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IDENTIFICACIÒN DE Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum EN POLLO DE ENGORDE DE LA LINEA ROSS 308 JOSE ANDERSSON PIÑEROS GORDILLO MANUEL ARTURO RODRIGUEZ VASQUEZ UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS PROGRAMA DE ZOOTECNIA 2010 IDENTIFICACION DE Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum EN POLLO DE ENGORDE DE LA LINEA ROSS 308 JOSE ANDERSSON PIÑEROS GORDILLO MANUEL ARTURO RODRIGUEZ VASQUEZ Trabajo de grado presentado para optar el tìtulo de Zootecnista Director JAVIER EDUARDO GÓMEZ Médico veterinario ULS. UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS PROGRAMA DE ZOOTECNIA BOGOTA D.C 2010 DIRECTIVAS HERMANO CARLOS GABRIEL GÒMEZ RESTREPO F.S.C RECTOR HERMANO FABIO CORONADO PADILLA F.S.C VICERRECTOR ACADEMICO HERMANO CARLOS ALBERTO PABÒN MENESES F.S.C VICERRECTOR DE PROMOCIÒN Y DESARROLLO HUMANO HERMANO MANUEL CANCELADO JIMENEZ F.S.C VICERRECTOR DE INVESTIGACIÒN Y TRASFERENCIA DOCTOR EDUARDO ANGEL REYES VICERRECTOR ADMINISTRATIVO DOCTORA PATRICIA INES ORTIZ VALENCIA SECRETARIA GENERAL DOCTOR LUIS CARLOS VILLAMIL JIMENEZ DECANO FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS DOCTOR JOS LECONTE SECRETARIO ACADEMICO FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS DOCTOR RAFAEL IGNACIO PAREJA MEJIA DIRECTOR DEL PROGRAMA DE ZOOTECNIA DOCTOR ALEJANDRO TOBON GONZALEZ ASISTENTE ACADEMICO APROBACION _______________________________________ DOCTOR RAFAEL IGNACIO PAREJA MEJIA DIRECTOR DEL PROGRAMA ______________________________________ DOCTOR ALEJANDRO TOBON GONZALEZ ASISTENTE ACADEMICO ______________________________________ DOCTOR JAVIER GÒMEZ DIRECTOR DEL TRABAJO DE GRADO ______________________________________ DOCTORA RUTH RODRIGUEZ ANDRADE JURADO ______________________________________ DOCTOR GUILLERMO GÒMEZ JURADO JURADO AGRADECIMIENTOS A Dios por permitirnos terminar nuestra carrera. A nuestros padres por su apoyo, por su confianza y ayuda durante toda la carrera. A nuestro director de tesis, Doctor Javier Eduardo Gómez, por sus conocimientos y la asesoría brindada para el desarrollo de este proyecto. A la Universidad de la Salle por el apoyo brindado para que este proyecto se realizara. A Rosario Santos, por su ayuda y colaboración incondicional durante las pruebas de laboratorio requeridas para este proyecto. DEDICATORIA A Dios por su ayuda espiritual. A nuestros padres por su paciencia confianza y ayuda brindada a lo largo de nuestra vida. A todos nuestros amigos que estuvieron con nosotros en toda nuestra carrera. Jose Andersson Piñeros Gordillo Manuel Arturo Rodriguez Vasquez 1 IDENTIFICACION DE Salmonella Gallinarum Y Salmonella Pullorum EN POLLO DE ENGORDE DE LA LINEA ROSS 308 RESUMEN La avicultura de nuestro país ha venido sufriendo un problema de gran relevancia, consistente en la aparición de una enfermedad denominada científicamente como salmonelosis, la cual origina problemas patológicos que ocasionan principalmente alteraciones en los parámetros zootécnicos de las aves, situación que constituye perdidas enormes en las empresas avícolas. En la década de los ochenta se produjo un aumento en los casos de salmonelosis humana trasmitida por los alimentos. La principal fuente fueron los productos avícolas. Esto creo una gran desconfianza para los consumidores, provocando que no compraran estos productos por prevención. También generó dificultades a los avicultores nacionales para competir en los mercados externos. Debido a todo esto las empresas avícolas disminuyeron sus utilidades. Lo anterior se debe a que no existen investigaciones de salmonelosis en granja en donde se disponga de datos o información necesaria para la implementación de estrategias, reglamentación y control adecuado de salmonelosis aviar en las granjas de Colombia. El principal objetivo de esta investigación fue el aislamiento, identificación y serotipificación de Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum en pollos de engorde de la línea Ross 308, por medio de hisopados cloacales en una granja del sector avícola con una población de 36.000 aves, divididos en 4 lotes cada uno de 9.000 aves. Por cada lote se tomaron 20 hisopados cloacales al final de las semanas 1, 2, 3 de vida. En total se tomaron 240 hisopos cloacales equivalente a 4800 aves representando el 10% de la población total. Para la identificación de las bacterias se llevo a cabo en el laboratorio de control de calidad de la Universidad de La Sallé sede norte por medio de pruebas bioquímicas y el sistema de identificación BBL Crystal. Los 2 resultados obtenidos se analizaron por medio de estadística descriptiva mostrando la presencia de Salmonella Spp en un 80,42 %, Proteus Spp 11,67%, Enterobacter Cloacae 5.83%, Klebsiela Spp 2,08 % y la ausencia de Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum en estas aves. PALABRAS CLAVES: Aislamiento, Identificación, Salmonella, Pollos. 3 ABSTRAC The poultry industry of our country has been facing a problem of great importance, namely the emergence of a disease known scientifically as salmonella, which causes problems mainly caused pathological changes in the zootechnical parameters of birds, presenting huge losses in the poultry companies. In the eighties there was an increase in human salmonellosis cases of foodborne. The main source was poultry products. This created a great distrust for consumers, causing them not to buy these products for prevention. It also generates difficulties for domestic poultry farmers to compete in foreign markets. Because of all this poultry companies decreased their profits. This is because there is no salmonella in farm research where data are available or information necessary for the implementation of strategies, proper regulation and control of avian salmonellosis on farms in Colombia. The main objective of this research was the isolation, identification and serotyping of Salmonella Gallinarum and Salmonella Pullorum in broilers of the Ross 308 line, through cloacal swabs on a farm where the poultry sector has a population of 36,000 birds divided into 4 lots each of 9,000 birds. For each batch took 20 cloacal swabs at the end of weeks 1, 2, 3 living. A total of 240 cloacal swabs were taken equivalent to 4,800 birds representing 10% of the total population. For the isolation and identification of bacteria was carried out in the quality control laboratory of the University of La Salle north headquarters through biochemical tests and BBL Crystal Identification System. The results were analyzed using descriptive statistics showing the presence of Salmonella Spp in 80,42 %,, Proteus Spp 11,67%, Enterobacter Cloacae5.83%, Klebsiella Spp 2,08 % and the absence of Salmonella Pullorum and Salmonella Gallinarum in birds. KEY WORDS: Isolation, Identification, Salmonella, Chickens. 4 TABLA DE CONTENIDO RESUMEN .................................................................................................................... 1 ABSTRAC ..................................................................................................................... 3 1. INTRODUCCIÒN ................................................................................................. 10 2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 12 2.1 OBJETIVO GENERAL .......................................................................................12 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................. 12 3. MARCO TEÒRICO .............................................................................................. 13 3.1 GENERALIDADES DE LA AVICULTURA EN COLOMBIA ................................ 13 3.2 POLLO DE ENGORDE LINEA ROSS 308 ........................................................ 14 3.2.1 Parámetros Zootécnicos ................................................................................. 15 3.3 ENFERMEDADES BACTERIANAS EN LA AVICULTURA ................................ 15 3.4 GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS ......................................................... 15 3.4.1 Clasificación De Las Bacterias ....................................................................... 16 3.5 GENERALIDADES DE LA SALMONELA .......................................................... 17 3.5.1 Estructura Antígena ........................................................................................ 19 3.5.2 Salmonella Gallinarum ................................................................................... 21 3.5.3 Salmonella Pullorum ....................................................................................... 21 3.6 SALMONELOSIS .............................................................................................. 22 3.6.1 Resistencia A Antibióticos .............................................................................. 23 3.6.2 Transmisión en el Hombre .............................................................................. 24 3.6.3 Programas De Control .................................................................................... 24 3.6.4 Diagnóstico .................................................................................................... 24 3.7 MÉTODOS PARA EL AISLAMIENTO DE SALMONELLA SPP ......................... 25 3.7.1 Preenriquecimiento en medio no selectivo ..................................................... 25 3.7.2 Medios de enriquecimiento selectivo ........................................................... 26 3.7.3 Medios de cultivo selectivos ........................................................................... 27 3.7.4 Medios de cultivo diferenciales ....................................................................... 27 3.7.4.1 Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) ........................................................ 28 5 3.7.4.2. Agar Bismuto Sulfito ................................................................................... 29 3.8 PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA ..... 29 3.8.1 Prueba De Indol ............................................................................................. 29 3.8.2 Prueba de catalasa......................................................................................... 30 3.8.3 Prueba oxidasa .............................................................................................. 30 3.8.4 Prueba De Movilidad ...................................................................................... 30 3.9 SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN BBL CRYSTAL® ........................................... 31 3.10. SEROTIPIFICACIÒN ...................................................................................... 32 3.10.1 Esquema De Kauffmann White..................................................................... 33 4. MATERIALES Y METODOS ................................................................................... 35 4.1 UBICACIÓN DEL PROYECTO .......................................................................... 35 4.2 UNIVERSO Y MUESTRA .................................................................................. 35 4.3 CARACTERIZACIÓN DE LAS GRANJAS ......................................................... 36 4.4. TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS PARA LA RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN ................................................................................................. 37 4.4.1 Método para la recolección de muestras de Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum ............................................................................................... 37 4.4.2 Aislamiento e identificación de Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum. ................................................................................................................................ 39 4.5 DISEÑO EXPERIMENTAL ................................................................................ 47 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................ 48 4.1 Resultados presencia / ausencia de Salmonella Spp ........................................ 48 4.2 Resultado pruebas bioquímicas ........................................................................ 49 4.3 Presencia de Salmonella Spp y otras especies ................................................. 51 4.4 Resultado muestras por lote .............................................................................. 52 4.5 Resultados semanales ...................................................................................... 53 6. CONCLUSIONES ................................................................................................ 54 7. RECOMENDACIÓNES ........................................................................................ 55 REFERENCIAS .......................................................................................................... 57 ANEXOS ..................................................................................................................... 60 6 TABLAS 1. Parámetros Zootécnicos Pollo De Engorde ..................................................... 15 2. Tipos de formas bacterianas ........................................................................... 16 3. Pruebas bioquímicas para la identificación de S. Gallinarum y S. Pullorum .... 18 4. Resultados pruebas bioquímicas ………………………………………………….50 7 FIGURAS 1. Pollo Ross 308 ............................................................................................... 14 2. Pared celular Gram negativas – Gram positivas .............................................. 17 3. Salmonella Spp. .............................................................................................. 19 4. Estructura antígena Salmonella Spp. .............................................................. 20 5. Prueba BBL Crystal ® ..................................................................................... 32 6. Muestreo con hisopo cloacal ........................................................................... 37 7. Tubos identificados para el muestreo .............................................................. 38 8. Tubos muestreados e identificados ................................................................. 38 9. Caldo Tetrationato ........................................................................................... 39 10. Siembra en caldo Tetrationato ........................................................................ 40 11. Muestras descartadas ..................................................................................... 41 12. Colonias Salmonella Spp. ............................................................................... 41 13. Prueba catalasa y oxidasa .............................................................................. 42 14. Medio SIM ....................................................................................................... 43 15. Muestras con Producción de H2S y movilidad +. ............................................. 43 16. Siembra en Agar triptiasa soya........................................................................44 17. Siembra en BBL Crystal. ®.............................................................................. 44 18. Esquema proceso de identificación de Salmonella Spp. en laboratorio ........... 46 8 GRAFICAS 1. Presencia / Ausencia de Salmonella Spp. ....................................................... 48 2. Porcentaje de aislamiento de Salmonella Spp y otras especies ...................... 51 3. Resultados muestras por lote. ......................................................................... 52 4. Resultados muestras semanales ..................................................................... 53 9 ANEXOS 1. Principales enfermedades de control oficial en Colombia. .............................. 62 2. Esquema de kauffmann white ......................................................................... 63 3. Registro de seguimiento de muestra ............................................................... 64 4. Estadística descriptiva presencia Salmonella Spp. por lotes y por semana…..75 10 1. INTRODUCCIÒN En el mundo a través del tiempo ha aumentado cada vez más el interés por la inocuidad de los alimentos en sus diferentes campos de producción. En Latinoamérica y en Colombia se han establecido documentos legislativos los cuales están encaminadas a la exigencia de la inocuidad de los alimentos en las diferentes etapas de producción encaminada siempre a la evolución de la agroindustria. La carne, uno de los productos más consumidos y base de la canasta familiar Colombiana, es uno de los productos más importantes por sus características nutricionales y es uno de los objetivos principales de control y vigilancia por estar considerado como de mayor riesgo para la salud pública, según el Decreto 3075 de 1997. (MINISTERIO DE LA PROTECCION SOCIAL, 1997) En Colombia la avicultura constituye uno sectores más dinámico dentro de las actividades pecuarias encaminadas a la producción de carne en las últimas tres décadas seguido por la producción de carne bovina y la porcicultura. La producción de pollo de engorde en Colombia es una de las principales actividades pecuarias ya que es de gran importancia para la alimentación de los colombianos, sin embargo las enfermedades trasmitidas por estos animales constituyen un aspecto de especial interés para las entidades gubernamentales que apelan a la prevención de éstas mediante exigencia de la implementación de sistemas de calidad como el Plan de Análisis de Peligros y Puntos Críticos de Control (HACCP), que garanticen la inocuidad de los productos. (DE LAS MERCEDES OSORIO ROJAS, 2009) Dentro de estas enfermedades de control oficial encontramos la Salmonelosis la cual es una enfermedad zoonotica, la cual afecta a la salud pública y produce grandes pérdidas económicas a nivel productivo por mortalidad, pérdida de peso y una disminución en la producción. Esta enfermedad es producida por bacterias denominadas Salmonelas, en las cuales se han identificado más de 2300 serotipos. Dentro de ellas encontramos las S. Gallinarum y S. Pullorum, las cuales son de gran importancia a nivel gubernamental ya que pueden afectar la salud pública de los colombianos y el comercio con los demás países del mundo. (CALNEK B. W., 2000) 11 Actualmente en la producción avícola de nuestro país, encontramos que hay deficiencia de información actualizada sobre la incidencia de la salmonelosis en las granjas de pollo de engorde que impiden facilitar las políticas de reglamentación y control de zoonosis en el país. El presente estudio busca aislar e identificar la presencia/ausencia de S. Gallinarum y S. Pullorum en pollo de engorde de la línea ROSS 308, por medio de pruebas bioquímicas y el sistema de identificación BBL Cristal para entérico no fermentadores con el fin de proporcionar información que ayude a facilitar las políticas de reglamentación y control de zoonosis en el país. Este estudio hace parte de un Macro proyecto que está realizando la Universidad de La Salle y el Ministerio de Agricultura y desarrollo rural, lo cual hace que todos los datos obtenidos no sean totalmente expuestos ya que algunos de estos datos son catalogados como confidenciales para el proyecto. 12 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GENERAL Identificación y serotipificación de Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum en pollo de engorde de la línea Ross 308. 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Implementar el manual para la toma de muestras de Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum en pollos de engorde Aislar la Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum en pollos de engorde de la línea Ross 308, por medio de muestras de Hisopos cloacales. Identificar la presencia Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum por medio de pruebas bioquímicas. Tipificar Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum en pollos de engorde. 13 3. MARCO TEÒRICO 3.1 GENERALIDADES DE LA AVICULTURA EN COLOMBIA En Colombia la avicultura se constituye en el sector más dinámico dentro de las actividades pecuarias en las tres últimas décadas. La producción de carne bovina se incrementó a una tasa anual del 1,4%. La porcicultura al 2,1% y la avicultura en 11,6 % para carne de pollo y 7,5% en producción de huevo. (FENAVI, 2009) La producción de pollo de engorde en Colombia es una de las principales producciones pecuarias ya que es de gran importancia para la alimentación de los colombianos. Según FENAVI (Federación Nacional de Avicultores de Colombia) el consumo per capital en los últimos años ha aumentado significativamente pasando de 20.1 kg/año en el 2006 a 23.7 kg/año en el 2009. Con respecto las demás cadenas pecuarias el pollo se ubica en el primer lugar de consumo frente a la carne de ganado bovino con 18 kg/año y la carne de cerdo con 4.4 kg/año. (FENAVI, 2009) La actividad pecuaria del pollo de engorde solo se ha destinado al consumo interno ya que la cantidad de carne de pollo (1.010.659 Ton. para el año 2008), solo abarca el consumo de la población colombiana. (FENAVI, 2009) Solo se han registrado para la cadena avícola exportaciones hacia Venezuela en lo que corresponde a huevo fértil y a pollito de un día. (MORA, 2008) Las cantidades de aves encastadas para el 2008 entre hembras y machos corresponden a 607.175.424, (577.745.031 machos y 29.430.393 hembras) lo cual es de gran significancia en generación de empleo en el país (FENAVI, 2009) 14 3.2 POLLO DE ENGORDE LINEA ROSS 308 El pollo Ross 308 es un pollo con características robustas especialmente en la pechuga y patas, lo cual lo hace ver de forma redondeada. Se caracteriza por tener una excelente velocidad de crecimiento, una magnifica conversión de peso y una buena resistencia a enfermedades. (Figura 1) (GUTIERREZ, DISNEY, & JOSE, 2007) FIGURA 1. Pollo Ross 308 FUENTE: (AVIAGEN, 2009) Esta línea ingreso al país en 1997 ya que se encontraba como una de las líneas genéticas más importantes en el mudo en lo que conlleva a la producción de pollo de engorde especialmente para la producción de pollos Broiler (pollo de asadero, 1900 gr). (TELLES, 2008) 15 3.2.1 Parámetros Zootécnicos Según los objetivos de rendimiento del manual Ross 308 se presentan los siguientes parámetros teniendo en cuenta una producción normal de pollo Broiler a una edad de 35 en un lote de aves mixtos. (Tabla 1) (AVIAGEN CORPOREITED, 2007): TABLA 1. Parámetros Zootécnicos Pollo De Engorde EDAD (DÍAS) 35 PESO CORPORAL (GR) 2021 GANANCIA DIARIA (GR) 89 CONSUMO DIARIO (GR) 183 CONSUMO ACUMULADO (GR) 3248 CONVERSIÓN1.6 PESO INICIAL (GR) 42 FUENTE: (AVIAGEN CORPOREITED, 2007) 3.3 ENFERMEDADES BACTERIANAS EN LA AVICULTURA Según el documento 3468 del COMPES indican en materia de sanidad aviar, existen tres enfermedades de control oficial: Influenza Aviar, enfermedad de Newcastle y Salmonelosis aviar. (Anexo 1.) 3.4 GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS Las bacterias son generalmente unicelulares las cuales hacen parte del grupo de los protistas inferiores. Estas presentan una estructura menos compleja que la de las células de los organismos superiores. Son células procariotas (su núcleo está formado por único cromosoma y carecen de membrana nuclear). (AVIAGEN, 2009) Las bacterias tienen diferentes tipos de morfología como: cocos (esféricos), bacilos (bastón), espirilos (espiras). (Tabla 2.) . Estos distintos tipos de morfología celulares 16 deben de haberse originados por mecanismos evolutivos, a saber, por selección y estabilización adaptiva frente a las distintas presiones ambientales presentes en diferentes nichos ecológicos. (AVIAGEN, 2009) TABLA 2.Tipos de formas bacterianas Forma Aspecto Cocos Células más o menos esféricas Bacilos En forma de bastón, alargados, que a su vez pueden tener varios aspectos: Cilíndricos Fusiformes En forma de masa, etc. Espirilos Atendiendo a los tipos de extremos, estos pueden ser: Redondeados (lo más frecuente) Cuadrados Biselados Afilados Vibrios Forma de espiral, con una o más de una vuelta de hélice. Otros tipos de formas Proyectada su imagen sobre el plano tienen forma de coma. Filamentos, ramificados o no. Anillos casi cerrados Formas con prolongaciones. FUENTE: (LANES, 1998) 3.4.1 Clasificación De Las Bacterias Aparte de la clasificación morfológica también se basa en gran medida en características tales como forma, capacidad de formar esporas, métodos de producción de energía (glucolisis en las anaerobias, respiración celular en las aerobias) y la reacción a la tinción de Gram. (Figura 2). (AVIAGEN, 2009) 17 FIGURA 2. Pared celular Gram negativas – Gram positivas FUENTE: (BIOLOGYCORNER, 2009) 3.5 GENERALIDADES DE LA SALMONELA El género Salmonella recibe su nombre gracias al microbiólogo Daniel Elmer Salmon (1850-1914). Este género de bacterias es de gran importancia a nivel de salud pública ya que la Salmonella puede habitar tanto en animales como en humanos. Las diversas especies de Salmonelas se trasmiten por contacto con animales enfermos como animales portadores sanos, aunque por lo general la enfermedad producida tiene un origen alimentario debido a la ingesta de alimentos contaminados, teniendo en cuenta que la materia fecal es una de las principales fuentes de contaminación a nivel ambiental. La Salmonela corresponde a bacterias Gram negativas que pertenecen a la familia Enterobacteriaceas y están compuestas por una sola especie denominada Salmonella Entérica. (Figura 3) Generalmente son móviles por flagelos a excepción de S. Gallinarum y S. Pullorum, las cuales causan tifoidea aviar y pullorosis respectivamente. Podemos encontrar aerobias y anaerobias facultativas y tienen un 18 amplio rango de temperatura de crecimiento destacando que la mejor temperatura de crecimiento es de 37⁰C y pueden desarrollarse en un pH entre 4 y 9.Son ubicuas en la naturaleza, son sensibles a la pasteurización, se inactivan a 64⁰C por un minuto (la S. Gallinarum es inactivada a 60⁰C por 10 minutos). (CALNEK B. W., 2000) La gran mayoría de estas bacterias se encuentran en el intestino animal lo cual nos indica que se diseminan fácilmente en el ambiente. Estas bacterias son incapaces de fermentar lactosa o sacarosa pero si fermentan glucosa con producción de acido y gas. Según su metabolismo estas bacterias para ser identificadas deben tener los siguientes resultados bioquímicamente. Cabe mencionar que la S. Gallinarum y S. Pullorum son inmóviles y no producen H2S (Tabla 3.) TABLA 3. Pruebas bioquímicas para la identificación de S. Gallinarum y S. Pullorum PRUEBA BIOQUIMICA RESULTADO Oxidasa - Catalasa + Indol - H2S - Movilidad - FUENTE: Adaptación (TERRAGNO, CAFFER, & BRUNA, 2003) 19 FIGURA 3. Salmonella Spp. FUENTE: (MENDEZ, 2007) 3.5.1 Estructura Antígena En la Salmonela encontramos dos clases de antígenos principales el antígeno somático O y antígeno flagelar H. el antígeno O lo encontramos en la pared de la bacteria y está conformada por polisacáridos. Estos antígenos son resistentes y termoestables a ácidos diluidos y alcohol el antígeno H se encuentra formado por proteína flagelina el cual como su nombre lo dice esta referenciado a la presencia del flagelo en la bacteria. (Figura 4) 20 FIGURA 4. Estructura antígena Salmonella Spp. Existen otros antígenos como el K y el VI que están presente en algunas especies esto debido a algunos genes específicos. Para identificar el antígeno “O” se hace con números arábigos y dada la participación de fracciones somáticas en algunas Salmonelas, se organizan en grupos cuyos miembros comparten uno o más antígenos somáticos. El antígeno flagelar es difásico (La primera fase inespecífica, se identifica con letras minúsculas, y la segunda fase especifica, con números arábigos). En lo que corresponde en la estructura antígena de la estructura antígena de la S. Gallinarum solamente contiene antígenos somáticos “o” la formula antígena de esta Salmonella es de 9 – 12 al igual que la S. Gallinarum. Sin en embargo la fracción 12 esta subdividida en 122 y 123 y según la predominancia de estas fracciones tenemos los tipos variantes, estándar o intermedios. La S. Pullorum estándar posee dominancia en la fracción 123 mientras que en la variante domina la fracción 122 y en las intermedias ambas fracciones se encuentran sin dominancia todo esto basado en el esquema de Kauffmann White. (MACFADDIN J. , 2000) ANTIGENO “H” ANTIGENO “O” ANTIGENO “VI” 21 3.5.2 Salmonella Gallinarum Es un bacilo corto y grueso sin flagelos no forma esporas ni cápsulas, se tiñe con colorantes ordinarios es Gram negativo, puede aislarse fácilmente de la sangre e hígado. Es aerobio y anaerobio facultativo y su temperatura óptima para el crecimiento es los 37 grados centígrados. Posee antígenos O1,9 y 12 similar al grupo D de la clasificación de las Salmonelas. (SENASICA, 2008) Los signos incluyen mortalidad repentina o esporádica, apatía, diarrea verde o amarilla (acompañada de la adhesión de las plumas cercanas al ano), pérdida de apetito, incremento de sed y una apariencia pálida de la cresta y carúncula (INSPECCION DE SALUD ANIMALY VEGETAL DE USDA DE TEXAS, 2003). 3.5.3 Salmonella Pullorum Es un germen Gram negativo, no posee flagelos, aerobio y anaerobio facultativo, puede aislarse de la sangre, hígado y bazo de aves infectadas. Este germen produce colonias lisas, brillantes opalescentes y de bordes continuos en cultivos de Agar EMB. Su temperatura óptima para crecimiento es de 37 grados centígrados con un PH de 7. Los signos clínicos principalmente son la falta de apetito, una disminución en el peso, alta mortalidad y la presencia de diarrea denominada diarrea bacilar blanca. (BWD, por sus siglas en ingles.) (INSPECCION DE SALUD ANIMALY VEGETAL DE USDA DE TEXAS, 2003) Bioquímicamente una completa diferenciación de la S. Pullorum y S. Gallinarum puede darse por la descarboxilación de la ornitina, la cual es positiva para la S. Pullorum. (SENASICA, 2008) . 22 3.6 SALMONELOSIS Es una enfermedad de gran importancia económica, ya que produce grandes pérdidas por mortalidad, pérdida de peso y una disminución en la producción. Es producida por bacterias denominadas Salmonelas. Las cuales pertenecen a la familia de las enterobacteriaslas cuales son Gram negativas. Se han identificado más de 2300 serotipos. En las cuales se encuentran como únicas inmóviles las S. Gallinarum y S. Pullorum. Estas bacterias son sensibles a la a pasterización y se inactivan a 64°c por un minuto a excepción de la S. Gallinarum, es inactivada a 60°c por 10 minutos. (CALNEK B. , 2000) Algunos tipos de Salmonela son altamente específicos las especies como lo es el caso de S. Thyphy en donde el hombre es el único que se considera como hospedador de este serotipo. En el caso de S. Gallinarum y S. Pullorum, las aves y los pájaros son los mayores hospedadores para estos dos serotipos. (SHIVAPRASAD, 2000) Las enfermedades causadas por la S. Gallinarum y S. Pullorum son denominadas como tifosis aviar y pullorosis respectivamente. Se caracterizan por ser septicémicas y afectan principalmente a pollos y pavos refiriéndose a aves para consumo humano ya que como se menciono anteriormente puede darse en general en las aves. Los signos clínicos que más presentan estas enfermedades son anorexia, diarrea, deshidratación, decaimiento y elevada mortalidad. Las lesiones macroscópicas y microscópicas comprenden hepatitis, tiflitis, onfalitis, miocarditis, ventriculitis, neumonía, sinovitis, peritonitis y oftamilitis. Las aves maduras pueden presentar ooforitis, salpingitis, peritonitis y perihepatitis. Por otra parte a nivel reproductivo, la Salmonela produce infección transovaricamente el cual provoca contaminación en los huevos y continuamente a los pollitos, dando a conocer que esta enfermedad entre los mecanismos de transmisión como uno de los más importantes para el proceso productivo. (VELASQUEZ, 1999) 23 3.6.1 Resistencia A Antibióticos Durante varios años las cepas de Salmonela han desarrollado resistencia a varios antibióticos. Los cual dificulta su control. Por otra parte el manejo indebido de antibióticos ha generado que estas bacterias sean resistentes a los antibióticos. Según la Organización Mundial de la Salud OMS (1997) el uso indebido de antibióticos en la producción animal intensiva incide para que la resistencia bacteriana se haya incrementado a un ritmo alarmante y es factible para que continué aumentando a proporciones mayores si no se realiza un debido control de antibióticos o agentes antimicrobianos. En los años 90 se identifico una cepa S. Typhimurium la cual es resistente a un amplio rango de antibióticos en donde se encuentra la ampicilina, estreptomicina, tetraciclina dando origen a la nomenclatura S. Typhimurium R-type ACSSUT esta cepa se ha encontrado en muestras de trabajadores de granjas, algunos mamíferos, aves y mascotas domesticas. (OMS, 1997) la resistencia a los antibióticos por Salmonelas procedente de las aves y de los humanos muestra que todas las cepas presentaron una sensibilidad del 100% ante el antibiótico Imipenen, mientras que el mayor porcentaje de resistencia la presento el antibiótico sulfametasol – trimetoprim y el antibiótico Gentamicina. Por otra parte se observa que la resistencia de antibióticos se presenta más en las cepas obtenidas en humanos que de cepas aviares. (VELASQUEZ, 1999) 24 3.6.2 Transmisión en el Hombre La principal ruta de infección en el hombre es por la ingestión de alimentos y agua contaminada, en los alimentos principalmente de origen animal como carne de res, cerdo, aves, huevos y leche, sin dejar atrás las frutas y vegetales. (OMS, 1997) Esta contaminación en los alimentos se puede dar por la manipulación indebida de los procesos de producción, distribución y preparación. Además otros orígenes de infección por Salmonella Spp, es la transmisión de persona a persona y el contacto con animales o mascotas. 3.6.3 Programas De Control El control de salmonelosis es muy complejo, para esto se debe reducir el riesgo de contaminación en los procesos de producción, transporte y preparación partiendo de una excelente bioseguridad de los procesos en granjas como también en plantas de beneficio y vehículos que trasportan los alimentos. Además se debe evaluar constantemente los puntos críticos que son importante para la inocuidad de los alimentos de origen animal, que conlleven hacia una producción limpia de residuos que brindan confianza y seguridad a los consumidores. En último lugar se debe concientizar a los consumidores al buen manejo de los alimentos y de los animales dentro de los hogares y así evitar posibles contaminaciones que afecten la salud y bienestar de las personas. 3.6.4 Diagnóstico Actualmente existen diferentes métodos para diagnósticos diferentes que pueden realizarse para la identificación de Salmonella Spp. la mayoría de los estudios realizados, demuestran que el cultivo microbiológico es la prueba más comúnmente implementada para la identificación de la bacteria a partir de tejidos y excrementos. El método apropiado debe tener una alta sensibilidad y especificidad y ser al mismo 25 tiempo simple, rápido y económico. Actualmente no existe ningún método que cumpla con todos los criterios y ninguno es óptimo para todas las condiciones, dado que pueden presentarse alteraciones en los medios de cultivo y algunas pruebas bioquímicas; por lo tanto es aconsejable apoyarse también en los nuevos métodos de diagnóstico que están innovando para el aislamiento de Salmonella Spp. Mediante el uso de pruebas serológicas y moleculares como ELISA y PCR respectivamente; esta última tiene la capacidad de detectar un pequeño número de organismos del género Salmonella (102 a 104). Estos métodos arrojan resultados favorables y confiables en menos tiempo, pero tienen la desventaja de ser costosos. (TERRAGNO, CAFFER, & BRUNA, 2003) Ante la sospecha de salmonelosis, el material que debe remitirse al laboratorio debe ser variado. Se enviará en caso de infección intestinal, muestra de heces. En enfermedad sistémica, se recoge una muestra de sangre para realizar un cultivo estándar. (STANCHI, 2007) 3.7 MÉTODOS PARA EL AISLAMIENTO DE SALMONELLA SPP Según Luna (1991) clasifica los métodos para el aislamiento de la bacteria, en tres etapas sucesivas las cuales son: Enriquecimiento No Selectivo, Enriquecimiento Selectivo, Siembra en Placa con medios sólidos selectivos y diferenciales. Posteriormente se lleva a cabo el estudio de las características Bioquímicas de las colonias sospechosas en los medios adecuados para su identificación y finalmente el Análisis Antigénico. 3.7.1 Preenriquecimiento en medio no selectivo Se utiliza cuando la muestra en estudio ha sufrido un proceso de desecación o irradiación, cuando ha estado congelada por mucho tiempo o si el pH del medio es muy bajo, este tratamiento puede determinar que las bacterias presentes en la 26 muestra se encuentren en un estado semi latente y tiene como finalidad la revitalización de los microorganismos afectados por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de almacenamiento, permitiendo que las células bacterianas comiencen el proceso de multiplicación normal sin estar expuestas a sustancias inhibidoras o selectivas que puedan llegar a ser tóxicas para estas bacterias (debilitadas), sustancias que si están presentes en los medios selectivos de enriquecimiento. Se realiza en caldo peptonado bufferado al 0,1%, para incrementar la recuperación de especies de Salmonelas deterioradas por técnicas de elaboración, preservación, preservantes, presión osmótica alta, cambios bruscos de pH. (LUNA, 1991.) 3.7.2 Medios de enriquecimiento selectivo Se realiza en caldos de enriquecimiento, los cuales estimulan el crecimiento de formas compatibles con Salmonella Spp, e inhiben el desarrollo de bacterias intestinales y coliformes. Entre los caldos mayormente usados para el enriquecimiento selectivo de Salmonella Spp. Se encuentra el caldo Tetrationato el cual Es utilizadocomo un medio de enriquecimiento selectivo para especies de Salmonella Spp, Que pueden estar presentes en pequeñas cantidades y que compiten con otras bacterias de la flora intestinal. (LABORATORIOS MCD, 2008) Este medio que junto con el tiosulfato excedente, inhibe de igual forma coliformes y otras bacterias acompañantes, sin alterar las bacterias reductoras de Tetrationato como Salmonella Spp. y Proteus Spp. Adicionalmente, las sales biliares que contiene inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia obligatoria en el intestino. (PALUMBO, 1999) Mueller demostró la efectividad del Caldo Tetrationato para el enriquecimiento de bacilos tifoídico y paratifoídicos y la inhibición de coliformes. En una modificación del medio de Mueller, Kauffma incrementó el número de aislamientos positivos de 27 Salmonella Spp. La base de Caldo Tetrationato está especificada en los Métodos Estándar para las pruebas de Salmonella Spp. (LABORATORIOS MCD, 2008) 3.7.3 Medios de cultivo selectivos Son aquellos que permiten seleccionar ciertos microorganismos deteniendo el desarrollo de otros; esto se logra con el agregado de sustancias inhibidoras como antibióticos, ciertos colorantes y sales biliares. Entre la gran variedad de medios selectivos encontramos el Agar MaCconkey el cual permite detectar con rapidez los microorganismos no fermentadores de lactosa como Salmonella Spp y Shigella Spp el agente inhibidor de este medio son las sales biliares. (STANCHI, 2007) Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. (LABORATORIOS BRITANIA, 2009) 3.7.4 Medios de cultivo diferenciales Son aquellos que permiten diferenciar bioquímicamente las bacterias por su actividad metabólica. Poseen un sustrato, sobre el cual actúa o no la bacteria y esa actividad se revela por variación del pH del medio o por alguna actividad enzimática que modifica su aspecto. En el proceso de recuperación de Salmonella Spp los aislamientos sospechosos por ser No fermentadores de lactosa en el Medio Selectivo, son sembrados en medios diferenciales que permiten la observación de colonias 28 características y propias de la bacteria (STANCHI, 2007). Los medios más reconocidos para el aislamiento de Salmonella Spp. Son: 3.7.4.1 Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) El Agar XLD (por sus siglas Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es utilizado para el aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos, especialmente del género Shigella y Providencia. (LABORATORIOS MCD, 2009) El efecto inhibidor de este medio de cultivo es débil. El desoxicolato genera la inhibición de bacterias coliformes y permite la dispersión de cepas de Proteus que puede llegar a confundirse con las colonias producidas por Salmonela. Adicionalmente, la diferenciación entre Salmonella Spp. y Shigella Spp. Se da porque la primera produce fermentación de Xilosa, descarboxilación de Lisina y genera ácido sulfhídrico. (HURTADO, 2001.) Este medio presenta la ventaja de facilitar el crecimiento de gérmenes exigentes ya que otros medios contienen inhibidores excesivamente tóxicos. Las bacterias que descarboxilan la lisina, se reconocen por la presencia de un color rojo- purpúreo, debido al aumento del pH alrededor de sus colonias. (MURRAY & SHEA., 2004) Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o sucesivamente, lo que puede dar lugar a diversos matices de color del indicador de pH, ó a un viraje de amarillo a rojo en el transcurso de una incubación más prolongada. Las colonias de Salmonella Spp. Se observan con pigmentación rosa o roja, algunas veces transparentes con o sin centro negro o completamente negras. Las colonias sospechosas de Shigella Spp. son transparentes y del mismo color que el medio de cultivo. Este género bacteriano al no fermentar la xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo, el rojo fenol; como tampoco decarboxilan la lisina, no se produce color rojo púrpura alrededor de las colonias, al no haberse producido cadaverina. (MURRAY & SHEA., 2004) 29 3.7.4.2. Agar Bismuto Sulfito Es un medio diferencial y selectivo, usado para el aislamiento e identificación de Salmonela entérica Serovar Typhi y otras bacterias entéricas. El medio contiene peptona y tejidos animales, extracto de carne, glucosa, sulfato férrico y sulfito bismuto que actúa como inhibidor de la mayoría de organismos comensales. Las colonias típicas de Salmonella Spp. Pueden ser café, gris o negras con o sin brillo metálico, generalmente el medio circundante (halo) es café que posteriormente se torna negro; algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. (MURRAY & SHEA., 2004) 3.8 PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE SALMONELLA En la identificación bioquímica para diagnostico de Salmonella Spp. Se utilizan diferentes métodos los cuales son muy efectivos. Entre ellos se encuentran: 3.8.1 Prueba De Indol Esta prueba consiste en verificar si la bacteria a analizar es capaz de desdoblar el Indol de la molécula de triptófano ya que el Indol es una molécula resultado de la degradación del triptófano. Las bacterias contiene triptofanasa las cuales tienen la función de desdoblar e hidrolizar el triptófano produciendo acido pirúvico, amoniaco e Indol. La prueba consiste en la formación de un complejo rojo cuando el Indol reacciona con el grupo aldehído del Dimetilaminobenzaldehido. Por lo cual se utiliza reactivo de Kovacs para realizar este procedimiento. Para la identificación de Salmonella Spp con respecto a esta prueba no hay producción de Indol ya que estas bacterias no tienen la capacidad de producir Indol. (MACFADDIN J. , 2000) 30 3.8.2 Prueba de catalasa Esta prueba consiste en la identificación de la enzima catalasa en los microorganismos, las cuales desdoblan el peróxido de hidrogeno en oxigeno y agua. Generalmente todos los microorganismos poseen esta enzima. 2H2O2 2H2O+O2 Para la identificación en laboratorio se deposita una muestra del microorganismo a analizar en un portaobjetos y se agrega una gota de peróxido de hidrogeno. A los pocos segundos se observa la reacción de con la presencia de gran cantidad de burbujas por un determinado tiempo. (WHEELIS, STANIE, & INGRAHAM, 1996) 3.8.3 Prueba oxidasa La prueba de oxidasa consiste en la detección de la enzima oxidasa del indofenol, la cual se descubre por su reacción con dimetil o tetrametil p-fenilendiamina. Se utiliza como reactivó recién preparado al 1 por 100 de agua de α-naftol, para la prueba se manipula una muestra de la bacteria a analizar en un portaobjetos o en papel filtro empapado con el reactivo. La prueba es positiva si aparece una mancha de color purpura o negro. (CARPHIER, 1996) 3.8.4 Prueba De Movilidad Esta prueba consiste en determinar si un organismo es móvil o inmóvil. Se realiza en un medio de cultivo semisólido (SIM), al mismo también es evaluada la producción de indol y de ácido sulfhídrico que es producida por los microorganismos. La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos, aunque algunas formas de cocos son móviles. Las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la 31 distribución aleatoria de losmicroorganismos. Por el contrario las bacterias inmóviles permanecerán en la misma picadura donde se sembraron (MacFADDIN, 2000). La mayoría de las Salmonelas son móviles a excepción de S. pullorum y S. gallinarum, huéspedes específicas de aves, responsables además de las enfermedades Pulorosis y Tifoidea aviar respectivamente (HERRERA, INFANTE, LEÓN, & DE NOGUERA, 1991) . 3.9 SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN BBL CRYSTAL® El sistema de identificación BBL Crystal (ID) de bacterias entéricas no fermentadoras (E/NF) sirve para la identificación de bacterias aerobias Gram-negativas que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae así como también de los bacilos Gram- negativos fermentadores y no fermentadores de glucosa aislados con más frecuencia. El sistema BBL Crystal es un método miniaturizado de identificación. Muchos de los análisis utilizados son modificaciones de los métodos clásicos. Estos incluyen test para la fermentación, oxidación, degradación e hidrólisis de diversos sustratos. Además contienen sustratos unidos a un cromógeno para detectar las enzimas que utilizan los microbios para metabolizar los diferentes sustratos. El kit BBL Crystal E/NF ID está compuesto (I) las tapas de BBL Crystal E/NF, (II) las bases del BBL Crystal, (III) los tubos del fluido y (If) de inoculo para organismos entéricos/heces BBL Crystal ID. El panel contiene 30 sustratos deshidratados en las puntas de los dientes. La base tiene 30 pocillos de reacción. El inoculo del análisis está preparado con el fluido de inoculo y se utiliza para llenar los 30 pocillos de la base. Cuando se alinea la tapa con la base y se cierra en su lugar el inoculo del análisis rehidrata los sustratos secos e inicia las reacciones del análisis. Después de un periodo de incubación, se examinan los pocillos para observar cambios de color. Los cambios de color se producen como resultado de actividades metabólicas de los microorganismos. El patrón resultante de las 30 reacciones se 32 convierte en número de perfil de 10 dígitos que se utilizan como base para la identificación. Los patrones de la reacción bioquímica y enzimática de los 30 sustratos BBL Crystal E/NF con una amplia variedad de microorganismos son almacenados en la base de datos de BBL Crysta E/NF ID. (Anexo 3) La identificación se deriva de un análisis comparativo del patrón de redacción del aislado del análisis con aquellos que existen en la base de datos. (Figura 5) FIGURA 5. Prueba BBL Crystal ® 3.10. SEROTIPIFICACIÒN La serotipificación constituye un importante complemento de la identificación bioquímica y desde el punto de vista epidemiológico permite determinar la prevalencia de una serovariedad en distintas zonas geográficas, como así también es de utilidad para el estudio de brotes y para conocer la fuente de infección y las vías de transmisión. La base de la serotipificación para todas las enterobacterias es similar: se pone en evidencia la presencia de antígenos somática, flagelares y capsulares. En el caso de, las serovariedades surgen como consecuencia de una asociación particular de factores antigénicos somáticos O y flagelares H. (CAFERR & TERRAGNO, 2001) 33 La Salmonella Spp. Está serotipificada de acuerdo a sus antígenos somáticos de superficie (LPS, antígenos O), antígenos flagelares (proteínas, antígenos H) y antígeno capsular (Vi) (TERRAGNO & CAFFER, 2003). Los antígenos se identifican con anticuerpos monovalentes y polivalentes disponibles comercialmente, mediante pruebas de aglutinación en lámina. Para identificar los antígenos O, se hace una prueba con antisueros contra los grupos del O1 (A) al O67, luego se prueba el antisuero Vi para antígeno capsular, y por último se incluyen los antisueros contra los antígenos flagelares H (CUBILLOS, 2009). En el género existe un solo tipo capsular, el tipo Vi (de virulencia), aunque la mayoría de las Salmonelas no producen cápsula (CUBILLOS, 2009). La constitución antigénica de la fracción polisacarídica del lipopolisacarido (LPS) define en gran parte la especie; así mismo, la clase y el número de azúcares junto con los enlaces existentes entre los mismos, definen los determinantes antigénicos que contienen los antígenos O de un determinado aislamiento; dichos antígenos O, junto con los determinantes antigénicos existentes en la superficie de los flagelos (antígenos H), que poseen la mayoría de las Salmonelas, contribuyen, desde el punto de vista serológico, a definir como especie un determinado aislamiento. Este esquema de clasificación se le denomina de Kauffmann-White (CUBILLOS, 2009). 3.10.1 Esquema De Kauffmann White Sobre la base de los componentes antigénicos somáticos O y flagelares H se ha establecido lo que se denomina el Esquema de Kauffmann-White, que agrupa a todas las serovariedades conocidas (CAFERR & TERRAGNO, 2001). (Anexo 2). Esta comprende 3 columnas: 34 Primera columna: Indica el nombre de la serovariedad, si la misma pertenece a S. entérica sub especie. Entérica (I) ó las siglas S. II, S. IIIa, S. IIIb, S. IV, S. V, S. VI; indicando que la serovariedad considerada pertenece a la subespecie II ó III a, etc. Segunda columna: Antígenos somáticos (O). Los números indican el ó los factores del antígeno O y se escriben, separados por una coma. Las serovariedades son agrupadas en grupos somáticos, cada uno de ellos caracterizado por un factor O mayor. Así se determínalos grupos A, B, C, etc. Por ej. el grupo O:2 (A) está integrado por S. Paratyphi A (1,2,12:a:-) entre otras, el grupo O:4 (B) por S. Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); S. Agona (1,4,12:f,g,s:- ); S. Saintpaul (1,4,5,12:e,h:1,2), entre otras. El Esquema de Kauffmann-White presenta 67 grupos O, desde el grupo A hasta el Z y luego continúa con números, desde el O: 51 hasta el O: 67 Tercera y cuarta columna: Antígenos flagelares (H). Se indican los factores de las fases 1 y 2, del antígeno H, respectivamente. Para la fase 1 los factores se denominan con letras minúsculas, seguidas algunas veces por un número que figura como subíndice y para la fase 2 se emplean en general números arábigos, aunque también se utilizan letras minúsculas. Un signo (negativo) indica que la fase considerada está ausente y por lo tanto la serovariedad es monofásica. Los símbolos para los factores somáticos determinados por conversión fágica están subrayados (por ej. 1, 2,12) Los factores O o H entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes o ausentes sin relación con la conversión fágica. Por ej. Factor [5] del grupo O: 4 (B). Cuando los factores H están entre corchetes significa que ellos se encuentran excepcionalmente en cepas salvajes. (CAFERR & TERRAGNO, 2001) 35 4. MATERIALES Y METODOS 4.1 UBICACIÓN DEL PROYECTO El trabajo de investigación se desarrolló en una granja correspondiente a una empresa del sector avícola especializada en la producción, levante y engorde de pollo de la línea Ross 308. La cual se encuentra localizada en el municipio de San Francisco de Sales (Cundinamarca) con una altitud 1520 m.s.n.m. y una temperatura promedio de 20°C. En cuanto el análisis de muestras se realizó en el laboratorio de control de calidad de la Universidad de La Sallé, sede Norte, ubicado en la ciudad de Bogotá en donde se realizaron todos los procesos de aislamiento e identificación de Salmonella Spp. 4.2 UNIVERSO Y MUESTRA Para este estudio se manejo una granja de una empresa del sector avícola la cual cuenta con 4 lotes diferentes (83, 84, 85, 86) y una capacidad promedio de 36.000 aves de la línea Ross 308, cada lote con una población de 9000 aves, dividida equitativamente entre machos y hembras. Por cada lote se tomaron 20 hisopados cloacales al final de las semanas 1, 2, 3 de vida, para un total de 80 hisopados por semana. Cada hisopo correspondiente a 20 animalespara un total de 1600 animales por semana. En total se tomaron 240 hisopos cloacales equivalente a 4800 aves representando el 10% de la población total. Las aves para este muestreo fueron tomadas completamente al azar con el fin de que toda la población tuviera la posibilidad de ser escogidas. 36 4.3 CARACTERIZACIÓN DE LAS GRANJAS Las granjas visitadas en donde se realizó el muestreo cumplían con todas la normas de bioseguridad que estableció la resolución 3283 del instituto Colombiano Agropecuario (ICA), las cuales presentan: Cuenta con un cerco perimetral en buen estado que restringe el libre acceso de personas, vehículos y animales. Dispone de una zona limpia para desinfección de todo personal que ingrese a la granja y objetos ajenos que ingresen. La granja posee arco de desinfección para vehículos. Disponen de registros de todo personal o vehículos que ingresen o salgan de la granja. Manipulan registros indicando cada protocolo que recomienda el ICA para la desinfección de los galpones. Cuentan con registros para manejo de mortalidad de las aves. Disponen de Pediluvios en la entrada de cada galpón para lavado y desinfección de botas. La granja posee en cada galpón una bodega con respectivas estibas para el almacenamiento del concentrado. La granja presenta una bodega general para almacenar desinfectantes y drogas. Los galpones en general disponen de una excelente infraestructura. Los operarios portan una dotación adecuada para las labores que se realizan en la granja. 37 4.4. TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS PARA LA RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN 4.4.1 Método para la recolección de muestras de Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum Para la toma de muestras se implemento el manual de toma de muestras en las explotaciones avícolas, para diagnóstico de Salmonella Spp Procedimiento Operacional Estandarizado (POE). (VENEGAS, SANCHEZ, GOMEZ, & SANTOS, 2009) Se utilizaron hisopos cloacales estériles, (Figura 6.) los cuales después de ser utilizados en el muestreo de las aves, fueron inmediatamente a insertados en tubos con agua peptonada, que fueron rotulados e identificados previamente. (Figura 7) En seguida estos tubos fueron empacados en neveras de icopor y sellados con el fin de mantenerlos refrigerados e identificados cada uno con el respectivo lote. (Figura 8) FIGURA 6. Muestreo con hisopo cloacal 38 FIGURA 7. Tubos identificados para el muestreo FIGURA 8. Tubos muestreados e identificados 39 4.4.2 Aislamiento e identificación de Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum. Para el aislamiento e identificación las muestras fueron trasladadas al laboratorio de control de calidad de la Universidad de La Sallé en un tiempo aproximado de 2 horas, en donde se sometieron a incubación a una temperatura de 37°C por un tiempo de 12 horas. Pasadas las 12 horas se procedió a agitar los tubos y posteriormente a retirar los hisopos. Inmediatamente se tomo 1ml de cada tubo y se sembró en tubos que contenian, 9ml de caldo Tetrationato con solución yodo – yoduro. (Figura 9) estos fueron incubados a una temperatura de 37°C en un lapso de 12 a 24 horas. (Figura 10) FIGURA 9. Caldo Tetrationato 40 FIGURA 10. Siembra en caldo Tetrationato Transcurridas las 12 a 24 horas se realizó la toma de muestra de cada unos de los tubos anteriormente mencionados, con un asa estéril para posteriormente ser sembrados por la técnica de agotamiento en cajas de petri en el medio de cultivo XLD, los cuales se llevaron a incubadora por un lapso de 12 a 24 horas a una temperatura de 37°C. De estas cajas incubadas, se comenzó a dar lectura macroscópica a las muestras, con el fin de identificar las posibles colonias de Salmonella Spp. (Colonias trasparentes con centro negro, colonias totalmente negras y colonias de color rosa) Además descartar las cajas que no presentaron crecimiento de la bacteria. (Figura 11 y 12) 41 FIGURA 11. Muestras descartadas FIGURA 12. Colonias Salmonella Spp. A todo estos procedimientos se les realizo un seguimiento escrito con el fin de tener documentado todos los procesos y resultados. (Anexo 3) 42 De las colonias identificadas como posibles Salmonellas Spp. se tomaron muestras con asas redondas para posteriormente ser puestas en láminas portaobjetos para realizarse las pruebas de catalasa y oxidasa (Figura 13). Otras muestras para ser sembradas en medios de cultivo Sim, que fueron incubados a una temperatura de 37°C durante un tiempo de 12 horas. Con el fin de realizar respectivamente la prueba de Indol, producción H2S y movilidad las cuales son necesarias para la identificación bioquímica S. Gallinarum y S. Pullorum. (Figura 14). FIGURA 13. Prueba catalasa y oxidasa 43 FIGURA 14. Medio SIM Trascurrido el tiempo de incubación se efectuó la lectura a cada uno de los medios sembrados con el fin de comparar estos resultados, con resultados de la literatura consultada que muestran cómo deben ser para que sean confirmados como S. Gallinarum y S. Pullorum. (Tabla 3) (Figura 15) FIGURA 15. Muestras con Producción de H2S y movilidad +. 44 Realizadas esta pruebas bioquímicas necesarias para la identificación S. Gallinarum y S. Pullorum, Se sembraron las muestras en Agar tripticasa soya las cuales fueron incubadas a 37°C por un lapso de 12 a 24 horas. (Figura 16) FIGURA 16. Siembra en Agar triptiasa soya Pasadas las 24 horas, se realizó la identificación bioquímica con el kit de diagnóstico rápido para la identificación de microorganismos entéricos no fermentadores BBL Crystal ®. Realizando el montaje y la lectura como lo indica el fabricante. (Figura 17). FIGURA 17. Siembra en BBL Crystal. ® 45 Finalmente se analizaron los datos obtenidos de los procedimientos anteriormente mencionados para así poder determinar si era necesario realizar las pruebas de serotipificación en las muestras identificadas como Salmonella Spp y así identificar su serovariedad. (Figura 18) 46 Figura 18. Esquema proceso de identificación de Salmonella Spp. En laboratorio Toma de muestra SI Siembra en medio XLD Transporte laboratorio Incubación muestras 12 horas, 37°c Retiro incubadora y Retiro del hisopo Siembra en caldo Tetrationato 12 a 24 horas, 37°c Incubación tubos Retiro incubadora Incubación cajas Retiro incubadora Crecimiento bacteria No Siembra agar tripticasa soya Retiro incubadora Incubación cajas 12 a 24 horas, 37 12 a 24 horas, 37 Esterilización y Desecho muestras BBL Crystal E/NF Serotipificación Pruebas: Catalasa, oxidada, indol, movilidad yH2S. 47 4.5 DISEÑO EXPERIMENTAL Para la toma de muestras se hizo una selección completamente al azar hasta completar el número de aves totales por muestreo. El cual se le realizo a 4 lotes de pollo de engorde de la línea Ross 308, en donde se tomaron 20 muestras por lote. (Cada muestra corresponde a un grupo de 20 aves), durante 3 semanas para un total de muestras 240 correspondiente a ,4800 aves muestreadas. (4X20X3) Para el análisis de datos se utilizo estadística descriptiva, los cuales se representaron con tablas, gráficos circulares entre otros. 48 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los siguientes resultados surgen de la implementación del manual para toma de muestras de S. Gallinarum y S. Pullorum en pollo de engorde y de la evaluación de los datos obtenidos en el Laboratorio de control de calidad de la Universidad de la Salle, en donde se tuvoen cuenta como indicadores la presencia / ausencia de salmonella Spp, análisis de datos de las pruebas bioquímicas necesarias para la identificación de S. Gallinarum y S. Pullorum (catalasa, oxidasa, indol, producción de H2S, movilidad) y la presencia de salmonella Spp y de otras especies, por lotes y por semanas. El proceso de toma de muestras y análisis de laboratorio tuvo una duración de 2 meses. 4.1 Resultados presencia / ausencia de Salmonella Spp GRAFICA 1. Presencia / Ausencia de Salmonella Spp. PRESENCIA 80,42% AUSENCIA, 19,58% 49 De las 240 muestras analizadas en 193 muestras fueron aisladas e identificadas como colonias típicas de Salmonella Spp (con pigmentación rosa o roja, algunas veces transparentes con o sin centro negro o completamente negras), Que representan el 80,42 %. El restante equivalente 19,58 % (47 muestras) fueron identificadas como colonias no típicas para Salmonellas Spp (Colonias de color blanco, diferentes formas, con cambios en el aspecto del medio a color amarillo). De el número total de muestras aisladas como sospechosas para Salmonella Spp. la totalidad fueron identificadas por medio del kit de diagnostico rápido BBL Crystal para entéricos no fermentadores como Salmonella Spp con un nivel de confianza promedio de 0.9879. Estudios realizados por (RUANO, 1996), mostraron un aislamiento total de 30 cepas de Salmonella Spp. en pollitos de 8 días de nacidos en granjas avícolas, de muestras de materia fecal, saco vitelino, hígado y ciego. Lo cual evidencia la presencia de Salmonella Spp en pollos de engorde en granja, además de la poca información de aislamiento de Salmonela por medio de hisopados cloacales. 4.2 Resultado pruebas bioquímicas Tabla 4 Resultado pruebas bioquímicas Prueba Muestras positivas Muestras negativas S. Gallinarum y S. Pullorum Indol 0 193 - Catalasa 193 0 + Oxidasa 0 193 - Producción H2S 193 0 - Movilidad 193 0 - En cuanto a las 193 muestras identificadas como Salmonella Spp. (80.42 %), se analizaron los datos registrados en el formato de seguimiento de muestras necesarias para la identificación de S. Gallinarum y S. Pullorum mostrando que la totalidad de las muestras identificadas como Salmonella Spp no pertenecen a las serovariedades 50 Gallinarum y Pullorum si no a otras serovariedades imposibilitando así la realización de la serotipificación.(Anexo 3) Según investigaciones realizadas por (BERCHIERI & asociados, 1999) determinaron que la presencia de S. Gallinarum y S. Pullorum dependen de la susceptibilidad de la línea de las aves, para este caso la línea Ross 308 como lo mencionamos anteriormente es un animal que presenta una buena resistencia a enfermedades lo cual es una de las principales características de la línea. Por otra parte concluyeron que no es fácil identificar S. Gallinarum y S. Pullorum en ausencia de signos clínicos característicos de las enfermedades causadas por estas bacterias, en este caso las aves encontradas en la granja no presentaban ningún signo clínico producido por estas dos bacterias lo cual comprueba lo mencionado anteriormente. Por otra parte en un estudio realizado (CUBILLOS, 2009) la S. Gallinarum y S. Pullorum es una bacteria que no posee flagelos lo cual nos indica que es inmóvil. También estas serovariedades no producen H2S gracias que en su metabolismo no reduce el hierro presente en el medio. Por consiguiente no se realizo la prueba de serotipificación. 51 4.3 Presencia de Salmonella Spp y otras especies GRAFICA 2. Porcentaje de aislamiento de Salmonella Spp y otras especies De las colonias identificadas como colonias no típicas para Salmonella Spp (19.58 %), el 11,67% equivalente a 28 muestras, fueron identificadas como Proteus Spp, con un nivel de confianza promedio de 0.9678. El 5.83% correspondiente a 14 muestras fueron identificas como Enterobacter Cloacae, con un nivel confianza promedio 0.9870 y 2,08 % correspondiente a 5 muestras fueron identificadas como Klebsiella Spp con un nivel de confianza 0.9029. 80,42%, 11,67% 5,83% 2,08% Sallmonella Proteus sp Enterobacter cloacae Klebsiella sp 52 4.4 Resultado muestras por lote GRAFICA 3. Resultados muestras por lote. Con respecto a los lotes, en el lote 83 se identificaron 50 muestras en total como Salmonella Spp. 5 muestras como Proteus Spp, 2 muestras como Klebsiella Spp y 3 muestras como Enterobacter Cloacae. Para el lote 84 se identificaron 46 muestras en total como Salmonella Spp. 4 muestras como Proteus Spp, 1 muestras como Klebsiella Spp y muestras como 9 Enterobacter Cloacae. Para el lote 85 se identificaron 52 muestras en total como Salmonella Spp. 6 muestras como Proteus Spp, 1 muestra como Klebsiella Spp y 1 muestra como Enterobacter Cloacae. Finalmente para el lote 86 se identificaron muestras en total 45 como Salmonella Spp. 13 muestras como Proteus Spp, 1 muestra como Klebsiella Spp y 1 muestra como Enterobacter Cloacae. Lo cual demuestra que no hay diferencias significativas (P<0.05) en los lotes con respecto a la presencia de Salmonella Spp.(Anexo 4) 50 46 52 45 5 4 6 13 2 1 1 13 9 1 1 0 10 20 30 40 50 60 LOTE 83 LOTE 84 LOTE 85 LOTE 86 Salmonella spp. Proteus spp Klebsiella spp. Enterobacter cloacae. 53 4.5 Resultados semanales GRAFICA 4 Resultados muestras semanales Por otro lado correspondiente a las semanas muestreadas, en la semana 1 se identificaron 65 muestras como Salmonellas Spp. 9 muestras como Proteus Spp. 1 muestra como Klebsiella Spp y 5 como Enterobacter Cloacae. Para la segunda semana se identificaron 65 muestras como salmonellas Spp. 9 muestras como Proteus Spp. 2 muestra como Klebsiella Spp y 4 como Enterobacter Cloacae. Y finalmente para la tercera semana se identificaron 63 muestras como salmonellas Spp. 10 muestras como Proteus Spp. 2 muestra como Klebsiella Spp y 5 como Enterobacter Cloacae. Evidenciado que no hay diferencias significativas con respecto a la presencia de Salmonella Spp. (P<0.05) en las primeras semanas de vida. (Anexo 4) Además se comprueba que la edad de las aves no influye en el aumento o disminución de la prevalencia de S. Gallinarum y S. pullorum. (Grafica 4). En el trabajo realizado por (BERCHIERI & asociados, 1999) también concluyeron que la presencia de las enfermedades causadas por salmonelas no depende de la edad de las aves si no de la resistencia de la línea y de la cantidad de anticuerpos obtenidos horizontalmente. 65 65 63 9 9 10 1 2 2 5 4 5 0 10 20 30 40 50 60 70 SEMANA 1 SEMANA 2 SEMANA 3 Salmonella spp. Proteus spp Klebsiella spp Enterobacter cloacae. 54 6. CONCLUSIONES Las técnicas sugeridas por el manual para la toma de muestras de S. Gallinarum y S. Pullorum en granja permiten la correcta ejecución de muestreo en campo. Es difícil el aislamiento e identificación de S. Gallinarum y S. Pullorum por medio de hisopados cloacales en ausencia de signos clínicos característicos de las enfermedades causadas por estas bacterias. Con este estudio se comprueba la baja prevalencia de Salmonelosis aviar causadas por S. Gallinarum y S. Pullorum en pollos de engorde en la línea Ross 308. Este estudio es el primer reporte mediante el cual se trata de aislar la S. Gallinarum y S. Pullorum por medio de Hisopado cloacal en pollo de engorde de la línea Ross 308 en nuestro país. 55 7. RECOMENDACIÓNES Seguir implementando los manuales para la identificación de agentes patógenos que afecten la producción avícola y las demás producciones pecuarias, que conlleve a mejorar cada vez más las cadenas productivas. Identificar S. Gallinarum y S. Pullorum con Hisopado de arrastre de cama, Hisopado en diferentes partesdel galpón e Hisopados en los órganos de las aves con el fin de obtener más información sobre estas bacterias. Realizar periódicamente chequeos rutinarios en todas las granjas avícolas con el fin de controlar la trasmisión, diseminación y obtener información actualizada de estos agentes bacterianos. La empresa evaluada implementa un buen manejo de bioseguridad en sus granjas y en sus procesos que anteceden como son la reproducción del pollito, incubación y transporte las granjas respectivas. Sin embargo se debe mejorar cada día más lo programas de bioseguridad para prevenir no solamente la Salmonelosis si no otras enfermedades que también afecten a la empresas y también en la salud pública en general. Se debe concientizar cada vez a los productores (pequeños, mediano y grandes), que las medidas sanitarias que se toman en la granjas son para beneficios de ellos en la parte productiva y económica. Se debe tener claro que todos los procesos de bioseguridad que se realizan en las granjas no son para la erradicación de las diferentes enfermedades ya que es muy difícil eliminar todos los agentes patógenos que se encuentran en nuestro medio, Pero si para establecer un control y evitar trasmisiones que afecten a la población avícola y lo más importante que afecte la salud pública de los colombianos. 56 Efectuar investigaciones complementarias sobre los tipos de salmonellas aisladas en este trabajo 57 REFERENCIAS AVIAGEN CORPOREITED. (2007). www.aviagen.com. Retrieved 10 24, 2009, from Broiler objetivos de rendimiento: http://www.aviagen.com/docs/Objetivos%20de%20rendimi%20Chico.pdf AVIAGEN. (2009). Manual de Manejo Ross 308. BERCHIERI, & asociados. (1999). Disase information salmonellosis. general information frecuently esked questions. Atlanta. BIOLOGYCORNER. (2009). (www.biologycorner.com). Retrieved noviembre 5, 2009 CAFERR, M., & TERRAGNO, R. (2001). 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