Aislamiento-e-identificacion-de-bacterias-metilotroficas-en-agua-y-filosfera-del-sistema-churince-en-el-Valle-de-Cuatro-Cienegas

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO EN CIENCIAS 
BIOLÓGICAS 
Instituto de Geología 
“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS 
METILOTRÓFICAS EN AGUA Y FILOSFERA DEL SISTEMA 
CHURINCE, EN EL VALLE DE CUATRO CIÉNEGAS” 
TESIS
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE 
 
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
 
(BIOLOGÍA EXPERIMENTAL) 
 
P R E S E N T A 
 
 
JORGE ANTONIO VALDIVIA ANISTRO 
 
 
 
DIRECTORA DE TESIS: DRA. IRMA AURORA ROSAS PÉREZ 
 
 
 
 
MÉXICO. D.F. MARZO, 2010 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 ii
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
 
AL POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO. 
 
 
 
 
 
AL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA (CONACYT) POR LA 
BECA OTORGADA PARA LA REALIZACIÓN DE DICHOS ESTUDIOS DE 
POSGRADO. 
 
 
 
 
A LOS MIEMBROS DEL CÓMITE TUTORAL: 
 
DRA. IRMA AURORA ROSAS PÉREZ 
DRA. VALERIA SOUZA SALDIVAR 
DR. JOSÉ DE JESÚS CABALLERO MELLADO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 iii
AGRADECIMIENTOS PERSONALES 
 
 
 
A la Dra. Irma Aurora Rosas Pérez por su apoyo y asesoría durante mis estudios de 
Posgrado realizados en el Laboratorio de Aerobiología del Centro de Ciencias de la 
Atmósfera, UNAM. 
 
 
 
A la Dra. Valeria Souza Saldivar por su apoyo para la secuenciación de las muestras 
analizadas. 
 
 
 
A la M. en C. Ariadna del Carmen Cruz Córdova por su apoyo técnico y sugerencias 
para el desarrollo del presente trabajo. 
 
 
 
A las técnicas María Eva Salinas Cortes y Leticia Martínez Romero por su apoyo en el 
trabajo de laboratorio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 iv
DEDICATORIA 
 
 
A mis padres y mis hermanos por su apoyo incondicional. 
 
 
A la Familia Ramírez Godinez: Sra. Eva, Sra. Lilia, Miguel, Alix y Daniel, y en especial 
a Marisol, por su apoyo, cariño y comprensión durante todo este tiempo. 
 
 
A mis grandes amigas: Ariadnna del Carmén Cruz y Alma Rosa Romero, por todo su 
apoyo, tiempo y cariño. 
 
 
A mis amigos y hermanos en la vida: Christian Valdés, Jesús Valentín, Javier Pineda, 
Jorge Paniagua y Cesar Nava. 
 
 
A mis amigos y compañeros de trabajo: Manuel Rico Bernal, Maricela Arteaga, 
Lourdes Castillo, Mitsui Saito y José Luis Guzmán. 
 
 
A todas que me han mostrado su apoyo incondicional: 
Julio Cárdenas, Arely, Brenda, Alíne, Verónica, Omar, Oscar, Samuel, Adriana y 
Antonio. 
 
 
 
 
¡Mil gracias!!!! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 v
ÍNDICE 
 
Resumen…………………………………………………………………………….................1 
Abstract………………………………………………………………………………………….3 
 
1. Introducción………………………………………………………………………………….4 
 1.1 Metabolismo microbiano…………………………………………………....................4 
 1.2 Bacterias metilotróficas………………………………………….................................4 
 
2. Objetivos……………………………………………………………...................................8 
 
3. Antecedentes………………………………………………………..................................9 
 3.1 Género Methylobacterium………………………………………................................9 
 3.1.1 Hábitat…………………………………………………………………...................10 
 3.1.2 Taxonomía……………………………………………………………....................11 
 3.1.3 Metabolismo....................................................................................................12 
 3.1.4 Ecología...........................................................................................................17 
 3.2 Zona de estudio....................................................................................................18 
 
4. Justificación...............................................................................................................19 
 
5. Hipótesis…………………………………………………………………………………….21 
 
6. Método………………………………………………………………………………………22 
 
7. Resultados………………………………………………………………………………….27 
 
8. Discusión……………………………………………………………………………………42 
 
9. Conclusiones……………………………………………………………………………….49 
 
10. Bibliografía…………………………………………………………………….................50 
 
11. Anexos……………………………………………………………………………….........61 
 
 
 
 
 vi
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1...........................................................................................................................6 
Metabolismo de compuestos C1 en bacterias metilotróficas aerobias 
 
Figura 2.........................................................................................................................10 
Imágenes de microscopia electrónica de metilotrofos del género Methylobacteriaum 
 
Figura 3.........................................................................................................................13 
Árbol filogenético de bacterias metilotróficas y no metilotróficas pertenecientes a las clases α, β 
y γ de Proteobacteria 
 
Figura 4.........................................................................................................................15 
Vías alternativas de oxidación de formaldehído (CH2O) en metilotrófos 
 
Figura 5.........................................................................................................................16 
Metabolismo metilotrófico propuesto con formato (HCOO¯) como punto de inicio para la 
obtención de energía y la producción de biomasa 
 
Figura 6.........................................................................................................................17 
Ciclo de la Serina 
 
Figura 7.........................................................................................................................19 
Imagen de Google Earth del Valle de Cuatro Ciénegas, donde se observa la ubicación del 
Pueblo “Cuatro Ciénegas de Carranza” y del Sistema Churince 
 
Figura 8.........................................................................................................................24 
Productos esperados en el análisis de PCR para la selección de posibles miembros del género 
Methylobacterium 
 
Figura 9.........................................................................................................................26 
Producto de la amplificación por PCR del gen de RNAr 16S y patrón de cortes esperados por la 
digestión con las enzimas de restricción KpnI, XhoI y StuI en Methylobacterium 
 
Figura 10.......................................................................................................................27 
Imagen de Google Earth de los componentes del Sistema Churince 
 
Figura 11.......................................................................................................................29 
 
 vii
Muestras de vegetación analizadas del Sistema Churince 
 
Figura 12.......................................................................................................................30 
Colonias de pigmentación rosa, amarilla y blanca de muestras del Sistema Churince 
 
Figura 13.......................................................................................................................31 
Unidades Formadoras de Colonia por mL de agua 
 
Figura 14.......................................................................................................................32 
Unidades Formadoras de Colonia por gramo de muestra de hoja 
 
Figura 15.......................................................................................................................33Análisis de PCR-Múltiplex para la selección de posibles miembros de Methylobacterium 
 
Figura 16.......................................................................................................................33 
Variación del número de bandas en el análisis de PCR-múltiplex en las colonias aisladas en un 
medio con metanol de agua y filosfera del Sistema Churince 
 
Figura 17.......................................................................................................................34 
Amplificación por PCR del gen completo de RNAr 16S 
 
Figura 18.......................................................................................................................35 
Análisis de restricción a colonias de pigmentación rosa de agua y filosfera para la formación de 
ribotipos con KpnI, XhoI y StuI 
 
Figura 19.......................................................................................................................36 
Análisis de restricción a colonias de pigmentación amarilla y blanca de agua y filosfera para la 
formación de ribotipos con KpnI, XhoI y StuI 
 
Figura 20.......................................................................................................................39 
Árbol filogenético que muestra la relación entre las secuencias del gen de RNAr 16S de los 
aislados de agua con sus taxas de mayor afiliación 
 
Figura 21.......................................................................................................................40 
Árbol filogenético que muestra la relación entre las secuencias del gen de RNAr 16S de los 
aislados de filosfera con sus taxas de mayor afiliación 
Figura 22.......................................................................................................................41 
 
 viii
Abundancia relativa de los filotipos identificados de las muestras de agua y filosfera con 
respecto al sitio en que fueron aislados del Sistema Churince 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1..........................................................................................................................24 
Oligonucleótidos utilizados en el análisis por PCR para la selección de posibles aislados 
pertenecientes a Methylobacterium 
 
Tabla 2..........................................................................................................................25 
Sitios de corte y condiciones para el análisis de restricción 
 
Tabla 3..........................................................................................................................25 
Sitios de corte en especies de Methylobacterium 
 
Tabla 4..........................................................................................................................28 
Composición fisicoquímica del agua de los tres componentes del Sistema Churince 
 
Tabla 5..........................................................................................................................30 
Unidades Formadoras de Colonias por mL de las muestras de agua (UFC mL-1) 
 
Tabla 6..........................................................................................................................31 
Unidades Formadoras de Colonias por gramo de muestra de hoja (UFC g-1) 
 
Tabla 7..........................................................................................................................37 
Afiliación filogenética de las secuencias de RNAr 16S de los aislados obtenidos de las 
muestras de agua y filosfera del Sistema Churince 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ix
ÍNDICE DE ANEXOS 
 
Anexo 1.........................................................................................................................61 
Especies conocidas del género Methylobacterium 
 
Anexo 2.........................................................................................................................62 
Coordenadas de los sitios del muestreo de reconocimiento 
 
Anexo 3.........................................................................................................................62 
Componentes por cada litro del Medio de Sales Minerales con Metanol 
 
Anexo 4.........................................................................................................................63 
Coordenadas de los sitios del segundo muestreo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 1
RESUMEN 
 
En Valle de Cuatro Ciénegas, localizado en el desierto de Chihuahua estado de 
Coahuila, se caracteriza por tener una gran variedad de habitats acuáticos como 
pozas, manantiales y arroyos. La composición química del agua está formada 
principalmente por sulfatos (SO42-) (2700-3100 mgL-1), calcio (Ca2+) (560- 620 mgL-1) y 
carbonatos (CO32-) (121-125 mgL-1); a pesar de ser extremadamente oligotrófica, con 
un desbalance estequiométrico de C:N:P de 1000:100:1, presenta un nivel inusual de 
diversidad y de endemismos de diferentes tipos de taxas, incluyendo 
microorganismos. Por lo que objetivo de este trabajo fue el aislamiento e identificación 
de las bacterias metilotróficas facultativas capaces de utilizar compuestos 
monocarbonados (C1) como el metanol, presentes en el agua y la filosfera del Sistema 
Churince. 
Muestras de agua y vegetación riparia fueron tomadas en los 3 componentes de dicho 
Sistema (Laguna Grande, Laguna Intermedia y el Manantial), las bacterias 
metilotróficas fueron aisladas usando un medio selectivo sólido de sales minerales con 
metanol al 0.5% como única fuente de carbono. Las placas se incubaron a 28ºC por 
15 días y las colonias que desarrollaron se clasificaron de acuerdo a su pigmentación 
(rosa, amarillo y blanca). 
Posterior a la extracción de DNA, los aislados se sometieron a dos análisis de 
selección: el primero a través de la amplificación de la enzima metanol 
deshidrogenasa (maxF) y de 2 regiones conservadas en el gen de RNAr 16S a través 
de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y el segundo por medio de la 
digestión con enzimas de restricción del gen de RNAr 16S para la formación de un 
ribotipo específico para el género Methylobacterium. El análisis de ribotipado permitiría 
la selección de los posibles miembros de dicho género, para así amplificar y 
secuenciar el gen de RNAr 16S para su identificación. 
El 78% de los aislados se relacionó con la subdivisión α-Proteobacteria 
(Methylobacterium y Rhizobium), 11% con la subdivisión γ-Proteobacteria (Serratia y 
Pseudomonas), y 2% con la subdivisión β-Proteobacteria (Methylophilus); así como 
con algunas bacterias Gram-positivas y no cultivables. Dentro de las colonias de 
pigmentación rosa se identificaron 3 especies que pertenecen al género 
Methylobacterium, siendo M. radiotolerans la mejor representada. La presencia de 
estas bacterias aerobias en un ambiente con recursos tan limitados era de esperarse, 
además de ser la primera vez que se aísla al género Methylobacterium de un 
ambiente hipersalino. 
 
 2
Las bacterias metilotróficas tienen un papel importante en el ciclo del carbono en los 
ecosistemas que habitan, además de regular las emisiones de compuestos orgánicos 
volátiles que podrían afectar la calidad del aire y el clima. Está es la primera que estas 
bacterias metilotróficas son identificadas en el Valle de Cuatro Ciénegas, por lo que 
sería importante entender el papel que desempeñan en el ciclo del carbono de 
ecosistemas con oligotrofia extrema. Estudios posteriores son necesarios para 
determinar su diversidad genética y sus posibles interacciones tróficas dentro de dicho 
ecosistema. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 3
ABSTRACT 
 
The arid basin of Cuatro Cienegas in the Chihuahua desert, located in the state of 
Coahuila, contains a wide range of aquatic habitats: springs, streams, marshes and 
ponds. In general their water chemical composition is formed mainly bySO42- (2700-
3100 mgL-1), Ca2+ (560- 620 mgL-1) and CO32- (121-125 mgL-1) ions while NaCl is rare. 
These oligotrophic ponds, C:N:P 1000:100:1, present an unusual high level of 
endemism and diversity in different taxa, including microorganisms. The aim of this 
study was to isolate and identify facultative methylotrophic bacteria, which are able to 
use one-carbon (C1) compounds, such as methanol. 
Water and riparian vegetation was sampled in the Churince system and methylotrophic 
bacteria were isolated using a selective ammonium mineral salt solid medium 
supplemented with 0.5% methanol as only source of carbon. Plates were incubated at 
28°C during 15 days. Colonies were classified by color (pink, yellow and white). 
Methanol dehydrogenase (maxF) gene and 2 conserved regions of the 16S rRNA was 
detected by PCR. 
The 16S rRNA gene was amplified and digested with specific restrictions enzymes for 
the formation of a specific ribotype for the Methylobacterium genus. This ribotype 
profile permitted the selection of possible members of this genus and 16S rRNA was 
sequenced to identify the isolates. 
Out of the isolated methylotrophic bacteria, 78% belong to α-proteobacteria 
(Methylobacterium and Rhyzobium), 11% to γ-proteobacteria (Serratia and 
Pseudomonas), and 2% to β-proteobacteria (Methylophilus). Also Gram positive 
bacteria and nonculturable bacteria were found. Three species of Methylobacterium 
were identified among the pink colonies and M. radiotolerans was the most common. In 
a place with limited resourses it was expected that these aerobic bacteria would be 
abundant but this is the first effort to demonstrate their presence and the isolation of 
Methylobacterium in a hypersaline environment. 
Methylotrrophic bacteria play an important role in the carbon cycle, and could be 
related with the decrease of VOC emission and gases that affect both, air quality and 
climate. This is the first time that methylotrophic bacteria in the Cuatro Cienegas 
system is reported and it is important to understand their role in the carbon cycle of 
extreme oligotrophic ecosystems. Further studies are needed in order to determine 
their genetic diversity and trophic interactions. 
 
 
 
 
 4
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1 Metabolismo microbiano 
 
Los Procariontes están divididos en dos linajes filogenéticos o dominios, Bacteria y 
Arquea, que tienen las mismas propiedades que cualquier sistema considerado como 
vivo: metabolismo, reproducción (crecimiento), diferenciación, comunicación, 
movimiento y evolución (Madigan & Jung, 2007). 
Dentro de sus propiedades más importantes está su capacidad de obtener energía y 
componentes celulares de distintas fuentes a través de diversos mecanismos. Esta 
diversidad metabólica les ha permitido desarrollar capacidades fisiológicas para 
habitar todos los ambientes del Planeta, inclusive aquellos con condiciones poco 
usuales o extremos. Han sido considerados como los responsables del mantenimiento 
y funcionamiento de dichos ambientes, ya que todas las formas de vida dependen de 
una u otra manera de la actividad de dichos microorganismos (Madigan et al., 2006; 
Madigan & Jung, 2007). 
Durante varias décadas, dicha diversidad metabólica fue considerada como un criterio 
determinante para la clasificación de las bacterias. Actualmente, con el estudio de la 
información presente en sus genomas se ha podido establecer la función específica 
que desempeñan en el ambiente, así como las relaciones evolutivas que les ha 
permitido desarrollarla o en algunos casos adquirirla (Madigan et al., 2006; 
Chistoserdova & Lidstrom, 2003). 
 
1.2 Bacterias metilotróficas 
 
La capacidad de utilizar compuestos reducidos con un solo átomo de carbono (C1) 
como única fuente de energía para el crecimiento ha sido denominada como 
Metilotrofia. Dentro de los compuestos utilizados se encuentran el metano, metanol, 
aminas metiladas (metilaminas), metanos halogenados y especies de azufre metilado 
(Hanson & Hanson, 1996; Chistoserdova & Lidstrom, 2003; Lidstrom, 2006). 
Las bacterias metilotróficas están ampliamente distribuidas en la naturaleza, 
encontrándose en una gran variedad de habitats acuáticos (epicontinentales y 
marinos) y terrestres (acidófilos, alcalinos, halófilos, psicrófilos y termófilos), por lo que 
se considera que juegan un papel importante en el Ciclo del Carbono de dichos 
habitats, ya que son uno de los principales reguladores biológicos de emisiones de 
metano y otros gases invernadero metilados (Hanson & Hanson, 1996; Chistoserdova 
& Lidstrom, 2003; Lidstrom, 2006). 
 
 5
Para su clasificación han sido divididas en dos grupos: bacterias metilotrofas 
anaerobias y bacterias metilotrofas aerobias; el primer grupo está formado 
principalmente por metanogenos, mientras que el segundo lo componen metilotrofos 
aerobios y anaerobios facultativos (Lidstrom, 2006). 
Las bacterias metilotrofas aerobias son filogenéticamente diversas, con representantes 
en Proteobacteria y en bacterias Gram-positivas de bajo y alto contenido de G+C; 
muchas de éstas son especies metilotrofas obligadas, es decir, que son incapaces de 
crecer en compuestos que tenga enlaces carbono-carbono. Sin embargo, en el grupo 
de bacterias que crecen en metanol se encuentra una gran diversidad de bacterias 
facultativas que pueden crecer en varios compuestos multicarbonados, además de los 
C1. Funcionalmente, pueden ser divididos en dos grupos: aquellos que son capaces de 
crecer en metano (llamados metanotrofos) y aquellos que pueden crecer en metanol 
y/o en otros compuestos metilados, pero no en metano (Lidstrom, 2006). 
La habilidad de crecer en estos compuestos C1 requiere de vías bioquímicas 
especiales para la obtención de energía y su metabolismo (Figura 1). Una 
característica importante en la metilotrofía aerobia es la presencia de formaldehído 
(HCHO) como compuesto intermediario, el cual puede ser oxidado a dióxido de 
carbono (CO2) para obtener energía y otra parte puede ser asimilada a través de dos 
vías, el Ciclo de la Serina o el Ciclo de Ribulosa Monofosfato. Por otro lado, algunos 
metilotrofos, llamados pseudometilotrofos o metilotrofos autótrofos, oxidan los 
compuestos C1 a CO2, el cual es asimilado por la vía clásica del Ciclo de Calvin-
Benson-Bassham (Hanson & Hanson, 1996; Chistoserdova & Lidstrom, 2003; 
Lidstrom, 2006). 
La oxidación a formaldehído de los compuestos metilados es realizado por la acción 
de oxidasas y/o deshidrogenasas; sólo las deshidrogenasas participan en la 
conservación de energía a través del transporte de electrones en citocromos 
específicos (Hanson & Hanson, 1996; Lidstrom, 2006; Wilson et al., 2008). 
Las bacterias metilotrofas facultativas son aquellas con la capacidad de crecer en más 
de un compuesto C1 y en algunos casos en compuestos multicarbonados. En este 
grupo se encuentran bacterias que pertenecen a la clase alfa (α), beta (β) y gamma (γ) 
Proteobacteria, así como bacterias Gram-positivas de alto y bajo contenido en G+C 
(Lidstrom, 2006). 
Dentro de la clase α-Proteobacteria se encuentran, por ejemplo, los géneros 
Hyphomicrobium, Aminobacter, Methylosulfomonas y Marinosulfomonas, que utilizan 
como vía de asimilación de compuestos C1 el Ciclo de la Serina (Lidstrom, 2006). 
 
 
 6
 
 
Figura 1. Metabolismo de compuestos C1 en bacterias metilotróficas aerobias. 1 = metano monoxigenasa; 2 = metanol 
deshidrogenasa; 3 = sistema de oxidación de formaldehído; 4 = formato deshidrogenasa; 5 = sistema de oxidación de 
halometanos; 6 = oxidasas de aminas metiladas; 7 = deshidrogenadas de aminas metiladas; y, 8 = oxidasa o 
deshidrogenasa de azufre metilado (Tomado de Lidstrom, 2006). 
 
 
 
El género Hyphomicrobium se caracteriza por utilizar metanol como principal 
compuesto C1, pero han sido identificadas nuevas especies con la capacidad para 
metabolizar compuestos como dimetilsulfoxido,dimetilsulfuro y dimetilsulfonato, así 
como glucosa, sucrosa, succinato o acetato (Borodina et al., 2000). 
El género Aminobacter esta compuesto por bacilos aerobios estrictos, Gram-negativos 
con flagelo, capaces de acumular inclusiones de poli-β-hidroxibutirato, que forman 
colonias blancas o amarillas claras, aisladas generalmente de suelo. Este género es 
capaz de metabolizar compuestos como monometilamina, trimetilamina, glicerol, ácido 
acético y algunas azúcares; no utiliza compuestos como metanol, etanol, dimetilamina, 
formamida y metano (Urakami, 2001). 
Los géneros Methylosulfonomonas y Marinosulfonomonas fueron clasificados como 
metilotrofos capaces de metabolizar al ácido metanosulfónico como fuente de carbono 
y energía. Sus especies tipos, Methylosulfonomonas methylovora y 
Marinosulfonomonas methylotropha, fueron aisladas de suelo y de agua marina 
respectivamente, las cuales son bacilos Gram-negativos que además de metabolizar 
al ácido metanosulfónico pueden crecer en metanol, cloruro de metilamonio, glucosa, 
fructuosa, acetato, piruvato y succinato, y en algunos casos en formaldehído y 
formato. Debido a su capacidad para metabolizar al ácido metanosulfónico, se 
consideran de importancia biogeoquímica en el ciclo del azufre (Holmes et al., 1997). 
 
 7
El género Methylobacillus pertenece a la clase β-Proteobacteria y se caracteriza por 
utilizar el Ciclo de Ribulosa Monofosfato para la asimilación de compuestos C1; 
formado por bacterias en forma de bacilo con un solo flagelo, Gram-negativos. Pueden 
metabolizar aeróbicamente compuestos de un solo carbono diferentes al metano, 
como el metanol y en algunos casos metilaminas o fructuosa (Stanley et al., 2001). 
Dentro de la clase γ-Proteobacteria se encuentra el género Methylophaga, el cual 
utiliza el Ciclo de Ribulosa Monofosfato para la asimilación de compuestos C1. 
Generalmente, esta formada por bacilos móviles, Gram-negativos, que producen 
colonias no pigmentadas, que metabolizan compuestos como metanol, metilamina, 
trimetilamina y fructuosa; incapaces de metabolizar metano, formaldehído, formato, 
ácidos orgánicos o aminoácidos; estos han sido aislados de diferentes ambientes, 
como de la superficie de rocas de mármol (Doronina et al., 2005). 
El género Arthrobacter es un metilotrofo que usa el Ciclo de Ribulosa Monofosfato 
para la asimilación de compuestos como metanol y metilamina principalmente, 
recientemente se ha descrito su capacidad para metabolizar dimetilsulfonato. De 
acuerdo a Lidstrom (2006), este género esta formado por bacterias Gram-positivas de 
alto contenido en G+C (Borodina et al., 2000; Lidstrom, 2006). 
Uno de los géneros más estudiados es Methylobacterium, el cual pertenece a la clase 
α-Proteobacteria, que ha mostrado la capacidad de metabolizar una gran variedad de 
compuestos monocarbonados, así como compuestos de mayor complejidad con 
enlaces carbono-carbono. Las especies de este género han sido aisladas de una gran 
variedad de ambientes, como agua, suelo o asociadas frecuentemente a plantas 
(Green, 2006; Raja et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 8
2. OBJETIVOS 
 
Objetivo General: 
 
Aislar e identificar a las bacterias metilotróficas facultativas presentes en el agua y la 
filosfera del Sistema Churince del Valle de Cuatro Ciénegas, Coahuila. 
 
Objetivos Particulares: 
 
1. Cuantificar, aislar y purificar las colonias presentes en el agua y en la filosfera de la 
vegetación del Sistema Churince que puedan crecer en un medio de Sales 
Minerales con metanol como fuente de carbono. 
 
2. Realizar la selección de las bacterias metilotróficas que tengan la enzima metanol 
deshidrogenasa (MDH) y dos regiones conservadas en el RNAr 16S. 
 
3. Realizar un análisis con enzimas de restricción para la formación de ribotipos. 
 
4. Identificar mediante la secuenciación del gen de RNAr 16S las especies de las 
colonias aisladas y seleccionadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9
3. ANTECEDENTES 
 
3.1 Género Methylobacterium 
 
El género Methylobacterium está formado en su mayoría por bacterias metilotrofas 
facultativas de pigmentación rosa (PPFM, por sus siglas en inglés), las cuales pueden 
crecer en metanol, formato, formaldehído y en varios compuestos orgánicos de mayor 
complejidad (glicerol, malonato, fumarato, succinato, etc.), algunas tienen la capacidad 
de utilizar aminas metiladas y sólo se han descrito dos especies capaces de crecer en 
metano. También ha sido analizada su capacidad de crecer en oxalato, por lo que han 
sido clasificadas como bacterias oxalotroficas, lo cual podría considerarse un criterio 
útil para su identificación (Green & Bousfield, 1983; Wood et al., 1998; Gallego et al., 
2006; Green, 2006; Sahin et al., 2008). 
Todas las especies del género son bacilos (0.8-1.0 x 1.0-8.0 mm) aerobios estrictos, 
Gram-negativos; se pueden encontrar solos o formando “rosetas”; tienen movilidad 
debido a un flagelo polar, subpolar o lateral; presentan inclusiones de poli-β-
hidroxibutirato y en algunas ocasiones gránulos de volutina (polifosfatos); su pared 
celular se encuentra estratificada; hay evidencia de un crecimiento polar, requieren de 
un período de incubación de 7 días aproximadamente, a una temperatura de 28 ± 3ºC 
y pH de 6.8 ± 0.2; producen colonias circulares, convexas, con borde entero, de 
pigmentación rosa pálido a naranja-rojo brillante, con un diámetro de 1 a 3 mm 
aproximadamente (Figura 2). No requieren de factores de crecimiento, pero se ha 
observado que en algunas cepas el pantotenato de calcio estimula su crecimiento 
(McDonald et al., 2001; Van Aken et al., 2004b; Gallego et al., 2005a, b, c; Gallego et 
al., 2006; Green, 2006; Madhaiyan et al., 2009). 
El metabolismo de los compuestos C1 lo realizan a través del Ciclo de la Serina y 
cuando crecen en compuestos orgánicos complejos utilizan el Ciclo del Ácido 
Tricarboxílico. Bioquímicamente son catalasa y oxidasa positivas, producen ureasa y 
algunas especies muestran una actividad lipolítica débil. Pueden utilizar como fuente 
de nitrógeno el nitrato y la urea; algunas tienen la capacidad de reducir el nitrato a 
nitrito (Patt et al., 1976; McDonald et al., 2001; Green, 2006; Lidstrom, 2006; 
Madhaiyan et al., 2007). 
 
 
 
 
 
 
 10
 
Figura 2. Imágenes de microscopia electrónica de metilotrofos del género Methylobacterium: a) M. jeotgali cepa 
S2R03-9T, Bar 1.0 µm (Tomado de Aslam et al., 2007). b) M. thiocyanatum cepa ALL/SCU-P, Bar 1.0 µm (Wood et al., 
1998). c) Colonias de pigmentación rosa-rojo producidas por Methylobacterium (Tomado de Schauer & Kutschera, 
2008). 
 
3.1.1 Hábitat 
 
Los miembros de este género son ubicuos en la naturaleza y han sido aislados de una 
gran variedad de ambientes, incluyendo: suelo, sedimento, aire, polvo, agua 
epicontinental y marina, sistema de suministro de agua, superficie de hojas (filosfera) y 
nódulos en raíz, granos de arroz y como contaminante en productos y procesos (Sy et 
al., 2001; Van Aken et al., 2004a; Jourand et al., 2004; Kato et al., 2005; Gallego et 
al., 2006; Idris et al., 2006; Aslam et al., 2007; Wang et al., 2007; Kang et al., 2008; 
Kato et al., 2008; Weon et al., 2008; Madhaiyan et al., 2009). 
Comúnmente son trasportadas en el aire y crecen en cualquier lugar que tenga 
condiciones favorables. Debido a que son bacterias aerobias estrictas pueden ser 
aisladas de cualquier ambiente acuático que tenga oxígeno disuelto aún en 
concentraciones mínimas (Green, 2006), produciendo masas viscosas de 
pigmentación rosa; algunos de estos ambientes acuáticos presentan concentraciones 
altas de cloro disuelto. Esta capacidad de tolerancia a cloro ha sido observada en 
diferentes especies del género y ha sido analizada con especies pertenecientes a 
colecciones, las cuales no mostraron dicha tolerancia; por loque se ha considerado 
que esta capacidad es un efecto de las condiciones del ambiente en el que se 
encuentran y no como una característica propia del género. Es por ello, que países 
como Japón han puesto interés en el análisis de dichas muestras, por los riesgos 
potenciales en salud pública que se podrían desarrollar (Hiraishi et al., 1995; Nishio et 
al., 1997; Rice et al., 2000). 
La cepa tipo Methylobacterium organophilum ATCC27886 fue aislada del metalimnion 
del lago Mendota en los Estados Unidos, en el cual durante el verano el metano se 
encuentra disponible en presencia de una baja concentración de oxígeno, produciendo 
a b c 
 
 11
su oxidación; además de utilizar una gran variedad de compuestos metilados liberados 
durante la descomposición del detritus de plantas. Años después se observó que esta 
capacidad había sido perdida, dado que no se mantuvo bajo condiciones adecuadas 
en el laboratorio (Green & Bousfield, 1983; Bousfield & Green, 1985; Green, 2006). 
Por otro lado, este género frecuentemente se encuentra asociado a plantas, 
colonizando sus raíces o habitando la superficie de las hojas. Uno de los primeros 
trabajos fue realizado por Austin y colaboradores (1978), en él hicieron un análisis de 
taxonomía numérica en el filoplano de Lolium perenne, siendo Methylobacterium uno 
de los fenotipos dominantes, denominado como “cromógenos rosas” (Green, 2006). 
Las plantas producen una gran variedad de compuestos volátiles, entre ellos el 
metanol, que representa cerca del 50% del carbono orgánico total en la atmósfera, el 
cual es un subproducto del metabolismo de la pectina durante la síntesis de la pared 
celular (Van Aken et al., 2004b; Abanda-Nkpwatt et al., 2006). 
Algunos autores consideran que la asociación entre este metilotrofo aerobio y las 
plantas se basa en su participación en el llamado “Ciclo del Metanol”, durante el cual 
este compuesto es aprovechado como fuente de carbono y energía por estas 
bacterias. Otros autores consideran que esta relación entre la bacteria y su planta 
hospedero es una simbiosis, debido a que se ha observado la producción de 
sustancias que promueven la germinación y crecimiento de la planta, como citocininas 
y auxinas (Ivanova et al., 2001; Zarnowski et al., 2002; Omer et al., 2004). 
Además de la producción de sustancias que promueven el crecimiento de la planta, 
este género puede actuar como antagonista de una gran variedad de microorganismos 
fitopatógenos, como se ha observado en las bacterias Xanthomonas campestris, 
Pseudomonas syringae y Erwinia carotovora, y en los hongos Fusarium culmorum, 
Rhizoctonia solani y R. cerealis (Romanovskaya et al., 2001; Trotsenko et al., 2001; 
Zarnowski et al., 2002). 
 
3.1.2 Taxonomía 
 
La primer especie de Methylobacterium fue aislada de heces de lombriz, fue 
inicialmente clasificada como Bacillus extorquens. A pesar de esto, hasta 1960 y 1970 
fueron estudiadas cuando se considero importante la capacidad de utilizar compuestos 
monocarbonados y sus posibles aplicaciones comerciales; pero su taxonomía hasta 
ese momento había sido confusa. Cuando Patt y colaboradores (1974) aislaron la 
primer PPFM capaz de utilizar metano propusieron el género Methylobacterium, el cual 
tuvo la desventaja de estar basado en la descripción de una sola cepa (M. 
 
 12
organophilum ATCC27886), la cual perdió la capacidad de utilizar dicho compuestos 
monocarbonado (Green, 2006). 
En un estudio taxonómico realizado por Green & Bousfield (1983), estos autores 
encontraron que M. organophilum ATCC27886 era fenotipicamente similar a varias 
especies de PPFM que no podían utilizar metano, por lo que llegaron a la conclusión 
de que todos aquellos taxones en los que habían sido distribuidas podrían ser 
acomodados dentro del género Methylobacterium. Para poder realizar esto, tuvieron 
que corregir la descripción del género, dejando de considerar la capacidad de utilizar 
metano, permitiendo la incorporación de aquellas cepas que pudieran o no utilizarlo; lo 
cual propició la reclasificación de varias especies a través de análisis de similitudes 
DNA-DNA y la comparación del perfil de proteínas solubles totales, haciendo más 
específica su clasificación (Green & Bousfield, 1983; Bousfield & Green, 1985; Green 
& Bousfield, 1988; Green, 2006). 
A finales de los años 80 se realizó una las primeras investigaciones para establecer 
relaciones filogenéticas entre metilobacterias, que se basó en el análisis de las 
secuencia de RNAr 5S, usando el principio de máxima similitud topológica para 
diseñar un árbol que se dividió en siete ramas separadas, el cual coincidía con su 
clasificación previa; concluyendo que las bacterias metilotrofas facultativas forman un 
dominio aparte de las bacterias que oxidan metano (Bulygina et al., 1989). 
Posteriormente, se establecieron relaciones filogenéticas a través del análisis de la 
secuencia de RNAr 16S, con lo que se identificaron relaciones entre su fisiología y su 
diversidad; permitiendo conocer su distribución dentro de las bacterias púrpuras o 
Proteobacteria, logrando determinar los distintos grupos que la formaban 
(metanotrófos obligados, metilotrofos obligados y varios grupos de metilotrofos 
facultativos), así como su vía principal de asimilación del formaldehído (Bulygina et al., 
1990; Bratina et al., 1992; Brusseau et al., 1994; Hanson & Hanson, 1996) (Figura 3). 
 
3.1.3 Metabolismo 
 
La capacidad de las metilobacterias para ser competitivas en diferentes ambientes 
esta dada por los diferentes sistemas enzimáticos utilizados para la oxidación y 
asimilación de compuestos monocarbonados, la composición de sus constituyentes 
celulares y los mecanismos de regulación de las rutas metabólicas. Algunos de los 
retos metabólicos a los cuales se tienen que enfrentar es la incorporación de carbono 
celular y la obtención de energía de compuestos con un sólo carbono (C1) a través de 
la formación de un compuesto intermediario tóxico, como el formaldehído, el cual tiene 
 
 13
la capacidad de reaccionar con proteínas y ácidos nucleidos (Hanson & Hanson, 1996; 
Chistoserdova & Lidstrom, 2003). 
 
 
 
Figura 3. Árbol filogenético sin raíz donde se observan las relaciones entre los diferentes grupos de bacterias 
metilotróficas y no metilotróficas pertenecientes a las clases α, β y γ de Proteobacteria. Las abreviaciones de los 
géneros son: M. = Methylobacterium; Mcy. = Methylocystis; Ms. = Methylosinus; Mc. = Methylococcus; Mp. = 
Methylophiulus; Mmc. = Methylomicrobium; Mm. = Methylomonas; Mtm. = Methanomonas; B. = Bdellovibrio; D. = 
Desulfovibrio; E. = Escherichia; P. = Pseudomonas; A. tumefacians = Agrobacterium tumefacians; A. chroocum = 
Azotobacter chroocum; N. oceanus = Nitrosocystis oceanus; N. exedens = Nannocystis exedens; R. rubrum = 
Rhodospirillum rubrum; R. capsalatus = Rhodobacter capsalatus. El grupo “Ia” incluye a las bacterias metanotróficas 
que utilizan la vía de Ribulosa Monofosfato (RuMP) para la asimilación de formaldehído; en el grupo “Ib” se encuentran 
los metilotrofos que utilizan la vía RuMP y que no oxidan o crecen en presencia de metano como fuente de carbono y 
energía. El grupo “IIa” contiene a las bacterias metanotróficas que utilizan la vía de la Serina para la asimilación de 
formaldehído y el grupo “IIb” contiene a las bacterias metanotróficas que utilizan la vía de la Serina, pero que no utilizan 
metano (Tomado de Hanson & Hanson, 1996). 
 
 14
Las etapas para la asimilación de compuestos C1 por Methylobacterium pueden 
resumirse en tres, principalmente: 1) oxidación del metanol, 2) oxidación y asimilación 
del formaldehído y 3) producción de biomasa a través del Ciclo de la Serina. 
 
 1) Oxidación de metanol 
El metanol es uno de los principales compuestos monocarbonados utilizados por las 
metilobacterias, el cual puede tener dos orígenes: endógeno, por la oxidación de 
metano, y exógeno por ladegradación de pectina y lignina, por ejemplo (Hanson & 
Hanson, 1996). 
La metanol deshidrogenasa (MDH) es una quinoproteína que cataliza la oxidación de 
metanol a formaldehído (CH3OH → CH2O), con el cofactor o grupo prostético 
pirroquinolina quinona (PQQ). La MDH es un tetrámero con dos subunidades 
“pesadas” y dos “ligeras” (α2β2), la unidad catalítica se localiza en las subunidades 
“pesadas”, produciendo reacciones de adición-eliminación, siendo el ión calcio (Ca2+) 
el catalizador de dichas reacciones. Cada subunidad α (66 kDa) contiene una 
molécula de PQQ y un ión Ca2+, mientras que la subunidad β es más pequeña (8.5 
kDa) y está plegada alrededor de la subunidad α (Anthony & Williams, 2003; Zhang et 
al., 2007). 
Los electrones son transferidos a la MDH a través del citocromo cL, siendo un 
citocromo atípico que sirve como aceptor específico. El citocromo cL es oxidado por el 
citocromo c (cH), que es específico para la oxidación de metanol. Tanto la MDH como 
sus dos citocromos son solubles y están localizados en el periplasma (Hanson & 
Hanson, 1996; Anthony & Williams, 2003; Zhang et al., 2007). 
A través del análisis del genoma de Methylobacterium extorquens A1 se localizaron los 
genes para dicho proceso en tres sitios diferentes. El cluster 1 (12.5 kb) contiene 14 
genes que se transcriben en la misma dirección y codifican para los polipéptidos 
estructurales de la MDH, el citocromo c, las proteínas para la inserción de calcio (Ca2+) 
y una proteína regulatoria con funciones desconocidas. El cluster 2 (60 kb) tiene los 
genes encargados para la regulación transcripcional y otro par que se localiza en 
cualquier parte del cromosoma. Los seis genes para la biosíntesis de PQQ se 
localizan en 2 clusters diferentes. El gen que codifica para la MDH (mxaF) se 
encuentra altamente conservado entre estos microorganismos (Hanson & Hanson, 
1996; Toyama et al., 1997; Chistoserdova et al., 2003). 
 
 2) Oxidación y asimilación de formaldehído 
Una vez oxidado el metanol, el formaldehído es oxidado a formato para la obtención 
de energía (CO2) o su asimilación a biomasa. Esta vía de oxidación puede producirse 
 
 15
de dos formas: a) en una se involucra un cluster de genes que codifican para enzimas 
con secuencia y función similar a las usadas en la reducción de CO2 en 
arqueobacterias productoras de metano, en la que el tetrahidrometanopterin (H4MPT) 
es el cofactor y b) en la segunda vía el cofactor es el tetrahidrofolato (H4F), análogo 
H4MPT, por lo que se ha sugerido una transferencia horizontal para su adquisición 
(Figura 4) (Chistoserdova et al., 1998; Chistoserdova & Lidstrom, 2003). 
Ambas reacciones ocurren de manera simultánea, produciéndose metilen-H4F, 
compuesto con el cual se inicia el Ciclo de la Serina. La condensación del 
formaldehído con tetrahidrofolato (H4F) es una reacción espontánea (no enzimática), 
mientras que la ruta alternativa con tetrahidrometanopterin (H4MPT) consume una 
molécula de ATP para dicha condensación, por lo que se podría considerar como una 
pérdida energética. Recientemente se determinó que la ruta de condensación 
espontánea no es la fuente principal de metilen-H4F, siendo únicamente una ruta de 
escape por una sobreproducción de formaldehído, ocasionado por su crecimiento en 
metanol de manera natural, lo que evita una intoxicación por acumulación de 
formaldehído. A través de la ruta con tetrahidrometanopterin (H4MPT) se produce 
formato, que funciona como el punto de partida entre la asimilación de compuestos C1 
en biomasa y la producción de energía, siendo una ruta con un flujo constante de 
formaldehído que evita su acumulación, con la desventaja de que consume una 
molécula de ATP. El óptimo funcionamiento de ambas rutas requiere de un control 
enzimático estricto, dando un balance al crecimiento metilotrófico (Figura 5) 
(Chistoserdova et al., 2003; Crowther et al., 2008). 
 
 
Figura 4. Vías alternativas de oxidación de formaldehído (CH2O) en metilotrofos y sus respectivos genes, como se 
encuentran en Methylobacterium extorquens AM1. fae, enzima de activación de formaldehído; mtdA, metileno 
H4MPT/metileno H4F deshidrogenasa (NADP); mtdB, metileno H4MPT deshidrogenasa (NAD(P)); fch, metileno H4F 
ciclohidrolasa; mch, metileno H4MPT ciclohidrolasa; fts, formal H4F sintasa; ffs, formal metanofuran (MFR)- H4MPT 
formiltransferasa; fdsABCD, fdhAB, subunidades de la NAD unida a formato deshidrogenasa; fmdABC, subunidades de 
formal MFR deshidrogenasa (Tomado de Chistoserdova & Lidstrom, 2003). 
VÍA DE OXIDACIÓN DE FORMALDEHIDO LIGADA A H4F 
CH2O
mtdA
NADP
Metileno
H4F 
H4F NADPH2
Metileno
H4F
CO2Formil
H+H2O
fch
H4F
fts
ADP+Pi ATP+H4F
Formato
NAD NADH2
fdsABCD 
fdhAb 
CH2O 
mtdA 
mtdB 
NAD(P)
Metileno 
H4MPT 
NAD(P)H2 
Metileno CO2Formil
H+H2O
mch ffs
MFR
Formil
fmdABC 
MFR, 2e- H4MPTH4MPTH4MPT H4MPT
fae
MFR
VÍA LIGADA A H4MPT (Arqueobacterias) 
 
 16
 3) Producción de biomasa a través del Ciclo de la Serina 
La producción de biomasa en Methylobacterium se realiza a través del Ciclo de la 
Serina. La serina se produce por la condensación del metilen-tetrahidrofolato (metilen-
H4F) y glicina. Este compuesto está formado por tres átomos de carbono, el cual sufre 
una serie de transformaciones hasta fosfoenolpiruvato, que es carboxilado a malato. El 
malato es reducido a dos compuestos de 2 carbonos, que pueden convertirse de 
nuevo en glicina o producir malil-coenzima A para producir glioxalato y acetil coenzima 
A, propiciando la producción de biomasa y de poli-β-hidroxibutirato (PHB) como 
reserva energética (Figura 6) (Hanson & Hanson, 1996; Chistoserdova et al., 2003; 
Lidstrom, 2006). 
Algunas reacciones del metabolismo metilotrofo, como la conversión de 2-
fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato, la fijación de dióxido de carbono (CO2) catalizado 
por fosfoenolpiruvato reductasa y la reducción de oxacelato a malato, son comunes en 
otros microorganismos heterótrofos (Hanson & Hanson, 1996; Chistoserdova et al., 
2003). 
 
 
 
 
CH3OH
HCHO
CH2=H4MPT
CO2
BIOMASA
CHΞH4MPT
CHO-H4MPT
HCOO¯
CO2 
excretado
CHO-H4F
CHΞH4F
CH2=H4F
H4MPT
H4MPT
H4F
H4F
MtdA, MtdB
Mch
Fch
FDH
GlyA
Fae
FtfL
Fch
MtdA
H4F
 
 
 
Figura 5. Metabolismo 
metilotrófico propuesto con 
formato (HCOO¯) como punto 
de inicio para la obtención de 
energía y la producción de 
biomasa, con sus respectivos 
genes (Tomado de Crowther et 
al., 2008). 
 
 17
 
 
Figura 6. Ciclo de la Serina (Tomado de Lidstrom, 2006). 
 
 
3.1.4 Ecología 
 
Las bacterias metilotróficas se encuentran ampliamente distribuidas en habitats 
acuáticos (epicontinentales y marinos) y terrestres, incluyendo ambientes descritos 
como acidófilos, alcalinos, halófilos, psicrófilos y termófilos (Chistoserdova & Lidstrom, 
2003; Lidstrom, 2006). 
Hasta el momento el género Methylobacterium está conformado por 35 especies 
(Anexo 1), las cuales han sido aisladas de diferentes habitats. Este género se 
considera ubicuo, debido a que puede ser transportado por el aire, alcanzando una 
amplia distribución. Además, tiene la capacidad de metabolizar diferentes compuestos 
monocarbonados, así como compuestos complejos con enlaces carbono-carbono 
(Green, 2006). 
Algunas especies se han encontrado en habitats acuáticos como agua epicontinental 
(M. organophilum) (Patt et al., 1976), agua residual (M. lusitanum) (Doronina et al., 
2002) y en el sistema de suministro (M. hispanicum, M. aquaticum, M. variabile, M. 
isbiliense, M. adhaesivum) (Gallego et al., 2005 a, b, c, d; Gallego et al., 2006); su 
presencia en un hábitat con una alta concentración de sales como el agua de mar, 
sólo ha sido descrita una especie (M. salsuginis) (Wang et al., 2007). 
Además, varias especies se han encontrado asociadas a plantas acuáticas y 
terrestres, colonizando sus raíces, la superficie de las hojas y los brotes en crecimiento 
(Raja et al., 2008).Por ejemplo, M. mesophilicum fue aislada de la hoja de centeno 
(Green & Bousfield, 1983), M. thiocyanatum se encuentra en la rizosfera de Allium 
aflatunense (Wood et al., 1998), M. nodulans, formando nódulos en especies del 
género Crotalaria (Sy et al., 2001), M. populi, está presente en tejidos álamo, M. 
 
 18
phyllosphaerae, ha sido aislada en le filosfera de la planta de arroz (Madhaiyan et al., 
2009), entre otras. Su presencia se debe a una estrecha relación simbiótica, siendo la 
filosfera el nicho con mayor sinergismo, donde Methylobacterium utiliza el metanol 
emitido como fuente de carbono y energía y, en respuesta produce fitohormonas como 
citocininas y auxinas (Ivanova et al., 2001; Trotsenko et al., 2001; Trotsenko et al., 
2005). Así, también ha mostrado la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (Sy et al., 
2001; Jourand et al., 2004) y regular los niveles de etileno metabolizando su principal 
precursor, 1-carboxilato 1-aminociclopropano (Madhaiyan et al., 2007). 
El análisis de la diversidad, la distribución y la estructura de las comunidades de este 
género en la filosfera ha permitido entender su diversidad funcional en dicho 
ecosistema (Raja et al., 2008). 
 
3.2 Zona de estudio 
 
El Valle de Cuatro Ciénegas se localiza en el desierto de Chihuahua, Estado de 
Coahuila (Figura 7), a 740 metros sobre el nivel del mar. Está rodeado por una cadena 
montañosa de rocas calizas, formando una cuenca evaporítica que anualmente recibe 
de 150 a 200 mm de precipitación. En este Valle se encuentra un sistema de pozas, 
manantiales y arroyos que alberga a especies endémicas de vertebrados y 
estromatolitos vivos, a pesar de las variaciones en las condiciones climáticas, en la 
composición y volumen del agua entre cada sitio (Tang & Roopnarine, 2003; Souza et 
al., 2006; Falcón et al., 2007; Alcaraz et al., 2008). 
El análisis de la diversidad microbiana en este ecosistema permitió la identificación de 
filotipos únicos que pertenecían a diez linajes del dominio Bacteria y uno a Arquea, 
entre los que se encontraron representantes de Bacillus, Pseudomonas, Vibrio, 
Rhizobiacea, Planctomyces, γ-Proteobacteria y bacterias Gram-positivas; de las 
cuales el 50% mostró similitud con comunidades microbianas del mar actual, a pesar 
de que la composición química del agua de Cuatro Ciénegas es diferente, con una 
elevada concentración de sulfatos y carbonatos (Souza et al., 2006). 
Es probable que bacterias metilotróficas, como el género Methylobacterium, estén 
formado parte de la estructura trófica de dicha comunidad microbiana, la cual ha 
mostrado similitud con microorganismos de ambientes acuáticos y que además 
puedan estar habitando la filosfera de la vegetación presente en este ecosistema. 
 
 
 
 
 
 19
 
 
Figura 7. Imagen de Google Earth del Valle de Cuatro Ciénegas, donde se observa la ubicación del Pueblo “Cuatro 
Ciénegas de Carranza” y del Sistema Churince. 
 
 
4. JUSTIFICACIÓN 
 
En el Valle de Cuatro Ciénegas se han identificado diversos endemismos y una 
diversidad microbiana única, presente en un sistema de pozas y manantiales (Souza 
et al., 2006; Escalante et al., 2008) que se han mantenido aislados durante un lago 
período de tiempo (Souza et al., 2006; Souza et al., 2008). 
A pesar de la diversidad existente, sus aguas se caracterizan por ser extremadamente 
oligotróficas (<1 µmol PO43-), con un desbalance estequimetríco de C:N:P de 
1000:100:1 (Elser et al., 2005; Souza et al., 2008) que impide el crecimiento de algas, 
por tanto los microorganismos ocupan la base de las cadenas alimentarías existentes 
(Alcaraz et al., 2008). 
El análisis de la distribución de esta diversidad mostró que diferentes microorganismos 
están en distintos sitios, propiciando una alta diversidad entre cada uno, sin la 
influencia de algún factor geográfico; siendo, probablemente, un resultado de las 
características hidrológicas de la zona y de las variaciones en las condiciones 
ambientales (Escalante et al., 2008). 
Aunque la diversidad microbiana identificada es diferente a la de otros ecosistemas, es 
probable que estén presentes bacterias metilotróficas, las cuales han sido aisladas de 
ambientes con una alta concentración en sales, en los que se producen diferentes 
 
 20
compuestos monocarbonados (Doronina et al., 2001; Trotsenko et al., 2007) que son 
utilizados como fuente de carbono y energía (Doronina et al., 2001). 
A pesar de que la elevada concentración de sales en el suelo ha impedido la 
colonización de plantas en el Valle (Tang & Roopnarine, 2003), existen algunas 
especies asociadas a las pozas. Debido a que las plantas generan emisiones de 
metanol y otros compuestos monocarbonados (Abanda-Nkpwatt et al., 2006; 
Trotsenko et al., 2007), diferentes bacterias metilotróficas podrían encontrarse 
colonizándolas. 
Por todo ello, el género Methylobacterium puede encontrarse en estos habitats, 
aprovechando los compuestos monocarbonados generados, los cuales necesitan de 
un requerimiento energético menor para ser metabolizados. 
En un muestreo de reconocimiento realizado en la Laguna Grande y el Manantial 
(Anexo 2) se aislaron 11 colonias de pigmentación rosa de agua sembrada en un 
medio de Sales Minerales con Metanol como fuente de carbono. Esto dio indicio de la 
existencia de metilobacterias en este ecosistema, por lo que fue planeado un segundo 
muestreo para confirmar su presencia en dichos sitios. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 21
5. HIPÓTESIS 
 
Debido a que el Valle de Cuatro Ciénegas es un ecosistema oligotrófico y a que los 
requerimientos energéticos para utilizar compuestos simples, como los 
monocarbonados, son menores en comparación a lo que demandan compuestos de 
mayor complejidad, se espera que bacterias metilotrofas como Methylobacterium se 
encuentren en el agua y la vegetación del Sistema Churince. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 22
6. MÉTODO 
 
I. Búsqueda de información de la zona de estudio para la ubicación y determinación 
de los sitios de muestreo. 
 
En la región oeste del Valle de Cuatro Ciénegas se encuentra el sistema hidrológico 
“Churince”, compuesto por un Manantial que forma un río pequeño que fluye a un lago 
de poca profundidad (Laguna Intermedia) y continua hasta llegar a un estanque en 
desecación (Laguna Grande) (Falcón et al., 2007), cuya agua se caracteriza por ser 
pobre en cloruro de sodio y carbonatos, pero con una elevada concentración de 
sulfatos, magnesio y calcio, principalmente (Alcaraz et al., 2008). 
El muestreo en este Sistema se realizó en Mayo del 2007, en el cual se tenía 
contemplado analizar los mismos sitios del muestreo de reconocimiento para verificar 
los datos obtenidos. Debido a la disminución del nivel del agua en la zona no fue 
posible realizarlo en dichos sitios, por lo que las muestras se tomaron lo más cerca 
posible y en algunos casos en sitios nuevos. 
 
II. Muestreo de agua superficial y de vegetación en los componentes del Sistema 
Churince. 
 
Se tomaron 300 mL de agua superficial en tubos de ensaye estériles con tapa, los 
cuales se abrieron y cerraron dentro del agua para evitar cualquier tipo de 
contaminación y se almacenaron a 4ºC. 
Las muestras de vegetación fueron tomadas adyacentes al sitio de donde se tomaba 
la muestra de agua y en algunos casos, se tomaron lo más cerca posible de dicho 
punto, ya que en la Laguna Grande se observó una disminución considerable del nivel 
del agua, por lo que se encontraban a una distancia considerable. Estas muestras se 
manipularon con material estéril (tijeras y pinzas de disección) y guantes, se 
guardaron en bolsas de vinil con cierre hermético (Zipplok) y se mantuvieron en 
refrigeración. 
Además, se tomaron 5 muestras de agua distribuidas en los tres componentes del 
Sistema para determinar las condiciones fisicoquímicas presentesdurante el tiempo 
en el que se realizó dicho muestreo, el cual fue realizado en el Laboratorio de Química 
Analítica del Instituto de Geofísica, UNAM. Se midieron in situ parámetros como pH, 
oxígeno disuelto, temperatura, potencial Redox y conductividad eléctrica usando un 
equipo multi-parámetro de YSI incorporated modelo 650MDS. 
 
 
 23
III. Procesamiento y condiciones del cultivo. 
 
Todas las muestras de agua se sembraron en un medio de Sales Minerales con 
Metanol como única fuente de carbono (Omer et al., 2004), el cual fue modificado en la 
concentración de los compuestos que contienen fósforo, debido a la baja 
concentración de dicho elemento en este ecosistema (Elser et al., 2005; Souza et al., 
2008) (Anexo 3). Se sembraron 100 µL de agua directamente por el método de 
extensión en placa. 
Las muestras de vegetación fueron procesadas de dos formas: por impresión directa y 
por sonicado. El método de impresión directa se realizó colocando la superficie de la 
hoja sobre una caja con medio de cultivo durante 30 segundos (Abanda-Nkpwatt et al., 
2006). El sonicado se realizó con 1 g de muestra colocado en un tubo de ensayo con 
solución salina al 0.85% con 2.25 μL de Tween 0.0025%, durante 20 minutos. 
Posteriormente se realizaron diluciones seriadas (10-3), sembrando 100 μL de cada 
dilución. 
La temperatura de crecimiento fue de 25 a 30ºC, con un período de incubación de 7 
días. 
 
IV. Cuantificación y aislamiento. 
 
Después del período de incubación, se realizó el conteo de colonias viables y se 
calcularon las Unidades Formadoras de Colonias. Se aisló el 10% o un número 
representativo (de 5 a 10 colonias) de acuerdo a la cantidad de colonias que crecieron 
en cada muestra. 
 
V. Extracción de DNA y amplificación por el método de Reacción en Cadena de la 
Polimerasa-Múltiplex (PCR-Múltiplex) de la enzima metanol deshidrogenasa (MDH) 
y de regiones conservadas en los genes que codifican el RNAr 16S para la 
selección de las posibles bacterias metilotróficas del género Methylobacterium. 
 
La extracción de DNA se realizó por medio de la incubación de colonias a 56ºC 
durante 2 horas con 100 µL de Buffer TE (Tris-HCl 10 mM pH = 8 y EDTA 1 mM pH = 
8) y 10 µL de Proteinasa K (14 mg mL-1). Posteriormente, se colocaron en una placa 
de calentamiento a 100ºC durante 10 min y se centrifugó a 10062 xg por 15 s, 
almacenándose a -20ºC hasta su uso. 
La amplificación por PCR del gen que codifica a la metanol deshidrogenasa (MDH), 
enzima con la que se realiza la oxidación del metanol a formaldehído, y de dos 
 
 24
regiones conservadas en el RNAr 16S de Methylobacterium es un criterio para la 
selección de aislados que posiblemente forman parte de este género. 
Los oligonucleótidos utilizados (Tabla 1) amplifican tres bandas: una de 550 pares de 
base (pb) aproximadamente, que corresponde al gen que codifica la enzima metanol 
deshidrogenasa y dos que corresponden a las regiones conservadas dentro del 
género (207 y 859 pb respectivamente) (Figura 8), bajo las siguientes condiciones de 
reacción: 94ºC por 1min; seguido por 35 ciclos a 94ºC por 1 min, 55ºC por 30 s y 72ºC 
por 1 min; y una extensión final de 72ºC por 1 min. 
En dicho análisis se usó como control positivo la cepa tipo de Methylobacterium 
extorquens ATCC14718. 
 
 
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados en el análisis por PCR para la selección de posibles aislados pertenecientes a 
Methylobacterium. Se muestra su sitio de hibridación en genes de RNAr 16S en M. organophilum D32226. 
 
Oligonucleótidos Secuencia (5'-3') Longitud (pb) M. organophilum 
mxaF GCG GCA CCA ACT GGG GCT GGT 21 - 
mxaR GGG CAG CAT GAA GGG CTC CC 20 - 
F1 GAA TAA GCC CCG GCT AAC TTC G 22 410 – 431 
R1 CGA ATT TCA CCT CTA CAC TCG CAG 24 593 – 616 
R3 CAC GAT TAC TAG CGA TTC CGC C 22 1239 – 1268 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Productos esperados en el análisis de PCR para la selección de posibles miembros del género 
Methylobacterium. Marcador de 1 Kb Plus DNA Leadder (Invitrogen ®) como referencia. 
MDH 859 pb aprox. 
550 pb aprox.
 207 pb aprox. 
Región I
Región II
 
 25
VI. Amplificación del gen de RNAr 16S, análisis de restricción para la formación de 
ribotipos y secuenciación para la identificación de las posibles especies. 
 
La formación de ribotipos está basado en los patrones generados por los cortes en el 
RNAr 16S por enzimas de restricción. Debido a que las secuencias del operón rrn 
están altamente conservadas y las bandas generadas por la acción de las enzimas 
pueden ser invariantes y especificas dentro de una especie es considerado un buen 
método de tipificación (Pfaller & Hollis, 2004). 
La amplificación del gen de RNAr 16S se realizó con oligonucleótidos universales 
(FUniS, 5'-AGA GTT TGA TCA TGG CTC-3', y RUni, 5'-GGT TAC CTT GTT ACG 
ACT-3') bajo las siguientes condiciones de reacción: 94ºC por 1min; seguido por 35 
ciclos a 94ºC por 1 min, 56ºC por 30 s y 72ºC por 1:30 min; y una extensión final de 
72ºC por 5 min. 
La selección de las enzimas de restricción se realizó a través de un análisis con el 
programa NEBcutter V2.0, eligiendo aquellas que generaran un corte en sitios 
similares en especies del género Methylobacterium anteriormente identificadas (Tabla 
2 y 3). Las enzimas seleccionadas fueron KpnI, XhoI y StuI, las cuales generan un 
posible patrón de cortes o ribotipo para la identificación de este género. 
 
 
Tabla 2. Sitios de corte y condiciones para el análisis de restricción. El tiempo de reacción fue de 2 h a 30 ºC. BSA = 
Albúmina; (1) = buffer 1; (2) = buffer 2. 
 
 Enzima KpnI XhoI StuI 
 Sitio de Reconocimiento 5'…GGTAC▼C...3' 
3'...C▲CATGG…5' 
5'…C▼TCGAG…3' 
3'…GAGCT▲C…5' 
5'…AGG▼CCT...3' 
3'…TCCG▲GA...5' 
 
Condiciones 
de 
Reacción 
H2O 5.8 5.9 8.8 
Buffer (1x) 1 (1) 1 (2) 1 (2) 
BSA (1x) 1 1 - 
Enzima (2U) 0.2 0.1 0.2 
 
 
De acuerdo al programa NEBcutter V2.0, cada enzima genera un corte en sitios 
distintos en Methylobacterium (Tabla 3), por lo que se espera un patrón de cortes o 
ribotipo para dicho género (Figura 9). 
 
Tabla 3. Sitios de corte en especies de Methylobacterium. 
 
Enzima M. extorquens 
JCM 2802 
M. minovorance 
CCM 4612T 
M. radiotolerans 
JCM 2831 
M. oryzae 
CBM20 
M. fujisawaense 
DSM 5686 
KpnI 406 411 402 408 418 
XhoI 925 930 1229 1239 1248 
StuI 360 365 356 362 372 
 
 26
 
 
 
Figura 9. Producto de la amplificación por PCR del gen de RNAr 16S y patrón de cortes esperados por la digestión con 
las enzimas de restricción KpnI, XhoI y StuI en Methylobacterium. Marcador de 1 Kb Plus DNA Leadder (Invitrogen ®) 
como referencia. 
 
 
VII. Análisis filogenético. 
 
Para esté análisis, la amplificación del gen de RNAr 16S se realizó con DNA extraído 
con “QIAamp® DNA Mini Kit”, siguiendo las instrucciones del fabricante. Posterior a la 
amplificación por PCR, se purifico dicho producto con “QIAquick PCR Purification Kit” 
para poder ser mandado a secuenciar. 
La secuencia del gen de RNAr 16S de los aislados seleccionados se analizaron en la 
base de datos del BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) del NCBI (National 
Center of Biotechnology Information) para identificar secuencias homólogas a la 
obtenida y determinar su identidad. 
Posteriormente, utilizando el algoritmo ClustalW del programa MEGA 4.0.2 (Molecular 
Evolutionary Genetics Analysis) se realizó el alineamiento con las secuencias que 
mostraron mayor identidad y se generaron los árboles correspondientes con el método 
de Neighbour-joining para establecer sus relaciones filogenéticas. 
 
 
 
 
 
RNAr 16S
Aprox.1500 pb 
KpnI
XhoI
StuI 
Aprox. 998 pb 
Aprox. 402 pb 
Aprox.1229 pb 
Aprox.171 pb 
Aprox.1044 pb 
Aprox.356 pb 
 
 27
7. RESULTADOS 
 
I. Muestreo. 
 
Se tomaron 15 muestrasde agua superficial y 12 de la vegetación adyacente a dichos 
sitios, si es que estaba presente. El muestreo se realizó en los tres componentes del 
Sistema Churince: Laguna Grande (LG), Laguna Intermedia (LI) y el Manantial (M) 
(Figura 10) (Anexo 3). 
 
 
 
 
Figura 10. Imagen de Google Earth de los componentes del Sistema Churince. a) Laguna Grande; b) Laguna 
Intermedia y c) Manantial. 
 
El análisis de la composición fisicoquímica del agua en el momento en que se realizó 
el muestreo (Tabla 4) mostró diferencias entre los parámetro medidos. El pH varió de 
7.3 a 8.4 del Manantial a la Laguna Grande. La concentración de oxígeno disuelto 
varió de acuerdo al sitio de muestreo: en el Manantial se midió una concentración de 
2.6 mgL-1, mientras que en la Laguna Intermedia aumentó a 5.8 mgL-1, y en la Laguna 
Grande se encontró una concentración entre 4.4 y 5.6 mgL-1. La temperatura 
disminuyó de 27.6ºC en el Manantial a 22.5ºC en la Laguna Grande. El potencial 
Redox fue similar en los tres componentes: en el Manantial fue de 264 mV, en la 
Laguna Intermedia de 272 mV y en la Laguna Grande de 263 a 269 mV. La 
conductividad eléctrica en el Manantial fue de 2.7 ms cm-1, en la Laguna Intermedia de 
a
b
c
 
 28
29 ms cm-1, mientras que en la Laguna Grande tuvo un valor entre 11.5 ms cm-1 y 30.1 
ms cm-1. 
 
Tabla 4. Composición fisicoquímica del agua de los tres componentes del Sistema Churince. LG = Laguna Grande; LI = 
Laguna Intermedia; M = Manantial; OD = oxígeno disuelto; PR = potencial redox (mV); CE = conductividad eléctrica 
(ms cm-1); HCO3- = ión bicarbonato; CO32- = ión carbonato; SO42- = ión sulfato; NO32- = ión nitrato. (*) = mgL-1. ND = No 
Detectado. 
 
 
Sitio 
 
pH OD* 
 
T (ºC) 
 
PR CE HCO3- * CO32- * SO42- * 
 
SiO32- * 
 
NO32- * 
 
 
LG 
8.4 4.4 25.1 263 12.8 222.6 22.1 8095 60.8 ND 
8.4 5.2 22.5 269 11.5 189.5 23.3 7076 45.8 ND 
8.0 5.6 22.5 269 30.1 167.0 8.1 1687 10.0 ND 
LI 8.2 5.8 23.0 272 29.0 163.4 5.8 1618 9.5 ND 
M 7.3 2.6 27.6 264 2.7 218.0 ND 1227 8.1 6.0 
 
 
Sitio Na+ * 
 
K+ * 
 
Ca2+ * Mg2+ * Pb2+ * Cd2+ * As3+ * Cl- * 
 
F- * 
 
 
LG 
1823.6 97.2 603.5 1179.9 0.18 0.04 0.09 1362.5 16.7 
1484.6 74.9 700.1 967.5 0.15 0.04 0.07 1130 13.8 
189.4 9.0 457.2 123.8 0.03 0.03 0.02 130.5 3.0 
LI 192.5 8.8 420.4 123.9 0.02 0.03 0.01 129 2.9 
M 158.5 7.8 321.2 107.2 0.02 0.03 0.01 111.5 2.6 
 
 
 
También se analizó la concentración de 19 solutos disueltos en el agua, de los cuales 
el bicarbonato (HCO3-), sulfato (SO42-), sodio (Na+), calcio (Ca2+), magnesio (Mg2+) y 
cloro (Cl-) mostraron concentraciones similares a las presentes en ambientes 
acuáticos hipersalinos como los “soda lakes” (Boltyanskaya et al., 2005; Sorokin & 
Kuenen, 2005); su concentración en Manantial fue de 218.0, 1227, 158.5, 321.2, 107.2 
y 111.5 mgL-1, respectivamente; en la Laguna Intermedia fueron de 163.4, 1618, 
192.5, 420.4, 123.9 y 129 mgL-1; mientras que de los 3 sitios analizados en la Laguna 
Grande los valores más elevados de estos iones fueron 222.6, 8095.5, 1823.6, 700.1, 
1179.9 y 1362.5 mgL-1, respectivamente. Algunos iones, como manganeso (Mn2+) y 
cobre (Cu2+) no fueron detectados; otros como hierro (Fe2+), azufre (S2-) y boro (B3+) 
mostraron algunas trazas solo en Laguna Grande (datos no mostrados). La 
concentración de nutrientes, como el nitrato (NO32-), sólo fue detectada en el Manantial 
con 6.0 mgL-1. 
Las muestras de vegetación analizadas, de acuerdo a su morfología, son plantas sub-
arbustivas que pertenecen a la Familia Asclepiadacea, género Asclepias (Figura 11a); 
mientras que otras eran similares a una planta compuesta, de las cuales no pudo 
establecer su familia o género (Figura 11b). 
 
 
 29
 
Figura 11. Muestras de vegetación analizadas del Sistema Churince. a) Sub-arbustiva perteneciente al género 
Asclapias; b) Planta similar a una compuesta. 
 
 
II. Cuantificación y aislamiento. 
 
El crecimiento de las colonias requirió de un período de incubación mayor al descrito 
en la literatura (Wang et al., 2007; Kang et al., 2007; Madhaiyan et al., 2009), con una 
duración de 10 a 15 días aproximadamente, durante el cual se desarrollaron colonias 
de pigmentación rosa, amarilla y blanca (Figura 12). 
En ambos tipos de muestras las colonias de pigmentación rosa mostraron un 
crecimiento lento y un diámetro menor, en comparación a las colonias de diferente 
pigmentación, lo cual dificultó su aislamiento; las colonias de diferente pigmentación 
fueron visibles después de 7 días de incubación y presentaron un diámetro colonial 
mayor. 
Se aislaron colonias de las tres pigmentaciones observadas, debido a que ya han sido 
identificadas dos especies que no producen pigmentación rosa, que anteriormente era 
considerado un criterio indispensable para su selección. 
Las colonias de las muestras de agua fueron cuantificadas y se calcularon las 
Unidades Formadoras de Colonias por mL de muestra en placa (UFC mL-1). Las 
colonias de pigmentación blanca fueron más abundantes que las de pigmentación rosa 
o amarilla; de las 15 muestras se aislaron 171 colonias (Tabla 5) (Figura 13). 
Para las muestras de filosfera, sólo se consideraron los datos obtenidos del método de 
sonicado, debido a que la impresión directa producía un crecimiento excesivo de 
hongos que impedían la cuantificación y el aislamiento de las colonias. 
 
 
a b 
 
 30
 
 
Figura 12. Colonias de pigmentación rosa, amarilla y blanca de muestras del Sistema Churince. 
 
Tabla 5. Unidades Formadoras de Colonias por mL de agua (UFC mL-1), en cada sitio de muestreo; - = Sin crecimiento. 
1-5: Laguna Grande; 6 -14: Laguna Intermedia; 15: Manantial. 
 
Sitios 
Colonias (UFC mL-1) 
Pigmentación Rosa Pigmentación Amarilla Pigmentación Blanca 
1 360 - 210 
2 350 - 270 
3 160 - 280 
4 260 - 560 
5 40 - 620 
6 10 30 370 
7 40 - 110 
8 30 10 340 
9 90 10 450 
10 60 - 310 
11 10 20 280 
12 100 - 300 
13 30 - 210 
14 20 - 200 
15 50 10 650 
 
 
 31
Los resultados se expresaron en Unidades Formadoras de Colonias por gramo de 
muestra fresca (UFC g-1) y se aislaron 316 colonias (Tabla 6). Es importante 
mencionar que en dichas muestras no hubo crecimiento de colonias de pigmentación 
amarilla, por lo que sólo se aislaron colonias rosas y blancas (Figura 14). 
Las colonias aisladas se sembraron por estría masiva, algunas de las cuales 
mostraron un crecimiento nulo, por lo que el número de colonias analizadas fue menor 
al cuantificado. 
 
0
500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Sitios de muestreo
lo
g 
U
FC
PR PA PB
 
Figura 13. Unidades Formadoras de Colonia por mL de agua. PR = pigmentación rosa; PA = pigmentación amarilla; PB 
= pigmentación blanca. 1-5: Laguna Grande; 6 -14: Laguna Intermedia; 15: Manantial. Nota: los resultados están 
representados en logaritmo de UFC mL-1. 
 
 
Tabla 6. Unidades Formadoras de Colonias por gramo de muestra de hoja (UFC g-1). NC = No Cuantificable. 
1 y 2: Laguna Grande; 3 -11: Laguna Intermedia; 12: Manantial. 
 
 
Sitios 
Colonias (UFC g-1) 
Pigmentación Rosa Pigmentación Blanca 
1 400 400 
2 300 1 200 
3 280 1 760 
4 10 800 NC 
5 1 800 4 900 
6 4 200 10 500 
7 5000 11 000 
8 4 000 5 700 
9 3 200 6 400 
10 2 320 800 
11 4 800 9 600 
12 8 100 54 900 
 
 32
0
500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
4.000
4.500
5.000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Sitios de muestreo
lo
g 
U
FC
PR PB
 
 
Figura 14. Unidades Formadoras de Colonia por gramo de muestra de hoja. PR = pigmentación rosa; PB = 
pigmentación blanca. 1 y 2: Laguna Grande; 3 -11: Laguna Intermedia; 12: Manantial. Nota: los resultados están 
expresados en logaritmo de UFC g-1. 
 
III. PCR-Múltiplex 
 
La amplificación por PCR de regiones conservadas en los genes que codifican el RNAr 
16S en Methylobacterium y el gen que codifica para la enzima querealiza la oxidación 
del metanol (MDH), fueron usados como un criterio para la selección de los aislados 
que posiblemente pertenecen a dicho género (Figura 15). 
Se seleccionaron 130 colonias de pigmentación rosa para ser analizadas, de las 
cuales el 28% (36/130) amplificó las tres bandas esperadas, en el resto se observaron 
variaciones en el número de bandas amplificadas. El 16% (21/130) amplificó la enzima 
MDH y la región II; el 36% (47/130) amplificó las dos regiones conservadas y el 20% 
(26/130) restante sólo amplificó la región II. 
De las colonias de diferente pigmentación se analizaron 113 aislados, de los que el 
28% (32/113) amplificó las 3 bandas esperadas; el 24% (27/113) amplificó la MDH y la 
región II; el 12% (14/113) amplificó las dos regiones conservadas y, el 24% (27/113) 
amplificó únicamente la región II. A diferencia de las colonias rosas, hubo aislados que 
amplificaron la enzima MDH y la región I únicamente, con 8% (9/113) y 4% (4/113) 
respectivamente (Figura 16). 
Para el análisis de restricción se utilizaron los aislados con los tres tipos de 
pigmentación que amplificaron las tres bandas esperadas a través del PCR-Múltiplex. 
 
 
 
 33
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15. a) Análisis de PCR-Múltiplex para la selección de posibles miembros de Methylobacterium. Marcador: 123 
bp DNA ladder (Invitrogen). b) Aislados de pigmentación diferente que amplificaron las 3 bandas del PCR-Múltiplex. 
23R = pigmentación rosa, 76A = pigmentación amarilla y 95B = pigmentación blanca. 
 
 
De los resultados obtenidos del análisis de PCR-Múltiplex se seleccionaron los 
aislados que amplificaron las 3 bandas esperadas, así como aquellos que mostraron 
variaciones, pero en los que se encontraba la enzima metanol deshidrogenasa para 
ser sometidos al análisis de restricción. 
 
 
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
3 bandas MDH + 207 pb 859pb + 207pb MDH 859 pb 207 pb
No rosas
Rosas
 
Figura 16. Variación del número de bandas en el análisis de PCR-múltiplex en las colonias aisladas en un medio con 
metanol de agua y filosfera del Sistema Churince. 
 
 
 
 23R 76A 95B 
2000 
1000 
5000 
12000 
1650 
 850 
246 369 
492 615 
783 861 
984 
a
b 
A3 A10 A31 A43 A77 F10 F30 F50 F112 
 
 34
IV. Análisis de restricción. 
 
La formación de ribotipos se realizó a través de la amplificación del gen de RNAr 16S 
completo (Figura 17) de 116 aislados seleccionados de los dos tipos de muestra, 
sometidos a digestión con las enzimas restricción seleccionadas. 
El análisis de los aislados con pigmentación rosa generaron el patrón de cortes 
esperado para Methylobacterium (Ribotipo 1), pero también se identificaron dos 
patrones de corte más (Ribotipo 2 y 3) (Figura 18). 
 
 
 
 
Figura 17. Amplificación por PCR del gen completo de RNAr 16S (1500 pb aproximadamente). Marcador: 123 bp DNA 
ladder (Invitrogen ®). 
 
 
En el Ribotipo 2 los cortes generados por KpnI y StuI variaron por algunas pares de 
base con respecto al Ribotipo 1 (KpnI → 984 y 416 pb; StuI → 1031 y 359 pb, 
aproximadamente); en cambio, la variación de XhoI fue de más 100 pb (908 y 492 pb, 
aproximadamente). 
En el Ribotipo 3 los cortes generados por KpnI y StuI fueron iguales a los observados 
en el Ribotipo 1; en el caso de XhoI no generó ningún corte, ya que se observó el 
producto de la amplificación del gen de RNAr 16S completo (1500 pb 
aproximadamente), por lo que probablemente estos aislados no tengan el sitio de 
reconocimiento para dicha enzima. 
Estas variaciones probablemente se deban a que los sitios de reconocimiento de las 
enzimas en dichos aislados varíen con respecto a los observados en el programa 
NEBcutter V2.0 con las especies de Methylobacterium reportadas. 
1599 
246 
369
492
615
783
861
984
1476 
1107
1230
1353
A3 A10 A31 A43 A57 A77 F10 F20 F31 F50 F69 F112 
 
 35
Sin embargo, algunas colonias de pigmentación rosa no generaron ninguno de los tres 
ribotipos observados, por lo que probablemente sean bacterias diferentes a 
Methylobacterium. 
El análisis de las colonias de pigmentación amarilla y blanca generó resultados muy 
diferentes, sólo dos colonias blancas mostraron un patrón similar al Ribotipo 1, en el 
resto se generaron cortes muy diferentes a los tres ribotipos observados y en algunos 
casos ningún corte. Esto puede suponer que sean géneros diferentes a 
Methylobacterium, pero que forma parte de las bacterias metilotróficas aerobias 
(Figura 18). 
En base a este criterio, se seleccionaron 55 (46 rosas, 5 blancos y 4 amarillos) 
aislados para ser secuenciados, tanto de los posibles miembros de Methylobacterium 
como de los aislados de géneros diferentes. 
 
 
 
Figura 18. Análisis de restricción a colonias de pigmentación rosa de agua (A) y filosfera (F) para la formación de 
ribotipos con KpnI, XhoI y StuI. Marcador: 123 bp DNA ladder (Invitrogen ®). 
123 246 
369 492 
615 738 
861 984 
1107 
123 
246 369 
492 615 
738 861 
984 1107 998 pb
402 pb
1229 pb
171 pb
1044 pb
356 pb
984 pb 
416 pb 
908 pb
492 pb
1031 pb 
369 pb 
998 pb
402 pb
1400 pb
1044 pb
356 pb
Ribotipo 1
Ribotipo 2
Ribotipo 3
A3 A10 A31 A43 A57 A77 
F10 F30 F31 F50 F69 F112 
 
 36
 
 
 
Figura 19. Análisis de restricción a colonias de pigmentación amarilla y blanca de agua (A) y filosfera (F) para la 
formación de ribotipos con KpnI, XhoI y StuI. CN = control negativo; CP = control positivo (M. extorquens ATCC14718); 
315 = Enterobacter sakazakii. Marcador: 123 bp DNA ladder (Invitrogen ®). 
 
 
V. Análisis filogenético. 
 
De los aislados seleccionados a través de los análisis de PCR y de Ribotipificación, se 
amplificó nuevamente el gen de RNAr 16S para ser secuenciado y así poder 
determinar su afiliación filogenética. Se obtuvieron 17 secuencias completas con una 
longitud promedio de 1476 nucleótidos (mínima de 1224 nucleótidos; máxima de 1447 
nucleótidos) y 38 secuencias parciales con una longitud promedio de 817 nucleótidos 
(mínima de 807 nucleótidos; máxima de 857 nucleótidos), las cuales fueron 
comparadas con las secuencias disponibles en el GenBank, identificando las 
secuencias más cercanas para determinar su identidad filogenética aproximada (Tabla 
7). El análisis filogenético mostró que el 73% de los aislados se relacionó con el 
CN CP 
Ribotipo 1 
Ribotipo 1 
Ribotipo 1 
402 pb
998 pb
1229 pb 
171 pb 
1044 pb 
356 pb 
123 
246 369 
492 615 
738 861 
984 1107 
123 
246 369 
492 615 
738 861 
984 1107 
A17 A24 A55 A66 A72 A75 A81 
A83 A85 F45 F52 F54 F57 F60 F71 315 
 
 37
género Methylobacterium, 5% con otras α-Proteobacterias, 2% a la subdivisión β-
Proteobacteria, 11% con la subdivisión γ-Proteobacteria, 4 % con bacterias Gram-
positivas (Bacillus) y el 5% restante con cepas no clasificadas o clonas no cultivables; 
lo cual demostró la gran diversidad de bacterias metilotróficas aerobias que están 
presentes en el agua y la filosfera del Sistema Churince. 
 
Tabla 7. Afiliación filogenética de las secuencias de RNAr 16S de los aislados obtenidos de las muestras de agua y 
filosfera del Sistema Churince. ND = No Determinado. 
 
 
 
 
 A
G
U
A
 
 
División 
 
Microorganismo filogenéticamente más relacionado 
Similitud 
(%) 
Aislado(s) 
Relacionado(s) 
 
 
α 
Proteobacteria 
Methylobacterium aminovorans CCM4612T. Agua; Sevilla, 
España 
99 A3, A7, A10 
Methylobacterium radiotolerans F2. Análisis del espacio 
intergénico ribosomal en muestras de filosfera 
 
Methylobacterium sp. AeL04. Origen Desconocido 
 
Methylobacterium sp. Aed01. Origen Desconocido