Mutaciones-del-gen-dypd-como-predictor-de-toxicidad-severa-en-pacientes-con-cancer-de-esofago-tratados-con-5-fluororacilo

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE MEDICINA 
DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN 
INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGÍA 
CURSO DE ESPECIALIDAD EN ONCOLOGÍA MEDICA 
 
MUTACIONES DEL GEN DYPD COMO PREDICTOR DE 
TOXICIDAD SEVERA EN PACIENTES CON CANCER DE 
ESOFAGO, TRATADOS CON 5 FLUORORACILO 
 T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
ESPECIALISTA EN ONCOLOGIA MEDICA 
PRESENTA: 
DRA. CLAUDIA LORENA URZUA FLORES 
 
DR. ARMANDO DANIEL RIVERA SALCEDO. 
 
 
DRA. ERIKA BETZABE RUIZ GARCIA 
DIRECTORA DE TESIS 
 
 
MÉXICO, D.F. A 15 DE AGOSTO DEL 2013 
 
 
 
D. en C. JUAN MANUEL MEJÍA ARANGURÉ 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
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Indice 
 
Resumen 3 
Antecedentes 4-10 
Planteamiento del problema 9 
Pregunta de investigación 10 
Justificación 10 
Hipótesis 10 
Objetivos 11 
Metodología 11-17 
Análisis estadístico 11 
Resultados 18-19 
Discusión 19 
Bibliografía 30-23 
 
 
 
 
 
 
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Resumen 
Mutaciones del gen dpd como predictor de toxicidad severa en pacientes con cancer de esófago, 
tratados con 5 fluorouracilo. 
 
Objetivo: 
Determinar la frecuencia de mutación del gen DYPD en pacientes con cáncer de esófago y asociar 
la mutación con toxicidad asociada al 5-FU. 
 
Material y Métodos: 
 
El estudio se realizó en pacientes con cáncer de esófago localmente avanzado y metastásico, 
tratados en el Instituto Nacional de Cancerología, los cuales recibieron quimioterapia a base de 
fluoropirimidinas, de primera o segunda línea con o sin radioterapia. 
Se realizó revisión de expedientes, registrando características clínicas, perfil de toxicidad, 
clasificándose de acuerdo a CTACE v 3. 
Las mutaciones se determinaron por PCR en tiempo real en muestras de tejido tumoral, y se 
realizó asociación entre la mutación y el perfil de toxicidad, el análisis se realizará por SPSS v 2.1 
 
Resultados: 
Se incluyeron pacientes con cáncer de esófago de Enero del 2011 a enero del 2013, 56 pacientes 
se incluyeron al estudio, un total de 45 hombres (80.4%) y 11 mujeres (19.6%), 6 pacientes 
tuvieron localización de esófago superior (10.7%), esófago medio 14 (25%), inferior 36 (64%), por 
histología epidermoide 28 (50%), y adenocarcinoma 28 pacientes (50%). En etapa clínica I 28 
pacientes (50%), III 12 pacientes (21.4%), IV 16 pacientes (28.6%), los pacientes que recibieron 
radioterapia completa 31 pacientes (55.4%), radioterapia incompleta 10. 
 
Conclusión: 
No encontramos significancia estadística entre las características clínicas, por laboratorio, imagen 
y patología de los pacientes relacionados con la toxicidad, aunque si observamos una tendencia 
con hemoglobina menor de 10g/dl, albúmina, y con histología epidermoide en relación a mayor 
toxicidad. 
Palabras clave: cáncer de esófago, fluoropirimidinas, Gen DPYD. 
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Antecedentes. 
Epidemiología 
El cáncer de esófago constituye la sexta causa de muerte por cáncer y la novena neoplasia 
más frecuente del mundo, se reportan 481,645 casos y 406,533 muertes a nivel mundial, con 
relación Hombre: mujer 2-4:1(1), el llamado Cinturón Asiático de cáncer de esófago comprende 
países como Turquía, Irán, Kazakstán y China, en los cuales existe alta incidencia de CCE, con más 
de 100 casos por 100 mil habitantes, también la incidencia es alta en el sur y este de África .En 
Estados Unidos se reportaron 16,980 casos y 14,70 muertes(2). En México, el Registro 
Histopatológico de Neoplasias Malignas del 2003, reporto 734 casos y 1.5% de todas las muertes 
por cáncer (3), los tumores hacia tercio inferior de esófago han ido aumentando de manera 
progresiva, la edad promedio de presentación es a los 65 años. 
Patología 
Los tipos histológicos más comunes son epidermoide 51.6%, el 60% de estos se localiza en 
el tercio medio del esófago, 25% en el esófago distal, se originan del epitelio escamoso, tienden a 
diseminarse por vía linfática, el adenocarcinoma es el segundo subtipo histológico más frecuente 
se encuentra en un 42%, tienden a localizarse en el tercio distal del esófago y unión 
gastroesofágica, se asocian con metaplasia o displasia. No existe diferencia en el pronóstico de 
ambas histologías. (7, 8,9) 
Factores de riesgo 
 Se han identificado factores de riesgo específicos para cada subtipo histológico los factores 
de riesgo para cáncer de esófago epidermoide son tilosis en forma hereditaria (síndrome de 
Howell-Evans) (7), 7% antecedente de neoplasia de tracto Aero digestivo, tabaquismo, 
alcoholismo, hacen efecto sinérgico con un riesgo relativo hasta de 50 veces (8,9). Alta ingesta de 
nitrosaminas, flavotoxinas, nuez de Betel, alimentos y bebidas a altas temperaturas (10). 
Por el contrario la infección por Helicobacter pylori, obesidad, enfermedad por reflujo 
gastroesofágico, esófago de Barret, divertículo de Zenker, además, se le relaciona con factores 
nutricionales, como dieta baja en selenio, vitamina E y caroteno beta, y consumo de encurtidos y 
conservas vegetales (que contienen nitrosaminas y micotoxinas) son factores de riesgo asociado 
con adenocarcinoma (8,9). 
 
 
 
 
5 
 
Cuadro clínico 
Las principales vías de diseminación son la extensión directa, los linfáticos y la vía 
hematógena. La extensión a estructuras contiguas se facilita por la falta de serosa y la estrecha 
relación anatómica con estructuras como el cayado aórtico, carina, tráquea y diafragma. La 
afección temprana de estos órganos dificulta el tratamiento quirúrgico. 
 
La disfagia es la manifestación clínica más frecuente (75%). Sin embargo, se presenta hasta 
que disminuye más de 60% el calibre de la luz esofágica, por lo que al momento del diagnóstico el 
tumor suele mostrar un crecimiento local avanzado. La pérdida ponderal significativa (mayor de 
10%del peso corporal inicial en los últimos 6 meses) se presenta en 57% de los pacientes y es un 
indicador independiente de mal pronóstico. La odinofagia se presenta en 17% de los casos, la 
disnea en 12% y puede haber una fístula traqueoesofágica en 6%. El antecedente de reflujo 
gastroesofágico se presenta en 21% de los pacientes. (7, 8,9) 
 
Tratamiento 
 
En enfermedad localmente avanzada y metastásica el tratamiento estándar aparte del 
quirúrgico es quimioterapia a base de 5- fluorouracilo ya tratamiento único, existen diversos 
estudios en los que se demuestra el beneficio de este medicamento. 
 
 
 
El estudio del Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) 85-01 comparó la quimio 
radioterapia concomitante con la radioterapia sola. En el grupo de quimio radioterapia 
concomitante se observó ventaja notoria en cuanto a sobrevida a 5 años (27 contra 0%), mediana 
de supervivencia (14.1 contra 9.3 meses) y control local. Por su parte, el estudio del Intergroup 
(INT 0123), que investigó la importancia de las dosis elevadas de radioterapia (50.4 contra 64.8 Gy) 
en combinación con quimioterapia concomitante,no demostró diferencias estadísticamente 
relevantes entre ambos grupos (13). 
 
El meta análisis de Cochrane, que comparó QT/RT o RT sola, reveló que la QT/RT definitiva 
es la mejor opción en pacientes que no son candidatos a tratamiento quirúrgico, ya que a pesar de 
ser más tóxico mejora la supervivencia y disminuye la recurrencia local(11). 
Con cualquier modalidad terapéutica, la falla loco regional tiene lugar en cerca de 20 a 80% de los 
casos. Con la quimio radioterapia concomitante la falla es de 35 a 45%. Sin embargo, las 
metástasis a distancia persisten como la causa principal de fracaso (9,10). 
 
Un meta-análisis de la participación de 1219 pacientes con cáncer color rectal tratados 
con 5-FU, mostraron que la toxicidad de grado 3 ó 4 se encuentra en el 31-34% de los pacientes, 
con 0,5% de los pacientes que experimentan toxicidad letal. (15) 
 
 
 
 
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5-FU 
El 5-Fluorouracilo (5-FU) descubierto por Heidelberg en 1957 por o su prodroga oral el 
capecitabine (utilizada por primera vez en 1999), son fármacos muy utilizado en una gran variedad 
neoplasias, tales como color rectal, gástrico, esófago, mama o páncreas. 5-FU es un compuesto 
orgánico aromático heterocíclico con una estructura similar a la de la pirimidina 
 Pertenecen a los análogos de las pirimidinas, y requieren de la conversión intracelular a 
metabolitos citotóxicos para dar lugar a sus efectos antitumorales. Los pacientes tratados con este 
fármaco pueden presentar diversos grados de toxicidad que va del 10-40%; en algunos casos 
siendo amenazantes para la vida. 
Los recientes avances en la comprensión del metabolismo del 5-FU y las enzimas claves 
involucrado en la activación y degradación de los 5-FU ha llevado a una mayor conciencia de que 
el catabolismo ruta de 5-FU juega un papel importante en la determinación de la toxicidad, así 
como la eficacia hacia 5-FU(16,17). 
 
El efecto más importante antitumoral de 5-FU puede ser atribuido a la inhibición de la 
timidilato sintetasa (TS) por FdUMP [21-24].TS es una enzima crucial para la síntesis de novo de 
timidilato (dTMP) que es necesaria para la síntesis de ADN. Esta enzima es responsable de la 
metilación de los 2-5-monofosfato de desoxiuridina (dUMP) en timidina 5-monofosfato (dTMP) 
con la concomitante la oxidación de N5, N10-metilentetrahidrofolato a dihidrofolato y este a su 
vez es precursor de ADN, por lo cual al ser inhibida la TS impide la formación de ADN. 
La contribución de mecanismos de citotoxicidad de 5-FU al RNA y ADN depende tanto de 
la concentración de 5-FU y la duración de la exposición, se ha sugerido que una exposición corta 
con altas concentraciones induce daño directo y mayor toxicidad, mientras que concentraciones 
más bajas con exposiciones más largas favorecen efectos directos sobre el ADN 
 
 
Del 1-3% del 5FU administrado será convertido a metabolitos citotóxicos y más del 80% 
será rápidamente degradado. En el catabolismo de 5-FU la enzima principal es la dihidropirimidina 
deshidrogenasa (DPD), la cual cataliza la reducción de 5-FU en 5,6-dihidrofluoracil (FUH2) y 
corresponde al 90% de la vía del catabolismo del 5-FU, las otras 2 vías del catabolismo del 5-FU 
corresponden a la orotato foforibosil transferasa (OPRT) con fosforribosil pirofosfato (PRPP) como 
cofactor, además de uridin quinasa (UP) (fig 1) 
7 
 
 
 
 
Fig 1 Metabolismo del 5-FU 
 
 
DPD 
 
La dihidropirimidina deshidrogenasa (DPD) es la enzima inicial y limitante de la velocidad 
en la ruta que cataboliza las pirimidinas fluoradas, como 5-FU y sus derivados (capecitabina). La 
DPD, tiene, por tanto, un papel crítico tanto en la efectividad antineoplásica de 5-FU como en su 
toxicidad, DPD se encuentra presente en varios tejidos como tracto gastrointestinal, sangre 
periférica e hígado en el cual se lleva a cabo el catabolismo del 5 FU, DPD es una enzima 
saturable. 
 
Un trastorno en la actividad de DPD tiene una relevancia extraordinaria en el catabolismo 
de 5-FU y, por tanto, en su efectividad y toxicidad. Si la actividad de la DPD se ve incrementada 
habrá menor cantidad de 5-FU y cierta resistencia a este compuesto. Por el lado contrario, si existe 
una actividad disminuida de la DPD se producirá un descenso del catabolismo de 5-FU con la 
consiguiente acumulación e incremento de su toxicidad (16, 17, 18,20). 
Deficiencia DPD 
 El déficit total de DPD constituye una enfermedad congénita, autosómica recesiva, que se 
manifiesta durante la infancia y se caracteriza por presencia de elevados niveles de timina y 
uracilo en orina, sangre y líquido cefalorraquídeo, habitualmente acompañados de déficit 
neurológico, retraso mental, convulsiones e hiperuraciluria (32). 
 Sin embargo, la deficiencia parcial de DPD no se manifiesta fenotípicamente, pero sí afecta 
al metabolismo de 5-FU. Un 5% de la población presenta deficiencia parcial de DPD –aunque hay 
datos que sugieren un porcentaje bastante mayor- y, por tanto, es susceptible de presentar 
reacciones de toxicidad severa tras recibir dosis de 5-fluorouracilo. En general, la toxicidad 
to 5-fluorouridine (FUR) catabolised by uridine phosphorylase
(UP) in the presence of ribose-1-phosphate (Rib-1-P); (3) pathway
3: indirectly to FdUMP by 20-deoxy-5-fluorouridine (FUdR)
catalysed by TP in the presence of deoxyribose-1-phosphate
(dRib-1-P) (Figure 1) (Peters et al, 1986, 1991).
The preferential use of the OPRT pathway (Pathway 1) was
revealed to correlate with a higher sensitivity to 5-FU in cell lines
and human xenograft models (Peters et al, 1986, 1991). Recently,
in studies using human colorectal cancer tissues, a higher OPRT
enzyme activity was observed in 5-FU-sensitive tissues than
nonsensitive ones in in vitro chemosensitivity test (Isshi et al,
2002; Fujii et al, 2003). However, some investigators stated that the
UP pathway (Pathway 2) is critical in the activation of 5-FU in
experimental models (Schwartz et al, 1985; Cao et al, 2002). It is
still controversial as to whether OPRT or UP gene expression is a
key enzyme to activate 5-FU to predict the antitumour effect in the
clinical setting.
Increasing TP activity is associated with the use of inter-
feron (Evans et al, 1981), pyrimidine analogues (Schwartz et al,
1995; Ciccolini et al, 2000), or direct transfection of the TP gene
(Evrard et al, 1999) to various cell lines and human xenograft
models, which results in an increase in sensitivity to 5-FU.
However, in the clinical setting, a high baseline level of gene
expression of TP in colorectal tumours was associated with
nonresponse in 5-FU/LV therapy (Metzger et al, 1998; Salonga et al,
2000). It is as yet unclear whether tumoral TP expression
affects the antitumour effect of UFT/LV therapy on metastatic
colorectal cancer.
In this study, we evaluated the predictive values of gene
expressions of three phosphorylating enzymes, OPRT, UP, and TP,
in UFT/LV treatment for metastatic colorectal cancer. In addition,
the gene expression ratio of 5-FU-phosphorylating enzymes and
the 5-FU degenerating enzyme DPD was also investigated for
comparison with the antitumour effect, such as tumour shrinkage
and survival.
PATIENTS AND METHODS
Clinical methods
The study population consisted of 37 patients with metastatic
colorectal cancer, treated from July 1998 to December 2000 at the
Department of Digestive Surgery, Tokyo Medical and Dental
University, Tokyo, Japan. This study was approved by the
Institutional Review Board of Tokyo Medical and Dental
University, and all patients gave written informed consent.
These 37 cases represent all patients during that period who
satisfied our enrollment criteria. They received the same treatment
as first-line chemotherapy for metastatic disease, after resection of
the primary tumour. Eligibility criteria, patient characteristics, and
treatment regimens were previously described (Ichikawa et al,
2000, 2003). Eligible patients had (1) a performance status score of
2 or better on the Zubrod scale(Eastern Cooperative Oncology
[ECOG]) (Zubrod et al, 1960); (2) at least one measurable lesion;
(3) adequate haematological, hepatic, and renal function; (4) life
expectancy over 3 months. The median age was 62 years (range:
38–80 years). Nine patients had synchronous metastatic tumours
at the time of resection of primary tumours and the other 28
patients had metachronous metastasis after resection of the
primary tumours. Treatment consisted of 400mgm2day 1 oral
UFT (in two doses q 12h) and 15mgbody day 1LV (in threedoses
q 8h) for 5 days, followed by a 2-day rest period for four times
during one 28-day cycle.
Before the treatment and after every two cycles (8 weeks) of
treatment, measurable disease was reassessed by computed
tomography. The response evaluation was based on standard
UICC guidelines (Hayward et al, 1977). There were two complete
responses (CR), 10 partial responses, 16 cases with no change, and
nine cases of progressive disease, with a 32.4% response rate (95%
confidence interval, 18.0–49.8%). All patients in this study arenow
off treatment; 36 of the 37 have died from cancer. One patient is
still alive with CR at 23.0 months. The median follow-up time was
14.0 months.
Archival fresh frozen samples were obtained from the primary
colorectal tumours at the time of surgery. No patient had received
5-FU chemotherapy preoperatively. Immediately after resection,
the tumour sample was divided into two equal portions of at least
500mg each, after removal of necrotic tissues. One portion was
fresh frozen in liquid nitrogen until the time of RNA extraction
and the other portion was embedded in paraffin to confirm
histologically that it contained less than 5% contamination of
normal tissue, necrotic tissue, and lymphocytes.
LABORATORY METHODS
Reverse transcriptional –polymerase chain reaction
(RT–PCR)
Total RNA for each sample was isolated using the RNeasy mini kit
(QIAGEN Inc., Chatsworth, CA, USA) according to the manufac-
turer’s instructions (Chomczynski and Sacchi, 1987). For cDNA
synthesis, reverse transcription using 10mg total RNA was
performed in a total volume of 100mg containing 250pmol oligo
(dT)18, 80U of RNasin (Promega, Madison, WI, USA), and 500U
Molony murine leukaemia virus reverse transcriptase (GIBCO
BRL, Gaithersburg, MD, USA), 50mM Tris-HCL (pH 8.3), 75mM
KCl, 3mM MgCl2, 10mM dithiothreitol, and 0.5mM deoxynucleo-
tide triphosphate (dNTP) solution.
5¢DFUR
Rib-1-P
Pathway 2
UP
FUR
UK
FUMP
FUdR
FdUDP
FdUMPFdUMP
FUDP FUTP F-RNA
TP
Tegafur
P450
5-FU
OPRT
PRPP
Pathway 1
Pathway 3
dRib-1-P
FUH2
F- -Ala
DPD
TP TK
TS
Ch2THF
Figure 1 Metabolism of 5-FU, 50DFUR, and Tegafur.
OPRT and OPRT/DPD in metastat ic colorectal cancer
W Ichikawa et al
1487
British Journal of Cancer (2003) 89(8), 1486–1492& 2003 Cancer Research UK
M
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8 
 
resultante de la administración de 5-FU en individuos con deficiencia parcial de DPD incluye 
síntomas gastrointestinales, mielosupresión, fiebre, mucositis, diarrea y en un porcentaje reducido 
de casos, neurotoxicidad. También se asocia con una cardiotoxicidad que incrementa el riesgo de 
infarto agudo de miocardio, inducción de arritmias ventriculares y supraventriculares. En los casos 
más severos pueden aparecer complicaciones como ataxia cerebelar, alteraciones de la función 
cognitiva e incluso la muerte (18, 19, 26, 29, 30,32). 
Gen DYPD 
 
El gen que codifica (DPYD) DPD se encuentra en el cromosoma 1p22 y esta constituido por 
23 exones que abarca aproximadamente 950kb, 81% de las mutaciones se encuentran del exón 2 
al 14.(16,20,23,24) 
La DPD puede perder su actividad o reducirla si el gen que la codifica sufre algunas 
mutaciones específicas. Las que más se han relacionado con los efectos adversos más severos son 
las siguientes: IVS142846A>T (que representa el 52% de los casos ya que al ocurrir, provoca la 
pérdida de un exón completo codificado en el gen), 1236G>A, c.2921A>T, c.2846A>T, c.2657G>A, 
c.1905+1G>A , c.1679T>A, c.1679T>G y c.496A>G. Estas mutaciones han sido detectadas en 
poblaciones caucásicas y orientales, donde se ha determinado que la deficiencia se presenta entre 
el 10 al 30% de los pacientes tratados con fluoropirimidinas, estas variantes se han relacionado 
con toxicidad severa al 5FU incluso en los pacientes que presentan toxicidad grado 3 y 4 se ha 
detectado deficiencia parcial en el 50% de los casos. (20,28, 29, 33,30). Diversos estudios han 
sugerido que los factores epigenéticos también pueden influir en la actividad DPD como la 
metilación aberrante del promotor DPYD (28,34) 
Diferentes análisis genotípicos y fenotípicos se han realizado en Japón, Taiwán, 
Corea(25,35), India, Pakistán(3637), África(38), Inglaterra, Holanda, Francia, Alemania, Portugal 
(39,40,41), EU encontrando diferentes tasas poblacionales de deficiencia parcial de DPD, La 
prevalencia de mutación IVS142846A se encuentra mutado en la alemanes 0.46%, turcos 0.75%, 
finlandeses1.1%, taiwaneses 2.7%, afro-americanos 0%, Holanda 0.91%(18). En una cohorte de 
114 pacientes coreanos tiene un valor mayor para la medición de actividad de DPD, por lo Tanto 
interpretación de estos estudios se ha visto complicada debido a que no existe un conceso actual 
de la deficiencia los estudios iniciales utilizaron el percentil 95 inferior como arbitrario punto de 
corte, otros grupos han sugerido el uso el percentil 70 más bajo de actividad DPD de una población 
normal como un nivel de umbral, que pondría a casi el 14% de la población en general en situación 
de riesgo para el desarrollo de la toxicidad relacionada con 5FU. 
 
 
 
 
9 
 
Toxicidades 
Los pacientes con deficiencia en la actividad de la DPD presentaran toxicidad, incluso 
algunos casos de consecuencia fatal. Las complicaciones principales son hematológicas 
(leucopenia, neutropenia febril y anemia o trombocitopenia), gastrointestinal (mucositis oral o 
intestinal, estomatitis, diarrea, náusea y vómito) o dermatológicas (síndrome mano-pie, perdida 
de pelo o piel seca), menos frecuentes pero también importantes son las anormalidades 
neurológicas (ataxia cerebelar, deterioro cognitivo o niveles alterados de consciencia). 
 
Las toxicidades relacionadas a Quimioterapia se clasifican de acuerdo a Common 
Terminology Criteria for Adverse Events v 3 (CTCAE) National Cancer Institute, ver anexo 
Técnicas de medición de DPD 
Se han desarrollado diferentes técnicas para determinar la deficiencia de DPD, con 5-FU 
radiomarcado y medición de DPD en sangre periférica por medio de cromatografía(43,44), aunque 
lo niveles son más altos en el hígado se correlacionó con la actividad, en sangre periférica. Por 
PCR en tiempo real es un método alternativo de medir la actividad enzimática, sin embargo aún no 
queda claro si la cuantificación de la expresión de ARNm, represente con precisión la actividad 
enzimática(45). 
 
Mediciones del metabolito final del 5-FU fluoro-b-alanina (FBAL), disminución de niveles 
de FBAL se correlacionan con DPD disminuida, otra técnica es medición del catabolismo del uracilo 
(42). Otras técnicas para predecir la deficiencia parcial de DPD utilizan enfoques basados en 
genómica por PCR en tiempo real.(20,28,29,30), así también diversos estudios han empleado la 
técnica de PCR en tiempo real para mutaciones en el gen DYPD con asociación a toxicidad severa 
 
 
Planteamiento del problema 
 
El cáncer de esófago representa la sexta causa de muerte y la novena en frecuencia a nivel 
mundial, mas de dos terceras partes se diagnostican en etapas avanzadas, el tratamiento 
contempla la quimioterapia a base de fluoropirimidinas, en donde se han reportado toxicidad 
grado 3 y 4 hasta en un 30% de los pacientes de los cuales la mitad tienen mutación de DPD. 
10 
 
En la práctica cotidiana, no se toma en cuenta la mutación de DPD antes de iniciar 
tratamiento con fluoropirimidinas ni tampoco se conoce la incidencia de mutaciónde DPD en 
población mexicana, así como determinar la frecuencia de las diferentes mutaciones ya conocidas. 
 
 
 Pregunta de investigación 
La mutación del gen DYDPD se asocia a toxicidad severa en pacientes mexicanos tratados con 5- 
Fluorouracilo? 
 
Justificación. 
 En los estudios realizados para determinar la frecuencia de mutación de DPD en Europa, 
África, Asia, se han reportado incidencias de mutaciones diferentes de acuerdo al grupo étnico, en 
México no existe un reporte de mutación de DPD, así mismo se han asociado los diferentes tipos 
de mutaciones a toxicidad severa tras la administración de 5 –FU, debido a que aproximadamente 
el 50% de los pacientes que experimentan toxicidad grado 3 o 4 presentan mutación de este gen, 
por lo cual en un futuro podría ser una prueba de tamizaje antes de iniciar tratamiento con 
fluoropirimidinas. 
 
HIPÓTESIS 
 
Hipótesis nula: 
 
La mutación del gen DYPD no se asocia con toxicidad severa en pacientes tratados con 5-FU. 
 
Hipótesis alterna: 
La mutación del gen DYPD se asocia a toxicidad severa en pacientes tratados con 5-FU. 
 
 
 
11 
 
 
 
 
 
Objetivos 
General: 
Determinar de acuerdo a las características de los pacientes, que factores se asocian a mayor 
toxicidad. 
Secundarios: 
Asociar respuesta con toxicidad 
Determinar los diferentes tipos y la frecuencia de mutación de DPYD en pacientes con cáncer de 
esófago 
 
 
 
Metodología 
 
Tipo de estudio: retrospectivo, exploratorio (no se realizó tamaño de muestra debido a que es 
exploratorio). 
Análisis estadístico 
Se realizo análisis descriptivo de las variables clínicas, por imagen , patología y de laboratorio y 
pposteriormente se realizó un análisis de modelo de regresión logística univariado para identificar 
factores que existen en relación a toxicidad por quimioterapia mediante el programa SPSS versión 
2.1, tomándose como p significatica 0.005 
 
 
 
 
12 
 
 
 
 
Definición de las variables y la forma de medición: 
 
 
Nombre Fuente Definición Escala de 
medición 
Calificación 
 
Edad Expedien
te 
 
Pacientes entre 18 y 75 años Cuantitativa 
discontinua 
Numérica 
Sexo Expedien
te 
Género cualitativa 1. hombre 
2. mujer 
Histología Expedien
te 
Patólogo 
Tipo histológico reportado en el 
laboratorio de patología 
cualitativa 1. adenocarci
noma 
2. epidermoi
de 
Grado expedien
te 
Patólogo 
Grado de diferenciación histológica 
reportado en el laboratorio de patología 
cualitativa 1. Bien 
diferencia
do 
2. Moderada
mente dif. 
3. Poco dif. 
Localizació
n 
Expedien
te 
Sitio anatómico en esófago y unión 
esofagogástrica donde se localiza el 
epicentro del tumor 
cualitativa 1. Superior 
2. Medio 
3. Inferior 
4. Unión 
esófago-
gástrica 
Número 
de Ciclos 
de QT 
Expedien
te 
Número de ciclos de quimioterapia de 
primera línea recibidos 
Cuantitativa 
discontínua 
Numérica 
13 
 
Quimioter
apia de 
segunda 
línea 
expedien
te 
Pacientes que hayan recibido otro 
esquema de quimioterapia posterior a la 
progresión 
Cualitativa 1.- Si 
2.- No 
Respuesta 
por TAC 
(dependie
nte) 
Expedien
te 
RECIST 
V1.1 
Modificación del diámetro mayor del 
tumor 
Cualitativa 1.- Respuesta 
completa 
2.- Respuesta 
parcial 
3.- Enfermedad 
estable 
4.- progresión 
Etapa 
clínica 
Expedien
te 
AJCC, 
2010 
Clasificación de la enfermedad de 
acuerdo a la profundidad de invasión 
tumoral, número de ganglios y presencia 
de metástasis a distancia. 
Categórica, 
ordinal 
T:1-4 
N:1-3 
M:0-1 
Toxicidad Expedien
te 
Se define como cualquier toxicidad en el 
tiempo en el que recibieron 
quimioterapia 
Se evaluó neutropenia como neutrófilos 
menos a 1500 
Anemia < 10gr/dl 
 trombocitopenia < 75,000 
mucositis eritema de la mucosa 
diarrea aumento de número y 
consistencia de evacuaciones 
síndrome mano-pie eritema en plantas y 
palmas 
vómito > 1 episodio en el dia 
 náusea que ocasione disminución del 
apetito 
Cuantitativa 
continua 
CTCAE v 3 
14 
 
Mutación 
DPD 
Laborato
rio de 
medicina 
traslacio
nal 
Prueba realizada por PCR cualitativa Numérica 
 
Población 
 
La población incluye pacientes con cáncer de esófago y UEG con enfermedad localmente avanzada 
y metastásica, valorados por la Unidad Funcional de Gastro-oncología del Instituto Nacional de 
Cancerología, en el periodo comprendido entre enero del 2011 y diciembre del 2012. 
 
Procedimiento 
 
Criterios de Inclusión 
 
Pacientes con cáncer de esófago y UEG, que hayan recibido quimioterapia a base de 
fluoropirimidinas, esquema de primera o segunda línea. 
Pacientes de 18 a 75 años 
Pacientes que cuenten con estudio de tomografía, para evaluación de respuesta al tratamiento 
con quimioterapia paliativa. 
Pacientes que cuenten con biopsia para determinación de mutación de DPD 
 
 
Criterios de Exclusión 
 
Pacientes que no hayan recibido fluoropirimidinas. 
 
 
 
 
Las pruebas se realizarán en biopsias realizadas por endoscopia previa al tratamiento con 
quimioterapia. 
Desparafinación de muestras 
 
1. Realizar de 5-10 cortes de muestras de tejido embebido en parafina de aproximadamente 
25μm. 
2. Depositar en microtubos para centrífuga de 1.5mL previamente etiquetados 
3. Incubar con 1mL de xileno en horno de calor seco a una temperatura de 56oC durante una 
hora. 
4. Sacar los tubos del horno y eliminar la mayor cantidad del volumen para volver a colocar 
1mL de xileno a cada uno de los tubos. Incubarán durante una hora a 56oC. 
5. Eliminar la mayor cantidad de xileno posible y realizar 3 lavados por pipeteo con etanol 
absoluto 
6. Elimina la mayor cantidad de etanol remanente y de dejar secar a 56oC. 
15 
 
 
 
 
Extracción y purificación de ADN genómico (ADNg) 
 
La extracción del ADNg se realizará mediante el empleo del kit DNeasy® blood and tissue de 
QIAGEN siguiendo las siguientes instrucciones del proveedor: 
 
1. Colocar en un tubo eppendorf de 1.5 mL previamente etiquetado, 180 μl de Buffer ATL, y 
agregar posteriormente 20 μl de proteinasa K, vortexear e incubar a 56°C hasta que el 
tejido este completamente lisado. 
2. Vortexear 15 segundos y posteriormente adicionar 200 μl de Buffer AL y vortexear. Luego 
adicionar 200 μl etanol (96–100%) y vortexear nuevamente. 
3. 
columna de DNeasy mini spin previamente etiquetada. Centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) 
durante 1 min. Desechar el filtrado y el tubo de colección. 
4. Pasar la columna a un nuevo tubo de colección de 2 ml, adicionar 500 μl de Buffer AW1, y 
centrifugar a 6000 x g (8000 rpm) por 1 minuto. Desechar el filtrado con el tubo de 
colección. 
5. Pasar la columna a un nuevo tubo de colección de 2 ml, adicionar 500 μl de Buffer AW2 y 
centrifugar por 3 minutos a 20,000 x g (14,000 rpm) para secar. Descartar el filtrado con el 
tubo de colección. 
6. Pasar la columna a un tubo de Eppendorf nuevo de 1.5 ml previamente etiquetado y 
pipetear 200 μl de Buffer AE directamente sobre la membrana. Incubar a temperatura 
ambiente por 1 minuto, y luego centrifugar por 1 minuto a 6000 x g (8000 rpm) para eluír. 
 
 
 
 
 
 
 
Cuantificación de ADNg 
 
La cuantificación del ADNg se realizará mediante el empleo del espectrofotómetro NanoDrop 
2000c (Thermo Scientific). 
 
1. Dar doble Click al icono del software NanoDrop™ 2000 y seleccionar cuantificación de 
ácidos nucleicos. Seleccionar Add to report antes de la medición para guardar los datos de 
las muestras automáticamente a un documento de trabajo. 
2. Establecer el Blanco usando el Buffer apropiado. Pipetear 1-2 μL del Buffer, bajar el brazo 
y hacer clic en el botón Blank. La solución Blanco generalmente es la misma solución 
Buffer en que la molécula de interés fue disuelta. 
3. Limpiar el blanco de los pedestales de medición utilizando un paño de laboratorio seco y 
sin pelusa. Introducir el ID de la muestra en el campo correspondiente. Vortexear durante 
15 segundosel tubo que contiene la muestra y pipetear 1 μL y hacer clic en Measure. 
4. Limpiar las muestras de los pedestales de medición y volver a repetir el punto 3 entre cada 
muestra. 
16 
 
 
Pre-PCR 
 
Se recomienda utilizar 20ng de ADNg, donde la misma cantidad de ADN debe ser utilizado entre 
cada muestra. Para preparar la reacción de PCR y la placa, se utilizarán sondas para g.846927A>T, 
g.843669A>T, g.827462G>A, g.476002G>A, g.410273T>G, g.226525A>G, g.42731T>C 
 
Para cada muestra, calcular el número total de reacciones requeridas 
Calcular el volumen total requerido para cada componente de reacción: 
 Volumen por reacción x el número total de reacciones + 10% 
 
 
Componente 
Volumen para una reacción 
20Lμ de reacción 
(Placas de 96 pozos) 
TaqMan Genotyping master mix, 2X 12.5 μl 
Muestra de ADNg 13.75 μl 
Taqman drug metabolism assay 1.25μl 
Total de volumen de super mix 27.5μL 
 
 
 
 
 
 
1. Etiquetar tubos de 1.5 mL, añadir todos los componentes y vortexear 
2. Centrifugar brevemente para eliminar todas las burbujas 
3. Para cada conjunto de replicados, transferir alícuotas de super mix a un tubo, después añadir 
el gen de referencia y alelo mutante (TaqMan mutation detection assay) a cada tubo. 
 
 
Placa de PCR Volumen de super mix 
por reacción 
96 pozos 27.5μL 
 
 
4. Añadir el volumen apropiado mezcla de PCR en cada pozo de reacción de la placa de PCR. 
5. Verificar que no haya presencia de burbujas en el fondo del pocillo, si fuera así, eliminarlas con 
una punta de micropipeta. 
6. Cubrir la placa con una película adhesiva óptica y llevar al equipo de PCR. 
 
 
 
 
Reacción de cadena de polimerasa en tiempo real (qPCR) 
 
Encender el equipo de PCR y el ordenador. En el programa 7500 del sistema QPCR Applied 
Biosystems 7500 Fast: 
17 
 
 
1. Dar click en “7500 Fast Software” para abrir el programa 
2. En la ventana principal, dar click a “Advanced setup” para desplegar en menú de opciones 
3. Etiquetar el nombre del experimento y seleccionar el tipo de placa a utilizar (No. de pozos) 
4. Seleccionar en el tipo de experimento “Genotyping” 
5. Seleccionar el tipo de reactivo (TaqMan) 
6. Seleccionar la velocidad de rampa, la cual, depende de la master mix que se empleará. 
7. Cambiar a la ventana “Plate setup” y seleccionar el número de blancos (8) 
8. Etiquetar cada pocillo iniciando por el gen de referencia y seguido de los blancos para cada 
muestra 
9. Definir muestras seleccionando los pocillos de los blancos para cada muestra presionando la 
tecla “Control”. El etiquetado de muestras se debe realizar después. 
10. Cambiar a la ventana “Run Method” en el cual, el método de corrida ya está preseleccionado. 
Definir el volumen de muestra a utilizar 
11. Cambiar a la ventana “Reaction setup” y definir las concentraciones de la master mix (2.0X) y 
del ensayo (10.0X), automáticamente, aparecerán los volúmenes que se debieron utilizar en la 
preparación de la master. 
12. Dar click en “Start run” y “Ok” 
 
 
 
Análisis de Datos 
 
Los pasos de análisis son: 
 
1. Analizar los datos en el sistema de PCR en tiempo real, utilizando los siguientes ajustes de 
análisis: 
1.1. CT manual (ciclo umbral): 0.2 
1.2. Basal automático: On 
 
El programa del PCR en tiempo real determina los valores CT para el ensayo de detección de 
mutación y las reacciones del Control positivo interno (IPC) 
 
2. Revisar los gráficos de amplificación y/o valores CT para todos los pozos de reacción: 
 
Tipo de reacción Parámetros 
Las muestras analizadas con el gen de 
referencia (FAM) 
Verificar que las curvas de amplificación tengan 
una distintiva, la fase de amplificación linear y 
valores CT estén dentro de un rango de 18-28 
para 20μL y de 17-27 para 10μL 
Muestras analizadas con un mutante alelo 
(FAM) 
Revisar las curvas de amplificación y valores CT. 
Presencia o ausencia de una distintiva, fase de 
amplificación linear y valores CT dependan de la 
cantidad de alelo mutante presente en la 
muestra. 
Muestras control negativo Verificar que las muestras de control negativo 
no estén amplificadas o tengan valores muy 
altos de CT 
18 
 
Muestras de control sin molde Verificar que no estén aplificadas 
Replicados Verificar que los valores entre los replicados 
tengan valores CT de similares 
 
 
 
 
Resultados 
Resultados 
Se incluyeron pacientes con cáncer de esófago de Enero del 2011 a enero del 2013, 56 pacientes 
se incluyeron al estudio, un total de 45 hombres (80.4%) y 11 mujeres (19.6%), con una edad 
media de 64.2 años, 6 pacientes tuvieron localización de esófago superior (10.7%), esófago medio 
14 (25%), inferior 36 (64%), por histología epidermoide 28 (50%), y adenocarcinoma 28 pacientes 
(50%). En etapa clínica I 28 pacientes (50%), III 12 pacientes (21.4%), IV 16 pacientes (28.6%), los 
pacientes que recibieron radioterapia completa 31 pacientes (55.4%), radioterapia incompleta 10 
(17.9%), antecedentes de tabaquismo 32 pacientes con 57.1%, alcoholismo 32 pacientes (57.1%). 
Los pacientes que no presentaron neutropenia 46 pacientes (82.1%)algún grado de neutropenia 
fueron 10 pacientes (17.8%).Diarrea 42 pacientes no presentaron (75%), algún grado de diarrea en 
14 pacientes (25%). Sin ningún grado de mucositis 52 pacientes (92%) con algún grado de 
mucositis 4 pacientes (7.2%), ningún paciente presentó síndrome mano-pie, no presentaron 
anemia 54 pacientes (96%), 2 pacientes presentaron algún grado de anemia (3.5%). 
El IMC promedio fue de 24kg/m2, con mínimo de 15.9kg/m2 y un máximo de 34.4 kg/m2, con 
respecto a la albúmina con media de 3.7 g/dl, mínimo de 2.1g7dl y máximo de 3.7g/dl. 
Hemoglobina media de 14.3g/dl con minino de 4.7g/dl. 
Los pacientes que tuvieron respuesta por biopsia fueron 29 (51.8%), sin respuesta 27 (48.2%), 
respuesta por imagen 35 pacientes (59%), y sin respuesta 21 pacientes (41%). 
Se realizó análisis de regresión logística univariado para identificar factores que estén relacionados 
con la toxicidad a quimioterapia , los resultados se resumen como ORy su respectivo intervalo de 
confianza se tomó como p significativa 0.005, los resultados se enlistan en la tabla 1 . 
Variable OR IC P 
Edad 1.01 0.96-1.06 0.64 
Hemoglobina 0.92 0.67-1.55 0.112 
Albúmina 2.7 0.67-7.08 0.195 
Antígeno 1.00 0.97-1.03 0.766 
19 
 
Carcinoembrionario 
Radioterapia 2.4 0.56-10.1 0.235 
ECOG > 2 1.64 0.97-7.17 0.510 
Etapa clínica 1.00 0.23-3.92 0.999 
Respuesta por imagen 0.58 0.14-2.32 0.447 
Histología 2.77 0.63-12.1 0.174 
Localización 2.57 0.49-13.5 0.264 
Tabaquismo 1.15 0.28-4.76 0.841 
Alcoholismo 2.15 0.46-9.98 0.327 
Respuesta por biopsia 2.54 0.58-11.08 0.213 
Análisis univariado (tabla 1 ). 
Pendiente determinar mutación de DYPD por PCR en tiempo real 
Discusión 
En este estudio el 81% de los pacientes presentaron algún grado de toxicidad durante el 
tratamiento con quimioterapia, no encontramos significancia estadística entre las características 
clínicas, por laboratorio, imagen y patología de los pacientes relacionados con la toxicidad, aunque 
si observamos una tendencia con hemoglobina menor de 10g/dl, albúmina, y con histología 
epidermoide en relación a mayor toxicidad, posiblemente se deba al tamaño de la muestra, aún 
están pendientes los resultados para determinar mutación de DYPD las cuales se anexaran 
posteriormente. 
 
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