tesis68 (1)

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PROPAGACIÓN in vitro A PARTIR DE MERISTEMOS DE CINCO 
VARIEDADES COMERCIALES DE Dianthus caryophyllus L. (clavel) 
 
 
 
 
 
 
 
ANA MARÍA AFANADOR PÉREZ 
 
 
 
 
 
TRABAJO DE GRADO 
Presentado como requisito parcial para obtener el título de 
 
 
 
BIOLOGA 
 
 
 
DIRECTORA 
CLAUDIA RAMIREZ SANDOVAL 
Unidad de Biotecnología Vegetal 
 
 
 
 
 
 
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA 
FACULTAD DE CIENCIAS 
CARRERA DE BIOLOGÍA 
BOGOTA, DC. 
Junio de 2005 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NOTA DE ADVERTENCIA 
 
 
Articulo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946 
 
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus 
alumnos en sus trabajos tesis. Solo velará por que no se publique nada 
contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan 
ataques personales contra persona alguna, antes se vea en ellas el anhelo 
de buscar la verdad y la justicia” 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 2
 
 
 
 
 
PROPAGACIÓN in vitro A PARTIR DE MERISTEMOS DE CINCO 
VARIEDADES COMERCIALES DE Dianthus caryophyllus L. (clavel) 
 
 
 
 
 
ANA MARÍA AFANADOR PÉREZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
APROBADO 
 
 
 
 
 
 
Claudia Ramírez Sandoval, MSc 
Directora 
 
 
 
 
 
 
 Iván Cruz Daniel Zapata 
 Ingeniero Agrónomo Ingeniero Industrial 
 Jurado Jurado 
 3
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PROPAGACIÓN in vitro A PARTIR DE MERISTEMOS DE CINCO 
VARIEDADES COMERCIALES DE Dianthus caryophyllus L. (clavel) 
 
 
 
 
 
 
ANA MARÍA AFANADOR PÉREZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Angela Umaña, MPhil Carmen Cecilia Espíndola, MSc 
Decana Académica Directora de la Carrera de Biología 
Facultad de Ciencias Facultad de Ciencias 
 
 
 
 
 
 
 
 4
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mi Familia y Nicolás por todo su amor y comprensión 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 5
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
 
A Germán Mejía por su interés y apoyo y a la empresa Colibrí Flowers por el 
suministro del material vegetal para el desarrollo del trabajo. 
A Claudia Ramírez, MSc, investigadora de la Unidad de Biotecnología 
Vegetal de la Universidad Javeriana por la dirección técnica y científica y el 
constante apoyo durante la realización del trabajo. 
A Juan Carlos Vaca, PhD, investigador de la Unidad de Biotecnología 
Vegetal de la Universidad Javeriana por la asesoría en el área de virología 
vegetal. 
A Dagoberto Castro, PhD, investigador de la Universidad Católica de Oriente 
(Rionegro – Antioquia) por la asesoría durante la ejecución del trabajo. 
A Jhon Alexander Zambrano e Iván Cruz por el apoyo durante la fase de 
laboratorio. 
A Nixon y Jorge por su colaboración durante la fase de laboratorio. 
A Jenny Milena Escobar por su asesoría y realización del análisis estadístico. 
A mis padres y hermanos por el constante apoyo, ánimo, tiempo y 
comprensión durante la realización del trabajo. 
A Nico por la total entrega, dedicación, comprensión, apoyo y presencia en 
todo momento. 
A la familia Fernández por el apoyo y colaboración a lo largo del trabajo. 
 
 
 
JUNIO DE 2005 
 
 
 
 6
TABLA DE CONTENIDO 
 
 
 
RESUMEN……………………………………………………………………………...16 
 
ABSTRACT…………………………………………………………………………….17 
 
1. INTRODUCCION ............................................................................................ 18 
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA ...................................... 20 
2.1 Dianthus caryophyllus l. (Clavel) ............................................................... 20 
2.1.1 CLASIFICACIÓN BOTÁNICA......................................................................... 20 
 
2.1.2 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA ........................................................................... 20 
 
2.1.3 ORIGEN E HISTORIA .................................................................................. 21 
 
2.1.4 ZONAS DE PRODUCCIÓN ........................................................................... 22 
 
2.1.5 VARIEDADES ............................................................................................ 22 
 
2.1.6 CULTIVO Y PRODUCCIÓN........................................................................... 23 
2.1.6.1 Factores ambientales que influyen sobre la producción ................. 24 
2.1.6.1.1 Temperatura 24 
2.1.6.1.2 Suelo 24 
2.1.6.1.3 Riego 24 
2.1.6.1.4. Nutrientes 24 
 
2.1.7 PLAGAS Y ENFERMEDADES ....................................................................... 25 
2.1.7.1 Plagas.............................................................................................. 25 
2.1.7.1.1 Ácaros 25 
2.1.7.1.2 Áfidos 26 
2.1.7.1.3 Trips 26 
2.1.7.1.5 Nemátodos 26 
 
2.1.7.2 Enfermedades causadas por hongos y bacterias ........................... 27 
2.1.7.2.1 Marchitamiento vascular 27 
2.1.7.2.2 Botritis 27 
2.1.7.2.3 Roya del clavel 27 
2.1.7.2.4 Mancha foliar 28 
 
2.1.7.3 Enfermedades causadas por virus .................................................. 28 
2.1.7.3.1 Virus del mosaico de las nerviaciones del clavel (CaVM) 28 
2.1.7.3.2 Virus del jaspeado del clavel (CaERV) 29 
2.1.7.3.3 Virus de la mancha anular del clavel (CaRSV) 29 
 vii
2.1.7.3.4. Virus del moteado necrótico del clavel (CaNFV) 29 
2.1.7.3.5 Virus moteado del clavel (CarMV) 30 
2.1.7.3.5.1 Clasificación....................................................................... 30 
2.1.7.3.5.2 Historia y distribución......................................................... 30 
2.1.7.3.5.3 Transmisión ....................................................................... 30 
2.1.7.3.5.4 Citopatología...................................................................... 30 
2.1.7.3.5.5 Sintomatología del clavel................................................... 31 
2.1.7.3.5.6 Rango natural de hospederos ........................................... 31 
 
2.1.7.4 Técnicas para la detección de virus 31 
2.1.7.4.1 Pruebas biológicas ............................................................... 32 
2.1.7.4.2 Citopatología......................................................................... 32 
2.1.7.4.3 Inmunoabsorbancia en microscopio electrónico (ISEM) ...... 32 
2.1.7.4.4 Prueba inmunoenzimática (ELISA)....................................... 33 
2.1.7.4.5 Hibridación molecular ........................................................... 34 
2.1.7.4.6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)....................... 34 
 2.1.7.5 Control de virus ........................................................................... 35 
2.1.7.5.1 Quimioterapia ....................................................................... 36 
2.1.7.5.2 Termoterapia ........................................................................ 36 
 
2.2 CRECIMIENTO Y DESARROLLO................................................................ 37 
2.2.2 ZONAS DE CRECIMIENTO – MERISTEMOS –................................................. 38 
2.2.3 REGULADORES DE CRECIMIENTO .............................................................. 40 
2.2.2.1 Auxinas............................................................................................ 40 
2.2.2.2 Citoquininas..................................................................................... 41 
 
2.3 CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMOS ....................................................... 43 
2.3.1 ETAPAS DEL CULTIVO DE MERISTEMOS IN VITRO......................................... 46 
2.3.1.1 Etapa 0: Etapa preparativa.............................................................. 46 
2.3.1.2 Etapa I: Establecimiento del explante ............................................. 46 
2.3.1.3 Etapa II: Multiplicación y elongación de brotes ............................... 47 
2.3.1.4 Etapa Enraizamiento in vitro............................................................ 472.3.1.5 Etapa IV: Aclimatación del material obtenido in vitro ...................... 48 
 
2.3.2 PROBLEMAS ASOCIADOS AL CULTIVO IN VITRO ........................................... 48 
2.3.2.1 Contaminación................................................................................. 48 
2.3.2.2 Oxidación......................................................................................... 49 
2.3.3.2 Vitrificación ó hiperhidratación......................................................... 50 
2.3.3.2.1 Posibles causas de la hiperhidratación 51 
2.3.3.2.2 Factores que influyen en la hiperhidratación 51 
2.3.3.2.3 Signos 52 
 
2.4 MICROPROPAGACIÓN DE CLAVEL ................................................................. 52 
 
 viii
3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN................................ 56 
3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA..................................................................... 56 
3.2 JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ........................................................... 56 
 
4. OBJETIVOS .................................................................................................... 58 
4.1 OBJETIVO GENERAL..................................................................................... 58 
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................. 58 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................... 59 
5.1 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN...................................................................... 59 
5.1.1 Diseño experimental del Componente I. Atenuación del CarMV........ 60 
5.1.2 Diseño Experimental del Componente II. Proceso de Micropropagación 
del Material Vegetal..................................................................................... 61 
5.1.3 Población de estudio y muestra ......................................................... 62 
5.1.4 Variables del estudio. ......................................................................... 63 
5.4.1.1 Componente I. Atenuación del CarMV 63 
5.4.1.2 Componente II. Proceso de Micropropagación del Material Vegetal
 64 
 
5.2 MÉTODOS ................................................................................................... 66 
5.2.2 Termoterapia ...................................................................................... 68 
5.2.3 Detección de partículas virales........................................................... 69 
5.2.3 Micropropagación del Material Vegetal .............................................. 71 
5.2.3.1 Establecimiento de meristemos in vitro 72 
5.2.3.1.1 Desinfestación ...................................................................... 72 
5.2.3.1.2 Obtención y siembra del explante ........................................ 72 
5.2.3.1.3 Medio y condiciones físicas del cultivo ................................. 73 
5.2.3.2 Propagación in vitro 73 
5.2.3.3 Enraizamiento in vitro 74 
 
5.3 RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN............................................................. 74 
 
5.4 ANÁLISIS DE LA INFORMACIÓN...................................................................... 75 
5.4.1. Componente I. Atenuación del CarMV .............................................. 75 
5.4.1.1Prueba no paramétrica de Kruskall Wallis 75 
5.4.1.2 Prueba de Rango Múltiple Duncan 76 
5.4.2 Componente II. Proceso de micropropagación ................................. 76 
5.4.2.1 Análisis de Varianza (ANOVA) 76 
5.4.2.2 Prueba de Rango Múltiple Duncan 77 
 
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................... 78 
6.1 COMPONENTE I. ATENUACIÓN DEL CARMV .................................................. 78 
 
 ix
6.2 COMPONENTE II. PROCESO DE MICROPROPAGACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL83 
6.2.1 Establecimiento in vitro de meristemos .............................................. 86 
6.2.2 Propagación in vitro............................................................................ 89 
6.2.2.1 Ciclo de multiplicación 1 89 
6.2.2.2 Ciclo de multiplicación 2 91 
6.2.2.3 Efecto de la concentración de agar en la hiperhidratación 95 
6.2.3 Fase de Enraizamiento in vitro ........................................................... 97 
6.2.4 Comportamiento de las variedades a través del tiempo................... 101 
6.2.5 Cálculo del potencial productivo....................................................... 106 
 
7. CONCLUSIONES ......................................................................................... 109 
 
8. RECOMENDACIONES ................................................................................. 111 
 
9. LITERATURA CITADA ................................................................................. 112 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 x
LISTA DE TABLAS 
 
 
 
Tabla 1. Requerimientos nutricionales del clavel......................................................25 
 
Tabla 2. Componente I. Métodos empleados para la atenuación del CarMV...........59 
 
Tabla 3. Componente II. Fases del proceso de micropropagación...........................60 
 
Tabla 4. Niveles del Factor 1 (métodos de atenuación del CarMV) del componente I
..................................................................................................................................60 
 
Tabla 5. Niveles del Factor 2 (variedades) del componente I...................................61 
 
Tabla 6. Niveles del Factor 1 (variedades) del componente II..................................62 
 
Tabla 7. Población y variables del estudio en cada etapa del proceso de 
micropropagación......................................................................................................63 
 
Tabla 8. Tratamientos evaluados en la fase de enraizamiento.................................74 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 xi
LISTA DE FIGURAS 
 
 
Figura 1. Esquejes de Dianthus caryophyllus, durante la etapa de enraizamiento en 
los invernaderos de la empresa floricultora...............................................................67 
 
Figura 2. Esquejes de cinco variedades de clavel durante el método de termoterapia 
en una Cámara de crecimiento (fitotron) a temperatura constante de 38ºC. 
Instalaciones de la Unidad de Biotecnología Vegetal PUJ........................................68 
 
Figura 3. Metodología empleada para la atenuación del CarMV .............................70 
 
Figura 4. Esquema de las fases realizadas en condiciones in vitro. Establecimiento 
de meristemos, multiplicación y enraizamiento. Medio Murashige & Skoog (MS). 
Kinetina (Kin), Acido indolacético (AIA).....................................................................71 
 
Figura 5. Meristemo apical del esqueje de Dianthus caryophyllus. A. Meristemo 
ubicado en el cono primordial del esqueje. B. Meristemo apical extraido del esqueje.
..................................................................................................................................73 
 
Figura 6. Resultados de la prueba “DAS – ELISA”, en las cinco variedades y con 
cada método de atenuación de virus, a partir de los valores promedio de 
absorbancia (nm). .....................................................................................................79 
 
Figura 7. Efecto de los métodos para la atenuación del virus moteado de clavel 
(CarMV) en esquejes de cinco variedades de clavel. ...............................................81 
 
Figura 8. Porcentaje de supervivencia de los esquejes sometidos a termoterapia.83 
 
Figura 9. Número de brotes desarrollados y perdidos para cada variedad en el 
proceso de micropropagación ...................................................................................85 
 
Figura 10. Esquejes de la variedad Picote Vanesa luego de ser sometidos al 
método de termoterapia. A) Grupo I. B) Grupo II. .....................................................86Figura 11. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en la fase de establecimiento 
in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus...............................................87 
 
Figura 12. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en la fase de 
establecimiento in vitro de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.....................88 
 
Figura 13. Tasa de multiplicación en el ciclo de propagación 1, para las variedades 
Mercedes, Orange Bri, Picote Vanesa y White Sim de Clavel. .................................90 
 
Figura 14. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en el ciclo de multiplicación 1 
de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus. .........................................................90 
 
 xii
Figura 15. Tasa de velocidad de multiplicación en el ciclo de propagación 2 para las 
variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim...................................................92 
 
Figura 16. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en el ciclo de propagación 2 
de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus. .........................................................95 
 
Figura 17. Efecto de la concentración de agar sobre la hiperhidratación de los 
explantes de las variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim durante la etapa 
de multiplicación. T1: 8 % de agar; Control: 7 % de agar. ........................................96 
 
Figura 18. Efecto de la concentración del medio de cultivo y del AIA sobre el 
desarrollo de raíces (%) en las variedades: Mercedes, Picote Vanesa y White Sim.
..................................................................................................................................99 
 
Figura 19. Comparación del efecto de los tratamientos aplicados para la inducción 
de raíces in vitro para cada variedad. .....................................................................100 
 
Figura 20. Tasa de pérdida en el tiempo para cada variedad ................................101 
 
Figura 21. Tasa de velocidad de multiplicación en el ciclo de multiplicación 1 y 2 
para cada variedad..................................................................................................103 
 
Figura 22. Número de brotes exitosos en cada variedad a través del tiempo........104 
 
Figura 23. Brotes de Dianthus caryophyllus obtenidos in vitro. A: Brote 
hiperhidratado de la variedad Mercedes. B: Brote no hiperhidratado de la variedad 
Picote Vanesa. ........................................................................................................104 
 
Figura 24. Número de brotes hiperhidratados por variedad a través del tiempo....105 
 
 
 
 
 
 
 
 xiii
LISTA DE ANEXOS 
 
 
Anexo 1. Composición del medio nutritivo Murashige & Skoog (MS) (1962) .........127 
 
Anexo 2. Resultados de la prueba ELISA (valores de absorbancia nm) en cada 
método de cada variedad........................................................................................128 
 
Anexo 3. Componente I Atenuación del CarMV. Prueba de Normalidad de la prueba 
ELISA para los 3 métodos.......................................................................................128 
 
Anexo 4. Componente I. Atenuación del CarMV. Prueba de Homoestacidad de la 
prueba ELISA para los 3 métodos...........................................................................129 
 
Anexo 5. Tabla de los tratamientos (método y variedad) para aplicar la prueba 
Kruskall – Wallis ......................................................................................................129 
 
Anexo 6. Componente I. Atenuación del CarMV. Prueba Kruskall – Wallis para las 
variables método y variedad ...................................................................................130 
 
Anexo 7. Componente I. Atenuación del CarMV . Prueba Duncan para las variables 
método y variedad...................................................................................................130 
 
Anexo 8. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. 
Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Primera Fecha)........................131 
 
Anexo 9. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. 
Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Primera Fecha). .......................132 
 
Anexo 10. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. 
Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Segunda Fecha). .....................132 
 
Anexo 11. Componente II. Proceso de micropropagación Establecimiento in vitro. 
Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Segunda Fecha). .....................133 
 
Anexo 12. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. 
Prueba ANOVA para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de 
Multiplicación 1).......................................................................................................133 
 
Anexo 13. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. 
Prueba Duncan para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de 
Multiplicación 1).......................................................................................................134 
 
Anexo 14. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. 
Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 1).........134 
 
Anexo 15. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. 
Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 1). .......135 
 14
Anexo 16. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. 
Prueba ANOVA para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de 
Multiplicación 2).......................................................................................................135 
 
Anexo 17. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. 
Prueba Duncan para la variable Tasa de velocidad de Multiplicación (Ciclo de 
Multiplicación 2).......................................................................................................136 
 
Anexo 18. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. 
Prueba ANOVA para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 2).........136 
 
Anexo 19. Componente II. Proceso de micropropagación Propagación in vitro. 
Prueba Duncan para la variable Tasa de pérdida (Ciclo de Multiplicación 2). .......137 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 15
 
RESUMEN 
 
 
 
El presente trabajo tuvo como objetivo desarrollar una metodología para la 
micropropagación de cinco variedades comerciales de Dianthus caryophyllus 
L. (clavel), a partir de meristemos apicales. Adicionalmente se analizaron las 
concentraciones del virus moteado del clavel (CarMV) en tejido vegetal de 
cinco variedades mediante la utilización de la prueba de ELISA luego de 
haber recibido los métodos de termoterapia y cultivo in vitro de meristemos y 
la combinación de ambos. Se evaluaron las tasas de pérdida y las de 
velocidad de multiplicación para cada variedad con el fin de determinar el 
comportamiento de cada una en condiciones in vitro. En la fase de 
establecimiento in vitro se confirmó que la variedad se asocia con la tasa de 
pérdida; y con la presencia de microorganismos, vitrificación y oxidación de 
los explantes. Durante la fase de multiplicación in vitro, la tasa de velocidad 
de multiplicación aumento en el segundo 2 ciclo de propagación, dejando de 
manifiesto el aumento de la capacidad morfogénetica a través de los 
subcultivos. Durante la etapa de inducción de raíces se evidenció la 
capacidad rizogénetica de las variedades. El comportamiento de cada 
variedad durante las etapas fue diferente por lo que se concluye que la 
respuesta es específica para cada genotipo. Se estableció la presencia del 
virus en las 5 variedades estudiadas. La concentración del virus se redujo 
utilizando el tratamiento combinado de termoterapiay cultivo in vitro de 
meristemos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 16
ABSTRACT 
 
The main object of the following project was to develop a methodology for the 
micropropagation of five different commercial varieties of Dianthus 
caryophyllus L. based on apical meristems. In addition to the above, another 
purpose of the investigation was to analyze the different concentrations of the 
CarMV virus in every of the five carnation varieties using the ELISA test. All 
the varieties were treated before trying the ELISA test with thermotherapy, in 
vitro culture or both. After, another analysis was the one based on the lost 
rates and the multiplication velocity for each and every variety, looking 
forward to determine their behavior under in vitro conditions. During the in 
vitro establishment phase, the results allowed to confirm that the variety 
influenced the lost rate. The latter was also influenced by the presence of 
microorganisms, hiperhydratation and explants oxidation. The in vitro 
multiplication phase was also reviewed and the multiplication velocity rate 
was higher in the second propagation cycle, permitting to conclude that the 
morphogenetic capacity was higher after several subcultures. During the root 
induction stage, there was also another factor analyzed which was the 
rizogenetic capacity of each variety. Nevertheless, each variety behavior was 
different in each treatment. The latter may allow concluding that the specific 
answer depends on each genotype. It was established the presence of the 
CarMV in the five different varieties. The virus concentration was reduced 
after the use of the combination of thermotherapy and meristem in vitro 
culture treatments. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 17
1. INTRODUCCION 
 
La economía colombiana ha entrado a competir en el mercado mundial 
gracias a productos como el petróleo, el café, las frutas y las flores, los 
cuales tienen una importancia significativa para el país. 
 
El rubro de la floricultura se ha convertido en una interesante opción 
productiva para la agricultura en Colombia. De acuerdo con la Asociación 
Colombiana de Exportadores de Flores (Asocolflores), la floricultura ocupa el 
primer lugar como generadora de divisas dentro de las exportaciones no 
tradicionales de Colombia. El 95% de la producción se destina a la 
exportación. En el año 1979 Colombia exportó flores por un valor de 75 
millones de dólares y en 1992 la cifra alcanzó ya los 341 millones. En 1994 el 
material exportado fue de 430 millones de dólares y en 1996 se totalizaron 
509,9 millones de dólares, cifra que supone un crecimiento del 17% con 
relación al año anterior. Los principales mercados son Estados Unidos (80%) 
y la Unión Europea (14%); dentro de este bloque económico se destacan el 
mercado británico y alemán, con participaciones del 6,2% y del 2,0%, 
respectivamente, sobre el valor exportado (Asocolflores, 2005). 
 
En Colombia el área sembrada con flores de corte asciende a 6544 
hectáreas. El 85% de la producción se desarrolla en la Sabana de Bogotá, 
12% en el área de Rionegro y 3% en Valle, Cauca y el Eje Cafetero. La 
principal especie exportada es el clavel (estándar y miniatura), con más de 
4.000 hectáreas dedicadas a este cultivo. (ASOCOLFLORES, 2005). 
 
 
Una de las principales zonas productoras de clavel es la Sabana de Bogotá; 
en esta región el cultivo de clavel se ha convertido en una alternativa de 
producción. Sin embargo, los métodos de propagación vegetativa 
 18
convencionales presentan limitaciones con respecto al suministro de plantas 
madres con condiciones fisiológicas y fitosanitarias adecuadas. 
Las enfermedades causadas por virus afectan el rendimiento y la calidad de 
la producción de flores de clavel, en especial el virus moteado de clavel 
(CarMV), responsable de pérdidas del 16 % en la producción de flores 
exportables en plantas infectadas por este. 
 
La aplicación de técnicas de cultivo in vitro de tejidos en ornamentales es una 
alternativa que permite suministrar al floricultor material vegetal revigorizado 
(rejuvenecimiento) y con condiciones fitosanitarias adecuadas para 
enraizamiento y producción de esquejes para multiplicación masiva 
(Hartmann et al., 1997). 
 
Teniendo en cuenta la importancia económica del clavel, la empresa privada 
se ha interesado en utilizar ésta herramienta, que ofrece alternativas 
respecto a la calidad del material vegetal. Sin embargo, se conoce poco del 
comportamiento in vitro de las variedades comerciales cultivadas en 
condiciones colombianas, razón por la cual se ha formado un vínculo con la 
academia con el fin de investigar, conocer, y ofrecer alternativas que apoyen 
los sistemas de propagación convencional. 
 
El presente trabajo tuvo como objetivo adaptar y desarrollar metodologías 
para la propagación in vitro de cinco variedades comerciales de clavel y 
evaluar el comportamiento de la respuesta en condiciones in vitro. Así 
mismo, se aplicaron diferentes métodos dirigidos a analizar el efecto de la 
concentración del virus moteado del clavel. 
 
 
 
 
 
 
 19
 
2. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA 
 
2.1 Dianthus caryophyllus L. (clavel) 
 
2.1.1 Clasificación botánica 
 
La clasificación sistemática del clavel según Janes (1988) es: 
 
CLASE: Dicotiledonea 
SUBCLASE: Caryophyllidae
ORDEN: Caryophyllales 
FAMILIA: Caryophyllaceae 
SUBFAMILIA: Silenoideae 
GENERO: Dianthus 
ESPECIE: Dianthus caryophyllus L. 
Nombre Científico: Dianthus caryophyllus L. 
Nombres Comunes: Clavel, Clavel del poeta 
 
2.1.2 Descripción botánica 
 
Es una planta perenne de base leñosa con tallos de hasta 80 cm de altura, 
glabros y de día largo. 
Hojas: lineares de 0.8-1.5 cm de longitud, planas y blandas, acuminadas y 
glaucas, con la base envainadora. 
Flores: En grupos de 1-5, muy olorosas. Sin estipulas. Epicáliz con 4-6 
brácteas anchas, abruptamente acuminadas, mucho más cortas que el cáliz. 
Cáliz de 2.5-3 cm de longitud, con dientes triangulares. Pétalos dentados de 
forma irregular, no barbados, de 1-1.5 cm de longitud, de color rosado-
púrpura en las especies silvestres (Heywood & Moore, 1998). 
 
 20
 
 
2.1.3 Origen e historia 
 
Luego de las rosas y los crisantemos, el clavel es la tercera flor de corte más 
popular del mundo, siendo originario de la cuenca mediterránea. Sus 
orígenes datan del año 300 A.C., cuando el filósofo griego Theophratus 
nombró a esta flor Dianthus, que significa en su lengua, dios (Dios) y anthos 
(Flor). Posteriormente, la “Flor divina”, fue descrita por Linneo como Dianthus 
caryophyllus (Ball, 1998). 
 
El interés comercial por esta especie data de inicios del siglo XVI, época en 
la que se realizaron los primeros mejoramientos. Las variedades de claveles 
de floración permanente fueron desarrolladas en Francia en 1840 e 
introducidas a América en 1852 (Larson, 1992). 
 
En 1938, William Sim, obtuvo por hibridaciones y selecciones, una serie de 
claveles que llevaron su nombre “Clavel Sim o Clavel Americano”. Se 
caracterizaron por presentar una mayor longitud y un cáliz más firme. Sin 
embargo, presentaba problemas como la susceptibilidad a adquirir 
enfermedades y la dificultad de ser cultivadas al aire libre. (Larson, 1992). 
 
López (1989) clasifica el clavel utilizado en floricultura en tres grupos: 
1. Claveles europeos 
2. Claveles americanos (Sim) 
3. Miniclaveles (Spray) 
 
Los europeos son los más fáciles de cultivar, ya que se adaptan al aire libre 
sin el uso de tecnología. El Sim es el mejor remunerado, tiene mayor calidad 
y es comercializado por el floricultor tecnificado. Durante el invierno es 
 21
necesario protegerlo en invernaderos. El miniclavel o tipo spray, es muy 
apreciado en el norte de Europa (López, 1989). 
 
 
 
2.1.4 Zonas de producción 
 
Las áreas de mayor producción de clavel son Holanda, Colombia, Israel, 
Kenia y España. De igual manera, las áreas cercanasa los 30º de latitud 
norte o sur y en el borde oeste de los continentes, presentan condiciones 
apropiadas para su cultivo. Dentro de estas áreas se incluye el sur de 
California, el área Mediterránea, cerca de Perth en Australia, las cercanías de 
Valparaíso en Chile y en Sudáfrica (Ball, 1998; Ojeda, 2004). 
 
2.1.5 Variedades 
 
En la producción comercial para flor cortada se cultivan tres tipos de clavel: 
Americano o Sim, Europeo y Miniatura o Spray. Dentro de dichos tipos existe 
un gran número de variedades que se diferencian por su color, textura del 
pétalo, resistencia o susceptibilidad a enfermedades, adaptabilidad al aire 
libre o invernadero y rendimiento. Basándose en estas características, el 
floricultor selecciona las variedades de acuerdo con las condiciones 
ambientales y demandas del mercado (Larson, 1992). 
 
El mejoramiento de la calidad de las variedades obtenidas de clavel, resulta 
de los cruces intraespecíficos entre los diferentes tipos. Debido a las 
exigencias del mercado, el número de variedades es elevado, apareciendo 
de manera contínua nuevas formas y tipos, producto de mutaciones 
inducidas, hibridaciones y selección de características deseadas. (Larson, 
1992). 
 
 22
Las flores de los claveles Americanos o Sim se caracterizan por ser las más 
bellas debido a su diversidad de colores, tallos de gran porte y una 
sobresaliente durabilidad. Entre los claveles europeos se destacan los tipos 
Chabaud y Flamands, que producen flores de gran tamaño, tallo largo 
adecuado para el manejo en el cultivo y uso en floristerías (Ojeda 2004). 
 
Las variedades miniatura se caracterizan por tener tallos muy cortos y 
abundante floración. Con ésta característica se pretende que el clavel tenga 
el mayor número de botones florales (López, 1989). 
 
Actualmente, la producción de nuevas variedades esta basada en las 
siguientes características: resistencia al hongo Fusarium oxysporum, 
limpieza de virus, longitud del tallo, precocidad y rapidez de crecimiento, 
duración de la flor, ausencia de botones laterales, diversidad de colores y 
adaptación a cultivos al aire libre (Ojeda, 2004). 
 
En los últimos años se ha intentado recuperar el olor, una característica que 
se había perdido en estas flores a favor de su belleza visual, pero que las 
tendencias del mercado están exigiendo (Ojeda, 2004). 
 
 
 
2.1.6 Cultivo y producción 
 
 
Se estima que el clavel tiene un ciclo de vida útil de dos años bajo 
condiciones como las colombianas. La producción de flores comienza a partir 
del sexto mes, aunque depende de la variedad. Se calcula que la 
productividad promedio del clavel estándar (Europeo y Sim) se encuentra 
entre 180 y 210 flores / m² al año (rendimiento bruto). Mientras que el clavel 
miniatura tiene una productividad de 190 flores/m². Sin embargo, estos datos 
 23
pueden variar por la influencia de factores ambientales y por el manejo de 
cada uno de los cultivos (Pizano, 2000). 
 
2.1.6.1 Factores ambientales que influyen sobre la producción 
 
2.1.6.1.1 Temperatura 
 
La temperatura óptima diurna es de 20° C a 25ºC que se obtiene fácilmente 
bajo invernaderos a la altura de los 2600 metros sobre el nivel del mar; 
rasgos predominantes en la zona de la Sabana de Bogotá. Con respecto a la 
temperatura nocturna, ésta baja a 6 y 8 °C, razón por la cual se hace 
necesario el uso de invernaderos en ésta región (Pizano, 2000). 
 
2.1.6.1.2 Suelo 
 
El clavel se adapta a un amplio rango de suelos, desde arenosos a franco-
arcillosos, pero requiere de una profundidad efectiva es de 30 a 40 cm. El 
rango de pH debe estar entre 6,5 - 7. Es importante destacar que a mayor 
restricción de las características antes mencionadas, se pierde más calidad 
que producción (Ojeda, 2004). 
 
2.1.6.1.3 Riego 
 
El sistema de riego más indicado para la producción de clavel es el goteo, ya 
que dosifica de manera precisa la cantidad de agua aplicada y evita la 
dispersión de algunas enfermedades y plagas del follaje y de las flores por 
salpicadura (Pizano, 2000). 
 
 
2.1.6.1.4. Nutrientes 
 
A continuación se presenta una tabla con las necesidades básicas de 
nutrientes. 
 24
 
Tabla 1. Requerimientos nutricionales del clavel 
Elemento Gramos / cama - semana 
Potasio 135 
Nitrógeno 98 
Calcio 52 
Magnesio 20 
Fósforo 20 
Azufre 20 
Zinc 0.44 
Boro 0.35 
Cobre 0.25 
 Nota: Los requerimientos nutricionales han sido calculados para camas de 30 m² y una 
densidad de siembra promedio de 1000 plantas por cama. Tomado de Pizano, 2000. 
 
 
2.1.7 Plagas y Enfermedades 
2.1.7.1 Plagas 
 
Las plagas más comunes que afectan al cultivo del clavel son algunos 
insectos, ácaros y nemátodos. 
 
 
2.1.7.1.1 Ácaros 
 
El ácaro más común que afecta el cultivo de clavel es la arañita roja 
(Tetranychus cinnabarinus). Es un artrópodo de ocho patas en su estado 
adulto, sin alas y con un aparato bucal que posee una articulación prensil que 
le permite perforar las hojas para succionar el contenido de sus células 
(Gómez, 1992). 
 25
Los primeros signos manifestados en el haz del follaje son puntos blancos 
que luego se tornan en manchas rojizas oscuras. En casos de grandes 
poblaciones puede llegar a secar la planta por completo. Los daños más 
importantes se producen en los primeros estados vegetativos de la planta, 
produciendo retraso en el crecimiento (Gómez, 1992). 
 
2.1.7.1.2 Áfidos 
 
Los áfidos son una plaga muy frecuente en el clavel. Se alimentan de hojas y 
flores, en donde succionan los azúcares que se transportan por el floema. 
(López, 1989). 
 
2.1.7.1.3 Trips 
 
Las especies más importantes que atacan al cultivo del clavel son Haplothrips 
sp y Thrip tabaco. Estos insectos se alimentan de flores y centros de 
crecimiento provocando decoloraciones y deformaciones en los tejidos 
afectados. Para el control se prefieren los insecticidas sistémicos (López, 1989). 
 
2.1.7.1.5 Nemátodos 
 
Los géneros Meloidogyne y Heterodera, son endoparásitos que se alimentan 
de la parte aérea y radicular del clavel, produciendo decoloración, 
debilitamiento y enanismo. Adicionalmente, los nemátodos pueden actuar 
como vectores de algunos virus. Igualmente pueden ser la causa de la 
invasión por bacterias y hongos sobre las plantas. Para su control se debe 
identificar los géneros y poblaciones presentes en el suelo, para determinar 
una posible aplicación de nematicidas granulares o esterilizantes de suelo, 
previo a la siembra (Marroquín & Arbeláez, 1992). 
 
 26
2.1.7.2 Enfermedades causadas por hongos y bacterias 
 
2.1.7.2.1 Marchitamiento vascular 
 
Enfermedad originada por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Afecta 
al sistema vascular pudiendo llevar a la desecación y muerte de la planta 
(Carver et al., 1996). Inicialmente los signos se manifiestan en las hojas 
inferiores hasta llegar a las hojas superiores. En los estados finales el tallo 
muestra agrietamiento por la parte exterior y toma el aspecto de leña seca 
(Ochoa, 1996; Arbeláez, 1999). 
 
Como medidas de manejo preventivo esta la desinfección del suelo previo a 
la siembra y control de la humedad (Mirkova, 1998). 
 
 
2.1.7.2.2 Botritis 
 
Botrytis cinerea es un hongo que infecta inicialmente a las flores, luego se 
transmite hacia las hojas, pecíolos y tallos. Los signos en las flores se 
manifiestan como necrosis del tejido; en las hojas se desarrollan lesiones 
necróticas con forma de V que se cubren con moho gris y posteriormente se 
marchita y muere la hoja. Su desarrollo se favorece por la alta humedad, 
poca ventilación y exceso de nitrógeno (Latorre et al., 1998). 
 
 
 
2.1.7.2.3 Roya del clavel 
 
Causada por el hongo Uromyces caryophyllinus, ataca las hojas y los tallos, 
produciendo manchas amarillas, estas producen agrietamiento de la cutícula, 
posteriormente aparecen manchas de color café en forma de ampollas que al 
reventar liberan las esporas cuyo polvocubre las hojas, flores y tallos. Las 
épocas de mayor incidencia de ésta enfermedad son las de lluvias o cuando 
 27
los cultivos permanecen con su follaje mojado por causa del riego mal 
realizado (Arbeláez, 1987) 
 
2.1.7.2.4 Mancha foliar 
 
Producida por Pseudomonas andropogonis (Smith) Stapp bacteria gram-
negativa con forma de bastoncillo. Los signos se manifiestan a nivel del 
follaje al formarse lesiones circulares e irregulares con centros marrones y 
bordes de color pardo rojizo (Ochoa, 1996). 
2.1.7.3 Enfermedades causadas por virus 
 
Las enfermedades causadas por virus juegan un papel muy importante en la 
productividad de las plantas. En el clavel, el rendimiento en la producción 
puede descender entre un 30 y un 50% con la mayoría de las virosis (Oliger 
et al., 1994). Actualmente se conocen doce virus distintos capaces de 
infectar el clavel, de los cuales cinco se encuentran en todas las regiones del 
mundo. Aun cuando se ha identificado su presencia en los cultivos no es 
motivo de preocupación para los floricultores, ya que la expresión de los 
signos es leve e incluso imperceptible. Sin embargo, la productividad y 
calidad del material vegetal libre de virus es significativamente mejor que la 
de las plantas infectadas (Gonzáles et al., 1990; Pizano, 2000). 
 
A continuación se describirán cinco de los virus más frecuentes del clavel: 
 
2.1.7.3.1 Virus del mosaico de las nerviaciones del clavel (CaVM) 
 
Pertenece al grupo de los potyvirus. Se manifiesta sobre el tejido foliar cerca 
de las nerviaciones con un jaspeado difuso localizado principalmente sobre 
las hojas. Durante el invierno estos signos quedan enmascarados (Oliger et 
al., 1994). 
 28
 
2.1.7.3.2 Virus del jaspeado del clavel (CaERV) 
 
Corresponde al género de los Caulimovirus e infecta solamente a las plantas 
de la familia Caryophyllaceae. Se expresa por pequeñas manchas necróticas 
en líneas o anillos sobre los bordes. Algunas veces, las necrosis se 
distribuyen en placas bordeadas de color pardo o púrpura, situadas en la 
punta de las hojas, provocando deformaciones en el borde. (Oliger et al., 
1994; Büchen – Osmond, 2002). 
 
 
2.1.7.3.3 Virus de la mancha anular del clavel (CaRSV) 
 
Es un pequeño virus de ARN isométrico que infecta principalmente a 
Dianthus caryophyllus, Dianthus barbatus. Se ha logrado inocular 
artificialmente en plantas de varias familias. Se transmite mecánicamente y 
por contacto entre plantas o por injertación. Sobre las hojas infectadas se 
desarrollan anillos concéntricos y moteados (Arbeláez 1999; Pizano, 2000; 
Büchen – Osmond, 2002). 
 
2.1.7.3.4. Virus del moteado necrótico del clavel (CaNFV) 
 
Pertenece al grupo de los closterovirus. Infecta principalmente a D. 
caryophyllus, D. barbatus y D. chinensis. Se ha reportado como vectores los 
insectos de la familia Aphididae (áfidos). Sus signos son moteados y rayados 
sobre las hojas de color gris o rojo (Brunt et al., 1996). 
 
 
 
 
 
 29
2.1.7.3.5 Virus moteado del clavel (CarMV) 
 
2.1.7.3.5.1 Clasificación 
 
De acuerdo con el comité internacional en taxonomía de virus (ICTV), el virus 
moteado del clavel pertenece al grupo de los Tombovirus, genero Carmovirus 
y familia Tombusviridae. Presenta una morfología isosaédrica y posee un 
genoma monopartito de ARN linear de cadena simple y polaridad positiva 
(Carrington & Morris, 1985; Rodriguez et al., 2000; Büchen – Osmond, 2002). 
 
2.1.7.3.5.2 Historia y distribución 
 
Fue descrito por primera vez en Inglaterra en 1955 por Kassanis. Diez años 
después se encontraron variedades de clavel infectadas con el CarMV 
(Hollings & Stone, 1964). 
La distribución de éste virus inicio en Estados Unidos en la costa oeste, 
especialmente en California. En la actualidad se encuentra en todo el mundo. 
Colombia es uno de los países más afectados. Rodriguez et al. 2000, 
reportaron la alta incidencia del CarMV en la Sabana de Bogotá, encontrando 
una proporción del 82% de muestras positivas. 
 
2.1.7.3.5.3 Transmisión 
 
El CarMV es transmitido mecánicamente y se propaga fácilmente de una 
planta a otra por las heridas o injertación (Pizano, 2000; Büchen – Osmond, 
2002). Generalmente sucede por la siembra de esquejes de plantas madres 
contaminadas o infectadas(Cano & Sánchez, 1994). 
 
 
2.1.7.3.5.4 Citopatología 
 
El virus moteado del clavel infecta todas las estructuras de la planta, 
causando alteraciones citopatológicas en las células. Las más comunes son 
 30
formación de vesículas periféricas en el citoplasma, múltiples membranas, 
variaciones del núcleo y desarrollo de burbujas en las vacuolas por 
acumulación de virus (Castr, 1973). 
 
 
2.1.7.3.5.5 Sintomatología del clavel 
 
Los claveles infectados por el CarMV se caracterizan por presentar tenues 
moteados cloróticos, manchas y punteados en las hojas nuevas. Las hojas 
viejas pueden presentar el virus enmascarado. También se presenta 
deformación de hojas y falta de vigor, comparado con plantas sanas (Cano & 
Sanchez, 1994; Pizano, 2000; Ojeda 2004). 
Según esto es de suma importancia establecer cultivos de clavel libres del 
CarMV, ya que la calidad y cantidad de las flores se ve aumentada en 
comparación del material infectado con el virus (Calderón & Arbeláez, 1999). 
 
 
 
2.1.7.3.5.6 Rango natural de hospederos 
 
El CarMV se puede encontrar en las siguientes especies: Dianthus 
caryophyllus, D. barbatus, D. chinensis, D. superbus, Saponaria officinalis, S. 
Vaccaria, Daphne odora, Begonia eliator. Sin embargo, se ha logrado 
inocular artificialmente en una gran cantidad de especies (Pizano, 2000). 
 
 
2.1.7.4 Técnicas para la detección de virus 
 
Para la elección de la técnica utilizada en el diagnóstico de la enfermedad y 
la detección del virus responsable, se debe tener en cuenta la finalidad del 
trabajo a realizar, la experiencia del investigador y la disponibilidad de 
equipos y reactivos del laboratorio (Conti et al., 2001). 
 
 
 31
2.1.7.4.1 Pruebas biológicas 
 
Consiste en la utilización de plantas indicadoras (herbáceas) que se inoculan 
con virus fitopatógenos; posteriormente las plantas manifiestan signos típicos 
de la infección. Para el aislamiento de la mayoría de los virus de las plantas 
hortícolas se utilizan como huéspedes, herbáceas de las siguientes familias: 
Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Solanaceae (Conti et al., 2001). Estas 
pruebas se utilizan cuando no se dispone de reactivos para el diagnóstico en 
el laboratorio. 
 
2.1.7.4.2 Citopatología 
 
Se basa en el reconocimiento de un conjunto de modificaciones de las 
células de los tejidos vegetales que son el resultado de un metabolismo 
alterado por la infección viral, dando como resultado el desarrollo de cuerpos 
de inclusión (proteínas estructurales, no estructurales, y funcionales, 
utilizadas en la replicación viral). Estas estructuras son detectadas por el 
microscopio óptico. Si se requiere una observación detallada se puede usar 
el microscopio electrónico. Sin embargo, su identificación no es rápida ni 
fácil y requiere de personal capacitado (Mattews, 1991). 
 
2.1.7.4.3 Inmunoabsorbancia en microscopio electrónico (ISEM) 
 
Se utiliza para detectar virus en pequeñas concentraciones o en mezclas con 
otros virus. La muestra infectada se coloca sobre un retículo de microscopía 
electrónica previamente sensibilizado con un anticuerpo; el anticuerpo 
captura de forma específica a las partículas virales de la muestra y lo 
concentra en el retículo, facilitando la búsqueda con el microscopio 
electrónico (Conti et al., 2001). La sensibilidad del ensayo es similar a la 
obtenida con la prueba inmunoenzimática que se menciona a continuación. 
Sin embargo, la metodología es costosa en términos de instrumentos y 
personal, dificultando diagnósticos a gran escala. 
 32
 
2.1.7.4.4 Prueba inmunoenzimática (ELISA) 
 
La prueba ELISA (Enzyme-Linked-Inmunosorbent Assay)es el método 
serológico más usado actualmente, dada su alta sensibilidad, rapidez y 
evaluación cuantitativa y cualitativa del virus (Conti et al., 2001). 
Esta técnica se basa en el reconocimiento de un antígeno (partículas de 
virus) por anticuerpos y la posterior unión de este complejo con una enzima. 
Este conjugado retiene simultáneamente la actividad inmunológica y 
enzimática de los componentes. Si existe una unión entre los anticuerpos 
específicos y su respectivo antígeno, se produce un cambio de color de la 
solución y esto permite determinar los resultados visualmente o cuantificarlos 
por medio de un espectofotómetro. Existen varias modificaciones de la 
prueba ELISA, que se usan de acuerdo con el objetivo del análisis, dentro de 
las más conocidas se encuentra el método de doble anticuerpo o "Sandwich" 
y el método indirecto (Clark & Adams, 1977; Mattews, 1991; Coll, 1993). 
 
El test ELISA incluye varios pasos: el primero consiste en la adsorción del 
anticuerpo en un pozo plástico tratado. Se utiliza este material porque tiene 
gran afinidad por las proteínas. El segundo paso es la unión del antígeno con 
el anticuerpo. El tercer paso se basa en la conjugación del anticuerpo con 
una enzima (ej. Fosfatasa alcalina) capaz de producir un cambio de color en 
un sustrato adecuado (ej. Fosfato disódico de p-nitrofenilo), cuyo producto 
absorbe luz a una determinada longitud de onda, que es proporcional a la 
concentración de antígeno (Clark & Adams, 1977; Castaño – Zapata, 1998). 
En esta técnica se utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales que se 
diferencian en el número de sitios de unión al virus (Schumann, 1998). 
 
Con el fin de hacer la prueba ELISA más versátil y aplicada a diagnósticos a 
gran escala, se han desarrollado diferentes técnicas: Western Blot, Dot Blot, 
Dipstisck Tissue Blot, que difieren del ELISA por la utilización de otros 
 33
soportes (membranas de nitrocelulosa, nylon, polivinildiflurida) (Conti et al., 
2001). 
 
2.1.7.4.5 Hibridación molecular 
 
Las técnicas moleculares han contribuido a aumentar el conocimiento en el 
campo de la virología vegetal. Su ventaja radica en la posibilidad de 
diagnosticar y/o identificar el genoma viral completo. Especialmente es útil en 
casos como la detección de virus inestables, con bajo poder inmunógeno, 
escasa presencia en el huésped natural, viroides y cepas de virus 
serológicamente próximos o indistinguibles. Sin embargo, la metodología es 
muy costosa en términos de reactivos y equipos y necesita personal 
capacitado en técnicas moleculares; por este motivo, no se emplea en 
investigaciones básicas y de diagnóstico a gran escala (Hammond & Rosner, 
1994; Matthews, 1991; Conti et al., 2001) 
 
La hibridación molecular se basa en la preparación de construcciones 
genéticas que contienen secuencias de nucleótidos homólogas al genoma 
viral, ya que a partir de estas construcciones se sintetizan las sondas que se 
utilizan para señalar la presencia o ausencia de virus en muestras de plantas. 
La detección de virus por hibridación molecular ha sido ampliamente 
utilizada, en particular la hibridación sobre extractos de ácidos nucleicos 
totales de plantas aplicados sobre membranas de nitrocelulosa o nylon. 
Recientemente se han utilizado técnicas de hibridación molecular sobre 
improntas de secciones de tejidos de plantas cuya obtención es más sencilla 
que los extractos de ácidos nucleicos (Foster & Taylor, 1998). 
 
 
2.1.7.4.6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
 
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la 
amplificación de un segmento de DNA utilizando la enzima DNA polimerasa y 
 34
cebadores (oligonucleótidos que hibridan con la cadena complementaria a la 
secuencia a amplificar). Se utiliza para la detección de secuencias 
nucleotídicas virales (Hames et al., 1995). La reacción se produce en tres 
fases: 
1. El DNA que se quiere amplificar se desnaturaliza en cadenas sencillas. 
2. Los cebadores hibridan al DNA de cadena sencilla. 
3. Síntesis de la cadena complementaria del DNA producida por la DNA 
polimerasa (Taq polimerasa) 
Cada etapa o ciclo se realiza a una temperatura diferente. El ciclo se puede 
repetir llevando a cabo otra vez todos los pasos. El resultado obtenido es un 
producto amplificado de DNA que puede ser detectado por una electroforesis 
(Foster & Taylor 1998; Klug & Cummings, 1999). 
 
Para que esta técnica sea aplicada a virus con cadena RNA, es necesario 
sintetizar una cadena de DNA complementario mediante transcripción 
inversa (RT-PCR) (Foster & Taylor, 1998). 
 
La mayor ventaja derivada de la PCR es la identificación de secuencias 
nucleotídicas virales que no pueden ser detectadas por pruebas serológicas. 
Sin embargo, requiere de más tiempo por lo que su aplicación se dificulta 
para diagnósticos en masa (Conti et al., 2001). 
 
 
 
2.1.7.5 Control de virus 
 
La mejor forma de mantener los cultivos de plantas libres de virus es el 
establecimiento de material certificado y su continua inspección respecto a 
determinados virus. Si el virus ya está presente dentro del cultivo se pueden 
realizar diferentes tratamientos; el éxito de estos dependerá de las 
propiedades del virus y de la especie vegetal (Razdan, 2003). 
 
 35
2.1.7.5.1 Quimioterapia 
 
En la actualidad no se ha desarrollado ninguna sustancia química capaz de 
erradicar los virus de plantas infectadas. Hasta el momento se han realizado 
trabajos con el fin de suprimir virus de tejidos vegetales y protoplastos con la 
adición de sustancias químicas (antimetabólicos) en el medio. Sin embargo, 
no se han obtenido resultados exitosos, ya que en algunos casos el virus se 
suprime y en otros se estimula su producción. Se ha reportado que el uso de 
ribavirin (análogos nucleosídicos) tiene efectos positivos en la eliminación del 
virus PVX en plantas de papa (Razdan, 2003). No obstante, la quimioterapia 
presenta ciertos problemas de orden técnico, ya que las sustancias con 
propiedades viricidas han producido toxicidad en los tejidos vegetales 
tratados (Media & Díaz, 1981). 
 
 
2.1.7.5.2 Termoterapia 
 
Consiste en colocar plantas completas o estructuras de éstas, en cámaras de 
crecimiento a temperatura de 35 a 40ºC. El tiempo de exposición al calor es 
variable y depende de la especie. Con esto se pretende reducir la 
concentración de virus en la planta (Razdan, 2003). 
 
Experimentos llevados a cabo por Kassanis en 1965, muestran que la 
habilidad del virus para infectar o multiplicarse en plantas a 36ºC no está 
correlacionada con su punto de inactivación térmica. La eliminación de los 
virus puede ser atribuida a algún sistema metabólico, el cual causa un 
desbalance entre la síntesis y la degradación de los virus o a una dificultad 
para la multiplicación a esa temperatura (Razdan, 2003). 
 
Por otro lado, Quak (1977), reportó que la reducción en la concentración del 
virus, se puede dar por la competencia entre las células del huésped que se 
 36
encuentran en proceso de rápida división y las partículas del virus, por 
lugares de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas lo cual puede llevar a un 
cambio en el balance entre la síntesis y degradación de las partículas del 
virus. 
 
Se ha encontrado que no todos los virus reaccionan de la misma manera a la 
termoterapia. Para la eliminación de algunos virus isométricos, 4 a 6 
semanas podrían ser suficientes. Mientras que virus como el del 
enrollamiento de la hoja (PLRV) en papa necesitan de un período más 
prolongado (varios meses), probablemente más largo del que la planta pueda 
resistir. Trabajos realizados por Hearon y Lawson (1980) en Saponaria 
vaccaria y Baker y Kinnaman (1973) en clavel, obtuvieron una reducción en 
la concentración de los virus presentes en cada especie. A pesar de esto el 
porcentaje de plantas que sobrevive es bajo porque no toleran las altas 
temperaturas.Adicionalmente, muchos virus no pueden ser inactivados por 
tratamientos de calor, se sugiere utilizar el cultivo in vitro de meristemos 
(Razdan, 2003) 
 
2.2 CRECIMIENTO Y DESARROLLO 
El conjunto de eventos que contribuyen a la progresiva formación del cuerpo 
de la planta y que le permiten obtener alimento, reproducirse y adaptarse a 
su ambiente se define como desarrollo (o morfogénesis). Este involucra dos 
procesos: crecimiento (se manifiesta por cambios cuantitativos) y 
diferenciación (se refiere a los cambios cualitativos) (Azcón – Bieto & Talón, 
2000) 
 
El crecimiento se explica como un incremento irreversible en tamaño y 
volumen, que esta dado por la combinación de expansión y división celular. 
La expansión celular ocurre por una mayor extensibilidad de la pared, con 
intervención de expansinas (proteínas que promueven la pérdida de rigidez), 
 37
endoglucanasas, y un aumento en la presión de turgencia. Esta extensión se 
convierte en irreversible una vez que la pared recupera su rigidez (Raven et 
al., 1999). El control de la división celular radica en el ciclo celular, que se 
define como la secuencia de eventos bioquímicos y morfológicos que llevan a 
la generación de células nuevas a partir de una célula madre (Azcón – Bieto 
& Talón, 2000). 
 
Para que el cuerpo de la planta se desarrolle es necesario un proceso de 
diferenciación celular, en el que las células se especializan para ser 
estructural y funcionalmente diferentes unas de otras. Este proceso depende 
básicamente de la expresión diferencial del material genético. Estas células 
tendrán toda la información necesaria para formar una nueva planta. Este 
fenómeno se conoce como totipotencia celular (Azcón – Bieto & Talón, 
2000). Las zonas de crecimiento (meristemos) que se mantienen en 
constante división presentan la mayor proporción de células totipotentes 
(Taiz & Zeiger, 1998) 
 
 
2.2.2 Zonas de crecimiento – meristemos – 
 
El meristemo, es una estructura dinámica en la que continuamente se está 
produciendo crecimiento y división celular (Azcon – Bieto & Talón, 2000). 
 
Los meristemos se pueden clasificar por su origen, posición y la estructura 
que originan. Los meristemos apicales (o primarios) del tallo y de la raíz 
conducen al desarrollo del cuerpo primario (raíces, tallos y hojas) de la planta 
y se forman durante la embriogénesis (Randall & Hake 1997). Los 
meristemos secundarios como los axilares son similares a los primarios en 
estructura y desarrollo, aunque dan origen a raíces o tallos secundarios 
(Margara, 1988; Kerstetter & Hake 1997; Randall & Hake 1997). 
 
 38
Adicional al desarrollo del cuerpo primario está el desarrollo del cuerpo 
secundario que se diferencia porque no da lugar a una planta completa ya 
que sólo está formado por un número limitado de tejidos y la ausencia de 
ciertos órganos. Tal crecimiento deriva de los meristemos laterales (Taiz & 
Zeiger, 1998; Azcon – Bieto & Talón, 2000). 
 
En los meristemos suceden eventos morfogenéticos que conducen a la 
formación de la planta; el origen de un nuevo primordio foliar está 
determinado por un cambio en el plano de división. Generalmente una 
división periclinal en el corpus (capa interna) o en la túnica (capa externa) 
sugiere que se está desarrollando un nuevo primordio (Kerstetter & Hake 
1997). 
 
El meristemo apical se divide en tres regiones o zonas: 
 
Zona central (ZC): ubicada en el extremo distal, presenta células vacuoladas 
y núcleos prominentes, ocurren menos divisiones celulares que en el resto. 
Zona periférica (ZP): Rodea a la zona central, presenta índices más 
elevados de división celular, su función principal es la formación de órganos 
laterales. 
Zona medular (ZM): Situada en la base del meristemo, las células que 
origina son la parte central del tallo y los tejidos vasculares. 
 
Durante el desarrollo vegetativo se conserva la organización del meristemo, 
pero la posición y el destino de las células derivadas del mismo cambian con 
el tiempo. Este proceso está regulado por la información de la posición y por 
la regulación génica (Azcon – Bieto & Talón, 2000). 
 
 
 
 
 39
 
2.2.3 Reguladores de crecimiento 
 
El desarrollo de las plantas está influenciado por la interacción de factores 
externos e internos. Dentro de los factores internos se incluyen las 
hormonas (o fitohormonas), las cuales se definen como señales químicas 
que facilitan la comunicación entre las células y coordinan sus actividades. El 
control hormonal lo realizan cinco grupos principales: auxinas, giberelinas, 
citoquininas, etileno y ácido abscísico. Sin embargo, en los últimos años se 
han aislado una serie de sustancias que también pueden clasificarse como 
hormonas vegetales. En este nuevo grupo de hormonas se incluyen: 
jasmonatos, poliaminas, salicatos y brasinosteroides (Azcon – Bieto & Talón, 
2000). 
 
Las células vegetales responden a las señales hormonales mediante un 
mecanismo de acoplamiento estímulo – respuesta que requiere la percepción 
de la señal (primer mensajero) por un receptor, seguido de la generación y 
transmisión de la señal que activará la respuesta. Estos procesos constituyen 
la cadena de transducción de la señal hormonal (Azcon – Bieto & Talón, 
2000). 
2.2.2.1 Auxinas 
 
El nombre auxina significa en griego 'crecer' y es dado a un grupo de 
sustancias que estimulan la elongación. El ácido indolacético (IAA) es la 
forma predominante, sin embargo, se aceptan como auxinas naturales el 
ácido fenilacético, ciertos cloro-indoles y el ácido indolbutírico. A su vez 
existen varias sustancias que causan un efecto fisiológico similar y que se 
han producido sintéticamente; entre las cuales se encuentra el ácido 
naftalenacético (NAA), El ácido 2,4 – diclorofenoxiacético (2,4 – D) y el ácido 
2 – metil – 4 – clorofenoxiacético (MCPA) (Taiz & Zeiger, 1998). 
 40
 
Una de las principales características de las auxinas es la fuerte polaridad 
exhibida en su transporte a través de la planta. Las hormonas son 
transportadas por medio de un mecanismo dependiente de energía, 
alejándose en forma basipétala, es decir, desde el punto apical de la planta 
hacia su base. Este flujo de auxinas reprime el desarrollo de brotes axilares 
laterales a lo largo del tallo, manteniendo de esta forma la dominancia apical. 
El movimiento de las auxinas fuera de la lámina foliar hacia la base del 
pecíolo parece también prevenir la abscisión de las hojas (Raven et. al., 
1999). 
 
Las auxinas participan en diferentes procesos del desarrollo vegetal: 
alargamiento o elongación celular, formación de raíces adventicias, 
partenocarpia, tropismos, promoción de biosíntesis del etileno, entre otros. 
Por ello, se han desarrollado auxinas sintéticas que son utilizadas en el área 
agronómica y biotecnológica (Azcon – Bieto & Talón, 2000). 
 
En el cultivo in vitro de tejidos se utiliza principalmente para estimular el 
crecimiento y favorecer la formación de raíces. Sin embargo, la respuesta 
que se produce tras la aplicación al explante depende de la edad fisiológica 
del material vegetal, la naturaleza de las auxinas, concentración y tiempo de 
aplicación (Hartmann et al., 1997). 
 
 
 
2.2.2.2 Citoquininas 
 
En 1956 Skoog y colaboradores aislaron la quinetina (6 – furfurilaminopurina) 
a partir del DNA del esperma del arenque sometido al autoclave. El término 
 41
hace referencia a su capacidad para promover la división celular en tejidos 
vegetales. A pesar de su gran actividad biológica, no es sintetizada por las 
plantas. Se puede obtener a partir de mezclas de adenina y furfuril alcohol. 
La primera citoquinina natural identificada fue la zeatina, a parir del 
endospermo del maíz. A partir de esto se han descubierto varias sustancias 
naturales y sintéticas, que tienen efectos análogos a la quinetina. (Roca & 
Mroginski 1991; Taiz & Zeiger, 1998). 
 
Las citoquininas se pueden derivarde la base púrica adenina (6 – 
aminopurina) y de la fenilúrea. Las derivadas de la adenina poseen un 
sustituyente de naturaleza isoprenoide o aromática, en el nitrógeno amínico 
de la posición 6 del anillo de purina, en este grupo se encuentran citoquininas 
naturales como la zeatina, benciladenina y citoquininas sintéticas como la 
kinetina (6 – furanosil aminopurina). A pesar de tener similitudes en la 
estructura pueden presentar analogías respecto a la síntesis, actividad y 
metabolismo (Van Staden & Crouch, 1996). 
 
Las citoquininas procedentes de la fenilúrea, son compuestos sintéticos 
divididos en dos grupos, las piridylureas y las thidiazolureas. En el grupo de 
las thidiazolureas se encuentra el thidiazuron, un compuesto con actividad de 
citoqunina, el cual es más efectivo que las citoquininas naturales en la 
promoción del desarrollo de yemas axilares, o la diferenciación de yemas 
adventicias en cultivos in vitro (Huetteman et al., 1993). 
 
Las citoquininas regulan varios procesos del desarrollo de las plantas, 
incluyendo división celular, proliferación de yemas axilares, senescencia 
foliar y floración, entre otros. Gran parte de estos procesos están afectados 
por otros estímulos, especialmente ambientales y hormonales. Como caso 
típico esta la interacción de las citoquininas con las auxinas que se utiliza 
para regular la neoformación de órganos in vitro y controlar la dominancia 
 42
apical fundamental en la industria de la micropropagación (Ascón – Bieto & 
Talón, 2000). 
 
 
2.3 CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMOS 
El cultivo de tejidos in vitro comprende una serie de técnicas mediante las 
cuales un explante (porción de tejido o de un órgano que se retira del resto 
de la planta) se cultiva en un medio de composición química definida en 
condiciones ambientales controladas (Razdan, 2003). 
 
Los factores que se deben tener en cuenta para obtener una respuesta 
adecuada del explante incluyen: la posición en la planta donadora, edad 
ontogenética y estado fisiológico de la misma. Adicionalmente se debe 
considerar la especie con la que se esté trabajando y los objetivos que se 
buscan. Uno de estos, es el uso de meristemos apicales para la producción 
de plantas libres de virus (Razdan, 2003). 
 
En los años 50 en estudios realizados sobre dalias dirigidos por Morel y 
Martin se descubrió que las plantas obtenidas a partir de meristemos estaban 
libres de virus. Después de este trabajo y ante la evidencia de las 
aplicaciones de este método, se iniciaron estudios en busca de las razones 
por las cuales esto sucedía. Una primera hipótesis explica la ausencia del 
virus en el meristemo por la inexistencia de tejido vascular (tejido a través del 
cual se movilizan los virus) en directa relación con el meristemo. Incluso si el 
virus fuera capaz de invadir o moverse de célula a célula, la velocidad de 
avance de los virus sería inferior a la de crecimiento del meristemo, lo cual 
impediría su invasión. Otras hipótesis proponen una inhibición de la 
replicación de los virus en la zona meristemática debido a la alta tasa 
metabólica del meristemo y a la elevada concentración de reguladores 
(auxinas) en esa zona. Aunque el motivo de la ausencia de virus en el 
 43
meristemo no está totalmente esclarecido, estas hipótesis o una conjunción 
de las mismas parece ser bastante acertada (Azcón – Bieto, 2000; Peña, 
2000). 
 
Sin embargo, existen argumentos que contradicen la absoluta ausencia de 
meristemos libres de virus, ya que es un proceso probabilístico, que no 
ocurre en el 100% de los casos, sino sólo en una alta proporción (Gonzáles 
et al., 1990). 
 
Una vez obtenidos los meristemos se proceden a la siembra en un medio de 
cultivo, con el cual se busca el crecimiento y regeneración de estos mediante 
el aporte de nutrientes. La composición general de los medios de cultivo no 
varía mucho de especie a especie y sus elementos esenciales son 
macronutrientes (nitrógeno, fósforo, potasio, calcio, magnesio y azufre), 
micronutrientes (boro, cobalto, manganeso, hierro, zinc, molibdeno y cobre), 
compuestos orgánicos (vitaminas como tiamina, piridoxina y acido nicotínico), 
fuente de carbono (generalmente sacarosa), reguladores de crecimiento y 
materiales de soporte. El medio más usado para micropropagación es el de 
Murashige & Skoog (1962) cuya composición puede variar de acuerdo con 
los requerimientos de cada especie (Razdan, 2003). 
 
Dentro de los materiales de soporte el más utilizado es el agar, cuyo 
componente es la agarosa, proveniente de ciertas algas. Otros son el 
Phytagel® y Gel Rite® que se componen de ácido glucorónico, ramanos y 
glucosa. Al tener elementos sustitutos del agar su potencial mátrico es más 
bajo, lo que permite mayor disponibilidad de agua para el explante cultivado 
in vitro; no obstante se pueden presentar problemas de hiperhidratación 
(Passqualetto, 1990; George, 1996). Existen otros materiales de soporte 
como el medio líquido en agitación ó puentes de papel filtro. 
 
 44
Con respecto al pH del medio, el rango entre el cual se debe ajustar previo a 
autoclavar es de 5.6 a 5.8. En general la respuesta de las plantas no es muy 
sensible a los cambios de pH en rangos pequeños. Es importante recalcar 
que el crecimiento del material vegetal en un período de tiempo puede 
generar cambios en el pH, haciéndose necesaria la transferencia a medios 
frescos (Smith, 1992). 
 
 
Dentro de los factores físicos a tener en cuenta se incluyen la luz, la 
temperatura y la humedad relativa. Se ha reportado que cambios de 
irradiancia (cantidad y calidad de luz), fotoperíodo (duración de la luz) y 
longitud de onda afectan el tamaño de las hojas y brotes al igual que la 
morfogénesis (Jeong et al., 1995). De igual manera, la temperatura influye 
sobre el desarrollo del explante in vitro. El promedio para la mayoría de 
especies es de 25ºC (Razdan, 2003). Temperaturas tan bajas como los 6ºC 
pueden reducir significativamente la tasa de crecimiento, mientras que otras 
tan altas como 30ºC pueden inhibir la multiplicación de brotes (Hartmann et 
al., 1997). Se debe considerar que utilizar una misma temperatura durante 
los períodos de luz (generalmente, 16 horas) y oscuridad (8 horas) favorece 
la organogénesis. 
 
El tercer factor físico a tener en cuenta es la humedad relativa del recipiente 
que puede ser cercana al 100% en condiciones in vitro. El potencial hídrico 
del aire y el sustrato es menos negativo o cercano a cero. Por lo tanto, no se 
presenta un gradiente de potencial hídrico suficiente para dirigir un proceso 
de transpiración, lo cual contribuye a la hiperhidratación de los tejidos 
cultivados in vitro (Ziv, 1991; Jeong et al., 1995). 
 
Un último aspecto a tener en cuenta es la composición de gases dentro del 
recipiente. Los principales son etileno, oxígeno, dióxido de carbono, y 
 45
acetaldehído. Los efectos producidos por estos gases afectan la 
morfogénesis, promoviendo crecimientos celulares anormales. Sin embargo, 
aún se desconoce del todo la interacción de estos gases entre sí y su efecto 
en el comportamiento de las plantas (Razdan, 2003). 
 
2.3.1 Etapas del cultivo de meristemos in vitro 
 
El cultivo in vitro de meristemos, comprende las siguientes etapas: 
 
2.3.1.1 Etapa 0: Etapa preparativa 
 
Consiste en clasificar el material que se encuentra en condiciones fisiológicas 
y fitosanitarias adecuadas. Usualmente las plantas que donan el explante se 
someten a termoterapia con el fin de eliminar partículas virales (Hartmann et 
al., 1997). 
 
2.3.1.2 Etapa I: Establecimiento del explante 
 
Las plantas donadoras de explantes deben someterse a una desinfestación 
superficial, con productos químicos que sean tóxicos para los 
microorganismos, puesto que si no se eliminan podrían competir con el 
crecimiento y desarrollo del explante en condiciones in vitro (Debergh & 
Zimmerman 1991).Dentro de los productos químicos más utilizados se encuentran el etanol (50 
%), que posee una baja tensión superficial y puede fácilmente humedecer el 
tejido; hipoclorito de sodio (NaClO) y el hipoclorito de calcio (CaClO). El 
hipoclorito de sodio se utiliza con mayor frecuencia; para su aplicación se 
manejan diluciones a concentraciones de 2 a 3.5 % y tiempos de 
desinfestación que no afecten el tejido. Además, se recomienda realizar 
 46
lavados (3 a 5 veces) con agua destilada estéril, con el fin de eliminar 
residuos de desinfectantes que pueden inhibir el crecimiento del explante. 
Estos procedimientos se deben realizar dentro de una cámara de flujo 
laminar que garantice la asepsia del procedimiento (Hartmann et al., 1997). 
 
Durante la etapa de establecimiento, el explante pasa por un periodo inicial, 
donde se estabiliza después del estrés producido por el aislamiento de la 
planta donadora y por los tratamientos de desinfestación. De esta manera, se 
espera que ocurra un crecimiento resultado de la división y elongación celular 
(Smith, 1992). 
 
2.3.1.3 Etapa II: Multiplicación y elongación de brotes 
 
Tiene como objetivo la multiplicación de los brotes obtenidos a partir del 
meristemo. Por lo general, el medio de cultivo es similar al de la fase de 
establecimiento y es común utilizar citoquininas con el propósito de estimular 
la división celular e inhibir la dominancia apical para lograr el crecimiento de 
brotes (Razdan, 2003). 
 
El número de subcultivos y la composición del medio de cultivo pueden 
afectar la estabilidad genética y la tasa de multiplicación de las plantas 
obtenidas (Hartmann et al., 1997). 
 
2.3.1.4 Etapa Enraizamiento in vitro 
 
Los brotes obtenidos son sometidos a condiciones de enraizamiento y 
preparación para ser transplantados ex vitro. Para este procedimiento se 
deben transferir por unos días a un medio de cultivo sin reguladores de 
crecimiento y posteriormente se subcultivan en medio para la inducción de 
 47
raíces in vitro. Se recomienda que se disminuyan los niveles de citoquininas 
exógenas y se aumenten los de auxinas exógenas. Adicionalmente, se debe 
disminuir la concentración de las sales y de la fuente de carbono (Razdan, 
2003). 
El tiempo de duración de esta etapa depende de la especie o variedad y el 
tipo y concentración del regulador de crecimiento (Luttge et al., 1993; 
Debergh & Zimmermann 1991). 
 
2.3.1.5 Etapa IV: Aclimatación del material obtenido in vitro 
 
Es la etapa conocida como endurecimiento, proceso mediante el cual las 
plantas obtenidas en condiciones in vitro se transfieren gradualmente a un 
ambiente ex vitro. Para obtener éxito en los resultados se debe reducir 
gradualmente la humedad relativa que rodea a la planta, con el objetivo de 
lograr que la planta controle la transpiración y pueda adaptarse a un sustrato 
en condiciones de campo (Hartmann et al., 1997). 
 
2.3.2 Problemas asociados al cultivo in vitro 
2.3.2.1 Contaminación 
 
La presencia de microorganismos en los cultivos in vitro reduce el éxito de 
los resultados, especialmente durante las primeras etapas. Esta situación se 
genera por las condiciones físicas del cultivo que conforman un ambiente 
propicio para su desarrollo (Debergh & Zimmerman, 1991). 
 
La mayor fuente de contaminación en el cultivo de tejidos vegetales se 
produce por la presencia de microorganismos superficiales y sistémicos de la 
planta donadora. Para controlar la contaminación superficial se deben 
descartar los individuos que estén en mal estado fitosanitario, realizar 
 48
procedimientos de desinfestación adecuados, utilizando desinfectantes 
superficiales y fungicidas. A pesar de esto, el material puede no quedar 
completamente estéril, ya que es probable que se presenten 
microorganismos sistémicos como virus, bacterias y hongos. Algunos de 
estos contaminantes se pueden tratar con el uso de antibióticos o de 
tratamientos de quimioterapia y termoterapia (Casells, 1991). 
Adicional al uso de sustancias químicas de desinfección, es necesario 
trabajar en ambientes adecuados, esterilizar los medios de cultivo, y realizar 
los cultivos siguiendo ciertas normas de asepsia (Roca & Mroginski, 1991). 
2.3.2.2 Oxidación 
Durante el cultivo in vitro el explante sufre siempre en mayor o menor medida 
situaciones de estrés, ocasionadas por daños mecánicos o por las 
condiciones del cultivo in vitro (como la composición del medio). Estas 
situaciones estimulan el metabolismo de los compuestos fenólicos. La 
síntesis de fenoles va a producir una serie de reacciones de 
hipersensibilidad, tales como la exudación al medio del contenido de las 
células deterioradas. De igual forma, las células vecinas de las que 
inicialmente fueron lesionadas se ven afectadas, incluso aunque esas células 
no parezcan estarlo, llevando finalmente a una muerte prematura (Debergh 
& Read, 1991). 
 
En general, los fenoles son sustancias lábiles y fáciles de oxidar. Los 
productos generados por la oxidación tienen carácter fitotóxico, por lo que 
son capaces de alterar eventos morfogenéticos y/o de crecimiento y 
desarrollo, potenciando en otras ocasiones otros procesos de oxidación, 
puesto que se convierten en potentes oxidantes (Dixon & Paiva, 1995). 
 
Por todo lo dicho, en el cultivo de tejidos se hace necesario controlar el 
efecto de la oxidación. Una forma mediante la cual se puede realizar esto es 
 49
evitando el estrés que estimula la biosíntesis de compuestos fenólicos, con el 
fin de impedir que estas sustancias aparezcan en los cultivos y produzcan 
efectos tóxicos e inhiban el crecimiento (Debergh & Read, 1991). 
 
Otros métodos que han dado buen resultado cuando la síntesis de fenoles no 
puede evitarse son: la dispersión, adsorción o lavado, con sustancias como 
el carbón activado (CA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la modificación del 
potencial redox (disminuyendo los agentes redox), o la disponibilidad de 
oxígeno; la inactivación de enzimas de tipo fenolasa (quelantes), y otros 
sistemas como la incubación en condiciones de oscuridad, bajo pH, 
incubación a temperaturas más bajas, entre otros. En general lo que se 
busca al proporcionar éstas condiciones es reducir la actividad fenolasa y la 
disponibilidad de sustratos para esta enzima (Debergh & Zimmerman, 1991; 
Thomas & Ravindra, 1997). 
 
La adición de sustancias antioxidantes, es otro de los métodos que suelen 
aplicarse, aunque es necesario tener mucho cuidado, ya que se pueden 
convertir en oxidantes muy potentes, invirtiéndose su efecto positivo en el 
control de los fenoles (Debergh & Read, 1991). 
 
 
2.3.3.2 Vitrificación ó hiperhidratación 
 
La vitrificación ó hiperhidratación, es un desorden fisiológico que se presenta 
en los tejidos cultivados in vitro, especialmente en las hojas, que incide sobre 
dos de los procesos más importantes que realizan estas estructuras: la 
fotosíntesis y el intercambio gaseoso. En menor medida los tallos y raíces 
también resultan afectados por estas anomalías anatómicas, que en ciertos 
 50
casos van a impedir el establecimiento de plantas micropropagadas en 
condiciones ex vitro (Ziv, 1991; Kevers et al., 2004; Saher et al., 2004) . 
 
 
 
2.3.3.2.1 Posibles causas de la hiperhidratación 
 
 
Los estudios realizados sobre la hiperhidratación, señalan que los defectos 
anatómicos y fisiológicos observados, son el resultado de varias alteraciones 
en determinadas rutas metabólicas. Así los cambios en la síntesis de 
proteínas, inciden en varias enzimas implicadas en la fotosíntesis (Rubisco), 
en la síntesis de celulosa y lignina (fenilalanina amonioliasa, glúcano 
sintetasa), y en procesos asociados con la producción de etileno 
(peroxidasas) (Saher et al., 2004). Los niveles de proteínas de hojas 
hiperhidratadas son inferiores a los de hojas normales y se ha detectado una 
proteina de 30 kD exclusiva de hojas vitrificadas y otras