso de dos dispositivos diferentes que ofrecían resultados
de sensibilidad en menos tiempo que los métodos convencionales.

Test colorimétrico: RAPID POLYMYXIN ACINETOBACTER
El Rapid Test Polymyxin Acinetobacter (RT Acinetobacter) se usa para
detectar la sensibilidad y la resistencia a colistina y polimixina B a partir de un
cultivo bacteriano de Acinetobacter baumannii.
El test incluye los siguientes materiales y reactivos:
-RP NaCl: Vial de 3mL de medio líquido que contiene 0,85 g/L de NaCl para
la preparación del inóculo.
-Medio RP Acinetobacter: Vial de 1,5 mL de medio de cultivo para
Acinetobacter baumannii, a base de un caldo nutritivo, un azúcar (fuente de
carbono y energía) y un indicador de pH (rojo fenol).
-Bandeja RP Acinetobacter: Bandeja que contiene un pocillo C-, de control
negativo, dos pocillos Test que contienen colistina a concentraciones de 2 y 4
μg/mL y un pocillo C+, de control de crecimiento bacteriano.
-RP TC (Control de turbidez): Vial de 3 mL de solución de sulfato de bario
para control de turbidez.
-Sistema de cierre: Tapa protectora de bandeja de plástico translúcido para la
bandeja inoculada.
En la figura 10A se esquematiza el procedimiento a seguir para la realización
del test.

Materiales y Métodos
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Los pasos que incluye son:
1- A partir de un pase puro y fresco del microorganismo en MHA se prepara
una dilución 3-3,5 McF en un vial RP NaCl.
2- Transferir 500μL del medio RP NaCl inoculado en el medio RP
Acinetobacter y mezclar bien.
3- Distribuir el medio RP Acinetobacter inoculado de la siguiente manera:
 100μL en los pocillos nº 2 y 3 (contienen colistina a concentración 2
y 4 μg/mL).
 100μL en el pocillo nº 4, que es el de control de crecimiento (sin
colistina).
 El pocillo nº 1 se utilizará como control negativo para lo cual se
dispensarán en el 75μL de medio RP Acinetobacter sin inocular y 25
μL de medio RP NaCl sin inocular.
4- Cubrir todos los pocillos de la bandeja con el sistema de cerrado
proporcionado por el fabricante.
5- Incubar a 35 ± 2ºC durante 3 o 4 horas.
6- Lectura:
 Lectura del control negativo (pocillo nº 1). Tiene que tener un color
rojo idéntico al que tenía inicialmente. Cualquier cambio de color será
indicativo de contaminación y, por tanto, invalidará el resultado.
 Control positivo (pocillo nº 4). El medio tiene que volverse de color
naranja, anarajando/amarillo o amarillo. Si no se produce un cambio
apreciable del color a las 3 horas (primera lectura) habrá que aumentar
el tiempo de incubación otra hora. En el caso de que no se produzca
cambio de color pasado este tiempo, debe sospecharse que no se ha
inoculado de manera adecuada y, por tanto, el resultado no será válido.
Materiales y Métodos
41

 Lectura e interpretación de los pocillos nº 2 y 3 (pocillos problema).
Se leen valorando el cambio de color por comparación con el control
positivo.
o Si el/los pocillos problema son de color naranja,
anarajando/amarillo o amarillo y de color idéntico al
control positivo, la cepa se considera resistente a colistina
con CMI 2 o 4 μg/mL, según el pocillo en el que se haya
producido el cambio de color. En este caso no haría falta
incubar más tiempo el dispositivo.
o Si los pocillos presentan un color rojo, o un color
diferente al del control positivo, como podemos observar
en la figura 10B, la cepa se considera sensible a colistina.
En este caso, se debe reincubar la galería una hora más y
volver a interpretarla.

Figura 10. Test colorimétrico de detección de resistencia a colistina en AB. A) esquema del
procedimiento para el desarrollo del test; B) ejemplo de resultado de un aislado AB sensible
a colistina.

A
B
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Placas selectivas: SUPERPOLYMYXIN
El SUPERPOLYMYXIN es un agar selectivo de bacilos gram negativos
resistentes a colistina. La selección de bacilos gram negativos se debe a la
presencia de colorantes (azul de metileno y eosina) y antibióticos (daptomicina)
que inhiben el crecimiento de gram positivos. Además, esta complementado
con lactosa y colorantes que permite la diferenciación de bacterias lactosa
positivas de negativas. Para distinguir los microorganismos resistentes a
colistina, el agar esta suplementado con una concentración de colistina de
2µg/mL.
La inoculación del agar se puede realizar a partir de una muestra clínica directa
o a partir de un cultivo bacteriano.
En este caso, se realizó a partir de un cultivo monomicrobiano de AB en MHA,
se preparó una suspensión bacteriana en una solución de 0,9 % de NaCl estéril,
con una densidad óptica equivalente a 0,5 McF. A partir de esta primera
suspensión, se preparó una dilución 1/10 y se distribuyeron 10 μL de la misma
sobre el agar SUPERPOLYMYXIN. Se incubó a 35 ± 2ºC durante 24-48 horas
y se procedió a la lectura. Para ello se siguieron las indicaciones del fabricante
que se detallan en la tabla 7.

Materiales y Métodos
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Tabla 7. Aspecto macroscópico de las coloniasde diferentes especies bacterianas en agar
SUPERPOLYMYXIN.

Microorganismo
Aspecto de las colonias en agar
SUPERPOLYMYXIN
Escherichia coli
Colonias de 2-3 mm de diámetro, de color
morado oscuro con un centro negro y brillo
metálico verdoso

Klebsiella spp Grandes colonias de color morado oscuro

Enterobacter aerogenes
Colonias azuladas, con el centro de color
marrón oscuro, planas y que confluyen, de 4-6
mm de diámetro, que presentan un brillo
metálico solo ocasionalmente

Citrobacter spp.
Colonias de color morado con un ligero reflejo
metálico

Proteus mirabilis
Colonias de color rosa/morado claro, planas y
translućidas

Salmonella spp, Shigella spp Colonias de color ámbar, transparentes

Acinetobacter baumannii,
Pseudomonas aeruginosa,
Stenotrophomonas
maltophilia
Colonias incoloras o de color lavanda

Los aislamientos de cepas con crecimiento inhibido se clasifican como
sensibles con una CMI a la colistina ≤ 2 μg/mL. Los aislamientos con
crecimiento no inhibido se clasifican como resistentes con una CMI > 2 μg/mL.

Materiales y Métodos
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Estudios de sinergia

 Plazomicina
- Método de difusión en disco
Se realizó una prueba de sinergia de doble disco para evaluar las posibles
interacciones entre dos fármacos frente a los aislados seleccionados (n=10). Se
utilizaron discos de amikacina (30μg), plazomicina (30μg), meropenem (10μg)
e imipenem (10μg). Los discos de plazomicina se prepararon utilizando papel
Whatman sobre el que se depositó solución antibiótica hasta alcanzar la
cantidad deseada. Las distancias entre los discos debían ajustarse
adecuadamente con cada cepa para poder detectar con precisión las
interacciones antibióticas.
Se prepararon suspensiones bacterianas 0,5 McF de los diferentes aislados. Se
utilizaron para el ensayo placas de MHA y se sembraron los aislados utilizando
la técnica de césped. Los discos se colocaron por separado con una distancia
menor a la suma de los radios de zona libre de crecimiento para cada disco
probado por separado. Después de 18-24 h de incubación a 35 ± 2ºC, se leyeron
los resultados.
El sinergismo se observa como una zona de inhibición que une los halos de los
dos antimicrobianos, mientras que en el antagonismo esta zona de unión
aparece con crecimiento visible, incluso en las zonas de inhibición de los dos
antimicrobianos (Eliopoulos, GM., et al).
- Técnica del tablero de ajedrez o checkerboard
Es un método de microdilución en caldo que permite evaluar la actividad in
vitro de antibióticos en combinación. Cada uno de los antibióticos se utiliza en
un rango de diluciones dobles y seriadas que van desde 2x el valor de CMI para
cada uno de los antimicrobianos de la combinación hasta llegar a diluciones (4-
5) por debajo de la CMI (SEIMC Procedimiento 70). Cada pocillo de la
Materiales y Métodos
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microplaca utilizada para realizar estas pruebas contendría una única
combinación de los dos antibióticos.
Se utilizó este ensayo para valorar la actividad de la plazomicina en
combinación con imipenem, meropenem, colistina, fosfomicina y tigeciclina
en diez cepas de A. baumannii, como describió previamente Petersen, PJ., et
al. Las cepas se seleccionaron en función de su perfil de sensibilidad y de su
pertenencia a los diferentes grupos clonales obtenidos por PFGE. Se repitieron
todos los experimentos utilizando amikacina (aminoglucósido más potente
frente a A. baumannii) como antibiótico comparador.
Se prepararon diluciones seriadas en MHB de los compuestos a evaluar según
el siguiente esquema:

 Plazomicina (antimicrobiano A): 7 diluciones (0,125-
1024µg/mL).
 Amikacina (antimicrobiano B): 7 diluciones (0,125-1024µg/mL).
 Antimicrobianos “C” (imipenem, meropenem, colistina,
fosfomicina y tigeciclina): 11 diluciones con rangos acordes a la
CMI de cada uno de los microorganismos analizados. Este rango
fue siempre como mínimo 4-5 diluciones por debajo de la CMI y
4-5 por encima de esta.

Se añadieron 50 μL de antimicrobiano A o B en cada pocillo y 50 μL de uno
de los antimicrobianos del grupo C en concentraciones crecientes, como
podemos ver representado en la figura 11. Se ha de tener en cuenta que, al
combinar dos diluciones de antibióticos, se tiene que aplicar el factor de
dilución a la hora de calcular la concentración final de cada uno de ellos. La
concentración del antimicrobiano A o B aumenta de abajo hacia arriba (G-A)
y la del B, de derecha a izquierda (11-1). En la columna 12 se añadieron 100
μL de A o B solo, y en la fila H, 100 μL de C solo. Esta distribución permite
obtener la CMI de cada uno de los antibióticos por separado (columna 12 y fila
Materiales y Métodos
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H) y establecer las posibles sinergias que puedan darse en la combinación
ensayada.
Figura 11. Esquema de inoculación de las placas microtiter.

 Inoculación e incubación
Partiendo de un pase fresco de cada cepa, se preparó una suspensión bacteriana
en suero salino con una turbidez de 0,5 McF. A partir de ella se realizó una
dilución 1:100 y se inocularon las placas con 10 μL de la dilución en cada
pocillo. Para la realización de este paso se utilizó una pipeta multicanal.
Con el fin de evitar contaminaciones y alteraciones del volumen por
evaporación, las placas se protegieron con papel film y se incubaron a 35 ± 2ºC
durante 18-24 horas en atmósfera aerobia.

Antimicrobiano C
A
n
ti
m
ic
ro
b
ia
n
o
A
o
B

Materiales y Métodos
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 Lectura e interpretación
Las interacciones son calculadas algebraicamente e interpretadas dependiendo
de la actividad antibacteriana de la combinación en relación con la actividad de
los agentes de forma individual. Para ello se utiliza la concentración inhibitoria
fraccionada total (FICT), que es la suma de las concentraciones inhibitorias
fraccionadas de los dos antimicrobianos a comparar:

FIC Ab A = CMI Ab A combinación/ CMI Ab A sólo

FICT = FIC Ab A + FIC Ab C

Según el valor obtenido, clasificamos el efecto de nuestras combinaciones en
(SEIMC Procedimiento 70):

 Efecto sinérgico si FIC ≤ 0,5
 Efecto indiferente si FIC > 0,5 y ≤ 4
 Efecto antagónico si FIC > 4

La representación gráfica de los valores de CMI de cada antibiótico en
presencia del otro también nos sirve para valorar el tipo de interacción (Figura
12).

Materiales y Métodos
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Figura 12. Representación gráfica de las combinaciones de antibiótico con los posibles
resultados. (Modificado de: CMPH Clinical Microbiology Procedures Handbook. 4th
Edition 2016).
Materiales y Métodos
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- Curvas de letalidad
Es una técnica que permite ensayar el efecto de concentraciones de antibiótico
concretas a lo largo del tiempo. Se utilizó para valorar la actividad in vitro de
meropenem, colistina, tigeciclina y fosfomicina en combinación con
plazomicina o amikacina.
El análisis se realizó de acuerdo con los métodos descritos previamente por
Petersen, PJ., et al.
Las concentraciones utilizadas fueron ¼ y ½ de la CMI de amikacina y
plazomicina y las concentraciones plasmáticas en estado de equilibrio (Steady
State Concentration, STT) del resto de los antibióticos: imipenem (6,8μg/mL),
meropenem (6,8μg/mL), colistina (4μg/mL), tigeciclina (0,1μg/mL) y
fosfomicina (83μg/mL) (Tängdén, T., et al).
 Preparación del inóculo
Se realizó un cultivo en MHB con 2-3 colonias de cultivo fresco.
Posteriormente se preparó una dilución 1/10 en MHB y se incubó 1-2 horas
hasta alcanzar una densidad óptica a 580 nm, cercana a 0,3 pero sin sobrepasar
ese valor, lo que corresponde aproximadamente a un inóculo de 1 x 107.
Una vez alcanzado ese inóculo, se prepararon diluciones 1/10 de tubos
controles (sin antibiótico) y en los tubos con los antibióticos a estudiar (Figura
13).
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