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Aprendiendo Biologia

19/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA

Actividad Inmunomoduladora de TRANSFERON® (Extracto Dializado de
Leucocitos) en un modelo de infección herpética con el virus Herpes
Simplex Tipo 1.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO

PRESENTA
EDWIN ANGEL GONZÁLEZ AMAYA

MÉXICO, D.F. AÑO 2015

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE: Profesor: PATRICIA ELVIRA BERRON RUIZ
VOCAL: Profesor: ROCIO GABRIELA TIRADO MENDOZA
SECRETARIO: Profesor: NOHEMI SALINAS JAZMIN
1er. SUPLENTE: Profesor: MARIO ADAN MORENO EUTIMIO
2° SUPLENTE: Profesor: GIBRAN PEREZ MONTESINOS

SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA:
UNIDAD DE DESARROLLO E INVESTIGACION EN BIOPROCESOS

ASESOR DEL TEMA:
NOHEMI SALINAS JAZMIN _____________________________
SUSTENTANTE (S):
EDWIN ANGEL GONZALEZ AMAYA _____________________________
Índice General

Contenido.

Índice General........................................................................................................................ I
Índice de imágenes................................................................................................................ IV
Índice de tablas...................................................................................................................... V
Índice de figuras.................................................................................................................... VI
Abreviaturas........................................................................................................................... VII

1. Resumen
1.1. Resumen..................................................................................................................... 1

2. Marco teórico.
2.1. Infección viral……………………………………………………………………................ 2
2.2. Herpesviridae.............................................................................................................. 3
2.2.1. Estructura de virus Herpes Simplex tipo 1 (VHS-1)........................................ 4
2.2.2. Entrada viral..................................................................................................... 5
2.2.3. Replicación de VHS-1..................................................................................... 6
2.2.4. Latencia........................................................................................................... 8
2.2.5. Reactivación.................................................................................................... 8
2.3. Infección herpética..................................................................................................... 10
2.3.1. Epidemiología del VHS-1................................................................................ 11
2.4. Respuesta inmune contra VHS-1.............................................................................. 12
2.5. Reconocimiento viral................................................................................................. 15
2.5.1. Toll Like Receptors (TLR)............................................................................... 15
2.5.2. TLR extracelular activado por VHS-1…………................................................ 16
2.5.2.1. TLR2................................................................................................... 16
2.5.3. TLR intracelulares activados por VHS-1......................................................... 16
2.5.3.1. TLR3................................................................................................... 16
2.5.3.2. TLR7................................................................................................... 17
2.5.3.3. TLR9................................................................................................... 18
2.6. TRANSFERON® (Extracto Dializado de Leucocitos)……………………...…............ 20
2.6.1. Extracto Dializado de leucocitos (EDL) y aplicaciones.................................... 22
2.6.2. Extracto Dializado de leucocitos (EDL) y VHS-1……………………………….. 24
2.7. Modelo murino de infección herpética..................................................................... 25

Índice General

3. Justificación.
3.1. Justificación............................................................................................................... 27

4. Hipótesis.
4.1. Hipótesis..................................................................................................................... 28

5. Objetivos.
5.1. Objetivos generales................................................................................................... 29
5.2. Objetivos particulares................................................................................................ 29

6. Materiales y métodos.
6.1. Cultivo y obtención de células VERO (ATCC CCL-81)........................................... 30
6.2. Propagación viral (VHS-1 ATCC™ VR-1493)........................................................... 31
6.2.1. Cosecha viral................................................................................................... 31
6.2.2. Determinación del título viral........................................................................... 32
6.3. Ratones....................................................................................................................... 34
6.4. Inoculación viral......................................................................................................... 35
6.5. Esquema de infección, extracción de órganos y administración de
TRANSFERON®..................................................................................................................

36
6.5.1. Clasificación de los grupos.............................................................................. 36
6.5.2. Esquema de administración de TRANSFERON® y extracción de órganos.... 36
6.5.2.1. Obtención de órganos linfoides……................................................... 37
6.5.2.2. Obtención de células provenientes de ganglios inguinales y bazo…. 37
6.6. Anticuerpos................................................................................................................ 39
6.6.1. Titulación de anticuerpos................................................................................ 40
6.6.2. Diseño de paneles de anticuerpos.................................................................. 41
6.6.3. Tinciones celulares.......................................................................................... 43
6.6.3.1. Tinciones extracelulares..................................................................... 43
6.6.3.2. Tinciones intracelulares...................................................................... 43
6.7. Análisis citométrico................................................................................................... 44
6.7.1. Análisis citométrico de la combinación 1: linfocitos T (CD4+, CD8+) y células CD3-
/CD19+ (%y expresión de TLR3, TLR7 y TLR9................................................

44
6.7.2. Análisis citométrico de la combinación 2: Células NK 1.1 y células CD16+/32+ (%
y expresión de TLR3, TLR7 y TLR9).................................................

45
6.8. Análisis estadístico.................................................................................................... 46

Índice General

iii

7. Resultados.
7.1. Porcentaje de células CD19+/CD3- y CD19-/CD3+ de ganglios inguinales y bazo. 47
7.2. Porcentaje de células CD4+/CD8- y CD4-/CD8+ de ganglios inguinales y bazo…. 50
7.3. Porcentaje de células NK 1.1 y células CD16+/32+de ganglios inguinales ybazo 52
7.4. Expresión de TLR3 en células de Ganglios Inguinales…………………………….. 54
7.5. Expresión de TLR7 en células de Ganglios Inguinales.…………...……………….. 57
7.6. Expresión de TLR9 en células de Ganglios Inguinales……...………………..……. 61

8. Discusión.
8.1. Discusión de resultados.......................................................................................... 65

9. Observaciones
9.1. Observaciones finales............................................................................................... 70

10. Conclusiones.
10.1. Conclusiones……………………………………………………………..………………… 71

11. Referencias bibliográficas.
11.1. Bibliografía………………………………………………………………………………….. 72

Índice de Imágenes

Índice de imágenes.
Imagen 1. Componentes de Virus Herpes Simplex Tipo 1 (VHS-1)........... 4
Imagen 2. Cronología de infección celular por VHS-1................................ 7
Imagen 3. Proceso de establecimiento y reactivación viral....................... 9
Imagen 4. Lesiones provocadas por VHS-1................................................ 10
Imagen 5. Respuesta inmune a VHS-1......................................................... 14
Imagen 6. Rutas de señalizaciónTLR3, TLR7 y TLR9 activadas por
componentes de VHS-1……………………………………………………….....

19
Imagen 7. Curva de sobrevida de ratones infectados con VHS-1
tratados con el lote 12C04 de TRANSFERON® oral………………………....

21
Imagen 8. Regulación de citocinas al administrar TRANSFERON®……. 21
Imagen 9. Diseño de la placa de cultivo para determinar el título
viral……
33
Imagen 10. Planificación de administración con TRANSFERON® y
extracción de órganos...................................................................................

36
Imagen 11. Esquematización de diluciones seriadas................................. 40
Imagen 12. Espectros de emisión de los fluorocromos utilizados en la
combinación 1................................................................................................

41
Imagen 13. Espectros de emisión de los fluorocromos utilizados en la
combinación 2................................................................................................

42
Imagen 14. Estrategia de análisis citométrico de la combinación 1........ 44
Imagen 15. Estrategia de análisis citométrico de la combinación 2........ 45
Índice de Tablas

Índice de tablas.

Tabla 1. Grupos del ensayo........................................................................... 36

Tabla 2. Anticuerpos...................................................................................... 39

Tabla 3. Concentración final de anticuerpos............................................... 40

Índice de Figuras

Índice de figuras.
Figura 1. Porcentaje de células fenotipo CD3+/CD19+ de ganglios
inguinales y bazo…………………………………………………………............

49
Figura 2. Porcentaje de células fenotipo CD4+/CD8+ de ganglios
inguinales y bazo...........................................................................................

51
Figura 3. Porcentaje de células fenotipo NK1.1 y CD16+/32+ de ganglios
inguinales y bazo…...…………………………………………...........................

53
Figura 4. Expresión de TLR3 en células CD8+ de ganglios inguinales..... 55
Figura 5. Expresión de TLR3 en células NK1.1 de ganglios inguinales... 56
Figura 6. Expresión de TLR3 en células CD16+/32+ de ganglios
inguinales…………………………………………………………………………...

56
Figura 7. Expresión de TLR7 en células CD19+ de ganglios inguinales... 58
Figura 8. Expresión de TLR7 en células CD4+ de ganglios inguinales..... 59
Figura 9. Expresión de TLR7 en células NK1.1 de ganglios inguinales... 59
Figura 10. Expresión de TLR7 en células CD16+/32+ de ganglios
inguinales…………………………………………………………………………...

60
Figura 11. Expresión de TLR9 en células CD4+ de ganglios inguinales 62
Figura 12. Expresión de TLR9 en células CD8+ de ganglios inguinales... 63
Figura 13. Expresión de TLR9 en células NK1.1 de ganglios inguinales. 63
Figura 14. Expresión de TLR9 en células CD16+/32+ de ganglios
inguinales…………………………………………………………………………...

64
Abreviaturas

vii

Abreviaturas.
µL. Microlitos.
AC. Anticuerpo.
APC. Célula presentadora de antígeno (Antigen Presenting Cells).
BL. Buffer de lavado.
BT. Buffer de tinción.
BP. Buffer de permeabilizado.
cAMP. AMP cíclico.
cbp: Cuanto baste para
CD16+/32+. Células con fenotipo CD16+/32+ (células dendríticas, macrófagos,
granulocitos).
CD3-/CD19+. Linfocitos con fenotipo CD3-/CD19+ (linfocitos B).
CD3+/CD19-. Linfocitos con fenotipo CD3+/CD19- (linfocitos T).
CD4+. Subpoblación de linfocitos T CD4+.
CD8+. Subpoblación de linfocitos T CD8+.
CMV. Citomegalovirus.
CPE. Efecto citopático (Cytophatic Effect).
CTL´s. Linfocitos T citotóxicos (Cytotoxic T Lymphocytes).
Da. Daltones.
DC. Células dendríticas (Dendritic Cells).
DES. Diferencia estadísticamente significativa.
Abreviaturas

viii

dIMF. Delta de intensidad media de fluorescencia.
DNA. Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid).
DTH. Hipersensibilidad retardada (Delayed Time Hypersensivity).
E. Genes tempranos de la replicación de VHS-1.
EBV. Virus Epstein Barr.
EDL. Extracto dializado leucocitario.
EEM. Error estándar de la media.
EMEM. Medio mínimo esencial Eagle.
ENCB. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.
FEUM. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos.
FT. Factor de transferencia.
gB. Glicoproteína B del virus herpes simplex tipo1.
gC. Glicoproteína C del virus herpes simplex tipo1.
gD. Glicoproteína D del virus herpes simplex tipo1.
gG. Glicoproteína G del virus herpes simplex tipo1.
gH. Glicoproteína H del virus herpes simplex tipo1.
gI. Glicoproteína I del virus herpes simplex tipo1.
HCEC´s. Célula epitelial de córnea humana (Human Corneal Epithelial Cell).
HCF-1. Factor 1 de célula hospedera (Host Cell Factor-1).
HHV-6. Virus Herpes Humano Tipo 6 (Human Herpes Virus-6).
HHV-7. Virus Herpes Humano Tipo 7 (Human Herpes Virus-7).
Abreviaturas

HHV-8. Virus Herpes Humano Tipo 8 (Human Herpes Virus-8).
HSPG´s. Receptores de proteoglicanos de heparán sulfato (Heparan Sulfate
Proteoglycans Receptors).
HVEM. Receptores humanos mediadores de entrada viral (Human Viral
Entrance Mediators).
IE.Genes inmediatos tempranos (Immediate Early) de la replicación de VHS-
1.
Ig. Inmunoglobulina.
IL. Interleucina.
IMF. Intensidad media de fluorescencia.
INF. Infectado
INF+T. infectado con tratamiento (TRANSFERON®).
INF-1. Interferones tipo 1 (INF-α, INF-β)
INF-α. Interferón alfa.
INF-β. Interferón beta.
INF-γ. Interferón gamma.
iNOS. Óxido nítrico sintasa.
IPC. Células productores de interferón (Interferon Producer Cells).
IPN. Instituto Politécnico Nacional.
kbp. Kilo pares de bases.
kDa. Kilo Daltones.
L. Genes tardíos (lately) de la replicación de VHS-1.
Abreviaturas

LAT. Transcripto asociado a latencia.
LPS. Lipopolisacárido.
MHC1.Complejo principal de histocompatibilidad 1(Major Histocompatibility
Complex-1).
MHC2. Complejo principal de histocompatibilidad 2 (Major Histocompatibility
Complex-2).
mL. Mililitros.MOI. Multiplicidad de infección (Multiplicity of Infection).
mRNA. MicroRNA
MyD88. . Proteína de respuesta primaria de diferenciación mieloide 88
NF-ΚB. Factor nuclear potenciador de cadenas kappa de células B.
NK 1.1. Células Natural Killer 1.1.
nm. Nanómetro.
NO INF. No infectado.
NO INF+T. No infectado con tratamiento (TRANSFERON®).
NO. Óxido nitroso.
OCT-1. Octámero de transcripción 1.
p.i. postinfección.
PAMP´s. Patrones moleculares asociados a patógenos (Pathogen-
Associated Molecular Patterns).
PBS. Solución buffer de Fosfatos (Phosphate Buffer Solutions).
pDC´s. Células dendríticas plasmacitoides (Plasmacytoid Dendritic Cells).
Abreviaturas

PFT: Proyecto Factor de Transferencia.
PRR´s. Receptores de reconocimiento de patrones (Patterns-Recognition
Receptors).
RNA. Ácido ribonucleico (Ribonucleic Acid).
SD. Desviación estándar (Standard Desviation).
SFB. Suero fetal bovino
TAP 1/TAP 2. Transportador asociado a presentación de antígenos 1/2.
LTh1. Linfocitos T helper (auxiliar) 1 (Lymphocyte T Helper-1).
LTh2. Linfocitos T helper (auxiliar) 2 (Lymphocyte T Helper-2).
TIF-α. Factor de transactivación de interferones alfa.
TIR. Receptor Toll/IL-1 (Receptor IL Toll).
TLR. Receptor tipo Toll (Toll Like Receptor).
TNF-α. Factor de necrosis tumoral alfa (Tumoral Necrosis Factor-alpha).
TNF-β. Factor de necrosis tumoral beta (Tumoral Necrosis Factor-betha).
TRIF. Factor transcripcional liberador de Interferones (Transcriptional
Release Interferon Factor).
UDIBI. Unidad de Desarrollo e Investigación en Bioprocesos.
VHS-1. Virus Herpes Simplex Tipo 1.
VHS-2. Virus Herpes Simplex Tipo 2.
VP. Proteínas Virales.
VZV. Virus Varicela Zoster.
Resumen

1.1. Resumen
Los extractos dializados de leucocitos (EDL) son mezclas peptídicas menores a 10KDa que se
obtienen a partir de la disrupción de leucocitos de donadores sanos. Se les atribuye la
capacidad de modular la respuesta inmune contra enfermedades bacterianas, parasíticas,
virales, fúngicas y autoinmunes.
Investigaciones previas han reportado que los EDL modifican porcentajes celulares y
expresión de citocinas en sangre en infecciones con VHS-1. Generalmente VHS-1 es
autolimitante, sin embargo en personas inmunocomprometidas el virus puede causar severos
daños epiteliales y neuronales. Para el reconocimiento de VHS-1 participan componentes
celulares y humorales de la respuesta inmune que tratan de eliminar o limitar la acción del
virus.
TRANSFERON® es un EDL producido bajo buenas prácticas de fabricación en las
instalaciones de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, ha mostrado clínicamente ser un
excelente agente terapéutico contra la infección provocada por el VHS-1 ya que disminuye la
potencia, el tiempo y la periodicidad de la infección con este virus.
Por esta razón el siguiente trabajo se enfocó en evaluar el posible efecto protector que ejerce
TRANSFERON® en un modelo murino de Virus Herpes Simplex Tipo 1 (VHS-1) cutáneo, al
medir porcentajes y expresión de TLR3, TLR7 y TLR9 en células del sistema inmune innato y
adaptativo de ganglios inguinales. Con los datos obtenidos experimentalmente pudimos
detectar un cambio en los porcentajes de células CD19+ (20%-40%), CD3+ (80%-50%) y NK
1.1 (2%-3%) de ganglios inguinales debido a la infección con VHS-1 más no al tratamiento
con TRANSFERON®. Por otro lado se observaron variaciones en el patrón de expresión de
los TLR al analizar células de ganglios inguinales obtenidas de ratones infectados o no
infectados que recibieron o no tratamiento con TRANSFERON® que correlacionan y
posiblemente contribuyan con la sobrevida de estos ratones infectados con VHS-1.
Marco Teórico

2.1. Infección Viral.
Durante toda la vida, el ser humano está en contacto diariamente con diversos
microorganismos que conviven con él de manera sinérgica, simbiótica o
parasítica. De estas, la última forma de vida generalmente es la causante de
diferentes patologías dependiendo de su origen (bacteriano, viral, parasítico o
fúngico) de dicho microorganismo.
Las patologías virales actualmente representan un gran reto en la salud pública,
ya que la aparición de nuevos virus con cambios en sus patrones epidemiológicos
y la resistencia a fármacos, son nuevos campos de estudio para la ciencia.
Los virus son pequeños segmentos de ácidos nucleícos encerrados dentro de
una envoltura de proteínas y/o lipoproteínas que tienen la habilidad de penetrar
las células del hospedero y utilizar la maquinaria celular para replicarse. El más
simple de ellos consta de pocos genes que codifican para una polimerasa e
importantes proteínas que componen a un virión, mientras que los virus más
complejos contienen cientos de genes que codifican para numerosas proteínas
estructurales, proteínas que alteran el metabolismo celular a favor de la
replicación viral (o hacer capaz al virus para persistir en un estado latente) y
proteínas que modifican la respuesta inmune del hospedero para favorecer la
transmisión del virus.
Las infecciones virales, ya sean agudas o persistentes, activan la respuesta
inmune del hospedero infectado. La respuesta depende de diferentes variables
como el tipo del virus, dosis infectiva, sitio de infección, ruta, transmisión,
respaldo genético del infectado y la capacidad del sistema inmune del hospedero
para responder. En infecciones virales, el sistema inmune del hospedero es el
principal actor y la respuesta inmune innata es la primera línea de defensa que
previene una invasión, esparcimiento o replicación temprana del virus, antes de
que actúe una protección más específica por parte del sistema inmune
adaptativo.
Marco Teórico

2.2. Herpesviridae.
La familia Herpesviridae comprende virus estructuralmente parecidos y se
subdividen en tres subfamilias dependiendo de sus actividades biológicas:
 Alphaherpesviridae: Incluye a herpes simplex tipo 1 (VHS-1), herpes
simplex tipo 2 (VHS-2) y varicela-zoster (VZV). Estos virus lisan las células
infectadas y establecen infecciones latentes en ganglios neuronales
sensoriales1, 2.
 Betaherpesviridae: Comprende a citomegalovirus (CMV), virus herpes
humano tipo 6 (HHV-6) y virus herpes humano tipo 7 (HHV-7), infectan y
permanecen en tejidos linfoides, glándulas salivales y riñones, 2.
 Gammaherpesviridae: Comprende al virus Epstein Barr (EBV) y el virus
herpes humano tipo 8 (HHV-8). Se replica en células linfoides y puede
producir infecciones líticas en células epiteliales. Establecen latencia en
células linfoides1, 2.
 Los herpesvirus tienen una estructura similar, miden de entre 150 y 200nm,
con simetría icosaédrica, DNA de doble cadena lineal, cápside de 162
capsómeros y una envoltura glicoproteínica. Entre la cápside y la envoltura
tiene una doble capa proteica y enzimas virales necesarias para efectuar
una reactivación. Antigénicamente le funciona como un disfraz utilizando
material propio de la célula huésped 1, 2.

Marco Teórico

2.2.1 Estructura de VHS-1.
VHS-1 es un virus envuelto con un diámetro entre 180 y 200nm; estructuralmente
los herpes virus están formados de afuera hacia adentro por 4 principales
elementos: una envoltura de glicoproteínas, el tegumento, la nucleocápside y el
material genético3.
Los alfa-herpesvirus son de un núcleo denso de electrones con una doble cadena
lineal de DNA (dsDNA) cuya longitud varía de 120 a 230 kbp, que codifican para
aproximadamente 84 genes4 encerradas dentro de una cápside icosaédrica
constituida de 162 capsómeros de composición proteica la cual está compuesta
básicamente por4 proteínas virales: VP5 (UL19), VP26 (UL35), VP23 (UL18) y
VP19 (UL38)5.
La cápside está rodeada por una capa de proteínas conocida como tegumento,
conformado por 23 proteínas, una de ellas, VP16 conocido también como factor
inductor de trans-activación α (TIF-α) codificada por UL4, importante en la
replicación y reactivación viral6. Otras proteínas virales importantes que se
encuentran en el tegumento son VP22 (UL49) que tiene la habilidad de
diseminarse de célula a célula y una proteína VP1-2 (UL36) cuyo papel es
importante en la liberación del DNA viral en el poro nuclear celular durante la
entrada del virus.
Posterior el tegumento se encuentra la envoltura viral, la cual contiene once
glucoproteínas virales; siendo las más importantes: gB (VP7y VP8.5 codificadas
por el gen UL27), gC (VP8; UL44) y gD (VP17, VP18; UL6), que reconocen e
interactúan con el receptor celular del hospedero, y gG (UL4) que diferencia a
VHS1 de VHS-2 1,7, 6.

Imagen 1. Componentes de Virus Herpes Simplex Tipo 1 (VHS-1).
Marco Teórico

2.2.2. Entrada Viral.
La entrada de VHS-1 al cuerpo humano es a través de heridas en la piel por
inoculación en mucosa donde se lleva a cabo la replicación en células epiteliales
La entrada de VHS-1 se da en dos etapas; en la primera existe una interacción de
la envoltura con la membrana plasmática. Esta etapa es dependiente de la
interacción de proteínas víricas con receptores específicos en la superficie celular
lo que lleva a la endocitosis del virus y posteriormente a la segunda etapa que es
la fusión de la envoltura viral con la membrana de la vesícula endocítica5.
La primera etapa consta de una interacción reversible de la envoltura viral con la
membrana celular, donde existe la unión de las proteínas viriónicas gB y gC con
receptores de proteoglicanos de heparán sulfato (HSPG´s) de la superficie
celular5. Después de la unión en la superficie celular, el virus entra a través de una
fusión con la membrana plasmática. La fusión es mediada por la glucoproteína D
(gD) la cual interactúa con los receptores celulares que median la entrada del virus
(HVEM), induciendo así cambios conformacionales en gD8. Estos cambios causan
la formación de complejos de fusión multiproteínicos (gD, gB, gH y gL), capaces
de usar múltiples receptores encontrados en diversos tipos celulares para iniciar la
fusión.
El receptor HVEM es una molécula perteneciente a la familia de receptores de
TNF, llamado también Nectin-1 del grupo de la superfamilia de las
inmunoglobulinas; es una forma modificada de receptores heparán sulfato (3-OS
HS) el cual es altamente expresado en células inmunes, células epiteliales y
neuronas tanto de animales como de humanos, sin embargo, este receptor
modificado de heparán sulfato (Nectin-1) sólo media la entrada de VHS-1 y no de
VHS-2 en las células antes mencionadas9.

Marco Teórico

2.2.3. Replicación de VHS-1.
Principalmente las proteínas del tegumento son las encargadas del proceso de la
replicación en células, además de funciones como la evasión del sistema inmune y
la promoción de la transcripción de genes virales. La proteína del tegumento VP16
asociado a factor 1 de la célula hospedera (HCF-1) se unen con el octámero
transcripción 1 (OCT-1) para formar un complejo factor transcripcional, el cual
promueve fuertemente la transcripción de genes virales inmediatos tempranos (IE)
o también conocidos como genes α, encargados de primera instancia de la
transactivación y evasión del sistema inmune. Los productos génicos α sirven para
activar la transcripción de genes tempranos (E) o genes β que codifican proteínas
necesarias para la replicación de DNA viral. Enseguida de una replicación del
genoma viral, los genes β que se replicaron en esta etapa, son esenciales para la
replicación los genes γ o tardíos (L) que codifican elementos estructurales del
virión 3,10.
Las proteínas del tegumento (VP16) asociadas con los factores de transcripción
celular, promueven la transcripción de cinco IE mRNA codificando en células
infectadas, las proteínas 0 (ICP0), ICP4, ICP22, ICP27, ICP47. Las cuatro
proteínas ICP0, 4, 22, 27 son reguladores transcripcionales y traduccionales de
genes tempranos (E) y genes tardíos (L), mientras que ICP47 interfiere con el
transporte asociado a la presentación de antígenos (TAP1/TAP2) y por lo tanto
altera la presentación de antígenos a través de las moléculas codificadas por el
gen del complejo principal de histocompatibilidad tipo 1 (MHC1)11.
La acumulación de ICP4 e ICP27 inician la expresión de genes tempranos (E), los
cuales primeramente codifican en proteínas involucradas en la replicación de DNA
viral. Finalmente, los genes L se producen después de la replicación de DNA viral
y conllevan a la producción de proteínas estructurales (proteínas de tegumento y
proteínas de la cápside); subsecuentemente estas proteínas (tegumento y
cápside) se asocian para la formación de viriones que una vez incorporados
dentro de vesículas son liberados por exocitosis. Alternativamente el virus puede
ser liberado por lisis celular o por la formación de sincitios12.
Marco Teórico

Imagen 2.Cronología de infección celular por el virus Herpes Simplex Tipo 1 (VHS-1) .Interacción de proteínas virales
gB y gC con receptores HSPG´s de membrana celular, (2) Liberación las proteínas de la cápside y el tegumento en el
citosol. (3) La cápside es transportada gracias a la maquinaria del citoesqueleto celular al núcleo a través de un poro y
libera el DNA viral. (4)VP16 se localiza en el núcleo. (5) El DNA viral es transcrito por la RNA polimerasa II del hospedero
para obtener los primeros genes α estimulados por la proteína del tegumento VP16. Cinco de seis proteínas alfa funcionan
como reguladores de la expresión génica viral en el núcleo. (6) Las proteínas alfa transactivan los genes beta. Las
proteínas beta están implicadas en la replicación del DNA viral. (7) DNA viral estimula la expresión de genes gamma. Las
proteínas gamma están encargadas en el ensamblaje en el núcleo de los componentes virales y las modificaciones en la
membrana celular para la formación del virión. (8) El DNA viral es encapsilado. (9) La cápside que contiene al DNA brota
desde el interior celular para formar un virión nuevo envuelto.

Marco Teórico

2.2.4. Latencia.
VHS-1 es un virus que tiene la capacidad de permanecer en un estado latente (no
replicativo) dentro de la neurona. Durante la latencia, la transcripción del genoma
de VHS-1 está principalmente representado por un único RNA: el transcripto
asociado a latencia (LAT). El LAT es inusual, ya que es un transcripto de
aproximadamente 6.3kDa altamente inestable y se encuentra dentro de las células
sensoriales infectadas13. El LAT tiene diversas funciones, una de ellas es la de
inhibir rutas extrínsecas e intrínsecas de apoptosis celular y con ello favorecer una
posterior reactivación viral14, 16.
Existe un balance para mantener al virus en un estado latente. Las contribuciones
para que se de este balance dependen del ambiente neuronal, el LAT y las
células CD8+ que rodean a las neuronas15. Durante la latencia el LAT es el
transcripto predominante producido a partir del genoma viral, sin embargo, sigue
existiendo un nivel bajo de genes líticos necesarios para promover la producción
de VP16 y genes γ útiles para la reactivación viral10.
2.2.5. Reactivación.
En la Imagen 3 se muestra la morfología polarizada de las neuronas, la cual
contribuye al establecimiento y control de la latenciade VHS-1. Durante la
infección inicial VHS-1 entra al sistema nervioso central vía axones terminales o
neuronas periféricas que inervan la mucosa o placas epiteliales; las cápsides se
someten a un transporte axonal retrogrado al soma neuronal donde el genoma
(círculos verdes) es liberado dentro del núcleo. Las proteínas del tegumento VP16
(triángulos azules) se disocian casi inmediatamente después de la liberación del
virus dentro del citoplasma y se translocan hacia el núcleo con muy baja eficiencia
debido a la presencia de factor transcripcional del hospedero HCF-1(puntos
negros) en el citoplasma de ambos axones y cuerpo celular. VP16 es necesaria
para una productiva replicación en neurona y por lo tanto la ausencia de VP16
facilita el establecimiento de la latencia. La reactivación de los estímulos puede
provocar cambios en las neuronas, incluyendo acumulación nuclear de HCF-1 y
VP16, las cuales se sintetizan de novo junto con otras proteínas virales
Marco Teórico

regulatorias. La estimulación de los transcriptos virales líticos por VP16, lleva a la
amplificación de DNA viral y a la síntesis de proteínas viriónicas. La cápside y los
viriones se transportan de manera anterógrada a la terminación axonal, donde
maduran y son liberados de nuevo en células epiteliales, con lo que el ciclo vuelve
a comenzar17.
Imagen 3. Proceso de establecimiento y reactivación viral. A) Establecimiento: infección en terminales neuronales y
transporte retrogrado al soma de la neurona B) Acumulación de VP-16 y HCF-1 para la promoción de genes α. Transporte
anterógrado hacia la zona que inerva la neurona y consecuente producción de nuevos viriones.

Marco Teórico

2.3. Infección herpética.
La enfermedad causada por VHS-1 o VHS-2 tiene características únicas,
representada por una inflamación cutánea con tonalidad rojiza y purulenta mejor
conocida como lesión herpética. VHS-1 y VHS-2 son virus que una vez inoculados
en células epiteliales comienzan una temprana etapa infecciosa y productiva de
viriones. Los virus tienen la habilidad de transportarse retrógradamente al soma de
las neuronas por medio de los axones y permanecer en un estado no replicante
(latente) e inducir recurrentes infecciones productivas, gracias a la reactivación
del virus cuando éste se transporta del soma neuronal hacia el sitio epitelial que
inerva (transporte anterógrado)17,23.
Las manifestaciones clínicas más recurrentes son principalmente lesivas,
provocando herpes orofacial y herpes genital, asociado a VHS-1 y VHS-2
respectivamente. En muchas ocasiones estas infecciones son asintomáticas,
siendo esta la forma más común de la propagación viral 18, 19.
La repetitividad de las manifestaciones se debe a factores ambientales,
emocionales o físicos a los que el infectado está expuesto. Se ha observado que
la frecuencia de la infección es directamente proporcional a la severidad y
duración de la primo infección con este virus. Un grupo con mayor riesgo de
infección, son pacientes inmunocomprometidos quienes desarrollan severas y
frecuentes infecciones herpéticas20, 21.

Imagen 4. Lesiones provocadas por VHS-1.A. Gingivoestomatitis herpética. B. Herpes labial C. Panadizo
herpético D. Herpes Simplex 1 de localización genital. Infectious skin diseases II: viral and parasitic infections.
Hospital Clínico Universidad de Chile 2007.
Marco Teórico

2.3.1. Epidemiología del virus herpes simple tipo 1 (VHS-1).
VHS-1 es un virus patogénico humano que tiene una seroprevalencia del 80% al
90% en la población mundial adulta que sufre alguna inmunodeficiencia y en el
65% de la población adulta de los Estados Unidos22.
Aunque las enfermedades clínicas causadas por VHS-1 generalmente son leves y
autolimitantes (gingivoestomatitis, herpes labial, herpes genital, etc.), el virus
(VHS-1) tiene el potencial para causar en pacientes inmunocomprometidos
encefalitis letal, queratoestomatitis grave y en mujeres embarazadas el virus
puede diseminarse hacia los neonatos, causando severas patologías que no son
compatibles con la vida del recién nacido23.
La infección primaria ocurre en las mucosas y en células epiteliales después de
que el hospedero es infectado con secreciones de un portador del virus,
resultando generalmente y de principio, en una infección lítica donde más del 80%
de los genes virales están expresándose secuencialmente en una cascada
temprana temporal.
La infección primaria con VHS-1 ocurre usualmente en edades tempranas de la
vida y a menudo son asintomáticas (90%) 23. A su vez, durante la infección
primaria el virus se establece en una latente infección en neuronas sensoriales,
que sirven como fuente viral para una recurrente manifestación.
Los humanos son los únicos hospederos naturales de VHS-1, aunque algunas
líneas celulares pueden ayudar a la replicación en cultivo de este virus, la latencia
no se ha podido establecer in vitro en sistemas de cultivos celulares actualmente
disponibles. Varios modelos animales pueden ser infectados con VHS-1 por vía
ocular y cutánea que recapitulan completamente en todos los sentidos una
verdadera infección latente parecida y particular vista en humanos ya que pueden
asemejar el ambiente de la infección y replicación viral de VHS-1 en humanos24.

Marco Teórico

2.4. Respuesta inmune contra VHS-1.
El sistema inmunológico ha evolucionado para proteger a los organismos
multicelulares de diversos patógenos; la respuesta generalmente actúa de
manera inmediata, es adaptable y de memoria, produciendo una gran variedad
de células y factores humorales de protección que son capaces de reconocer y
eliminar de manera específica componentes ajenos al cuerpo.
La respuesta inmunológica se compone de dos sistemas bien definidos: el sistema
inmune innato y el sistema inmune adaptativo, este segundo característico de
vertebrados. La meta del primero de ellos es la inmediata eliminación o limitación
del esparcimiento del patógeno, el segundo tiene como responsabilidad eliminar
totalmente y recordar al patógeno invasor. La inducción de una respuesta de
memoria es debido a una serie de exposiciones patogénicas, con las cuales la
respuesta es más rápida e intensa en caso de un ataque posterior. La adaptación
de las dos tipos de respuestas inmunes es muy importante, puesto que funcionan
en un sistema altamente cooperativo para producir una respuesta más eficaz de lo
que haría una por si sola25.
Los primeros obstáculos con los que se encuentra un patógeno en el ser humano
son barreras físicas (piel, mucosas, vellosidades) que protegen al hospedero. En
estas barreras físicas existen componentes químicos como ácidos, iones,
lisosimas y otras enzimas que también tratan de eliminar al microorganismo que
pueda causar una enfermedad25.
La replicación del virus VHS-1 en células epiteliales periféricas produce la
liberación de interferones tipo 1 que activaran células de la respuesta inmune
innata como: macrófagos, células dendríticas, células NK, linfocitos TCD8+
citotóxicos (CTL CD8+) y granulocitos, además de promover la expresión de MHCI
y MHC2 en células infectadas26. Los macrófagos secretaran interferones tipo 1,
citocinas proinflamatorias (IL-6, TNF-α, RANTES) y óxido nítrico que reclutarán y
activarán aún más células al sitio de la infección10.
Marco Teórico

El INF-γ de inicio puede controlar la infección por VHS-1 activando células de la
inmunidad innata(células NK) que inducen la apoptósis en células infectadas con
VHS-1. Existe evidencia que las células T, células NK y posiblemente las
neuronas, produzcan INF-γ y TNF-α en respuesta a la infección a VHS-1 en el
Sistema Nervioso; el cual promueve la proliferación de células CD4+ Th2, ya que
son estas células las indicadas para la interacción con células B y así ejercer un
impacto en la respuesta inmune específica para la producción de anticuerpos
contra VHS-126.
Los interferones tipo 1 liberados por células epiteliales infectadas y por
macrófagos, inducirán un estado antiviral en células epiteliales no infectadas,
haciendo difícil para el virus su replicación en estas. También por la existencia de
interferones tipo 1, habrá reclutamiento de neutrófilos que inducirán apoptosis en
células infectadas y producirán TNF-α. Células NK liberarán interferón γ (INF-γ),
granzimas y perforinas que inducirán apoptosis en células epiteliales infectadas
con el virus VHS-127.
A su vez las células NK activaran células dendríticas en el sitio de la infección al
liberar INF-γ, las células dendríticas maduras, por un lado liberarán más
interferones tipo 1 y por otro lado viajaran a través de los conductos linfáticos
hacia los nódulos donde presentarán péptidos virales a células T y B naive para su
activación 10, 28.
En el sitio de la infección el principal rol de células B, en la respuesta inmune
contra VHS-1 no es producir anticuerpos neutralizantes, sino trabajar como una
célula presentadora de antígeno29.
Las células TCD8+ ejercen su acción efectora a través de la secreción de
interferón gamma, TNF-α, perforinas y granzimas después de activarse por medio
de MHC-I de células infectadas con VHS-1, induciendo apoptosis30. El INF-γ
promueve la presentación de péptidos virales por células presentadoras de
antígenos, inhibe la replicación viral, detienen el ciclo celular de células infectadas
y promueve la respuesta coordinada por linfocitos Th1. Por otra parte células
Marco Teórico

TCD8+ se infiltran al sistema nervioso, rodean neuronas que presentan virus e
inhiben la reactivación y mantienen al virus de herpes simplex tipo 1 en estado
latente30.
Poblaciones de linfocitos T son importantes en una infección con VHS-1, ya que
después de la acción natural de células del sistema inmune, entre el cuarto y el
quinto día estas células viajaran al sitio de la infección, esto se ha observado ya
que cuando un virus es inoculado en cornea o epitelio, la respuesta inmune contra
el virus se desarrolla en el ganglio trigémino y en ganglios linfoides cercanos al
sitio de infección 31.
La respuesta inmune humoral es seguida rápidamente ante una inicial infección
con VHS-1. Los anticuerpos predominantes y específicos a VHS-1 son de isotipo
IgA secretados por células plasmáticas. Estos anticuerpos pueden ser detectados
el día 3 p.i. y seguidos por una aparición de anticuerpos subclase IgG1 e IgG3.
Anticuerpos IgA específicos a VHS-1 están presentes por 6 semanas y
gradualmente decrecen hasta niveles indetectables. IgM son secretados por
células B y son detectados en mucosa32.
Imagen 5. Respuesta inmune a VHS-1. La infección con VHS-1 en células epiteliales e induce la producción
de interferón beta (INF-β). INF-β activa células de la inmunidad innata las cuales a su vez secretan interferón
alfa (INF-α). Los interferones tipo 1 (INF-β e INF-α), inducen un estado antiviral producido de manera
autocrina por las células epiteliales no infectadas. Interleucina-18 (IL-18) e IL-15 producida por células
dendríticas (DC´s) activan células Natural Killer (NK) que secretaran INF-γ y granzimas. Las DC´s procesan
viriones y los transportan a los nódulos linfoides para activar a las células naive B y T. Células T activadas
viajan al sitio de la infección primaria y al ganglio trigeminal, donde rodean a las neuronas infectadas y
previenen la replicación por la secreción de INF-γ y granzimas.
Marco Teórico

2.5. Reconocimiento Viral.
2.5.1. Toll Like Receptor (TLR).
Los receptores tipo Toll (TLR) son sensores del sistema inmune que se
encuentran en células epiteliales, células presentadoras de antígeno (APC) como
macrófagos y células dendríticas (DC), neutrófilos, además de linfocitos T y
linfocitos B. Los TLR están implicados en el control de las infecciones a través del
reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) de
bacterias, parásitos, hogos y virus, representando así, la primera línea de defensa
en la respuesta inmune innata12, 33. Los TLR son también llamados receptores de
reconocimiento de patrones (PRR) capaces de iniciar cascadas de señalización
dependientes de estas moléculas para tratar de eliminar al patógeno invasor.
En ratones doce TLR de ratones han sido identificados, sin embargo, solo 9 han
sido bien caracterizados. La expresión de la molécula depende del tipo de célula y
en su habilidad para reconocer una gran variedad de patógenos invasores. TLR 1,
2, 4, 5 y 6 sirven para el reconocimiento de moléculas de patógenos en la
superficie del invasor generalmente hidrofóbicas (LPS, Peptidoglicanos), mientras
que los TLR 3, 7, 8 y 9 están localizados en membranas endosomales y lisosomas
que sirven principalmente como sensores de ácidos nucleicos34.

La cascada de señalización de los TLR se inicia por la activación de un dominio de
traducción conocido como receptor Toll/IL-1 (TIR). El cual puede interactuar con
adaptadores citoplasmáticos proteínicos; ya sea MyD88 (proteína de respuesta
primaria de diferenciación mieloide 88) o TRIF (Factor transcripcional liberador de
Interferones). Generalmente la ruta de señalización de los TLR comienza con la
interacción de TIR con la proteína adaptadora citoplasmática MyD88, a excepción
de TLR3 y una vía de alterna TLR4 las cuales comienzan con la interacción de
TRIF35 con TIR; ambas resultas en la activación generalmente NF-κβ y la
producción final de citocinas proinflamatorias, quimiocinas e interferones36.

Los TLR están altamente distribuidos y son expresados en una gran variedad de
tejidos y células. Varios TLR son expresados en células mieloides y linfoides, en
Marco Teórico

particular en células dendríticas (DC), las cuales juegan un papel importante en la
iniciación de una respuesta inmune adaptativa por la inducción de la maduración y
producción de citocinas en DC37.
La expresión de TLR del 1 al 10 has sido analizada por PCR y citometría de flujo
en linfocitos T purificados. Específicamente los TLR 1, 2, 3, 4, 5, 7 y 9 fueron
detectados en células T de sangre periférica de humanos. En subpoblaciones de
células T (CD4+ y CD8+) purificadas de amígdalas, la expresión fue en diferente
grado de TLR 1, 2, 3, 5 y 937.
En células TCD4+ naive de ratones BALB/C se demostró la expresión de TLR4,
TLR3, TLR5 Y TLR9, por el contrario en células TCD4+ activadas hubo una clara
expresión de TLR3 y TLR938.

2.5.2. TLR extracelular activado por VHS-1.
2.5.2.1. TLR2
Si bien es conocido el papel de TLR2 en el reconocimiento de componentes
membranales de bacterias (lipoproteínas), este receptor puede ser activado por
proteínas virales de VHS-1 (gH/gL y gb) que al ser liberadas en el medio
extracelular inician la señalización vía MyD-88, activando NF-κβ e inducir
finalmente la producción de interferones tipo 1 y citocinas proinflamatorias33.
2.5.3. TLR intracelulares activados por VHS-1.
2.5.3.1. TLR3
TLR3 es un receptor repetido rico en leucina (LRR) se expresa en células
leucocitarias tales como células dendríticas, linfocitos T y células NK. TLR3
expresado en este tipo de células es funcionaly mientras TLR9 se activa por
PAMP´s, este receptor reconoce acumulación intracelular de RNA viral de doble
cadena (dsRNA)39. La interacción TLR3-TRIF induce la activación del Factor
liberador de Interferones 3 (IRF3) y NF-Κβ40; en conjunto estas moléculas inducen
la producción interferones tipo 1(INF-α y INF-β), INF-γ, citocinas proinflamatorias
(IL-12,IL-1, IL-6 y TNF-α) y quimiocinas que contribuyen a la atracción y activación
de células fagocitarias, citotoxicas y del sistema inmune adaptativo para tratar de
erradicar al patógeno40, 31.
Marco Teórico

La expresión de TLR3 en células dendríticas promueve la expresión cruzada de
antígenos virales lo que contribuye a un eficiente desarrollo de más células
CD8+41.

Cuando el TLR3 en células NK es estimulado aumenta su actividad citotóxica por
la regulación de CD69 en este tipo de células además de promover la producción
citocinas proinflamatorias IL-6, IL-8 e INF-γ42.

La activación de TLR3 por medio de agonistas antes una la infección nasal con
VHS-1 en ratones BALB/C, disminuye la severidad de la encefalitis provocada por
el virus y la mortalidad, quizá debido la producción temprana de INF-β, TNF-α, IL-
12 y CXCL10 principalmente43.

Finalmente la expresión TLR3 (dsRNA) promueve la supervivencia de células T de
ratón y potencializa la producción de INF-γ. Este efecto está asociado a la
activación de NF-κβ y un aumento de la proteína antiapoptótica Bcl 38.
2.5.3.2. TLR7
TLR7 efectúa su acción en endosomas celulares, reconoce cadenas simples de
RNA (ssRNA) pero la expresión de este receptor es restringida a la producción de
interferones y citocinas proinflamatorias principalmente en células dendríticas
plamacitoides (pDC) y macrófagos, sin embargo se ha observado que la expresión
de este receptor se encuentra en células B y linfocitos T y que también es
importante bajo una infección con VHS-1, promoviendo la producción de INF-α por
el reconocimiento y unión a regiones de cadenas simples de RNA ricas en
guanosina y uridina44. La estimulación de TLR7 en células dendríticas induce la
migración de estas a órganos linfoides, además de aumentar la producción de IL-
12 y TNF-α45.
TLR7 como un sensor antiviral inicia su ruta de señalización dependiente de MyD-
88 culminando en la síntesis de interferón gamma (INF-α) y citocinas
proinflamatorias por la activación de IRF7 y NF-κβ. Como se mencionó
Marco Teórico

anteriormente, TLR7 sólo se expresa predominantemente en células altamente
especializadas que han sido infectadas36, 45.
Se ha observado que la sensibilidad de TLR7 en células B se potencia en
presencia de interferones tipo 1 producidos por células dendríticas. Está
activación, por otro lado, desencadena la expansión celular de linfocitos B llevando
a la diferenciación de células B plasmáticas productoras de anticuerpos46.
Cuando TLR7 es activado en células NK aumenta su acción de citotoxicidad hacia
células infectadas además de inducir su producción de INF-γ47.
En células TCD4+ humanas, la expresión de TLR7 induce la proliferación de esta
población de células linfocitarias además de contribuir a la producción de citocinas
como: IL-8, IL-10 e INF-γ48.
2.5.3.3. TLR9
TLR9 es expresado, al igual que TLR7 principalmente en humanos en células B y
pDC. En ratones la expresión de TLR9 está altamente expresado en diferentes
tipos celulares34; se encuentra en endosomas y se estimula con DNA viral de
doble cadena (ds DNA) metilado rico en secuencias CpG. Estudios recientes
investigan el papel de TLR9 como mediador de la respuesta antiviral en el
reconocimiento de virus de doble cadena viral, tales como: VHS-1 y VHS-2. Al
reconocimiento de estos virus, TLR9 traduce señales intracelulares a través del
factor mieloide de diferenciación 88 (MyD88), el cual inicia una cascada de
señalización para activar el factor nuclear κβ (NF- κβ), estimulando la producción
de citocinas proinflamatorias (IL-6, IL-12) e interferones tipo 1 en células NK,
dendríticas y linfocitos T promoviendo así un estado antiviral49.

Agonistas que activaron TLR9 después de la infección con VHS-1 promovieron la
producción de otras citocinas que redujeron la carga viral y por ende la
supervivencia en ratones infectados con VHS-145.
En la imagen 6, se detallan las rutas activadas que promueven la producción de
citocinas proinflamatorias y de interferones tipo 1 como el resultado al
reconocimiento de partículas virales de VHS-1 por medio de TLR3, TLR7 y TLR9.
(A)La estimulación de TLR3, TLR7 y TLR9 resulta en la activación de dos rutas de
Marco Teórico

señalización MyD88 y TRIF que a su vez promueven factores de transcripción IκB,
p50 y p65 en el citoplasma, los cuales funcionan como activadores
transcripcionales para la producción de un gran número de citocinas
proinflamatorias (IL-6, IL-8, IL-12 y NF-κβ) necesarias para atraer células que
contribuyan a la eliminación del virus. (B)La producción de interferones tipo I en
respuesta al reconocimiento de VHS-1 es provocada por factores regulatorios de
interferones celulares (IRF´s) principalmente IRF3 e IRF7, activados igualmente
por MyD88 y TRIF.
Imagen 6. Rutas de señalización de TLR3, TLR7 y TLR9 activadas por componentes de VHS-1. A) Factores de
transcripción activados para la producción de IL-12, IL-8, IL-6 y NFκβ. B) Factores activados para la producción de
Interferones tipo 136.
Aunque varios TLR son necesarios para el reconocimiento de VHS-1 y que
resulte al final en una buena respuesta inmunológica, la expresión de estos
receptores parece ser que es de manera coordinada y secuencial; ya que en un
experimento hecho in vivo en células epiteliales de córnea humana (HCEC´s)
infectadas con VHS-1 después de 8 horas de infección, la expresión de TLR7
aumento mientras que el nivel de TLR3 disminuyó48, 49.
Marco Teórico

2.6. TRANSFERON® (Extracto Dializado de Leucocitos).
El primer extracto dializado de leucocitos (EDL) fue probado en 1949 por S.
Lawrence quién demostró que el extracto podía modular la respuesta inmune de
los receptores50. El extracto dializado leucocitario (EDL) está constituido por una
mezcla heterogénea de péptidos de bajo peso molecular <10KDa51 que se obtiene
a partir de la disrupción de leucocitos de sangre periférica de donadores sanos.
Está compuesto por más de 200 moléculas altamente polares e hidrofílicas52.
El EDL ha sido reportado como un adyuvante y modulador de la respuesta inmune
efectivo en diversos casos patológicos causados por virus, parásitos,
microorganismos fúngicos y enfermedades causadas por micobacterias.
Actualmente en las instalaciones de la ENCB/IPN se produce, bajo buenas
prácticas de fabricación, EDL para uso humano con el nombre comercial de
TRANSFERON®. TRANSFERON® está registrado como un medicamento
biotecnológico ante las autoridades de salud del país y para que pueda ser
distribuido, la farmacopea de los estados Unidos Mexicanos (FEUM) exige que se
le realicen pruebas para verificar su seguridad, actividad y eficacia biológica52.
TRANSFERON® ha demostrado su reproducibilidad entre los lotes fabricados, ya
que bajo técnicas estandarizadas de control de calidad se ha evaluado: el
contenido de endotoxina53, la presencia de bacterias u hongos (test
microbiológico)53, su contenido proteico (0.433ng/mL) por metodología de BCA52,
las características de sus principios activos (péptidos) por SE-UPLC52, y su
potencia en modelos in vitro al estimular la producción de INF-γ en células
Jurkat52.
Adicionalmentecomo parte de los requisitos de control de calidad para la
liberación de los lotes de TRANSFERON® y para complementar los datos in vitro
de potencia biológica, en la UDIBI se estandarizó y validó un modelo murino de
infección cutánea con VHS-1 para determinar la eficacia de este este producto en
animales, bajo protocolos aprobados por el comité de ética del PFT en la
ENCB/IPN. Demostrando que TRANSFERON® aumentó la supervivencia de
Marco Teórico

ratones infectados con VHS-1(Imagen 7) y que correlaciona con la modulación de
expresión de INF-γ, TNF-α e IL-6 en sangre periférica53 (Imagen 8). Con este
método se manifestó que: (i) un modelo murino puede ser utilizado para evaluar la
actividad biológica de los EDL´s, tal como lo es TRANSFERON®, (ii) que el ensayo
puede ser utilizado rutinariamente como una prueba para la liberación de lotes por
demostrar efectividad y potencia, (iii) que TRANSFERON® es producido con alta
homogeneidad entre lotes, conociendo los estándares que son necesarios para
hemoderivados utilizados para uso clínico y que (iv) TRANSFERON® tiene un
efecto protector en un modelo murino de infección con VHS-1 que correlaciona
con el cambio de niveles de citocinas53.
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0 .75 g /200 L
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Imagen 7. Curva de sobrevida de ratones infectados con VHS-1 tratados con el lote 12C04 de TRANSFERON® .

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Imagen 8. Regulación de citocinas (TNF-α, IL-6 e INF-γ) al administrar TRANSFERON® en un modelo herpético murino.
Marco Teórico

2.6.1. Extractos dializados de leucocitos (EDL) y aplicaciones.
Particularmente los EDL han sido utilizados como adyuvantes, moduladores de la
respuesta inmune, con gran éxito al tratamiento de enfermedades tales como,
herpes, VIH, asma, artritis reumatoide, infecciones respiratorias recurrentes y
dermatitis atópica; ya que como modulador puede inducir una respuesta inmune
eficiente54.
En estudios anteriores se ha demostrado que el EDL puede restaurar el balance
de células Th1 y Th2 en infecciones virales para permitir la correcta resolución del
problema inflamatorio55.
Por otro lado el EDL podría modular la respuesta al reconocimiento de bacterias
Gram-negativas por la activación vía del complejo TLR4-MD2 el cual ocurre a
través de MyD88 mediando la ruta de NF-κβ56. Está regulación se demostró en un
modelo murino infectado con Micobacterium tuberculosis en el cual se empleó
extracto dializado de leucocitos específico para Micobacterium tuberculosis en
combinación con antibióticos (antituberculosos), lo que se observó es que los
ratones infectados y administrados con EDL mejoraron rápidamente en la
resolución de la enfermedad, diferente a lo observado en animales donde sólo fue
administrado el EDL o de forma única los antibióticos antes mencionados. Con el
ensayó concluyeron que los animales que recibieron EDL junto con los antibióticos
obtuvieron una restauración de los niveles en la expresión de citocinas tipo Th1:
TNF- α, NOS y significantes niveles de INF- γ que favorecieron una respuesta de
hipersensibilidad tipo retardada (DTH) y la supervivencia de los animales56.
Un estudio alterno indica que los EDL suprimen la actividad de factores
transcripcionales y por ende regulan la producción de citocinas en un estado de
inflamación crónica57.
Resultados previos indican que el EDL inhibe la actividad de NF-κβ de una línea
celular humana, sin estímulo alguno, siendo este factor de transcripción el
activador de la expresión de genes que codifican para citocinas proinflamatorias
tales como: IL-6 e IL-8 (CXCL8) las cuales son cruciales en la respuesta a agentes
Marco Teórico

infecciosos y por ende la otra característica de un EDL es la de controlar una
respuesta inmune exacerbada58.
Se considera al EDL como un modulador selectivo de la producción de TNF-α, IL-6
e IL-8 inducidas por componentes bacteriales en leucocitos, de modo que ante
una infección se produzca un proceso de inflamación controlado. Con respecto al
EDL se sabe de su potenciación en la secreción de CXCL8, observando así que,
el EDL contiene potente actividad quimioatrayente para granulocitos y monocitos.
IL-6 es una citocina con un amplio rango de actividad biológica, ya que muestra
efectos anti y proinflamatorios en la respuesta inmune y el EDL potencializa la
producción de esta citocina pero sin saber su influencia en estos eventos. Se
comprende que el EDL aumenta la producción de IL-6 e IL-8 promoviendo la
inflamación o resolución, iniciando el reclutamiento de neutrófilos y favoreciendo
así la infiltración de monocitos59.
El uso de extractos dializados de leucocitos de origen animal (bovino, murino, etc.)
también han sido utilizados en diversos ensayos. En uno de ellos demostraron que
un extracto leucocitario de origen bovino, tuvo un efecto para inducir la
fragmentación del ADN de células cancerígenas MCF-7 y sin afectar la viabilidad
de células mononucleares de sangre periférica60.

Marco Teórico

2.6.2. Extracto dializado de leucocitos (EDL) y VHS-1
El EDL es un inmunomodulador que se ha utilizado como adyuvante en el
tratamiento de VHS-1, demostrando ser efectivo en disminuir la duración de la
fase aguda y la frecuencia en la aparición de esta enfermedad. En una evaluación
hecha en 20 pacientes que fueron administrados subcutáneamente con extracto
dializado de leucocitos junto con un tratamiento de Aciclovir, disminuyeron la
recurrencia de la manifestación herpética, la potencia y efectos lesivos propios de
la enfermedad, comparando con pacientes que sólo recibieron Aciclovir;
concluyendo así que el EDL puede considerarse como un agente terapéutico de
elección en el tratamiento de herpes simplex tipo I (VHS-1)61.
En otro ensayo se utilizó un EDL donde los leucocitos provenían de donadores
que en alguna etapa de su vida sufrieron infecciones herpéticas, a lo que llamaron
extracto dializado de leucocitos anti herpes específico. Este extracto fue
administrado, en diferentes dosis a diferentes grupos, en pacientes con
recurrentes infecciones herpéticas. El resultado fue un mejoramiento en el 81% de
los participantes en el estudio, ya que redujeron la frecuencia y la duración de las
manifestaciones62.
Como se mencionó anteriormente los extractos dializados de leucocitos pueden
ser y probados en diferentes especies. En un modelo murino con VHS-1 o VHS-2,
que 15 días previos fueron tratados con extracto dializado específico para cada
virus preparado por la inmunización de terneros, fueron retados de forma
subcutánea con una dosis letal del virus. Los datos finales indicaron que el factor
de transferencia específico para cualquier reto letal de los dos virus pudieron
ejercer una protección exitosa al aumentar la supervivenciaen un 50% en
comparación con ratones que fueron administrados con factor de transferencia no
específico para VHS-1 o VHS-2, sino específico a Citomegalovirus (CMV)63,64.

Marco Teórico

2.7. Modelo murino de infección herpética.
En la actualidad se cuenta con diversos modelos para analizar el desarrollo de una
infección herpética con VHS-1. Los modelos in vivo o animales son de gran ayuda
para explicar los mecanismos de protección inmune que desarrollan los humanos,
ya que permiten la aplicación de técnicas que por ética no pueden reproducirse en
humanos. Los modelos in vivo brindan información que no puede ser obtenida o
reproducida totalmente en modelos in vitro. Los modelos murinos tienen un gran
uso y aceptación debido a la facilidad de manejo y recolección de datos, además
permitir el uso de ratones modificados genéticamente para dilucidar y proponer
diversos mecanismos de acción de patógenos. Los modelos murinos son los más
utilizados para el estudio de VHS-1.
Slobedman en 1994 un modelo de ratones C57BL infectados con virus VHS-1,
evaluó la relación que había entre el virus (VHS-1), la replicación de DNA y el
establecimiento de una infección latente; al comparar niveles de DNA viral,
transcriptos asociados a latencia (LAT) y número de neuronas LAT+. En este
estudio concluyeron que secuencias amplificadas y no amplificadas de DNA, se
encuentran en el sistema nervioso de ratones infectados vía cutánea con VHS-165.
Como se ha mencionado anteriormente, se han desarrollado diversos
medicamentos para curar la infección provocada por VHS-1. En el siguiente
experimento se usó un modelo murino, en el cual se evaluó el efecto antiviral de
extractos de plantas que se usan en países asiáticos como tratamiento terapéutico
contra el virus VHS-1 y polivirus tipo 1; con lo cual se demuestra que estos
modelos se pueden utilizar para ver efectos de protección de sustancias
innovadoras18.
Para evaluar la importancia de poblaciones celulares en la infección con VHS-1,
se desarrolló un experimento en el cual se retó con una dosis letal ocular de VHS-
1 a ratones C57BL depletados ya sea en células natural killer (NK), linfocitos
TCD4+, linfocitos TCD8+ o macrófagos, los cuales tuvieron una supervivencia de
12%, 100%, 80% y 85% respectivamente dependiendo de la población celular de
Marco Teórico

la que carecían, sugiriendo que las células NK y su natural producción de INF-γ
son un papel importante en la protección letal contra este virus66.
Thackray en el 2000 reportó un modelo no letal con el virus VHS-1 inoculado en la
nuca. Lo que este ensayo quería demostrar es que el virus puede provocar
infección en los ganglios cercanos a la zona de inoculada, ya que durante 11 días
postinfección, células infectadas con VHS-1 provenientes de ganglios cercanos al
sitio de infección fueron detectadas por medio de un gen reportero integrado al
virus. Y que ganglios removidos en 1.5 y 10 meses después de la inoculación,
mostraban neuronas LAT+ detectadas después de un co-cultivo a través de una
hibridación in situ67.
Finalmente, Baghian en el 2003 empleó la cepa viral VHS-1 ABGK la cual resulta
muy letal, ya que eliminó al 100 % de los animales infectados y no tratados con su
vacuna. Tal vacuna está basada en plásmidos que contienen genes de la
glicoproteína B o glicoproteína D y que ayudan al sistema inmune contra la
infección con el virus herpes simples tipo 1 en ratones SKH-1 y BALB/C. Los
ratones fueron inmunizados con el plásmido gB o gD, solos o con una mezcla de
polímeros, produciendo altos niveles de anticuerpos específicos para las proteínas
administradas. Tres semanas después los ratones fueron retados con un aislado
clínico de VHS-1 por infección/inoculación cutánea. Los ratones que fueron
inmunizados con los plásmidos y mezcla de polímeros tuvieron protección contra
VHS-1, respondiendo con una buena respuesta humoral contra VHS-168.
A continuación se describirán los componentes del sistema inmune murino
necesarios para el reconocimiento del virus VHS-1 y de cómo la infección con este
virus y el tratamiento con TRANSFERON®, modifican el porcentaje y la expresión
de TLR en células provenientes de ganglios inguinales y bazo que tratan de
eliminar o inhibir la acción viral.
Justificación

3.1. Justificación.
Sabemos que TRANSFERON® protege y aumenta la supervivencia de ratones en
un modelo de herpes cutáneo y que en la clínica se ha empleado
satisfactoriamente en diferentes patologías. Por lo tanto es importante dilucidar un
mecanismo por el cual este producto biotecnológico (EDL) ejerce una actividad
protectora. Por lo que el ensayo se enfoca en evaluar algunos aspectos
inmunológicos que TRANSFERON® pudiera modular durante la infección con
VHS-1.
Hipótesis

4.1. Hipótesis.
En un modelo murino de VHS-1 el tratamiento con TRANSFERON® modificará los
porcentajes celulares y su expresión de TLR3, TLR7 y TLR9 de células
dendríticas, macrófagos, granulocitos, células NK, linfocitos T y linfocitos B
provenientes de ganglios inguinales, con el objetivo de evitar el esparcimiento y
modular la producción de citocinas proinflamatorias o antinflamatorias para la
resolución de la infección por VHS-1 y aumentar la supervivencia de los ratones
infectados.
Objetivos

5.1. Objetivo General.
 Evaluar el efecto inmunomodulador que ejerce TRANSFERON® sobre los
componentes del sistema inmune (porcentaje celular y expresión de TLR3,
TLR7 y TLR9) en un modelo murino de herpes cutáneo.

5.2. Objetivos Particulares.
 Montaje del modelo murino de herpes cutáneo para evaluar el efecto
protector de TRANSFERON®.
 Obtener de manera eficiente ganglios inguinales y bazo de ratones
previamente finados bajo técnicas éticas de eutanasia.
 Teñir y fenotipificar células de ganglios inguinales y bazo por medio de la
técnica de citometría de flujo.
 Demostrar bajo parámetros estadísticos si existe diferencia de porcentajes
celulares o en la expresión de TLR, entre los diferentes grupos del ensayo
después de la infección con VHS-1 o administración de TRANSFERON®
(EDL).
Materiales y métodos.

6.1. Cultivo y propagación de células VERO (ATCC CCL-81).
Se cultivaron células células VERO ATCC™ CCL-81 para la propagación de VHS-
1. Las células VERO se obtuvieron del Banco Celular de la Unidad de Desarrollo e
Investigación en Bioprocesos (UDIBI).
Un vial de células VERO que permanecía en nitrógeno líquido (2x106/ml), se
descongeló en baño de agua a 37ºC, por 2 minutos. El contenido líquido del vial
se colocó en tubo para centrifuga de 15 ml (CORNING ™) junto con 9.0 ml de
medio de cultivo completo EMEM (ATCC™) suplementado con suero fetal bovino
SFB (GIBCO™) a una concentración del 10%, esta mezcla se agito suavemente
por inversión 3 veces.
Posteriormente el tubo se centrifugó a 1500 rpm durante 5 min. Se decantó el
sobrenadante y el paquete celular obtenido se resuspendió en 5 ml medio de
cultivo completo EMEM (ATCC™)+10% SFB, se procedió a evaluar la viabilidad
de las células al hacer una cuenta celular por exclusión de tripano. Si la viabilidad
era optima (>70%) se transfirió esta suspensión celular a una botella para cultivo
de 25 cm2(CORNING ™) y se incubo a 37ºC con 5% de CO2 (5x105 por caja de
25 cm2). Días después cuando se alcanzó del 70 al 80 % de confluencia en la
botella para cultivo, se realizó un sub-cultivó (pase). Se decantó el medio de
cultivo, y se adicionó 1 ml de solución de HANK´s 1x (GIBCO™). Sedecantó la
solución y se adiciono 1 mL de solución TrypLE 1X (GIBCO™) y se incubó la caja
5 minutos, a 37ºC para desprender la capa celular debido a las propiedades
adherentes de crecimiento de esta línea celular (VERO ATCC™ CCL-81).
Al terminar la incubación se agregó 5 ml de medio completo EMEM (ATCC™) +
10% SFB (GIBCO™). El contenido de la botella se transfirió a un tubo para
centrifuga de 15 ml. El tubo se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos a
temperatura ambiente. Se decantó el sobrenadante y se lavó el paquete celular
con 10 ml de solución de HANK`s1X (GIBCO™) estéril. Después del lavado se
volvió a centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se
decantó el sobrenadante y se resuspendió el paquete celular en 1 ml de medio de
Materiales y métodos.

cultivo completo EMEM (ATCC™). Esta suspensión se llevó a 15 ml con medio de
cultivo completo EMEM (ATCC™) + 10% SFB (GIBCO™) y se transfirió a 3
botellas de 25 cm2 (CORNING ™) (5x105) y/o a una de 75cm2(CORNING™)
(1x106). Se incubaron las células a 37ºC con 5% de CO2. Este proceso se repitió
hasta obtener las botellas suficientes con la confluencia celular necesaria para
trabajar con ellas y permitir así la propagación viral.
6.2. Propagación viral (VHS-1 ATCC™ VR-1493).

A las células VERO ATCC™ CCL-81 que previamente fueron incubadas y que
tenían de un 70 a 80 % de confluencia, se les retiró el medió en el cual estaban
sumergidas, lavando 2 veces con 5 mL de solución de HANK´S 1 x (GIBCO™) sin
adicionar directamente la solución a la monocapa celular. Posteriormente se
decantó el medio de HANK´s 1X (GIBCO™) y se agregaron 4ml de medio EMEM
(ATCC™) al 2% de SFB (GIBCO™) y la cantidad de virus VHS-1(ATCC™ VR-
1493) necesaria (1mL por caja de 25cm2 confluencia celular 80%-90%).Se
incubaron por 2 horas a 37°C con 5% de CO2 agitando cuidadosamente cada 15
minutos para que se absorbiera el virus.

Se retiró el medio con virus y se agregó 10 mL de medio de cultivo EMEM
(ATCC™) + 10% SFB (GIBCO™). Se incubaron 3 días a 37°C con 5% de CO2
hasta observar de un 80 a 90% de efecto citopático (CPE).

6.2.1. Cosecha viral: Virus Herpes Simplex (VHS-1).
Partiendo de una botella con células VERO ATCC™ CCL-81infectadas con Virus
Herpes Simplex (VHS-1) y con el 80-90% de efecto citopático (CPE), se congeló
la caja a -70ºC por lo menos 15 minutos y se dejó descongelar a temperatura
ambiente lentamente. Se removió el contenido de la botella con una pipeta de 5
mL (CORNING™) a un tubo de 15ml (CORNING™). Se sónico 3 veces por 30
segundos. El sobrenadante obtenido se mantuvo en hielo y se distribuyó en
alícuotas de 500µl, en tubos Eppendorf (CORNING™). Se almacenó a -70ºC
hasta su uso en medio de criopreservación.
Materiales y métodos.

6.2.2. Determinación de título viral.
Para ajustar la concentración viral se siguieron los siguientes pasos:
Se decantó el medio de cultivo EMEM + 10% SFB de las células VERO ATCC™
CCL-81 no infectadas. Se adicionó 3 ml de solución de HANK´s 1X (GIBCO™) a
la botella de cultivo (No adicionar directo a la monocapa) y se lavó la monocapa
celular por inversión suave de la botella de tal forma que el HANK´s (GIBCO™)
estuviera en contacto con toda la monocapa. (Tres veces).
Se decantó la solución HANK´s 1X (GIBCO™) y se adicionó, con una pipeta
estéril, 1 ml de tripsina TrypLE (GIBCO™). Se homogenizó por inversión suave
(tres veces) y se incubó la botella de cultivo a 37°C durante 8 minutos. Se adicionó
con una pipeta estéril 2 ml(CORNING ™) de medio de cultivo completo EMEM
(ATCC) + SFB 10%(GIBCO™) y se transfirió con una pipeta estéril a un tubo para
centrifuga de 15 ml.
Se centrifugaron las células a 125 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Se decantó el sobrenadante y resuspendió el paquete celular en 1 ml de medio de
cultivo completo EMEM (ATCC).
Se realizó la cuenta de las células por exclusión de azul tripano en la cámara de
Neubauer y se prepararon 10 ml de una suspensión celular a una concentración
de 100,000 células/ml de medio de cultivo EMEM (ATCC) suplementado al 5% de
Suero Fetal Bovino (GIBCO™).
Se colocaron 100μL de la suspensión preparada anteriormente (10,000
células/pozo) a cada pozo de la columna 1 a la columna 10 y a los pozos de la
columna 12 de una placa de 96 pozos fondo plano (CORNING ™). (Dejando libre
los pozos de la columna 11 (Imagen 9) y se incubo la placa a 37°C con 5% de
CO2 durante 1 hora.
Se descongelo un vial de VHS-1, cosechado como se indicó en el punto 6.2.1, y
se realizaron diluciones del virus desde 10-1 a 10-9 en un volumen final de 1 ml
(900 μL de medio de cultivo suplementado EMEM con 5% de SFB + 100 μL de
suspensión viral). Se adicionó con una micropipeta multicanal 100 μL de la
suspensión viral original a todos los pozos de la columna 1, posteriormente,
adicionar 100 μL de cada dilución a todos los pozos de cada una de las columnas
Materiales y métodos.

(8 pozos por dilución), a los pozos de la última columna se le adicionó medio de
cultivo suplementado EMEM con 5% de SFB (GIBCO™ (testigo negativo) (Ver
Imagen 9).Se incubo la placa durante 5 días a 37°C con 5% de CO2.

Imagen 9. Diseño de la placa de cultivo para determinar el título viral. Se muestran los pozos que
deben ser infectados.
Y se calculó la Dosis Infectiva 50 (TCID50) con la siguiente fórmula:

𝑥 = 𝑙𝑜𝑔10 Factor de dilución (
% 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑠𝑖𝑔𝑢𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎 50% 𝑑𝑒 𝐶𝑃𝐸−50
% 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑠𝑖𝑔𝑢𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎 50% 𝑑𝑒 𝐶𝑃𝐸−% 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑐𝑐𝑖ó𝑛 𝑎𝑛𝑡𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟 𝑎 50% 𝑑𝑒 𝐶𝑃𝐸
)
Fórmula Utilizada para calcular TCID50
Para convertir de TCID50 a escala logarítmica y representar el valor en UFP, el
valor obtenido se multiplica por ln(0.5).
Ejemplo:
107.875TCID50/mL= (7.496x107) (ln(0.5))= 5.1742x107 UFP/Ml

Materiales y métodos.

6.3. Ratones.

Los ratones utilizados en este modelo biológico (n=77) son de la especie Mus
musculus cepa BALB/C machos, con un peso de entre 14 y 16 gramos. Los
animales suministrados por el proveedor (FERANDELH S.A. de C.V.) se
resguardaron sin manipulación y libres de patógenos en el bióterio de la UDIBI
durante veinticuatro horas en condiciones de comida y alimento ad libitum, que
permitió la aclimatación y disminución el estrés provocado por el transporte.
Pasado ese día de aclimatación, se prosiguió a rasurar el área bajo dorsal de los
ratones. Posteriormente esta zona fue depilada e infectada siguiendo los
procedimientos experimentales aprobados por el comité de ética del Proyecto
Factor de Transferencia de la ENCB/IPN (FTU/BIO/012/010/PRO).

Un día después de eliminar el pelaje de los animales, los ratones fueron
anestesiados con pentobarbital, de concentración 6.3µg/µL administrando 10µL
por cada gramo que pesaba el ratón; para disminuir la movilidad y el dolor
provocado al momento de la depilación. El trabajo con animales anestesiados
aumenta el control en el manejo con ellos y la especificidad de la zona infectada
con el virus Herpes Simplex tipo 1(VHS-1).

Para depilar, en un portaobjetos de vidrio se depositó una gota (50µL
aproximadamente) de pegamento instantáneo KOLA LOKA® y se posicionó por 30
segundos en la zona baja lumbar del ratón, que antes fue rasurada. Una vez seco
el pegamento, el portaobjetos fue retirado con el objetivo de remover la placa de
queratina de la piel y exponer la superficie de la epidermis. Posteriormente se
escarificó la zona con una punta de micropipeta favoreciendo la penetración y la
infección viral con VHS-1.

Materiales y métodos.

6.4. Inoculación viral: Virus Herpes Simplex tipo 1 (ATCC VR-1493).
Inmediatamente después de que los ratones fueron depilados y la exposición de la
epidermis estaba reciente al retirar el estrato corneo, se inocularon