Ref_1008_EdicAbril2012_Ref140214_Esp

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Finalidad .
Principio .
Características del sistema .
Sistema para la determinación de la Alanina Amino
Transferasa (ALT) o Transaminasa Glutámico Pirúvica (GPT) de modo
cinético.
La ALT cataliza específicamente la transferencia del grupo
amino del la alanina para el cetoglutarato, con formación de glutamato y
piruvato. El piruvato se reduce a lactato por acción de la lactato
deshidrogenasa (LDH), en tanto que la coenzima NADH se oxida a NAD.
La reducción de la absorbancia a 340 nm, resultante de la oxidación de la
coenzima NADH, se monitorea fotométricamente, siendo directamente
proporcional a la actividad de la ALT en la muestra.
ALT
L-Alanina + Cetoglutarato Piruvato + L-Glutamato
LDH
Piruvato + NADH NAD + L-Lactato
La metodología cinética-UV para
la medición de la actividad de la ALT fue introducida por Karmen , siendo
posteriormente optimizada por Henry y colaboradores y el procedimiento
de medición ganó aceptación mundial por ser rápido, preciso y exacto.
El método de referencia propuesto por la
recomienda la
utilización del piridoxal fosfato para asegurar que toda la transferasa
presente en el suero esté totalmente activa, evitando así, resultados
falsamente disminuidos en muestras con deficiencia de la coenzima. El
sistema Labtest está optimizado para satisfacer esas recomendaciones.
Para obtener resultados rastreables al método de referencia IFCC, es
necesario utilizar el procedimiento bi-reactivo con la activación por el
piridoxal fosfato (Reactivo 3). Cuando se aplica el procedimiento mono-
reactivo no se utiliza la activación con piridoxal fosfato. Por lo tanto, los
resultados obtenidos no son rastreables al método de referencia de la
IFCC.
Los componentes de la reacción se encuentran distribuidos
adecuadamente en tres reactivos para otorgar mayor estabilidad en la
forma líquida original y mantenimiento de las condiciones óptimas de la
reacción.
El sistema ALT/GPT VET de Labtest utiliza mediciones en modo cinético y
puede ser fácilmente aplicado a analizadores automáticos y semi-
automáticos capaces de medir absorbancias a 340 nm
[Solamente para uso diagnóstico in vitro.]
1
2
International Federation of
Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (IFCC)
3
Metodología .
Reactivos
1. -
2. -
3. -
Material necesario y no provisto
1.
2.
3.
Cinética UV-IFCC.
Contiene Tampón Tris 132,5 mmol/L; L-alanina 687,5 mmol/L; LDH
2300 U/L y azida sódica 0,095%.
Contiene Tampón Tris 20 mmol/L; NADH 1320 mol/L, cetoglutarato
82,5 mmol/L y azida sódica 0,095%.
Contiene Tris 20 mmol/L, piridoxal fosfato 11,1 mmol/L, azida sódica
0,095%.
Los reactivos no abiertos, almacenados en las condiciones indicadas,
son estables hasta la fecha de expiración impresa en el rótulo. Después de
abiertos, los reactivos deben ser manipulados de acuerdo con las buenas
prácticas de laboratorio para evitar contaminaciones de naturaleza
química y microbiana que pueden provocar reducción de la estabilidad.
Los cuidados habituales de seguridad deben ser aplicados en la
manipulación de los reactivos. No utilizar los reactivos cuando la
absorbancia del reactivo de trabajo o de la mezcla Reactivo 1, Reactivo 2
y Reactivo 3, medida contra agua a 340 nm, fuera menor a 1,0 o cuando
los reactivos estuvieran turbios o con señales de contaminación.
En los analizadores automáticos, los reactivos están sujetos a
contaminaciones con otros reactivos o con el aire ambiente, dependiendo
de las características del equipo y de las condiciones de trabajo. Estas
contaminaciones pueden provocar reducción de la estabilidad de los
reactivos o modificaciones en su desempeño, requiriendo una nueva
calibración del sistema.
Como ocurre en toda medición de la actividad enzimática, la rigurosa
observancia del tiempo y de la temperatura de incubación es de gran
importancia para la calidad de los resultados obtenidos.
Los reactivos contienen azida sódica que es tóxica. No ingerir y, en el caso
de contacto con los ojos, lavar inmediatamente con gran cantidad de
agua y procurar auxilio médico. La azida puede formar compuestos
altamente explosivos con las cañerías de plomo y cobre. Por lo tanto,
utilizar grandes volúmenes de agua para descartar los reactivos.
Fotómetro con cubeta termostatizada capaz de medir con exactitud
absorbancias a 340 nm.
Pipetas para medir muestras y reactivos.
Cronómetro.
Reactivo 1 - Almacenar entre 2 - 8 °C.
Reactivo 2 - Almacenar entre 2 - 8 ºC.
Reactivo 3 - Almacenar entre 2 - 8 ºC.
≥
µ
REACTIVO 1
REACTIVO 2
REACTIVO 3
Precauciones y cuidados especiales
ALT/GPT LIQUIFORM VET Ref.: 1008
Español - Ref.: 1008
Influencias pre analíticas .
Determinación de la actividad enzimática utilizando el
piridoxal fosfato
La concentración de ALT en los
hepatocitos de equinos y rumiantes es baja; consecuentemente, la
actividad sérica de ALT en estas especies no es útil para la detección de
enfermedad hepática.
Esteroides anabólicos, medicamentos anticonvulsivos, cloranfenicol,
clorotiazida, gentamicina y otras drogas pueden causar aumento en la
actividad de la ALT.
Se debe crear un Procedimiento Operativo Estándar (POE) que establezca
procedimientos adecuados para la recolección, preparación y
almacenamiento de la muestra. Destacamos que los errores debidos a la
muestra pueden ser mucho mayores que los errores ocurridos durante el
procedimiento analítico.
Usar suero o plasma (EDTA, Heparina). La actividad enzimática
permanece estable durante 4 días entre 2 - 8 ºC y 2 semanas a 10 ºC
negativos.
Como ningún test conocido puede asegurar que las muestras de sangre
no transmitan infecciones, todas ellas deben ser consideradas como
potencialmente infecciosas. Por lo tanto, al manipularlas, se deben seguir
las normas establecidas para la bioseguridad.
Para descartar los reactivos y el material biológico sugerimos aplicar las
normas locales, estatales o federales de protección ambiental.
Valores de Bilirrubina hasta 19 mg/dL, Hemoglobina hasta 180 mg/dL,
Triglicéridos hasta 650 mg/dL no producen interferencias significativas.
Para evaluar la concentración aproximada de hemoglobina en una
muestra hemolizada se puede proceder del siguiente modo: Diluir
0,05 mL de la muestra en 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) y medir la
absorbancia a 405 ó 415 nm ajustando el cero con agua desionizada o
destilada.
Hemoglobina (mg/dL) Absorbancia x 601
Hemoglobina (mg/dL) Absorbancia x 467
Las muestras fuertemente lipémicas y ictéricas poseen absorbancia
elevada a 340 nm. Cuando la actividad enzimática en estas muestras está
muy aumentada, puede darse un consumo bastante rápido del sustrato
sin haber disminución significativa en la absorbancia. Por lo tanto, si se
obtuvieran valores bajos de actividad enzimática en estas muestras se
debe repetir la determinación utilizando la muestra diluida con NaCl
0,85%.
Ver los
Para obtener resultados rastreables al método de referencia IFCC, es
necesario utilizar el procedimiento bi-reactivo, para que la enzima sea
totalmente activada por el piridoxal fosfato.
≅
≅
405
415
ítems Cálculo, Calibración, Linealidad y Observaciones.
Preparación del reactivo .
Procedimiento de la muestra
Preparación del reactivo de trabajo .
Procedimiento de la muestra
Transferir 0,300 mL del Reactivo 3 a un frasco
de Reactivo 1 (24 mL) y homogeneizar suavemente. Estabilidad: 21 días
entre 2 - 8 ºC y 24 horas entre 15 - 25 ºC cuando no hubiera
contaminación química o microbiana. Anotar la fecha de expiración.
Opcionalmente se puede preparar un volumen menor de la mezcla
(Reactivo 1 + Reactivo 3) adicionando 1 parte del Reactivo 3 a 80 partes
del Reactivo 1 (ejemplo: adicionar 0,010 mL del Reactivo 3 a 0,800 mL
del Reactivo 1).
En un tubo rotulado Muestra o Calibrador, pipetear 0,800 mL de la
mezcla Reactivo 1 + Reactivo 3.
Adicionar 0,100 mL de muestra o de calibrador de enzimas,
homogeneizar y incubar en baño- María a 37 ± 0,2 ºC por 5 minutos.
Después deesta incubación, se puede esperar hasta 30 minutos para
iniciar la medición cinética con la adición del Reactivo 2.
Ajustar el cero del fotómetro a 340 nm con agua destilada o
desionizada.
Adicionar 0,200 mL del Reactivo 2, homogeneizar y transferir
inmediatamente a una cubeta termostatizada a 37 ± 0,2 ºC. Esperar 1
minuto.
Registrar la absorbancia inicial (A ) y disparar simultáneamente el
cronómetro. Después de 2 minutos registrar la absorbancia (A ).
Para verificar la linealidad de la reacción, registrar la absorbancia a
intervalos de 1 minuto y verificar si la diferencia de absorbancia por
minuto es equivalente.
Transferir el contenido de un frasco
de Reactivo 2 a un frasco de Reactivo 1 y homogeneizar suavemente. El
reactivo de trabajo es estable 14 días entre 2 - 8 ºC y 24 horas entre 15 -
25 ºC cuando no hubiera contaminación química o microbiana. Anotar la
fecha de expiración. Opcionalmente se puede preparar un volumen menor
de reactivo de trabajo mezclando 1 parte de Reactivo 2 con 4 partes de
Reactivo 1 (ejemplo: mezclar 0,200 mL de Reactivo 2 y 0,800 mL de
Reactivo 1).
Para preservar el desempeño, los reactivos deben permanecer fuera de la
temperatura de almacenamiento solamente el tiempo necesario para
obtener el volumen a utilizar. Evitar la exposición a la luz solar directa.
En un tubo rotulado Muestra o Calibrador, pipetear 1,0 mL del reactivo
de trabajo.
Ajustar el cero del fotómetro a 340 nm con agua destilada o
desionizada.
Adicionar 0,100 mL de muestra o calibrador de enzimas,
homogeneizar y transferir inmediatamente a una cubeta termostatizada a
37 ± 0,2 ºC. Esperar 1 minuto.
1.
2.
3.
4.
5.
Determinación de la actividad enzimática sin la
utilización del piridoxal fosfato
1.
2.
3.
1
2
Muestra
Interferencias
Procedimiento
Español - Ref.: 1008
1,875 - 1,733
A/min Calibrador = = 0,071
2
Actividad del Calibrador (U/L) = 125
125
Factor = = 1761
0,071
Actividade de la ALT (U/L) = 0,037 x 1761 = 65
Cuando las condiciones óptimas de reacción citadas anteriormente son
tenidas en consideración, se puede optar por la utilización del factor
1746.
Usar calibradores de la línea Calibra VET - Labtest que tienen actividades
de la ALT rastreables al material de referencia ERM-AD454/IFCC y al
método de referencia de la IFCC .
Calibración en 2 ó 3 puntos al cambiar de lote;
Calibración en 2 ó 3 puntos cuando el control interno de calidad lo indique.
Blanco de reactivos: agua desionizada o solución de cloruro de sodio
150 mmol/L (0,85%);
Usar calibradores de la línea Calibra VET - Labtest que tienen actividades
de la ALT rastreables al material de referencia ERM-AD454/IFCC y al
método de referencia de la IFCC .
Calibración en 2 ó 3 puntos al cambiar de lote;
Calibración en 2 ó 3 puntos cuando el control interno de calidad lo indique.
El resultado de la medición es lineal entre 3,5 y 400 U/L. Para valores
mayores, diluir la muestra con NaCl 150 mmol/L (0,85%). Realizar una
nueva medición y multiplicar el resultado obtenido por el factor de
dilución.
El laboratorio debe mantener un
programa de control interno de calidad que defina claramente los
reglamentos aplicables, objetivos, procedimientos, criterios para
especificaciones de la calidad y límites de tolerancia, acciones
correctivas y registro de las actividades. Deben utilizarse materiales de
control para monitorear la imprecisión de la medición y los desvíos de la
calibración. Se sugiere que las especificaciones del coeficiente de
variación y del error total sean basados en los componentes de la
variación biológica (VB) .
Se debe utilizar los intervalos
únicamente como orientación. Se recomienda que cada laboratorio
establezca, su propio rango de valores de referencia en la población de
animales atendida.
∆
Calibración
Calibraciones manuales
Intervalo de calibraciones
Sistemas automáticos
Intervalo de calibraciones
3
3
4,5,6
Control interno de la calidad .
Intervalo de referencia .
4.
Cálculos .
Ejemplo
Registrar la absorbancia inicial (A ) y disparar simultáneamente el
cronómetro. Después de 2 minutos registrar la absorbancia (A ).
Para verificar la linealidad de la reacción, registrar la absorbancia a
intervalos de 1 minuto y verificar si la diferencia de absorbancia por
minuto es equivalente.
Como ocurre en toda medición de la actividad enzimática, la rigurosa
observancia del tiempo y de la temperatura de incubación es de gran
importancia para la calidad de los resultados obtenidos.
Los procedimientos sugeridos son adecuados para fotómetros cuyo
volumen mínimo de reacción de medición es igual o menor a 1,0 mL.
Debe verificarse la necesidad de ajuste de volumen según el fotómetro
utilizado. Los volúmenes de muestra y reactivo pueden ser modificados
proporcionalmente sin perjuicio del desempeño del ensayo y el
procedimiento de cálculo se mantiene inalterado. En caso de reducción
de los volúmenes es fundamental que se observe el volumen mínimo
necesario para la medición fotométrica. Volúmenes de muestra menores
a 0,010 mL son críticos en aplicaciones manuales y deben ser usados
con cautela porque aumentan la imprecisión de la medición.
Es práctica habitual calcular los resultados de la actividad
enzimática utilizando un factor obtenido en condiciones óptimas de
reacción las que incluyen:
Longitud de onda: 340 nm
Cubeta termostatizada a 37 ± 0,2 ºC con 1,0 cm de espesor de solución.
Ancho medio de banda 2 nm.
Luz espuria 0,1 %.
Como en la mayoría de las veces no es posible trabajar bajo estas
condiciones, las buenas prácticas de laboratorio recomiendan realizar la
calibración del ensayo utilizando un calibrador de enzimas indicado por el
fabricante del reactivo. Labtest recomienda el Calibra VET para
calibración del sistema ALT/GPT Liquiform VET.
A/minuto Muestra o Calibrador = (A - A )/2
Actividad del Calibrador
Factor =
A/min Calibrador
ALT (U/L) = A/min Muestra x Factor
A = 1,925 A = 1,851
1,925 - 1,851
A/min Muestra = = 0,037
2
A = 1,875 A = 1,733
1
2
1 2
1 2
1 2
Una absorbancia inicial (A ) igual o menor a 0,8 es indicativa de que la
muestra tiene actividad elevada de ALT. En este caso, diluir la muestra
y repetir la medición (ver linealidad).
Muestra
Calibrador
1
≤
≤
∆
∆
∆
∆
Linealidad
Español - Ref.: 1008
Características de desempeño
Estudios de recuperación .
Estudios de comparación de métodos .
8
A dos muestras con concentraciones
de alanina amino transferasa iguales a 100 y 227 U/L le fueron
adicionadas cantidades medidas de la enzima, obteniéndose los
siguientes resultados:
El error sistemático proporcional medio estimado es igual a 0,7 U/L para
el nivel de decisión 80 U/L y 2,5 U/L para el nivel de decisión 281 U/L.
El método propuesto
fue comparado con el método de referencia de la IFCC , obteniéndose los
siguientes resultados:
Utilizando la ecuación de regresión, el error sistemático total (bias)
estimado es igual a 2,9% para un nivel de decisión igual a 89 U/L y 3,3%
para un nivel de decisión igual a 272 U/L. Estos errores son menores que
el error sistemático analítico de la especificación óptima basada en la
variación biológica que es ± 6,0%.
3
Ensayos realizados con piridoxal fosfato
Ensayos realizados sin piridoxal fosfato
≤
Especie (UI/L)
Canina 10 a 88
Felina
Equina
10 a 88
3 a 23
Utilizando la ecuación de regresión, el error sistemático total (bias)
estimado es igual a 2,6% para un nivel de decisión igual a 80 U/L y 3,7%
para un nivel de decisión igual a 282 U/L. Estos errores son menores que
el error sistemático analítico de la especificación óptima basada en la
variación biológica que es ± 6,0%.
Los estudios de precisión fueron
realizados en el sistema Labtest/Labmax 240 , utilizando muestras con
valores de actividad iguales a 89 y 272 U/L para el procedimiento con
piridoxal fosfato y 80 y 282 U/L para el procedimiento sin piridoxal
fosfato.
La imprecisión total obtenida en las muestras satisface la especificación
óptima para la imprecisióntotal basada en la variación biológica que es
6,1%.
El error total (error aleatorio + error
sistemático) estimado para el valor de 89 U/L es igual a 7,2% y para el
valor de 272 U/L es igual a 7,8% en los ensayos realizados con piridoxal
fosfato. Para los ensayos realizados sin piridoxal fosfato el error total
estimado para el valor de 80 U/L es igual a 5,5% y para el valor de 282 U/L
es igual a 5,7%. Los resultados indican que el método satisface la
especificación óptima para el error total ( 16%) basada en los
componentes de la Variación Biológica (VB).
Utilizándose como parámetro la
absorbancia mínima detectable, la sensibilidad fotométrica es de
1,75 U/L, correspondiendo a una absorbancia igual a 0,001.
≤
≤
≤
Estudios de precisión .
Ensayos realizados con piridoxal fosfato
Ensayos realizados sin piridoxal fosfato
Estimativa del error total .
Sensibilidad metodológica .
®
Número de muestras
Intervalo de concentraciones
(U/L)
Media de las estimativas
(U/L)
Ecuación de regresión
Coeficiente de correlación
Método
Comparativo
40
8,2 - 256,2
102,4
Método Labtest = 1,036 x
Método Comparativo - 0,589
0,999
40
8,0 - 262,7
105,5
Método
Labtest
Media
80
282
DE (U/L)
1,20
2,19
CV (%)
1,5
0,8
N
20
202Muestra
Muestra 1
Repetitividad - imprecisión intra-ensayo
Media
80
282
DE (U/L)
1,40
3,31
CV (%)
1,8
1,2
N
20
202Muestra
Muestra 1
Reproducibilidad - imprecisión total
Media
89
272
DE (U/L)
1,43
2,61
CV (%)
1,6
1,0
N
20
202Muestra
Muestra 1
Repetitividad - imprecisión intra-ensayo
Media
89
272
DE (U/L)
2,31
7,40
CV (%)
2,6
2,7
N
20
202Muestra
Muestra 1
Reproducibilidad - imprecisión total
Número de muestras
Intervalo de concentraciones
(U/L)
Media de las estimativas
(U/L)
Ecuación de regresión
Coeficiente de correlación
Método
Comparativo
40
8,2 - 256,2
102,4
Método Labtest = 0,958 x
Método Comparativo - 1,284
0,998
40
10,8 - 243,3
99,4
Método
Labtest
Inicial
Actividad (U/L)
Adicionada Esperada Encontrada
Recuperación
(%)
14014141100
27526841227
99,2
102,6
Español - Ref.: 1008
Efectos de la dilución de la matriz .
Significado clínico .
Observaciones
1.
2.
3.
Dos muestras con valores
iguales a 408 y 459 U/L fueron utilizadas para evaluar la respuesta del
sistema en las diluciones de la matriz con NaCl 150 mmol/L (0,85%).
Usando factores de dilución que variaron de 2 a 16 fue encontrada una
recuperación media 100,3%.
En perros y gatos la ALT es
predominantemente específica para lesión celular hepática. Sin embargo,
la ALT también puede estar aumentada en situaciones de lesión muscular
grave como rabdomiólisis, trombosis ilíaca en gatos, sin que exista lesión
hepática aparente. En estas situaciones, se recomienda la medición
concomitante de creatino quinasa (CK).
Se puede observar aumentos discretos a moderados de ALT en gatos con
hipertiroidismo y perros con hiperadrenocorticismo.
Diversas enfermedades hepáticas o cualquiera que cause lesión de
hepatocitos, puede aumentar la actividad sérica de la ALT. Entre los
factores más comunes encuéntranse: hipoxia, toxinas bacterianas,
inflamación, hepatitis canina, virus y otras afecciones virales, neoplasia
hepática, glicocorticoides y diversas drogas y medicamentos.
La ALT también puede estar aumentada en la fase de reparación de
enfermedades hepáticas debido a la regeneración activa de hepatocitos.
Es posible que en algunos perros y gatos con una importante enfermedad
hepática presenten la actividad sérica de ALT normal o discretamente
aumentada. En estas situaciones, entiéndese que la masa hepática puede
estar considerablemente disminuida y la cantidad de hepatocitos
remanentes es insuficiente para causar un aumento en la actividad de la
enzima.
En grandes animales, la ALT es una enzima muscular y, en la clínica, no
posee valor diagnóstico en estas especies.
La limpieza y secado adecuados del material utilizado son factores
fundamentales para la estabilidad de los reactivos y obtención de
resultados correctos.
El agua utilizada en el laboratorio debe tener la calidad adecuada para
cada aplicación. Así, para preparar reactivos y usar en las mediciones,
debe tener resistividad 1 megaohm o conductividad 1 microsiemens y
concentración de silicatos <0,1 mg/L (agua tipo II). Para el enjuague del
material de vidrio el agua puede ser del tipo III, con resistividad
0,1 megaohms o conductividad 10 microsiemens. En el enjuague
final, utilizar agua tipo II. Cuando la columna desionizadora está con su
capacidad saturada produce agua alcalina con liberación de varios iones,
silicatos y substancias con gran poder de oxidación o reducción que
deterioran los reactivos en pocos días o incluso horas, alterando los
resultados de modo imprevisible. Por ello es fundamental establecer un
programa de control de la calidad del agua.
Para una revisión de las fuentes fisiopatológicas y medicamentosas
de interferencia en los resultados y en la metodología se sugiere consultar
http:/www.fxol.org.
10,11
≥ ≤
≥ ≤
Referencias
Informaciones al consumidor
1. Karmen A. J Clin Invest 1955; 34:131.
2. Henry RJ, Chiamori N, Golub O, Berkman S. Amer J Clin Path 1960;
34:381.
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Concentration of Alanine Aminotransferase. Clin Chem Lab Med 2002;
40 (7):718-24.
4. Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular,
Base de Datos de Variación Biológica. Disponible en:
<http://www.seqc.es/article/articleview/330/1/170> (acceso desde
04/2006).
5. http://www.westgard.com/biodatabase1.htm (acceso desde
03/2008).
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Washington: AACC Press, 2005. p. 3-4.
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Philadelphia: W.B. Saunders Company, 1994. p. 788-96.
10. Kerr MG. Exámenes Laboratoriales en Medicina Veterinaria,
Bioquímica Clínica y Hematología. Roca . 2003.
11. Thrall MA, et al. Hematología y Bioquímica Clínica Veterinaria. Roca.
2007.
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las especificaciones hasta la fecha de expiración indicada en los rótulos,
siempre que los cuidados de utilización y almacenamiento indicados en
los rótulos y en estas instrucciones sean seguidos correctamente.
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Labtest Diagnóstica
Español - Ref.: 1008
Presentación
Producto Referencia Contenido
ALT/GPT
Liquiform Vet
1008-4/30
1008-2/100
4 X 6 mL
4 X 24 mL
1 X 1,5 mL
REACTIVO 1
REACTIVO 2
REACTIVO 3
2 X 20 mL
2 X 80 mL
1 X 2,2 mL
REACTIVO 1
REACTIVO 2
REACTIVO 3
Español - Ref.: 1008
CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38
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