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UNIVERSIDAD NACIONAL DE FRONTERA FACULTAD DE INGENIERÍA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS Y BIOTECNOLOGÍA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS TESIS PARA OBTENER EL TITULO PROFESIONAL DE INGENIERO DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS “Predicción de propiedades ópticas en biopolímeros con base a residuos del café (Coffea) mediante espectroscopia THz, acoplado a herramientas quimiométricas” Autora: Br. Lourdes de Jesús Sarango Moncada Asesor: Dr. Wilson Manuel Castro Silupu Coasesor: Mg. Segundo Grimaldo Chávez Quintana Coasesor: Ing. Miguel Angel Chauca Aguilar REGISTRO: PY-EPIIA-058 Sullana – Perú 2022 II Dedicatoria A Dios Por bendecirme y brindarme la oportunidad de desarrollar el presente trabajo, gracias a ello esta meta en mi vida se ve cumplida. A mis padres Wilson y Jenny, por su gran amor, apoyo y por su esfuerzo realizado para brindarme siempre lo mejor a lo largo de toda mi vida e inculcarme siempre a persistir y cumplir cada uno de mis propósitos. A mis familiares Hermanos, sobrinos, tíos y demás familiares quienes fueron testigos de la realización del presente trabajo y siempre estuvieron brindándome el apoyo necesario. III Agradecimiento A mi asesor Dr. Wilson Manuel Castro Silupu; por depositar en mí su confianza para realizar este proyecto, por el apoyo y conocimientos otorgados. Al equipo de profesionales encargados del Laboratorio de Inocuidad de Alimentos de la UNF; Ing. Jorge Mogollón, Ing. William Vera, y Lic. Glenda Palomino, agradecida por su esfuerzo, tiempo, dedicación, conocimientos, gestión eficiente y apoyo incondicional a lo largo de este estudio. A mi casa de estudios superiores la Universidad Nacional de Frontera por permitirme el uso de las instalaciones. Al proyecto “Creación del Laboratorio de Investigación de Inocuidad de Alimentos de la Universidad Nacional de Frontera”. A la Asociación Agraria Manos Unidas que mediante el proyecto presentado a PROCIENCIA - CONCYTEC, llamado “Obtención de biopolímeros con alta capacidad antioxidante a partir de residuos del beneficio del café (pulpa de café) y su evaluación en frutas nativas de exportación”, se logró el financiamiento de la presente tesis. IV Visto Bueno del Asesor de la tesis V Visto Bueno del Asesor de la tesis VI Visto Bueno del Asesor de la tesis VII Jurado evaluador ———————————————— Presidente MBA. Leandro Alonso Vallejos More ———————————————— Secretario Msc. Diego Salvador Lachira Estrada ———————————————— Vocal Dr. Wilson Manuel Castro Silupu VIII IX X Índice 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 18 1.1. Biopolímeros ................................................................................................... 18 1.1.1. Fuentes de biopolímeros ......................................................................... 19 1.1.2. El almidón ............................................................................................... 19 1.2. Residuos del café ............................................................................................ 20 1.3. Espectroscopia de Terahertz (THz -TDS) ................................................... 20 1.4. Quimiometría ................................................................................................. 23 1.5. Antecedentes ................................................................................................... 24 2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................. 28 2.1. Materiales ....................................................................................................... 28 2.1.1. Insumos ....................................................................................................... 28 2.1.2. Materiales e instrumentos de laboratorio ................................................ 28 2.1.3. Equipos .................................................................................................... 28 2.2. Metodología .................................................................................................... 28 2.2.1. Obtención del biopolímero ..................................................................... 29 2.2.2. Prueba de envejecimiento acelerado del biopolímero ......................... 32 2.2.3. Caracterización por color ...................................................................... 32 2.2.4. Análisis con espectroscopia THz ........................................................... 33 3. RESULTADOS ...................................................................................................... 39 3.1. Obtención de biopolímeros............................................................................ 39 3.2. Caracterización por color.............................................................................. 39 XI 3.3. Perfiles THz .................................................................................................... 41 3.4. Comparación de modelo y técnica de pre procesamiento de espectros .... 47 3.4.1. Predicción de los parámetros ópticos de biopolímeros en base a residuos del café (coffea) usando el modelo PLSR ............................................. 47 3.4.2. Predicción de los parámetros ópticos de biopolímeros en base a residuos del café (Coffea) usando el modelo Neuronal Net Fitting (NNF). ...... 57 4. DISCUSIÓN ........................................................................................................... 66 5. CONCLUSIONES ................................................................................................. 68 6. RECOMENDACIONES ....................................................................................... 69 7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................ 70 8. ANEXOS ................................................................................................................ 78 XII Índice de figuras Figura 1. Esquema de adquisición de imágenes por espectroscopia de THz – TDS .... 22 Figura 2. Esquema del procedimiento experimental .................................................... 29 Figura 3. Principales elementos del equipo de homogenización de biopolímeros ....... 31 Figura 4. Esquema de la cámara de secado de biopolímeros con luz ultra violeta (UV) ........................................................................................................................................ 32 Figura 5. Esquema de proceso de medición de espacio color CIE L*a*b* ................. 33 Figura 6. Principales elementos del sistema de adquisición de imágenes THZ – TDS. ........................................................................................................................................ 33 Figura 7. Captura de pantalla del Software Epina ImageLab, durante adquisición de espectros. ........................................................................................................................ 34 Figura 8. Umbralización, segmentación y extracción de la región de interés (ROI) en imágenes THz ................................................................................................................. 35 Figura 9. Muestras de Biopolímeros con diferentes concentraciones de antioxidante de café (Coffea) ................................................................................................................... 39 Figura 10. Parámetro “L*” de las diferentes concentraciones de antioxidantes .......... 40 Figura 11. Parámetro “a∗”de las diferentes concentraciones de antioxidantes ........ 40 Figura 12. Parámetro “b*” de las diferentes concentraciones de antioxidantes ........... 41 Figura 13. Espectros THz de los biopolímeros en el dominio de tiempo y en el dominio ........................................................................................................................................ 42 Figura 14. Espectros completos de biopolímeros con diferentes concentraciones de antioxidantes ................................................................................................................... 43 Figura 15. Perfiles de transmitancia durante el proceso de envejecimiento acelerado de biopolímeros sin presencia de antioxidantes. ................................................................. 44 Figura 16. Perfiles medios de transmitancia durante el proceso de envejecimiento acelerado de biopolímeros con 0.2% antioxidantes........................................................ 45 Figura 17. Perfiles medios de transmitancia durante el proceso de envejecimiento acelerado de biopolímeros con 0.4% de antioxidantes ................................................... 46 Figura 18. Perfiles medios de transmitancia durante el proceso de envejecimiento acelerado de biopolímeros con 0.6% de antioxidantes ................................................... 47 Figura 19. Métricas de predicción de la coordenada L* en biopolímeros sometida a 30°C usando PLSR. ........................................................................................................ 49 XIII Figura 20. Métricas de predicción de coordenada a* en biopolímeros sometido a 30°C usando PLSR .................................................................................................................. 50 Figura 21. Métricas de predicción de coordenada b* en biopolímeros sometidos a 30°C usando PLSR .................................................................................................................. 51 Figura 22. Métricas de predicción de coordenada L* en biopolímeros sometidos a 35°C usando PLSR ......................................................................................................... 52 Figura 23. Métricas de predicción de coordenada a* en biopolímeros sometido a 35°, usando PLSR .................................................................................................................. 53 Figura 24. Métricas de predicción de coordenada b* en biopolímeros sometido a 35°C usando PLSR .................................................................................................................. 54 Figura 25. Métricas de predicción de coordenada L* en biopolímeros sometidos a 40°C usando .................................................................................................................... 55 Figura 26. Métricas de predicción de coordenada a* en biopolímeros sometido a 40°C usando PLSR .................................................................................................................. 56 Figura 27. Métricas de predicción de coordenada b* en biopolímeros sometido a 40°C usando PLSR .................................................................................................................. 57 Figura 28. Métricas de predicción de coordenada L* de biopolímeros sometido a 30°C usando NNF .................................................................................................................... 58 Figura 29. Métricas de predicción de coordenada a* del biopolímero sometido a 30°C usando NNF .................................................................................................................... 59 Figura 30. Métricas de predicción de coordenada b* en biopolímeros sometido a 30°C usando NNF .................................................................................................................... 60 Figura 31. Métricas de predicción de la coordenada L* de biopolímeros sometido a 35°C usando NNF ........................................................................................................... 61 Figura 32. Métricas de predicción de coordenada a* en biopolímeros sometido a 35°C usando NNF .................................................................................................................... 62 Figura 33. Métricas de predicción de coordenada b* de biopolímeros sometidos a 35°C usando NNF .................................................................................................................... 63 Figura 34. Métricas de predicción de coordenada L* de biopolímero sometido a 40°C usando NNF .................................................................................................................... 64 Figura 35. Métricas de predicción de coordenada a* de biopolímero sometido a 40°C usando NNF .................................................................................................................... 65 Figura 36. Métricas de predicción de coordenada b* de biopolímero sometido a 40°C usando NNF .................................................................................................................... 66 XIV Figura 37. Pesado de insumos para elaboración de biopolímeros ................................ 84 Figura 38. Antioxidantes de pulpa de café ................................................................... 84 Figura 39. Plastificación del biopolímero .................................................................... 85 Figura 40. Mezcla formadora de biopolímeros ............................................................ 85 Figura 41. Reposo de mezcla en desecador .................................................................. 86 Figura 42. Pesado de mezcla en placas petri ................................................................ 86 Figura 43. Secado de muestra en estufa ....................................................................... 87 Figura 44. Acondicionamiento de muestras en desecador UV ..................................... 87 Figura 45. Biopolímeros con antioxidantes de pulpa de café ....................................... 88 Figura 46. Submuestras ................................................................................................ 88 XV Índice de tablas Tabla 1. Formulaciones para obtención de biopolímeros con antioxidante de café. ..... 30 Tabla 2. Resultados de predicción por modelado PLSR a 30°C ................................... 78 Tabla 3. Resultados de predicción por modelado PLSR a 35°C ................................... 79 Tabla 4. Resultados de predicción por modelado PLSR a 40°C ................................... 80 Tabla 5. Resultados de predicción por modelado NNF a 30°C ..................................... 81 Tabla 6. Resultados de predicción por modelado NNF a 35°C ..................................... 82 Tabla 7. Resultados de predicción por modelado NNF a 40°C ..................................... 83 XVI Resumen Los biopolímeros con adición de antioxidantes obtenidos de subproductos agrícolas son de gran interés en la industria de alimentos para el desarrollo de envases activos. Por otro lado, la calidad de estos materiales se relaciona con sus propiedades ópticas, siendo necesario el estudio de tecnologías rápidas, eficientes y no destructivas para su análisis. Por tanto, el objetivo de la presente investigación fue determinar si existe efecto en la predicción de propiedades ópticas en biopolímeros con base a residuos del café (Coffea), mediante espectroscopia THz - TDS, acoplado a herramientas quimiométricas. Para esto, se elaboraron biopolímeros con 0, 0.2, 0.4 y 0.6% de antioxidantes de pulpa de café, los mismosfueron sometidos a temperaturas de 30, 35 y 40°C, siendo evaluados cada veinticuatro horas durante cuatro días. Se adquirieron 960 perfiles en el dominio de tiempo, luego se convirtieron a perfiles en el dominio de la frecuencia usando la transformada de Fourier, a partir de los cuales se obtuvieron los espectros de transmitancia, estos fueron pre tratados con; Savitzky - Golay, Variable normal estándar, Normalizado, y Corrección de dispersión múltiple, en el rango de frecuencias de 0.5 – 3.0 THz. Seguidamente, se implementaron dos modelos de predicción; Regresión de Mínimos Cuadrados Parciales (PLSR) y Neuronal Net Fitting (NNF), correlacionando los datos espectrales con los datos del espacio de color CIE L*a*b*. El desempeño de los modelos se evaluó en términos de coeficiente de correlación (R2) y error cuadrático medio (RMSE). El mejor rendimiento se obtuvo con el modelo NNF (R2 = 1.0000) y error cuadrático medio (RMSE = 0.0000). Por tanto, es factible el uso de espectroscopia THz, acoplada a quimiometría para predicción de las propiedades ópticas del biopolímero con adición de antioxidantes de café. Palabras clave: Biopolímeros, envejecimiento acelerado, espectroscopia de terahercios, propiedades ópticas, quimiometría. XVII Abstract Biopolymers with added antioxidants obtained from agricultural by-products are of great interest in the food industry for the development of active packaging. On the other hand, the quality of these materials is related to their optical properties, being necessary to study fast, efficient and non-destructive technologies for their analysis. Therefore, the objective of this research was to determine if there is an effect in the prediction of optical properties in biopolymers based on coffee (Coffea) residues, by means of THz - TDS spectroscopy, coupled to chemometric tools. Biopolymers with 0, 0.2, 0.2, 0.4 and 0.6% of antioxidants from coffee pulp were prepared and subjected to temperatures of 30, 35 and 40°C, being evaluated every twenty-four hours for four days. A total of 960 time domain profiles were acquired, then converted to frequency domain profiles using the Fourier transform, from which transmittance spectra were obtained and pretreated with; Savitzky-Golay, Standard Normal Variable, Normalized, and Multiple Scattering Correction, in the frequency range of 0.5 - 3.0 THz. Next, two prediction models were implemented; Partial Least Squares Regression (PLSR) and Neuronal Net Fitting (NNF), correlating spectral data with CIE L*a*b* color space data. The performance of the models was evaluated in terms of correlation coefficient (R2) and root mean square error (RMSE). The best performance was obtained with the NNF model (R2 = 1) and root mean square error (RMSE = 0). Therefore, it is feasible to use THz spectroscopy coupled to chemometrics for prediction of the optical properties of the biopolymer with addition of coffee antioxidants. Keywords: Biopolymers, accelerated aging, terahertz spectroscopy, optical properties, chemometrics. 18 1. INTRODUCCIÓN La preocupación por los altos niveles de contaminación a causa de la inadecuada gestión de polímeros tradicionales no biodegradables ha conllevado al desarrollo de polímeros de base biológica amigables con el ambiente conocidos como biopolímeros (Sadasivuni y col., 2020). En el rubro de envases y embalajes para alimentos, han despertado un especial interés, sobre todo en los biopolímeros obtenidos de fuentes vegetales de alta disponibilidad y bajo costo como el almidón (Tarique y col., 2021). También existe creciente interés por la incorporación de compuestos bioactivos en los envases de alimentos, los mismos que se obtienen a partir de subproductos agroindustriales infravalorados (Arun y col., 2020), como la cascara del café; una fuente importante de compuestos antioxidantes con gran potencial para la conservación de alimentos (Silva y col., 2020; Rebollo-Hernanz y col., 2021). El desarrollo de biopolímeros y su aplicación en la industria alimentaria precisa del conocimiento de sus propiedades ópticas; refracción, reflexión, absorción, difusión y difracción de la luz (Udayakumar y col., 2021). La espectroscopia THz es una técnica vibracional no destructiva y no invasiva que ha surgido como técnica emergente para la evaluación de propiedades ópticas, térmicas y mecánicas en diversos materiales (Neu & Schmuttenmaer, 2018). Por lo que, se planteó como objetivo principal determinar si existe efecto en la predicción de propiedades ópticas en biopolímeros con base a residuos del café (Coffea), mediante espectroscopia THz, acoplado a herramientas quimiométricas. 1.1. Biopolímeros Los biopolímeros son macromoléculas presentes en la materia viva, constituido por monómeros con estructura lineal o ramificada (Telis, 2012). En cuanto a los monómeros, son moléculas que contiene ácidos nucleicos de aminoácidos, sacáridos o nucleótidos provenientes de matrices proteicas (Gandini & Lacerda, 2015). Actualmente, existe una tendencia creciente hacia el uso de biopolímeros por su menor impacto ambiental debido a su carácter biodegradable, siendo destinados como envases y/o embalajes en alimentos, productos agropecuarios, implantes médicos, productos de higiene, productos de catering, entre otros (Negm y col., 2020). 19 1.1.1. Fuentes de biopolímeros Los biopolímeros se obtienen de materias vivas naturales como vegetales, animales, microbios y biomasa. Por otro lado, químicamente se sintetizan a base de monómeros, tales como; aminoácidos, azucares y aceites, especialmente aquellos con alto contenido de triglicéridos (J.-P. Park y col., 2002). Las principales fuentes vegetales son los tubérculos, frutos, granos y cereales, debido a su alto contenido en almidón (Apriyanto y col., 2022; Okoro y col., 2021; Aydogdu y col., 2018; Rodsamran y Sothornvit, 2017). Las fuentes animales incluyen plumas de aves, tendones, huesos y pieles de ganado (Aaliya y col., 2021; S.-B. Park y col., 2017). Asimismo, se pueden obtener de diversas especies marinas como peces y crustáceos (Fassini y col., 2021; Ali y col., 2022). Entre las fuentes microbianas se tienen levaduras, hongos y algas (H. Liu y col., 2021; Moradali y Rehm, 2020). La biomasa incluye residuos agrícolas, desechos de plantas, madera y papel (Puglia y col., 2021; Jha y Kumar, 2019). La elección del sustrato es fundamental en el desarrollo de este tipo de materiales, preferentemente se usan matrices de bajo costo como productos agroindustriales, entre ellos, el almidón es el más popular (Galus y col., 2020). 1.1.2. El almidón El almidón es un polisacárido natural, biodegradable, de bajo costo, renovable y accesible, se puede obtener de semillas o granos, tubérculos, tallos, raíces inclusive en el polen. La molécula de almidón se compone principalmente de amilosa (AM) y amilopectina (AP), estos componentes difieren es sus propiedades y funciones. La AM tiene una estructura cuasi lineal lo que le confiere una mejor capacidad para formación de películas resistentes, inodoras, incoloras e insípidas. En contraste, la AP tiene una estructura muy ramificada, de mayor tamaño y peso molecular, tiene mayor estabilidad en agua formando geles blandos y películas débiles. Además, las cadenas cortas de AP conforman cristales en el almidón. Dependiendo de la fuente y edad del almidón, este presenta una relación entre 20 a 25% de AM, Siendo deseable las fuentes de mayor contenido de AM para la producción de biopolímeros. (Shahabi-Ghahfarrokhi y col., 2020; Schirmer y col., 2013). Acorde con el enfoque actual en el desarrollo sostenible, existe mayor interés por el uso de biopolímeros de origen natural para la fabricación de envases alimentarios y otros 20 productos industriales. El desarrollo de materiales a base de materias primas renovables, abundantes y de bajocosto en lugar de los polímeros convencionales es un gran paso para avanzar hacia una economía eco eficiente. 1.2. Residuos del café Diversos productos industriales, incluidos el café generan un gran volumen de subproductos que muchas veces se desperdician (Cruz y col., 2015). La cáscara y la pulpa son los principales residuos que se generan durante el procesamiento del café, representan entre el 30% a 50% del total del café (Rambo y col., 2013). Asimismo, diversos estudios han reportado las propiedades bioactivas de la pulpa del café, específicamente por su capacidad antioxidante, el cual podría incorporarse a los envases de alimentos para una mejor conservación (Manzar y col., 2020). La cereza de café contiene normalmente dos granos, cada uno cubierto por varias capas, primero encontramos una membrana adherida al grano conocida como piel de plata, luego vemos una segunda capa holgada de color amarillo conocida como pergamino, luego se aprecia el mucılago o pulpa que envuelve al pergamino y finalmente se encuentra la cascara (Esquivel & Jimenez, 2012). En cuanto a la composición química de la pulpa del café en base seca se cuenta con; fibra (21%), proteína (10%), cenizas (8%), extracto libre de Nitrógeno (44%) (Rosas-Sánchez y col., 2021), humedad entre 7% y 18%, además de la presencia de cafeína y taninos, los cuales son reconocidos por su bioactividad, principalmente como antioxidantes, que en dosis adecuadas pueden ser beneficiosos para la salud humana (Delgado y col., 2019). Además, la pulpa del café es una fuente potencial de colorantes y compuestos bioactivos con fines de ser usados en la industria alimentaria, los principales compuestos fenólicos identificados son; cafeína y ácido clorogénico, los cuales se ha determinado que disponen de un 65% a 70% de actividad antioxidante, similar al efecto de las frutas y verduras frescas en general (Echeverria & Nuti, 2017). 1.3. Espectroscopia de Terahertz (THz -TDS) La espectroscopia de terahercios (THz) es una técnica potente con múltiples aplicaciones en diversas áreas como la ingeniería, química, medicina, farmacología y los alimentos, ya que permite acceder a una región del espectro electromagnético donde no llegan la técnicas ópticas y electrónicas (Neu & Schmuttenmaer, 2018). El rango espectral de 21 terahercios es una porción del espectro electromagnético que se ubica entre las regiones microondas e Infrarroja, THz aborda frecuencias que históricamente ha sido muy difícil acceder, se han tenido fuentes de radiación en el resto del espectro electromagnético, pero en esta región especıfica ha sido prácticamente inexplorada hace tres décadas, y que actualmente ha sido probada con éxito para caracterización de materiales (Rogalin y col., 2018; Nellen y col., 2018), específicamente el rango espectral entre 0,1 THz y 10 THz (3,3 cm−1 al 33,3 cm−1) es una región importante para la relajación la relajación dieléctrica y la espectroscopia vibracional de los materiales orgánicos e inorgánicos (Singh y col., 2022). La espectroscopia THz se basa en la electrónica de transporte de espines (espintrónica), el espín es una propiedad de los electrones que hace que fluctúen hacia arriba o abajo. De acuerdo a la dirección del espín, estas corrientes de espines se pueden usar para transferir información incluso en materiales aislantes donde se suprime el transporte de cargas eléctricas (Bull y col.,2021). La interpretación de los espectros de teraherzios se basa en la vibración, en el rango de teraherzios, la radiación excita movimientos de moléculas enteras o gran parte de ellas que están unidas por fuerzas más débiles en comparación con las fuerzas covalentes en frecuencias infrarrojas (Salen y col., 2019). Estas señales se procesan matemáticamente con la transformada de Fourier comparando la señal THz difundida en la muestra con la señal obtenida en la misma trayectoria, pero sin muestra (Rogalin y col., 2018). La espectroscopia THz en el dominio del tiempo es capaz de transmitir un pulso de terahercios a una muestra y detectar el pulso transmitido como señal de salida. Para ello, un láser emite la señal dirigida o un pulso óptico en femtosegundos, el pulso óptico golpea directamente la muestra y la señal de salida es un pulso de terahercios emitido por la muestra misma, para las mediciones de emisión y transmisión. (Withayachumnankul & Naftaly, 2014). El rayo láser de femtosegundos rebota en una serie de espejos y pasa a través de la alineación óptica estándar antes de llegar a un divisor de haz, aquí el 99% del haz emisor excita la muestra y el otro 1% pasa al receptor para la detección en el dominio del tiempo. Un esquema típico de espectroscopia THz – TDS se observa en la Figura 1. 22 Figura 1. Esquema de adquisición de imágenes por espectroscopia de THz – TDS Nota. En la presente figura se observan los elementos de un esquema típico de espectroscopia de THz - TDS. Adaptado de Karaliunas y col., 2018 Generalmente, se consideran dos configuraciones básicas de sistemas THZ-TDS; en la primera configuración una caja negra contiene la muestra y el sistema óptico, entonces el haz emisor golpea la muestra directamente y la radiación de terahercios se propaga por el sistema óptico, en este caso existe el riesgo de señales espurias generadas por la humedad del ambiente, lo cual se pueden prevenir llenando la caja con gas nitrógeno, el haz es colimado por un lente cóncavo y pasa a través de un espejo parabólico, la muestra se coloca en porta muestra de cobre y se instala en un criostato que se puede usar para controlar la temperatura de la muestra entre 3°K y 500°K (Walther y col., 2002) En la segunda configuración o modo de transmisión, el haz infrarrojo pasa a través de un cristal de teluro de zinc para generar un haz de emisor de 2 terahercios que luego se transmite a través de la muestra, el cristal de teluro de zinc emite un pulso de terahercios debido a un proceso electro-óptico no lineal de segundo orden llamado rectificación óptica, este pulso de terahercios se enfoca en la muestra mediante dos espejos parabólicos, el haz receptor se dirige de manera que su longitud de trayectoria coincida aproximadamente con la longitud de trayectoria del haz emisor para hacer posible la detección en el dominio del tiempo, este sistema no requiere la aplicación de gas nitrógeno (Naftaly & Miles, 2007). 23 Las propiedades físicas, químicas y ópticas de los materiales se expresan en frecuencias de luz o diferentes tipos de energía (Rogalin y col., 2018). Específicamente, la determinación de propiedades ópticas de los materiales se basan en la reflexión, transmisión, absorción, elipsometría y dispersión angular de la luz, a medida que la radiación luminosa interactúa con la muestra y a partir de observar la frecuencia de la luz, se relacionan las propiedades físicas de un material los que depende de la energía, frecuencia o longitud de onda debido a las excitaciones magnéticas que ocurren en los materiales (Rogalin y col., 2018; Chen y Pickwell-MacPherson, 2022). 1.4. Quimiometría La gran cantidad de información espectral que contiene una muestra requiere de herramientas quimiométricas para su análisis (El Haddad y col., 2013). La quimiometría se puede definir como la disciplina que integra diversas técnicas matemáticas, estadística multivariable, informática y aprendizaje automático para extraer información sobre la composición o concentración química particular de una muestra (Lavine & Workman, 2008), en este caso a partir de datos espectrales. Las operaciones quimiométricas en el análisis de espectros THz incluyen básicamente operaciones de pre procesamiento, selección de características y modelamiento (El Haddad y col., 2013). El pre procesamiento tiene como finalidad filtrar las señales generadas por interferencias instrumentales y/o ambientalesconocidas como ruido, para lo cual existen una variedad de herramientas, habitualmente se utilizan los espectros promedios, suavizado de perfiles usando filtros Savitzky-Golay (H. Liu y col., 2018) o Transformada de Fourier (Nehrkorn y col., 2017), corrección de línea de base (Qu y col., 2021), derivadas , corrección del efecto multiplicativo de la dispersión, variable normal estándar (W. Liu, Liu, Chen y col., 2016), entre otros. Las operaciones de selección de características tienen por objetivo reducir la dimensionalidad de los datos, lo cual permite mejorar la rapidez y precisión de los modelos (Wei y col., 2021). El método más usado para selección de características es el análisis de componentes principales (PCA, por sus siglas en ingles). Los componentes principales se obtienen a partir de la descomposición de la matriz de la covarianza, formando una nueva matriz con vectores propios y valores propios. La selección de variables se realiza en función de las puntuaciones y cargas de los componentes principales (Helal y col., 2022). 24 El modelado de datos espectrales se realiza para resolver problemas de clasificación o predicción de muestras en base a reconocimiento de patrones, existen métodos supervisados y no supervisados (Sarjas y col., 2021; Pan y col., 2021), según se tenga o no un conocimiento a priori de los datos. Los métodos supervisados requieren un entrenamiento previo de la maquina con datos de calibración de datos conocidos y etiquetados. Es este grupo encontramos a los modelos discriminantes, K vecinos más próximos (Sun y col., 2022), máquinas de soporte vectorial (Yin y col., 2007), árbol de decisiones, redes neuronales artificiales supervisadas, métodos de varianza residual, entre otros. Los modelos no supervisados, buscan agrupaciones de datos similares sin necesidad de etiquetar previamente los datos, entre los modelos más usados, tenemos; análisis de clúster, árboles de mínima expansión, y redes neuronales no supervisadas (Shafie y col., 2022). Para problemas de predicción, se emplean generalmente modelos de regresión lineal múltiple (LMR; por sus siglas en ingles), y métodos de reducción de variables (B. Li y col., 2020). LMR se utiliza para correlacionar la señal espectral con la concentración de cada componente de la muestra aplicando la Ley de Lambert-Beer (Z. Li & Lian, 2016). Mientras que, los métodos de reducción de variables, identifican variables relevantes para reducir la dimensión de los datos sin perder información útil, lo cual permite eliminar el riesgo de colinealidad, entre estos métodos tenemos la regresión de componentes principales (PCR; por sus siglas en ingles) y regresión parcial de mínimos cuadrados (PLSR; por sus siglas en inglés) (Wei y col., 2021). 1.5. Antecedentes Ballesteros y col. (2018) desarrollaron películas de base biológica con nuevas funcionalidades, las cuales obtuvieron a través de extractos ricos en polisacáridos de posos de café gastados (SCG) obtenidos mediante dos métodos de pretratamiento de extracción, alcalino (PA) y auto hidrolisis (PB) a diferentes concentraciones respectivamente (0.5, 0.10 y 0.20 p/v), las cuales fueron incorporadas en una película a base de carboximetilcelulosa (CMC). Determinaron las propiedades fisicoquímicas de las películas finales, se realizaron microscopia electrónica de barrido, espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier, difracción de rayos X, análisis termogravimétrico, así como determinaciones de propiedades ópticas y mecánicas, contenido de humedad, solubilidad en agua, permeabilidad al vapor de agua, ángulo de contacto e isotermas de 25 sorción. La adición de extractos PA o PB ricos en polisacáridos añadidos a la película a base de CMC, dio como resultado cambios importantes en las propiedades fisicoquímicas de la película, principalmente en el color y la opacidad. Cacciotti y col. (2018) produjeron sistemas multifuncionales eco-sostenibles, basados en poliácido láctico) (PLA) como matriz biopolimérica, tierra de diatomeas como relleno reforzante y extracto de posos de café gastado como captador de oxıgeno, con el fin de proporcionar una mejora simultanea de las propiedades mecánicas y de barrera a los gases, espectroscopıa infrarroja (FT-IR, ATR), microscopıa electrónica de barrido (SEM), ensayos de tracción uniaxial, medidas de permeabilimetría de O2. Como referencia utilizaron películas de PLA puro (5% p/v) y sistemas binarios, basados en PLA y extracto de café molido (PLA – E), y PLA y diatomita (PLA-D), y los sistemas ternarios que contienen tanto el extracto derivado de los posos de café como la diatomita (PLA – DE). Registraron un aumento significativo de transición vítrea (Tg) en presencia del extracto de posos de café molido; y una mayor cristalinidad de las películas que contienen extracto de café molido. Finalmente registraron una mejora de las propiedades de barrera tanto mecánicas como de oxıgeno para los sistemas caracterizados por la copresencia de diatomita y extracto de posos de café, lo que sugiere un posible efecto sinérgico de los dos aditivos, por lo tanto, los sistemas obtenidos podrían considerarse una alternativa innovadora y prometedora a los polímeros no biodegradables. Gorokhov y col. (2020) aplicaron la espectroscopia de transmisión de terahercios en el dominio del tiempo a la caracterización de nano compuestos obtenidos por coextrusión de polímero PLA con adiciones de nano plaquetas de grafeno (GNP) y nanotubos de carbono de paredes múltiples (MWCNT). Prepararon los compuestos monorrelleno (PLA/MWCNT y PLA/GNP) con contenidos de relleno del 1.5, 3 y 6% en peso, y los compuestos biorrelleno (PLA/MWCNT /GNP) con contenidos totales de relleno del 3% y 6% en peso (combinando GNP y MWCNT en diferentes proporciones). Para realizar las mediciones de THz, redujeron el grosor de las muestras a 200 – 300 m. Todas las películas fueron estudiadas mediante microscopia de transmisión, que requiere muestras muy delgadas. Los espectros de terahercios - subterahercios (5 a 60 cm1) de las películas se midieron por medio de un espectrómetro pulsado en el dominio del tiempo (TDS) TERA K15 (Menlo Systems). El estudio concluyo que la combinación de diferentes rellenos de nanocarbono permite modificar con precisión las propiedades EM de un compuesto relleno con GNPs relativamente barato mediante la adición de CNTs, 26 obteniendo así un material con alto rendimiento en THz y que la espectroscopia de terahercios demostró ser una herramienta sensible para la estimación del caracter de la distribución del relleno. W. Liu, Liu, Hu y col. (2016) examinaron la viabilidad para la discriminación no destructiva de las semillas de arroz transgénico mediante un sistema de imágenes de espectroscopia de terahercios combinado con quimiometría. En el estudio definieron dos clases de semillas de arroz, transgénico y no transgénico, de un total de 200 muestras de semillas de arroz se dividieron aleatoriamente en un conjunto de calibración 70%, que incluía 70 muestras de cada clase y un conjunto de predicción 30%, que incluía 30 muestras de cada clase. Para adquirir las imágenes las semillas de arroz fueron colocadas en una plataforma móvil X y Y, se movieron a la velocidad de 8 m/punto para ser escaneadas y construir imágenes THz con dimensiones X, Y (Frecuencia) y T (Transformada rápida de Fourier). Aplicaron modelos de análisis de componentes principales (PCA), máquina de vectores de soporte de mínimos cuadrados (LS – SVM), redes neuronales de propagación posterior de PCA (PCA-BPNN) y bosques aleatorios (RF) con la primera y la segunda derivada y pretratamientos de transformación normal de variantes (SNV) para clasificar las semillas de arroz en función del genotipo. Los resultados demostraron que existían diferencias entre las semillas de arroz no transgénicas y las transgénicas,y que se podía lograr una excelente clasificación (la precisión era del 96,67% en el conjunto de predicciones) utilizando el modelo RF combinado con el pretratamiento de la primera derivada. Los resultados indicaron que la obtención de imágenes por espectroscopia THz junto con la quimiometría sería una técnica prometedora para identificar las semillas de arroz transgénicas con gran eficacia y sin necesidad de preparar la muestra. Wei y col. (2021) investiga la viabilidad de la espectroscopia de terahercios (THz) y los algoritmos de reducción de la dimensionalidad para determinar el contenido de proteínas en la soja. En primera instancia procesaron los datos del espectro de la muestra de THz mediante algoritmos de preprocesamiento o de reducción de la dimensionalidad, luego mediante un conjunto de calibración, se implementó la regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR), la regresión de vectores de apoyo con algoritmos genéticos (GA-SVR), la regresión de vectores de apoyo con optimizador de lobo gris (GWO-SVR) y la red neuronal de propagación posterior (BPNN), respectivamente, para modelar la determinación del contenido de proteínas. Posteriormente, el modelo fue validado por el 27 conjunto de predicciones. Finalmente, el modelo BPNN combinado con el análisis discriminante lineal (LDA) para el coeficiente relacionado del conjunto de predicción (Rp), el error cuadrático medio del conjunto de predicción (RMSEP), la desviación estándar relativa (RSD), el tiempo requerido para la operación fue respectivamente 0,9677, 1,25%, 3,37%, y 53.51 s. Los resultados experimentales mostraron que la determinación cuantitativa rápida y precisa de la proteína en la soja utilizando la espectroscopia THz es factible después de un algoritmo adecuado de reducción de la dimensionalidad. Oblitas-Cruz y col. (2021) clasifico los estados de madurez de 4 muestras de queso tipo Gruyere que fueron elaborados en Cajamarca - Perú, los cuales se analizaron durante 60 días, mediante espectroscopia THz - TDS con un rango espectral de 0.1 - 10 THz. Observo que el proceso de maduración del queso se logra identificar en un rango de 0.1 - 0.4 THz, lo cual puede deberse a la interacción del pH entre caseínas hidratadas y minerales, además de la proteólisis, luego realizo una extracción de las curvas de absorbancia y logró clasificar los estados de madurez con 24 modelos de clasificadores, obteniendo una precisión de 90% con el modelo Support Vector Machine (SVM). Finalmente concluye que la capacidad de la espectroscopia THz - TDS junto con análisis multivariados puede relacionar y caracterizar la estructura molecular que cambia a lo largo del tiempo de madures del queso, por tanto, se considera como una atractiva herramienta de proceso analítico para un mejor seguimiento en el control de la calidad de los alimentos. Teniendo en cuenta los antecedentes citados anteriormente, se puede destacar que los biopolímeros a base de residuos del café, tienen una alternativa innovadora y prometedora, para reemplazar a los polímeros no biodegradables, lo cual contribuiría a las exigencias de la industria alimentaria y que los resultados de experimentaciones donde se emplea la toma de imágenes mediante espectroscopia THz junto con la quimiometría sería una técnica relativamente nueva pero con un gran potencial para lograr identificar de forma eficaz los compuestos de interés. 28 2. MATERIALES Y MÉTODOS 2.1. Materiales 2.1.1. Insumos Agua destilada Alcohol polivinílico al 99% de pureza Almidón de yuca “Manihot esculenta” Extracto a base de cascara de café “Coffea arabica” Glicerina grado técnico al 98% 2.1.2. Materiales e instrumentos de laboratorio Bagueta Balanza de precisión HWA-S,China, Max 220 g, Min 0.01 g, d= 0.0001 Balanza de digital H. W. Kessel S.A., Macde 3200g, d = 0.01g Bisturí Cámara de secado y esterilización UV, dimensiones 40x40x10cm, capacidad de sílica gel 1Kg, rango de luz UV de 250 - 400nm. Estufa eléctrica marca Memmert, modelo 30 - 1060, rango de temperatura 20°C - 300°C. Homogeneizador, dimensiones 40x40cm, capacidad de 12 placas petri, 2 servomotores RDS3115, Oscilación hasta 5° en ambos ejes. Matraz Erlenmeyer de 500 ml Micrómetro digital, sensibilidad de 0.001mm Pinzas Placas petri Vasos de precipitado de 500ml 2.1.3. Equipos Cámara de imágenes de Teraherzios, marca “MenloSystem”, modelo “TeraSmart”, número de serie THz/0553. Colorímetro portátil (ShenZhen FRU WR-10QC, China) 2.2. Metodología La metodología aplicada en el presente estudio se esquematiza en la Figura 2 y se describe en las siguientes secciones. 29 Figura 2. Esquema del procedimiento experimental Nota. Elaboración propia (2022). 2.2.1. Obtención del biopolímero Pre-gelatinización En esta etapa, se agregó 18 g de almidón de yuca y 300 ml de agua destilada en un vaso de precipitado de 500 ml, la mezcla se agito suavemente con una bagueta por 5 minutos, luego se calentó en baño María a una temperatura de 80 °C por 30 30 minutos. Esta operación tuvo el propósito de favorecer la dispersión homogénea del almidón en el solvente. Gelatinización En esta etapa se incrementó la temperatura del baño María a 121 °C y se mantuvo la mezcla en constante agitación por quince minutos. Esta temperatura favoreció la formación de redes poliméricas entre el almidón y el agua. Plastificación Se redujo la temperatura hasta que la mezcla alcanzó 85 °C, luego se incorporó 7.5 ml de glicerina vertiendo lentamente sobre la mezcla con agitación constante, inmediatamente se agregó el alcohol polivinílico (5 g predisueltos) esparciendo paulatinamente y agitando para evitar la formación de burbujas de aire. Tras este proceso, se dividió la mezcla en cuatro partes iguales para obtener la muestra control (sin antioxidante) y las muestras con las diferentes concentraciones de antioxidante (0.2, 0.4 y 0.6 %). Adición de antioxidante de café Los antioxidantes extraídos de la pulpa del café fueron proporcionados por la empresa “Asociación Manos Unidas”, estos fueron envasados al vacío, envueltos en papel aluminio para protegerlos de la luz y almacenados en refrigeración hasta su uso. La adición de antioxidantes se realizó cuando la temperatura de la mezcla alcanzó los 30 °C, de acuerdo a las formulaciones que se muestran en la Tabla 1. Tabla 1. Formulaciones para obtención de biopolímeros con antioxidante de café. Concentración Peso del antioxidante (g) Volumen de la mezcla (ml) 0.2% 0.68 340 0.4% 1.36 340 0.6% 2.04 340 Nota. En esta tabla se muestra la cantidad de antioxidante de café agregado al biopolímero para obtener concentraciones al 0.2, 0.4 y 0.6%. Reposo En esta etapa, se colocaron los matraces conteniendo las diferentes mezclas del biopolímero en un desecador de vidrio provisto con gel sílice. El reposo se realizó 31 con el fin de reducir las burbujas de aire y estas asciendan a la superficie para su eliminación. Este proceso duro 24 horas. Moldeado La mezcla fue vertida sobre placas petri de 9 cm de diámetro, cada placa contenía un volumen de 12 ml de mezcla. Para lograr una distribución uniforme de la mezcla, las placas fueron homogenizadas en un agitador diseñado en el Laboratorio de Inocuidad de Alimentos de la Universidad Nacional de Frontera, véase la Figura 3. El homogeneizador operó a un ángulo de rotación de 4° y velocidad angular de 5 rpm, por 10 minutos logrando que la mezcla se distribuya uniformemente en la base de la placa. Figura 3. Principales elementos del equipo de homogenización de biopolímeros Nota. En esta figura se aprecia el proceso de homogenización durante el moldeado de los biopolímeros y el esquema del equipo diseñado para tal fin. Secado Las placas se colocaron en una cámarade secado provista con gel sílice y luz UV, diseñada en el Laboratorio de Inocuidad de Alimentos de la Universidad Nacional de Frontera, véase la Figura 4. Las placas con biopolímeros fueron sometidas a tratamiento UV, por 15 minutos al inicio del proceso de secado para evitar la proliferación de hongos, se mantuvieron almacenadas por cinco días en la cámara de secado hasta lograr que las películas adquieran textura firme sin que se perciba presencia de humedad. 32 Figura 4. Esquema de la cámara de secado de biopolímeros con luz ultra violeta (UV) Nota. En la presente figura se muestra el proceso de secado de los polímeros, identificando cada uno de los elementos que intervinieron en este proceso. Desmoldado Los biopolímeros secos se extrajeron de las placas petri usando bisturí y pinzas quirúrgicas. La manipulación se realizó con guantes de látex para evitar impregnar contaminantes a las muestras y/o alterar sus propiedades ópticas. Acondicionamiento de submuestras Se obtuvo un total de 12 láminas de biopolímeros, 3 láminas por concentración, los biopolímeros obtenido no tuvieron presencia de burbujas ni imperfecciones visibles. Cada lamina fue recortada en submuestras de 1.5 cm de ancho por 3.5 cm de largo, obteniendo un total de 8 submuestras por lamina. Para tal fin, se usaron bisturíes y regla metálica, asimismo se midió el espesor de cada lamina usando un micrómetro digital con una sensibilidad de 0.001mm. Las mediciones se realizaron en 10 puntos aleatorios de cada lámina y se calculó el valor medio. 2.2.2. Prueba de envejecimiento acelerado del biopolímero Las láminas se dividieron en subgrupos iguales conformados por 32 submuestras para cada concentración, estas se colocaron en estufas a 30, 35 y 40 °C respectivamente, por un periodo de 96 horas, siendo evaluadas cada 24 horas. La evaluación consistió en caracterización por color y adquisición de espectros THz, tal como se describe en las siguientes subsecciones. 2.2.3. Caracterización por color Se midió el color de los biopolímeros usando un colorímetro portátil (FRU WR10QC, China), cada lámina de biopolímero se colocó sobre una base de teflón y se adquirió la 33 medida de color por triplicado, ver Figura 5, considerando los valores medios de las coordenadas L*a*b* dónde L* es la luminosidad, y sus coordenadas van de blanco a negro. a*: valor rojo positivo a verde negativo; b*: amarillo positivo a azul negativo. Figura 5. Esquema de proceso de medición de espacio color CIE L*a*b* Nota. En esta figura se puede observar los elementos que intervinieron en el proceso de medición de color de los biopolímeros. 2.2.4. Análisis con espectroscopia THz Adquisición de imágenes y espectros mediante espectroscopia de THz –TDS Se utilizó un Sistema de Espectroscopia de Terahercios en el Dominio del Tiempo (THz - TDS; Terahertz time-domain spectroscopy), tal como se observa en la Figura 6. El sistema estuvo conformado por un espectrómetro compacto con rango espectral 6 THz, rango de escaneo 850 ps, resolución espectral 1,2 GHz, con un láser pulsado ultra rápido que emite una señal en femtosegundos a través de un sistema de espejos de bucle óptico distribuidos en forma no lineal y conectado al espectrómetro mediante un cable de fibra óptica. Para el desplazamiento de la muestra, cuenta con una torre con movimiento horizontal y vertical. El proceso de adquisición de imágenes se controló con los softwares Scan Control y TeraImage el cual sirve para establecer el rango de escaneo, ambos softwares son proporcionados por Menlo Sytems (Munich, Alemania). Figura 6. Principales elementos del sistema de adquisición de imágenes THZ – TDS. 34 Nota. En esta imagen se observa el equipo de espectroscopia THz - TDS. Segmentación y extracción de perfiles THz Para poder extraer la información espectral de las muestras se inicio con el proceso de conversión de los archivos los cuales son adquiridos en formato “*.IGTIFF ”, convertidos a “*.MAT”, para este proceso se usó el Software Epina ImageLab (ver Figura 7). Figura 7. Captura de pantalla del Software Epina ImageLab, durante adquisición de espectros. Nota. En la presente imagen se observa el proceso de importación de datos para ser convertidos y exportados en archivos *.MAT El proceso de segmentación se realizó por medio de la umbralización de imágenes en la banda 180, la cual pertenece a la frecuencia 3.62 THz y 1.99 ps, donde se logra observar un mejor contraste entre la muestra, porta muestra y aire, lo que permite obtener la información espectral de referencia (aire) y de los espectros que corresponden al 35 biopolímero. Seguidamente para obtener la región de interés (ROI) se circunscribió un rectángulo en el área de la muestra, y se segmentaron 10 regiones de interés de igual área (ver Figura 8), con la finalidad de extraer los datos y generar los perfiles medios de cada ROI para su posterior procesamiento. Figura 8. Umbralización, segmentación y extracción de la región de interés (ROI) en imágenes THz Nota. En la presente imagen se observa el proceso de umbralización y segmentación de las ROI. El número total de espectros obtenidos de las muestras fueron 960, a los cuales se les aplico Transformada de Fourier con la finalidad de obtener los espectros en el dominio de la frecuencia, aplicando la siguiente ecuación. Donde E(t) es la función de una señal en el dominio de tiempo, t es una variable en dimensión de tiempo, w en dimensión de frecuencia, i variable imaginaria √−1, y e es el número de euler. Después de la transformación de Fourier, y obtener la función espectral en el dominio de la frecuencia, se extrajo H(w) que es la función de transmisión, dónde E(w). Eref (w), Es(w) son las señales en el dominio de la frecuencia de la referencia y la muestra, respectivamente, y que viene dada por la siguiente Ec. (1) (2) 36 La fórmula para obtener el índice de refracción (η) de las muestras se observa a continuación. Donde, C es la velocidad de la luz en metros por segundo, ϕm(w), ϕref (w) es la fase de muestra y referencia, w es frecuencia angular en radianes por segundo y d es el espesor de la muestra en metros. Preprocesamiento Para el preprocesamiento de datos se empleó el Software Unscrambler X, y se aplicaron 4 técnicas de preprocesamiento, incluido el filtro Savitzky-Golay (SG) con 3 pasos y de segundo orden, variable normal estándar (SNV; standar nornal variable), normalizado (N) y Corrección de dispersión múltiple (MSC; multiple scattering correction), a continuación se comentan brevemente cada una de estas técnicas. S-G, donde 𝑦𝑗 0 = perfil suavizado; Ci = coeficiente del ith término del perfil y; Yj+i = perfil original; N = número de etapas de convolución. Norm, donde R(λ)N es la reflectancia normalizada, y R(λ) es la reflectancia en la longitud de onda “λ”. SNV, dónde SNVλ son las variaciones normales estándar para cada longitud de onda, Yλ son los valores de reflectancia, 𝑦λ̅̅ ̅ son los valores medios de reflectancia. (4) (3) (5) (6) 37 MSC, también llamada corrección de señal multiplicativa, pretende eliminar la dispersión, basándose en la idea que la dispersión se puede aproximar como señales que varían en compensación y pendiente. Básicamente, se corrige la pendiente del perfil espectral de cada muestra aproximándola al espectro promedio, esto reduce significativamente la señal de dispersión. MSC, se calcula de acuerdo a la Ecuación 7. donde; Aj.MSC es el espectro corregido por el algoritmo MSC; Aj es el espectro obtenido para la muestra o instancia j; Bj y mj son coeficientes de regresión para la instancia j. Modelamiento Se emplearon dos modelos de predicción; Regresiónde Mínimos Cuadrados Parciales (PLSR - Partial Least-Squares Regression) y Ajuste de Redes Neuronales (NNF - Neural Net Fitting), usando la caja de herramientas del software Matlab 2019a, a continuación, una breve descripción de cada uno de los modelos. PLSR, es un método ampliamente utilizado en el modelamiento de datos espectrales para predecir las propiedades químicas de diversas materias. Este modelo analiza cuantitativamente la relación entre los espectros de las muestras y sus valores referencia (Cheng & Sun, 2017) de manera que la relación entre pares contiguos de puntuaciones sea lo más fuerte posible. En principio, se analiza la redundancia, buscando asociaciones entre variables con alta variación en las respuestas para mejorar la exactitud en las predicciones (Guebel & Torres, 2013), de esta manera, permite reducir la dimensionalidad de los datos a un conjunto menor de variables no correlacionadas. Este modelo se implementa sobre la base de la Ecuación 8. Yi = β0 + βiXi + Ei Donde, Yi es la variable a predecir; β0 representa la constante del modelo siendo el punto donde la recta corta al eje de las ordenadas; βi representa la pendiente de la recta; Xi es el valor conocido de la variable “X”, y; Ei es el residuo la variación no modelada en “Y”. NNF, es una red neuronal de dos capas útil para solucionar problemas de ajuste de datos. Se entrena para identificar datos de entrada y salida, a partir de ello se pueden predecir la variable respuesta, Bataineh y Kaur, 2018. NNF proporciona tres algoritmos de entrenamiento, incluido Levenberg-Marquardt (LM), regularización bayesiana (RB) y (7) (8) 38 Retropropagación de gradiente conjugado escalado (RGCE). El algoritmo LM es el más rápido, asimismo, demanda de mayo capacidad de memoria, su función es actualizar los valores de peso y sesgo utilizando el método de optimización LM (de Jesés Rubio, 2020). Por su parte, RB sigue el procedimiento utilizado en LM, además, minimiza los errores cuadráticos y pesos, este algoritmo es útil para datos ruidosos o pequeños. Finalmente, RGCE, restaura los ponderados y sesgos, se recomienda para grandes dimensiones de datos (Khan y col., 2019). Para este caso en particular se utilizaron como valores de referencia las coordenadas del espacio de color CIE Lab. Donde; L* representa la luminosidad en un eje vertical de un color variando desde cero para negro hasta cien para blanco; a* representa el diferencial del espacio de color rojo/verde (+a indica rojo, -a indica verde); b* representa el diferencial del espacio de color amarillo/azul (+b indica amarillo, -b indica azul). Comparación de estadísticos Según lo descrito por Qin y col. (2015), para evaluar el rendimiento de los modelos PLSR y NNF con los espectros completos y optimizados se usaron los estadísticos; coeficiente de correlación (R2) y el error cuadrático medio (RMSE). R2, evalúa el grado de correlación entre los valores de referencia y los valores predichos (véase Ecuación 9), mientras que, RMSE evalúa la desviación entre los valores de referencia y los valores predichos (véase Ecuación 10). Dónde: Yi es la concentración de referencia de la i-ésima instancia; �̅� representa los valores medios de las concentraciones de referencia; �̂�𝑖 son las concentraciones previstas de la i-ésima instancia; �̅̂� son los valores medios de las concentraciones previstas y; N es el número de instancias. (9) (10) 39 3. RESULTADOS 3.1. Obtención de biopolímeros En la Figura 9 se muestran los biopolímeros de almidón de yuca (Manihot esculenta) con adición de diferentes concentraciones de antioxidante a base de residuos de café (Coffea) (0, 0.2, 0.4 y 0,6 %). Se evidencia que la coloración se torna más oscura a medida que se incrementa la concentración de antioxidantes de pulpa de café. A todas las muestras obtenidas se les midió el espesor, y se calculó el valor medio, siendo 0.15mm. Figura 9. Muestras de Biopolímeros con diferentes concentraciones de antioxidante de café (Coffea) Nota. Esta figura muestra las diferentes tonalidades de color que muestran los biopolímeros con antioxidante de café. 3.2. Caracterización por color En la Figura 10, se muestra la distribución de los datos para el parámetro de color “L”; donde la mayor luminosidad se acerca al color blanco (100) y la menor luminosidad se acerca al color negro (0). Se aprecia claramente que la luminosidad de los biopolímeros disminuye a medida que la concentración del antioxidante del café fue mayor, lo cual es coherente, puesto que, como se indicó en la subsección precedente, el antioxidante de pulpa de café oscurece al biopolímero. 40 Figura 10. Parámetro “L*” de las diferentes concentraciones de antioxidantes Nota. En la presente figura se observa el gráfico de dispersión de la coordenada “L*”; los cuales corresponden a la luminosidad, se evidencia que el valor de “L” desciende a medida que la concentración de antioxidante de café aumenta. En la Figura 11, se muestran la distribución de los datos para el parámetro de color “a*”, observándose que el valor de dicho parámetro se incrementa a medida que la concentración del antioxidante del café fue mayor, contrario a lo acontecido con el valor “L*”. Los valores positivos en el eje de color “a*”, indican una tendencia hacia el rojo. Figura 11. Parámetro “a∗” de las diferentes concentraciones de antioxidantes Nota. En la presente figura se observa el gráfico de dispersión de la coordenada “a∗”; el cual corresponde a los colores de rojo (+) a verde (-), según el porcentaje de antioxidante en los biopolímeros. En la Figura 12, se muestran la distribución de los datos para el parámetro de color “b*”, observando que el valor de dicho parámetro se incrementa a medida que la concentración 41 del antioxidante del café fue mayor, similar al comportamiento de “a*”. Los valores positivos en el eje de color “b∗”, indican una tendencia hacia al color amarillo. Figura 12. Parámetro “b*” de las diferentes concentraciones de antioxidantes Nota. En la presente figura se observa el gráfico de dispersión de la coordenada “b*”; el cual corresponde a los colores de amarillo (+) a azul (-), según el porcentaje de antioxidante en los biopolímeros. 3.3. Perfiles THz En la Figura 13, sub figura “a” se muestran los pulsos en el dominio de tiempo en un rango de 0 a 50 ps, los cuales fueron obtenidos del aire que es tomado como referencia y de las muestras de biopolímeros con 0, 0.2, 0.4 y 6% de antioxidantes de residuos de café, en la sub figura “b” se observan los espectros en el dominio de las frecuencias en un rango de 0 – 15 THz, los cuales fueron obtenidos aplicando transformada de Fourier. En la sub figura “c” se logra observar los espectros después de haber sido corregido y filtrado, en la sub figura “d” el espectro en el dominio de la frecuencia, se observa que las muestras de biopolímeros presentan espectros característicos con un primer valle en el rango de 0 - 3 THz, el cual nos indica la información espectral relevante con la cuál se realizarán los posteriores análisis. 42 Figura 13. Espectros THz de los biopolímeros en el dominio de tiempo y en el dominio Nota. En la presente imagen se observan los espectros de referencia y de cada biopolímero con diferente concentración de antioxidante. En la Figura 14, subfigura “a” se observa el espectro en el dominio de tiempo de THz, en la subfigura “b” se observa la transmitancia, obtenida de acuerdo al espesor de la muestra, y la subfigura “c” muestra el espectro de la parte real (N) del índice de refracción. En todos los espectros se puede observar que después de superar 3.0 THz, hay una gran cantidad de interferencias. Por lo tanto, la señal después de 3.0 THz se descartó para garantizarla precisión en la predicción de los modelos. Así, el rango de frecuencias de los espectros de THz en el presente trabajo fue de 0,5 - 3.0 THz, en el que hubo un total de 126 puntos espectrales. 43 Figura 14. Espectros completos de biopolímeros con diferentes concentraciones de antioxidantes Nota. En la presente imagen se observan los espectros en el dominio de tiempo de THz, transmitancia y el índice de refracción (N) En la Figura 15 sub figuras 15a, 15b y 15c, se observan los perfiles medios de los biopolímeros sin presencia de antioxidantes, sometidos a envejecimiento acelerado, siendo evaluados cada 24 horas, durante 4 días, a 30, 35 y 40°C, respectivamente. Se logra observar que los espectros presentan una disminución en la transmitancia en la frecuencia 0.5 THz. 44 Figura 15. Perfiles de transmitancia durante el proceso de envejecimiento acelerado de biopolímeros sin presencia de antioxidantes. Nota. En la presente figura se observan los perfiles de transmitancia en un rango de frecuencia de 0.5 - 2.5 THZ En la Figura 16 sub figuras 16a, 16b y 16c se observan los perfiles medios de los biopolímeros con 0.2% de antioxidantes de residuos de café, sometidos a envejecimiento acelerado, siendo evaluados cada 24 horas, durante 4 días, a 30, 35 y 40°C, respectivamente. (a) 30° (b) 35° (c) 40° 45 Figura 16. Perfiles medios de transmitancia durante el proceso de envejecimiento acelerado de biopolímeros con 0.2% antioxidantes Nota. En la presente figura se observan los perfiles de transmitancia en un rango de frecuencia de 0.5 - 2.5 THZ En la Figura 17 sub figuras 17a, 17b y 17c se observan los perfiles medios de los biopolímeros con 0.4% de antioxidantes de residuos de café, sometidos a envejecimiento acelerado, siendo evaluados cada 24 horas, durante 4 días, a 30, 35 y 40°C, respectivamente. (a) 30° (b) 35° (d) 40° 46 Figura 17. Perfiles medios de transmitancia durante el proceso de envejecimiento acelerado de biopolímeros con 0.4% de antioxidantes Nota. En la presente figura se observan los perfiles de transmitancia en un rango de frecuencia de 0.5 - 2.5 THZ En la Figura 18 sub figuras 18a, 18b y 17c se observan los perfiles medios de los biopolímeros con 0.6% de antioxidantes de residuos de café, sometidos a envejecimiento acelerado, siendo evaluados cada 24 horas, durante 4 días, a 30, 35 y 40°C, respectivamente. (a) 30° (b) 35° (c) 40° 47 Figura 18. Perfiles medios de transmitancia durante el proceso de envejecimiento acelerado de biopolímeros con 0.6% de antioxidantes Nota. En la presente figura se observan los perfiles de transmitancia en un rango de frecuencia de 0.5 - 2.5 THZ 3.4. Comparación de modelo y técnica de pre procesamiento de espectros 3.4.1. Predicción de los parámetros ópticos de biopolímeros en base a residuos del café (coffea) usando el modelo PLSR Para el modelamiento con regresión de mínimos cuadrados parciales (PLSR), se usó la data en un rango de frecuencia de 0.5 - 2.5 THz, dónde según la transmitancia obtenida (a) 40° (b) 40° (c) 40° 48 se puede extraer la mayor información espectral. Se aplicaron cuatro técnicas de pre procesamiento, incluido el filtro Savitzky - Golay (SG), variable normal estándar (SNV), normalizado de área (Norm) y corrección multiplicativa de la dispersión (MSC). El modelamiento también se aplicó sobre la data sin tratamiento (ST). El modelo PLSR se implementó con validación cruzada (K-fold = 5) y 30 repeticiones, usando los espectros completos, luego se optimizó el modelo con las variables relevantes (VR) seleccionadas en función de los betas coeficientes. En la figura 19 se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), en la coordenada “L*” (Blanco - negro) a 30°C para el entrenamiento y prueba del modelo, durante el envejecimiento acelerado por 4 días. Para la concentración con 0% de antioxidante se obtiene una baja predicción del modelo de entrenamiento para todas las técnicas de pre procesamiento, ya que se observa un R2 entre 0.5769 0.005, pero se observa un mejor ajuste para el modelo de prueba con normalizado obteniendo un R2 de 0.7452 y un RMSE de 1.51X10−03; estos resultados pueden ser debido a que la luminosidad del biopolímero sin antioxidante es mayor. Lo contrario a lo que podemos observar para la data con 0.2% y 0.4% de antioxidante de pulpa de café, donde la data normalizada presenta el mejor ajuste para el modelo de prueba, donde se obtienen resultados para R2 de 0.9633, 0.9959 y con mínimos RMSE de 1.73X10−03 y 7.71X10−04, respectivamente. Para la concentración con 0.6% el mejor ajuste obtenido es por el pretratamiento SNV para el modelo de prueba, con un R2 = 0.9672 y un RMSE = 1.46X10−03, esto se debe a que la luminosidad se encuentra afectada por la presencia del antioxidante. 49 Figura 19. Métricas de predicción de la coordenada L* en biopolímeros sometida a 30°C usando PLSR. Nota. En la presente figura se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), y error cuadrático medio (RMSE) para el entrenamiento y prueba del modelo PLSR para el parámetro de predicción de “L*”. En la figura 20 se observan los valores medios de R2 y RMSE, para el entrenamiento y prueba del modelo de predicción para la coordenada “a*” (Rojo - Verde) a 30°C durante 4 días de envejecimiento. Para el modelo de entrenamiento y prueba al 0% de antioxidantes se obtienen coeficientes de determinación R2 menores a 0.6241, siendo este el mayor resultado, correspondiente al pretratamiento SNV para el modelo de prueba, con un RMSE de 4.04X10−04. En comparación con los biopolímeros con presencia de antioxidantes de café, se logra observar un mejor ajuste en el modelo de predicción para prueba en comparación al modelo de entrenamiento, para las diferentes concentraciones a 0.2, 0.4 y 0.6%, el pretratamiento que mostro la mejor robustez del modelo es SNV, obteniendo R2 de 0.9614, 0.9848 y 0.9663, con un mínimo RMSE de 5.28X10−05, 9.55X10−04 y 5.32X10−04, respectivamente. 50 Figura 20. Métricas de predicción de coordenada a* en biopolímeros sometido a 30°C usando PLSR Nota. En la presente figura se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), y error cuadrático medio (RMSE) para el entrenamiento y prueba del modelo PLSR para el parámetro de predicción de la coordenada “a *” a 30°C. En la figura 21 se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2) y error cuadrático medio (RMSE) predichos durante los 4 días de envejecimiento en la coordenada “b*” (amarillo - azul) a 30°C. Se observa que para el biopolímero con 0% de antioxidante el mejor ajuste fue para el modelo de prueba con normalización obteniendo un R2 de 0.8839 y mínimo RMSE de 5.38X10−04. Los valores más altos para los biopolímeros con presencia de antioxidantes de pulpa de café, fueron para el modelo de prueba aplicando el pretratamiento de Norm, obteniendo altos valores para R2 de 0.9532, 0.9898 y 0.9768 con mínimos RMSE de 1.12X10−03, 3.48X10−03 y 7.39X10−03 para 0.2% ,0.4% y 0.6%, respectivamente. Esto quiere decir que el modelo de predicción presenta un mejor ajuste con respecto a esta coordenada ya que los valores positivos se encuentran en el color amarillo, lo cual es influenciado por el% de antioxidante añadido a cada película, y a la vez se encuentra afectado por el tiempo y la temperatura al que han sido sometidos para su envejecimiento. 51 Figura 21.Métricas de predicción de coordenada b* en biopolímeros sometidos a 30°C usando PLSR Nota. En la presente figura se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), y error cuadrático medio (RMSE) para el entrenamiento y prueba del modelo PLSR para el parámetro de predicción de la coordenada “b*” a 30°C. En la figura 22 se observan los valores de predicción obtenidos por el modelo PLSR de entrenamiento y prueba, para la coordenada “L*” (Blanco - Negro) a 35°C durante 4 días de envejecimiento. Para el biopolímero con 0% de antioxidante se observa el mejor R2 = 0.7639, y mínimo RMSE = 6.25X10−04 para el pretratamiento SG, en el modelo de prueba. El pretratamiento con mejor ajuste obtenido para la concentración 0.2% y 0.4% es SNV, para el modelo de prueba, con R2 = 0.9704, 0.9652, y mínimos RMSE 7.64X10−04 y 1.62X10−03, respectivamente para cada concentración. Para el biopolímero con 0.6% de antioxidante se obtuvo una baja predicción para el modelo de entrenamiento siendo el mayor R2 = 0.6818 y RMSE = 5.50X10−02 para el pretratamiento SNV, pero se observa una mejora en el modelo de prueba donde el pretratamiento MSC realiza un mejor ajuste y presenta mejor robustez, dando como resultado un R2 = 0.8846 y un RMSE = 9.33X10−03. 52 Figura 22. Métricas de predicción de coordenada L* en biopolímeros sometidos a 35°C usando PLSR Nota. En la presente figura se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), y error cuadrático medio (RMSE) para el entrenamiento y prueba del modelo PLSR para el parámetro de predicción de “L*” a 35°C. En la figura 23 se observa el grafico de barras de los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), y error cuadrático medio (RMSE), predichos por el modelo PLSR, para la coordenada “a∗” (Rojo - Verde) a 35°C durante 4 días de envejecimiento. Para las muestras con 0% de antioxidantes se observa una baja predicción del modelo, donde se obtienen valores menores a R2 = 0.6000 y mayores RMSE = 2.90X10−04. Los biopolímeros con 0.2% y 0.4% de antioxidantes de pulpa de café, se obtienen valores para R2 de 0.9706 y 0.9592 con mínimos RMSE de 2.91X10−04 y 3.08X10−04, respectivamente, siendo el mejor pretratamiento para 0.2% SNV y para 0.4% Savitzky - Golay (SG), correspondiente al modelo de prueba. La concentración con 0.6% se obtienen valores bajos de R2 siendo estos menores a 0.5757 para el modelo de entrenamiento, y para el modelo de prueba se obtienen valores de R2 = 0.8377 y mínimo RMSE = 4.42X10−03 correspondiente a la data sin pretratamiento, por lo tanto, para esta concentración representa el mayor ajuste y robustez del modelo. 53 Figura 23. Métricas de predicción de coordenada a* en biopolímeros sometido a 35°, usando PLSR Nota. En la presente figura se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), y error cuadrático medio (RMSE) para el entrenamiento y prueba del modelo PLSR para el parámetro de predicción de la coordenada “a*” a 35°C. En la figura 24 se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2) y error cuadrático medio (RMSE) predichos en la coordenada “b*” (amarillo - azul) a 35°C durante los 4 días de envejecimiento. Al 0% y 0.2% de antioxidantes de pulpa de café se obtuvieron valores de predicción para R2 de 0.8158, 0.9813 y un RMSE de 2.86X10−04, 5.80X10−04 para el modelo de prueba, respectivamente, dando el mayor ajuste y robustez del modelo corresponde al pretratamiento de normalización, lo que representa un nivel de precisión aceptable. En la concentración con 0.4% y 0.6% se obtienen valores altos de predicción aplicando el pretratamiento SG, para el modelo de prueba, obteniendo un R2 de 0.9615, 0.8575 y un RMSE de 1.80X10−03, 5.37X10−02, respectivamente para cada concentración. 54 Figura 24. Métricas de predicción de coordenada b* en biopolímeros sometido a 35°C usando PLSR Nota. En la presente figura se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), y error cuadrático medio (RMSE) para el entrenamiento y prueba del modelo PLSR para el parámetro de predicción de la coordenada “b*” a 35°C. En la figura 25 se observan los valores de predicción obtenidos por el modelo PLSR de entrenamiento y prueba, para la coordenada “L” (Blanco - Negro) a 35°C durante 4 días de envejecimiento. El coeficiente de determinación (R2), para la concentración con 0% de antioxidante, para todos los pretratamientos es menor a 0.6856 y RMSE mayor a 1.24X10−03, los cuales corresponden al pretratamiento MSC, y siendo menores en los otros pretratamientos, lo que quiere decir que el modelo no logra predecir el envejecimiento del biopolímero sin presencia de antioxidante. En la concentración con 0.2% se observan valores altos de predicción para el entrenamiento y prueba del modelo PLSR, para la data sin tratamiento (ST), y los pretratamientos SG, SNV y Norm, obteniendo un mejor ajuste para la data ST con un R2 = 0.9891 y un mínimo RMSE = 3.82X10−04. La concentración con 0.4% de antioxidantes de café obtiene un R2 = 0.8698 y un mínimo RMSE = 1.45X10−03 de la data pretratada con SNV. Para la concentración 0.6% los pretratamientos que dieron un mejor ajuste al modelo fueron SNV y Norm, donde se obtienen R2 de 0.9383, 0.9391 y mínimos RMSE = 2.65X10−03, 2.46X10−03, respectivamente, para ambas concentraciones los mejores valores de predicción fueron del modelo de prueba. 55 Figura 25. Métricas de predicción de coordenada L* en biopolímeros sometidos a 40°C usando Nota. En la presente figura se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), y error cuadrático medio (RMSE) para el entrenamiento y prueba del modelo PLSR para el parámetro de predicción de “L*” a 40. La figura 26 se observa el grafico de barras de los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), y error cuadrático medio (RMSE), predichos por el modelo PLSR, para la coordenada “a*” (Rojo - Verde) a 40°C durante 4 días de envejecimiento. Para el biopolímero sin presencia de antioxidante se observan bajos valores de predicción para el modelo de entrenamiento y prueba, dando el mayor valor para R2 = 0.6210 y un RMSE = 1.69X10−04. Los biopolímeros con 0.2% de antioxidantes se obtienen los mejores resultados para los pretratamientos SNV y Normalización con R2 de 0.9751 y mínimo RMSE de 4.25X10−04. Contrario a lo que observa para la concentración 0.4% donde se tiene el menor ajuste del modelo, obteniendo el mayor valor de R2 = 0.4399 y un RMSE = 1.12X10−03 para el pretratamiento SNV, para la concentración con 0.6% de antioxidantes se observa un alto rendimiento de predicción obteniendo el mayor R2 de 0.9496 y un mínimo RMSE de 4.47X10−04. 56 Figura 26. Métricas de predicción de coordenada a* en biopolímeros sometido a 40°C usando PLSR Nota. En la presente figura se observan los valores medios de los coeficientes de determinación (R2), y error cuadrático medio (RMSE) para el entrenamiento y prueba del modelo PLSR para el parámetro de predicción de la coordenada “a*” a 40°C. En la figura 27 se observan los valores de predicción con respecto a la coordenada “b*” (amarillo - azul) a 40°C durante los 4 días de envejecimiento. Los valores de predicción para el biopolímero con 0% de antioxidantes, fueron para R2 0.7542 y RMSE 6.29X10−04, correspondiente al pretratamiento SNV para el modelo prueba. El mayor rendimiento de predicción del modelo para la concentración 0.2% se obtuvo para los pretratamientos SG y SNV, con R2 de 0.9841, 0.9805 y mínimos RMSE de 1.13X10−03, 1.23X10-03, respectivamente. Para la concentración
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