Microscopio: História e Funcionamento

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Biología
pratica 1 
Profesora Responsable
Dra. Elcia Brito
2015
Microscopía
Conocer la herramienta básica de la biología, el microscopio.
Objetivo general
Objetivos específicos
Comprender la parte física del microscopio, es decir, como se forma la 
imagen.
Conocer los diferentes tipos de microscopios y sus aplicaciones 
Identificar una imagen sacada al microscopio y correlacionar al tipo de 
microscopio
Identificar partes de la célula a partir de fotos sacadas al microscópio 
El microscopio: 
Relaciones de tamaño
Histórico
Tipos de microscopio
M Óptico simples
M. Óptico compuesto 
MO de campo oscuro
MO de contraste de fases
MO de Microscopio Diferencial de 
Contraste de Interferencia
MO de Fluorescencia 
Microscopio electrónico
ME de transmisión y ME de Barrido
El poder resolutivo del ojo humano es de 0.2 mm (200 µm), o sea la menor distancia vista 
o resuelta por el ojo humano es de dos líneas separadas 1mm de distancia.
1. El microscopio: 
Relaciones de tamaño
Tamaño celular
Entonces, para se observar cosas menores que 200 µm se utilizan los microscopio
Si hay dos líneas a 200 µm de distancia, 
veremos una sola línea. 
Las células son las unidades básicas de los seres vivos. 
1. El microscopio: 
Histórico
No se sabe al cierto quien inventó el microscopio. Se creen que se pasó en 
Midelburg, en los Países Bajos, entre 1590 y 1610. Los nombres más citados son 
los de Hans y Zacharias Janssen.
Los usuarios más conocidos fueron van Leeuwenhoek and Hooke. 
Van Leeuwenhoek utilizaba lentes sencillas, pero de mucha mayor resolución que 
el microscopio utilizado por Hook.
1. El microscopio: 
Histórico 
Antoni van Leeuwenhoek , nasció y morió en Delft, 
Holanda (24 de octubre 1632 – 26 de agosto 1723) a la 
edad de casi 91 años.
Durante su vida fabricó más de 500 lentes, algunas de 
ellas de hasta 480 aumentos (potencia que excedía con 
mucho la de los primeros microscopios de lentes 
múltiples).
Construyó las telas lupas de mejor calidad que las que se 
podían conseguir ( con pulido de vidrio). Desarrolló 
pequeñas lentes biconvexas montadas sobre platinas de 
latón, que se sostenían muy cerca del ojo. A través de 
ellos podía observar objetos, que montaba sobre la 
cabeza de un alfiler.
Antoni van Leeuwenhoek, 
Fuente: Google, J. Verkolje, 1686, Project 
Gutenberg ebook of Den Waaragtigen 
Omloop des Bloeds
www.microscopy-uk.org.uk
1. El microscopio: 
Historico
Robert Hooke, nasció en Freshwater, 18 de julio de 1635 y murió en Londres, 3 de 
marzo de 1703, con apenas 68 años.
Fue uno de los científicos experimentales más importantes de la historia de la ciencia.
Sus intereses abarcaron campos tan dispares como la biología, la medicina, la
cronometría, la física planetaria, la microscopía, la náutica y la arquitectura.
En 1665 publicó el libro Micrographía, con relatos de 
observaciones microscópicas y telescópicas con 
detallados dibujos. Este libro contiene por primera vez la 
palabra célula.
Hooke descubrió las células observando en el microscopio
una laminilla de corcho, dándose cuenta que estaba
formada por pequeñas cavidades poliédricas que
recordaban a las celdillas de un panal. Por ello cada
cavidad se llamó célula.
1. El microscopio: 
Historico
En realidad Hook sólo vio las paredes celulares, ya que este tejido está muerto a la
madurez y las células ya no tienen contenido. Mas tarde, Hoock y algunos de sus
contemporáneos observaron células vivas.
El mejoramiento del microscopio solo se observó con la invención de las lentes
acromáticas, disponibles desde 1929.
La lente acromática es una lente en la que se 
ha corregido el fenómeno de la aberración 
cromática. 
Aberración cromática
Como el índice de refracción varía con la
longitud de onda, la distancia focal de una
lente también varía. Cada longitud de onda
forma una imagen de tamaño ligeramente
diferente.
1. El microscopio: 
Histórico
Mediante combinaciones de lentes convergentes y divergentes fabricadas con vidrios de 
distinta dispersión es posible minimizar la aberración cromática.
En general, en las lentes acromáticas se corrige la aberración cromática para dos o tres 
colores determinados.
Pero, fue Jan y Harmanus van Deyl los primeros a
hacer estas lentes tan chicas que para utilizar en las
objetivas de los microscopios, esto en 1870.
1. El microscopio: 
Histórico
La dispersión es la descomposición de 
la luz, la separación de la luz en las 
longitudes de onda que las componen. 
La luz blanca es una mezcla de 
diferentes colores
La dispersión de la luz
Cuando la luz pasa a través de materiales de
diferentes densidades, la velocidad de la luz
cambia ligeramente y esto causa una curva en el
rayo y en el interfaz entre los dos materiales.
La refracción de la luz
Los estudios de la física de la luz, contribuyó mucho para el desarrollo del microscopio
1. El microscopio: 
Historico
Las mejoras más importantes de la óptica de los microscopio surgieron a partir de los 
trabajos de Ernst Abbe (1877). Estas informaciones fueron utilizadas por Carl Zeiss Jena, 
que mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que 
permite obtener aumentos de 2000. 
Debido a estas mejorías la Alemana controla el comercio de la microscopia en el inicio del 
siglo XIX.
Mejorías del microscopio óptico padrón fueron ocurriendo desde entonces. 
Contraste de fase por Dutchman Zernike, en 1934
Contraste de interferencia por Nomarsky, en 1953
Microscopia de Fluorescencia en los años 70 (pero el principio fue 
elaborado en 1904 por Köhler) 
El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) fue desarrollada por Max Knoll y Ernst
Ruska en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio
electrónico de barrido (SEM).
Estos utilizan un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo
aumentos de 100.000 X.
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio simples 
Es aquel que solo utiliza una lenta de aumento
Ej. Una lupa Anton Van Leeuwenhoek
construyó microscopios
muy eficaces basados en
una sola lente pequeña y
convexa, montada sobre
una plancha
Lupa binocular estereoscópica
Ocular 10X y Objetivos de 2X y 4X en torreta giratoria. 
Aumentos de 20 y 40X 
Sólo sirve para exámenes superficiales (disección de animales, 
observación de colonias, detección de quistes de parásitos,…). 
Se consigue un número de aumentos entre 4 y 60.
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio Óptico
Traité Élémentaire de Physique por A.
Ganot. 9 ed. Publicado en 1884 por
Librairie Hachette et Cie. Par
La luz visible pasa a través de la muestra y de 
las lentes de vidrio por donde la luz es 
refractada e tal manera, que la imagen del 
espécimen es amplificada cuando se proyecta 
en el ojo.
Es un microscopio óptico que tiene más de 
un lente. 
Microscopio Óptico Compuesto
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
El objetivo está compuesto de varias lentes que crean 
una imagen real aumentada del objeto examinado. 
Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma 
que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. 
Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen 
virtual aumentada de la imagen real. 
El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el 
ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. 
El aumento total del microscopio depende de las 
longitudes focales de los dos sistemas de lentes.
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Está conformado por tres sistemas:
El sistema mecánico à una serie de piezas en las que van instaladas las lentes, que 
permiten el movimiento para el enfoque.
El sistema óptico à el conjunto de lentes.
El sistema de iluminación à las partes del microscopio que reflejan, transmiten y 
regulan la cantidad de luz.
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Brazo
Platina
Revolver
Macrométrico
Micrométrico
Condensador 
y 
diafragma
Lentes oculares
(10x y 12x) 
Objetivos
(4x, 10x, 40x y 100x)Fuente de iluminación
Base o pie
cámara oscura unida al brazo; tiene el
revolver con los objetivos en su parte inferior
y los oculares en el extremo superior.
Cabezal (tubo)
Plataforma horizontal sobre el 
que se coloca la preparación.
coge los objetivos
lámpara halógena
Situado en el interior del condensador, funciona como una 
iris cuya función es limitar el haz de rayos que atraviesa el 
sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados
Sistema de lentes que tiene la 
función de concentrar la luz 
generada por la fuente de 
iluminación hacia la preparación
Capta y amplia la imagen formada en el foco 
de la objetivas. En general los mas utilizados 
son los de 10X
Son colocados en la parte inferior del 
tubo en el revolver. Generan una 
imagen real, invertida y aumentada.
mueven la platina hacia 
arriba y hacia abajo, de 
forma rápida o lenta.
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio Óptico de Campo Oscuro
Se utiliza un fondo oscuro sobre el que se ven los objetos 
intensamente iluminados.
Se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, 
invisibles con iluminación normal.
Permite ver los microorganismos sin teñir, ver sus contornos y su movilidad
Utiliza una luz muy intensa en forma de un
cono hueco concentrado sobre el espécimen.
El campo de visión del objetivo se encuentra
en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge
la luz que se refleja en el objeto. Por ello las
porciones claras del espécimen aparecen como
un fondo oscuro y los objetos minúsculos que
se están analizando aparecen como una luz
brillante sobre el fondo.
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio Óptico de Campo Oscuro
(1) Un disco especial (Patch Stop) 
bloquea a luz creando un cono de luz 
formando un anillo de luz;
(2) Las lentes condensadores 
concentran la luz sobre la muestra; 
(3) La luz pasa por la muestra: la mayoría 
es directamente transmitida, pero 
algunos fotones son dispersados de la 
muestra;
(4) A luz dispersada entra en la objetiva; 
(la luz transmitida pasa directamente sin 
ser desviada, es bloqueada y no 
interacciona con la lente objetiva). 
Apenas la luz dispersada va producir la 
imagen, (la luz transmitida es perdida) 
Solo la luz dispersada 
es transmitida
luz dispersada 
por la muestra
Fuente de luz
Campo escuro
(Patch Stop)
muestra
Lente 
condensador
Lente objetiva
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio de Contraste de Fase
Se usa principalmente para aumentar 
el contraste entre las partes claras y 
oscuras de las células sin colorear. 
Es ideal para especímenes delgados, 
o células aisladas. 
El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como
en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo ,en el microscopio de fase el
cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, que
contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y
provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de
iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un
espécimen transparente, haciéndolo visible.
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio de Contraste de Fase
(a) Los orgánulos son casi invisibles en el 
microscopio de campo claro, pero tienen 
diferentes índices de refracción, 
(b) la luz es más desviadas en los objetos con 
un alto índice de refracción; 
Anillo condensador
Plan del objeto
Placa de fase
Plan de la imagen
Los dos rayos de luz son refractado de 
tal manera que en la salida del 
condensador salen como rayos 
paralelos, entran en contacto con la 
muestra, como rayos paralelos. 
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio Diferencial de Contraste de Interferencia (DIC)
Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la
célula estuviera proyectando sombras hacia un lado.
Se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases normal se
usa luz polarizada
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio Diferencial de Contraste de Interferencia (DIC)
La luz no polarizada entra en el microscopio
El pasa por un polarizador (Nomarski-modified Wollaston prism )
Los rayos son focalizados por el condensador para atravesar la muestra;
Ellos van interaccionar en puntos diferentes (adyacentes) de la muestra, que poseen
diferentes espesor, creando cambio de fases de un rayo en relación al otro.
Los rayos atraviesan una segunda lente objetiva convergente y un segundo prisma
Este combina los dos rayos creando una imagen de interferencia, con claros y obscuros.
Filtro polarizador 
(135º)
Remueve 
directamente la luz 
transmitida
Prisma Wollaston
recombina la luz 
polarizada que 
llega un una con 
una única 
polaridad
Lente 
objetiva
muestra
Lente 
condensador
Prisma Wollaston
separa la luz que 
llega en 
componentes de 
luz polarizados
Filtro polarizador (45º)
Prepara la luz para 
el primero prisma 
de Wollaston
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio de Fluorescencia
Consta de una fuente de luz muy potente y un filtro de excitación que sólo deja
pasar la radiación UV deseada. Ésta, tras interaccionar con la muestra, es de
nuevo filtrada, dejando pasar solamente la luz fluorescente hacia los oculares.
Una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente es aplicado al corte. 
Este es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas
luminosos, es decir , produce una fluorescencia.
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio de Fluorescencia
Componentes típicos:
la fuente de luz (lámpara de vapor de 
mercurio ), 
filtro de excitación, 
espejo dicroicos, 
filtro de emisión 
Los filtros y el espejo dicroico son 
organizados de modo a obtener un 
espectro de excitación, y formar la 
imagen. 
La muestra es iluminado con la luz de una determinada longitud de onda (la que es 
absorbida por el fluorocroros utilizado ), provocando la emisión de longitudes de onda 
más largas de luz (de un color diferente que absorbe la luz). 
Se utilizan filtros para separar la luz.
Filtro de 
excitación: 
delimita la 
banda de 
excitación, 
generalmente 
ultravioleta.
fluorescente por sí 
misma o marcada con 
fluorocromos 
Filtro de barrera: 
deja pasar sólo 
la fluorescencia.
Fuente de luz: va 
desde la luz UV 
hasta los IV
La imagen es invisible al ojo 
humano, hay que utilizar 
fotografías, fluorescencias o 
cualquier otra técnica de foto-
emisión.
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Utiliza electrones (longitud de onda muy chica) en lugar de fotones para formar imágenes.
Capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales 
Microscopio Electrónico
Hasta 500.000 aumentos comparados X 1000 de los MO
Funciona con un haz de electrones 
generados por un cañón electrónico, 
acelerados por un alto voltaje y 
focalizados por medio de “lentes 
magnéticas”, que forman una imagen 
sobre una placa fotográfica 
Los ME sólo se pueden ver en blanco y 
negro
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio Electrónico de Transmisión
detector.
muestra
inductor de 
enfoque 
(lentes 
magnéticas)
ánodo
cátodo
electrones
Emisor de electrones
carcasa 
inductor de 
enfoque 
(lentes 
magnéticas)
Un haz de electrones es dirigido hacia el objeto
que se desea aumentar. Una parte de los
electrones rebotan o son absorbidos por el
objeto y otros lo atraviesan formando una
imagen aumentada de la muestra.
Para utilizar un microscopio electrónico de
transmisión debe cortarse la muestra en capas
finas, no mayores de un par de miles de
angstroms.
1. El microscopio: 
Tipos de microscopio
Microscopio Electrónico de Barrido
En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de 
metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. 
Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la 
zona de muestra, siendo capaz de mostrar figurasen tres dimensiones.
50 nm
0.5µm
1µm
ADN
C.Golgi
Cel.vegetal cloroplasto0.2µm