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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN PATOGENIA DE LA INFECCIÓN POR Salmonella spp EN REPTILES DEL HERPETARIO REPTILIUM DEL ZOOLÓGICO DE ZACANGO Y DE LA UNIVERSIDAD DE PUEBLA. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: MÉDICA VETERINARIA ZOOTECNISTA P R E S E N T A: LIZBETH GONZÁLEZ CÁCERES ASESOR: DR. GUILLERMO VALDIVIA ANDA COASESOR: M.V.Z RODOLFO CÓRDOBA PONCE CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO. DE MÉXICO 2013 Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ ESTE TRABAJO FUE REALIZADO CON EL APOYO DE LOS PROYECTOS: Programas de Apoyo de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) IT224311-3 Programas de Apoyo de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) IN216005. Programa de Apoyo a Proyectos para el Mejoramiento de la Enseñanza (PAPIME) PE 200707 El trabajo fue realizado con el equipo e instalación del: Laboratorio de Patogenicidad Microbiana de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria en Salud Animal de la FESC, Campo 4 Laboratorio de Diagnóstico Integral Veterinario (DIVET®). Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ AGRADECIMIENTOS EN MEMORIA DE LAURA ALVARADO JIMÉNEZ Y LUIS MANUEL CÁCERES HERRERA A mis abuelitos que me enseñaron ser una mejor persona y saltar cualquier obstáculo. “Como el cantar de un zorzal recuerdo aquel cantar angelical, como aquel danzón sin fin recuerdo esa pareja bailar, como el aire acaricia mi mejilla recuerdo los besos que jamás se borraran, como las lagrimas que recorren mi rostro recuerdo el abrazo de fortaleza que siempre permanecerá” Dra. Lizbeth Cáceres Alvarado: A mi madre por enseñarme a ser una guerrera, aprender de todos y principalmente de mis errores. “Sé como una rosa, la tierra y agua te harán crecer, las espinas trataran de protegerte pero algunas cederán, tus tallos serán rojos y otros se marchitaran, algunos pies trataran de doblar tu tallo pero siempre hallaras una vara y eso, es lo que te hará fuerte” Ing. Ind. Alfonso Ángel González Vilchis: A mi padre por hacerme mirar siempre adelante. “Habrá siempre hoyos en tu camino a veces caerás muy fácilmente y en otras ocasiones hasta tierra tendrás que hacer a un lado, costara trabajo sí, ya que nada es fácil pero siempre, siempre saldrás”. M.V.Z. Pablo Cerritos Alvarez: A ti amor por desvelarte conmigo, por darme las herramientas para salir adelante, por todo lo que hemos realizado juntos y lo que nos falta. “El despertar cada día y lo primero en ver es a ti, ponerme la filipina y estar al lado del mejor maestro, sentir esa mano entrelazada con la mía que guía el bisturí hasta llegar a su objetivo, mirar ese rostro de felicidad y decirle te amo cosa”. Q.F.B. Alfonso Luis González Cáceres: A mi hermano porque nunca se da por vencido no se conforma con poco y lucha por alcanzar sus metas y ser el mejor. Gracias por ser mi inspiración día a día. “El mejor jugador no es aquel que recibe el balón y anota, el mejor jugador es aquel que desde el suelo se levanta y a pesar de todo sigue adelante ganando yardas hasta llegar a las Y “. Te adoro hermanito. Dr. en Psicología Luis Emilio Cáceres Alvarado: A mi tío por compartir su sabiduría y cariño. “Cual rey montado en su corcel y levantando su espada atraviesa un bosque lleno de espinas y charcos que se convierten en lagos traicioneros, pero aferrado a su fiel amigo y con la espada en alto, logra llegar a la cumbre donde el resplandecer del sol lo acompaña” María Teresa González, Guadalupe Vilchis y Alfonso González: A mi tía por siempre escucharme y tener esa palabra de aliento que te levanta el ánimo. A mis abuelos por su cariño. Sólo es útil el conocimiento que nos hace mejores” Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Eleuteria Hernández López: Por abrirme las puertas de su casa, por su alegría, cariño y consejos. Dr. Guillermo Valdivia Anda y M.V.Z. Rodolfo Córdova Ponce: Por su orientación y permitirme trabajar en lo que me gusta. M. en E. Susana Elvira García Vázquez, M. en MVZ Gerardo López Islas, M. en C. Ana María Hernández Villalobos, M. en C. Tiziano Santos Morin: Al jurado por su apoyo y tiempo. MVZ María de la Luz Montero Villeda, MVZ Bernardo Manríquez Novara, M. en C. Alicia López Zamudio: Por brindarme la oportunidad de entrar al mundo de especies exóticas, por su amistad y apoyo. Herpetario Reptilium: MVZ Agustín Álvarez Trujillo por abrirme las puertas, enseñarme el mundo de los reptiles y darme la oportunidad de aprender, Margarita, Dinora, Charly, Rafael por su amistad y apoyo. A mis profesores: Dr. Carlos Gerardo García Tovar, M. en E. Susana Elvira García Vázquez, M. en C. Jorge Alfredo Cuellar Ordaz, M. en A. Jorge López Pérez, DRA. Deneb Camacho Morfín, M.V.Z. Dora Luz Pantoja Carillo, M.V.Z. Victor Quintero Ramírez, M. en C. Ana María Hernández Villalobos, Dr. Fernando Viniegra Rodríguez. Por su enseñanza, paciencia y granito de arena. Amigos: Berenice, Beatriz, Liszet, Rosaura, Melina por su alegría, apoyo, sabiduría y consejos, Cynthia por su paciencia, aprendizaje, experiencias y crecimiento juntas, Alexis por escuchar y su apoyo, Amado por compartir sus conocimientos, Oscar por su orientación y amistad, Idelfonso, Katia, Fatima, Guadalupe, David, Jose Fernando, Samuel, Leonel, Ana, Mayra, Ileana, Prisila, Luis, Marco, Maribel, Adriana, Alma, Margarita, Alan, Gaby, Erick, Ayali, Carolina, Angeles, Selene, Samantha, Gisela, Jakelin, Alejandro, Daniel, Aron, Belisario, Francisco. Gracias por permitirme compartir con ustedes experiencias, por soportarme todos estos años y por su amistad. U.I.M.S.A. Laboratorio tres: Dr. Juan Carlos del Rio por su ayuda, orientación y paciencia, a M.C. Cesar Cuenca Verde por su conocimiento, apoyo y amistad, M.C. Patricia Aranguré por su amistad y apoyo, Erendira, Beatriz, por su amistad, apoyo, porque juntas aprendimos y crecimos, a Daniela, Reina, Liszet, Gaby, Laura, Emmanuel, Tere, Hadad, Tamara, Rosalinda, Enrique, Karina, Ana. Gracias a cada uno de ustedes por su amistad y hacer un buen ambiente de trabajo. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ ÍNDICE 1. Resumen. 1 2. Introducción. 3 3. Antecedentes. 7 4. Objetivos.11 4.1 Objetivo general. 4.2 Objetivos particulares. 5. Hipótesis. 11 6. Justificación. 12 7. Material y métodos. 13 8. Resultados. 22 9. Discusión. 28 10. Conclusiones. 31 11. Literatura citada. 32 Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1. Pruebas Bioquímicas de Salmonella spp 4 Cuadro 2. Animales Trabajados. 23 Cuadro 3. Aislamiento de Salmonella spp. 24 Cuadro 4. Aglutinación Antisuero Polivalente A-I, Vi (BIO-RAD) (SEROBAC). 25 Cuadro 5. Aglutinación Antígeno 35C, 35D. 26 Cuadro 6. Bacterias entéricas también aisladas. 27 Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Lugar de muestreo, Herpetario Reptilium del Zoológico de Zacango. 14 Figura 2. Lugar de muestreo, Herpetario de la Universidad de Puebla. 14 Figura 3. Lugar de muestreo, UMA Amatones. 14 Figura 4. Lugar de muestreo, UMA Laguna de Jade. 14 Figura 5. Lugar de muestreo, Veracruz Salvaje. 15 Figura 6. Obtención de muestras fecales a través de la cloaca de una 15 Iguana, utilizando un hisopo. Figura 7. Obtención de muestras fecales a través de un masaje en el 15 último tercio del cuerpo de una serpiente. Figura 8. Obtención de muestra sanguínea a través de la vena coccígea 20 de una serpiente. Figura 9.Obtención de muestra sanguínea de la vena yugular de una iguana. 20 Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ 1. RESUMEN La salmonelosis es un problema importante en la salud pública y animal, así también los reptiles son importantes como reservorios naturales de Salmonella spp., y su acción como posibles transmisores de esta bacteria al hombre. El presente trabajo fue realizado de Septiembre 2008 a Noviembre 2009 y consistió en el aislamiento de cepas de Salmonella spp a partir de las muestras fecales o cloacales pertenecientes a 119 reptiles ( 52 serpientes, 62 saurios y 5 tortugas), de los cuales 36 pertenecen al Herpetario Reptilium del Zoológico de Zacango (32 serpientes, 1 camaleón, 3 tortugas), 19 del Herpetario en la Escuela Superior de Medicina Veterinaria y Zootecnia A.C. de Puebla (13 serpientes, 4 iguanas, 2 tortugas), 40 de la UMA (Unidad de Manejo Ambiental) Amatones (40 iguanas), 15 UMA Laguna de Jade (15 iguanas) y 9 del Herpetario Veracruz Salvaje (7 serpientes, 2 iguanas). Además de determinar la presencia de anticuerpos séricos contra Salmonella a partir de las muestras sanguíneas de 76 reptiles (31 serpientes y 45 saurios). El estudio se realizó en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, en la Unidad de Investigación Multidiciplinaria (UIMSA). Se realizó la identificación bioquímica de las 289 cepas obtenidas de 119 muestras fecales o cloacales de 119 reptiles, incluidos en 34 especies diferentes. Las muestras se sembraron en medios selectivos de agar Salmonella- Shigella, agar Mac Conkey, agar Sulfito de Bismuto, los cuales se incubaron a 37°C durante 24hr, con medios de enriquecimiento caldo de tetrationato y agar verde brillante los cuales se incubaron a 37°C durante 19hr y a 37°C durante 24hr respectivamente y como medio diferencial se utilizó agar eosina azul de metileno que se incubó a 37°C durante 24h. A las colonias sospechosas se les realizaron las pruebas bioquímicas primarias de tinción de Gram, catalasa, oxidasa y pruebas bioquímicas secundarias como rojo de metilo, Voges Proskauer, Motilidad-Indol-Ornitina, Urea, Citrato, Lisina Hierro Agar, Triple Azúcar Hierro, los cuales fueron incubados a 37°C durante 24hr. Veinticinco de los ciento diecinueve reptiles estudiados que equivale al (21%), resultaron positivos al aislamiento de Salmonella obteniéndose un total de 47 cepas (16%) de 289 cepas que se lograrón aislar en total, correspondiente a 14 serpientes y 11 saurios. También se trabajó con muestras Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ sanguíneas de algunos de los reptiles para determinar la presencia de anticuerpos séricos contra Salmonella spp. obteniéndose como positivos a la aglutinación las cinco muestras sanguíneas. Los resultados indican que aunque en la mayoría de los casos, estos animales se comportan como portadores asintomáticos, en algunas ocasiones y por la actuación de múltiples factores predisponentes, Salmonella spp., puede producir enfermedad en ellos, esto se dedujo al correlacionar los hallazgos de aislamiento bacteriológico, anticuerpos séricos y hábitat. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ 2. INTRODUCCIÓN El género Salmonella está constituido por un grupo de microorganismos con una gran diversidad bioquímica y serológica (Levinson, 2006). Estas bacterias infectan a muchos animales además de los seres humanos; pueden invadir el tejido extra intestinal y producir fiebres entéricas, de las cuales la más grave es la fiebre tifoidea (Joklik et al., 1994 ; Geve y Loschner, 2002). TAXONOMÍA La taxonomía de Salmonella es complicada, debido al desarrollo y al empleo de diversas nomenclaturas a través de los años. El esquema antigénico de Kauffmann-White dio origen a más de 2000 especies de Salmonella, porque cada tipo antigénico que se descubría recibía la designación de especie. Ewing y Col. propusieron que solo hubiera tres especies de Salmonella: Salmonella cholerasuis, Salmonella enteritidis y Salmonella typhi (Gyles et al., 2004). Todas las otras especies o serotipos se definieron como serotipos de Salmonella enteritidis. Con este esquema la Salmonella typhimurium del esquema de Kauffmann-White se convirtió en Salmonella enteritidis serotipo typhimurium, esta designación fue utilizada de 1972 hasta 1983 (Joklik et al., 1994). Esto resulto en la identificación de dos especies, Salmonella bongori y Salmonella entérica la cual se divide en seis subespecies Salmonella entérica (subgrupo I), Salmonella salamae (subgrupo II), Salmonellaarizonae (subgrupo III), Salmonella diarizonae (subgrupo IV), Salmonella houtenae (subgrupo V), Salmonella indica (subgrupo VI) (Quinn y Markey, 2002). La mayoría de los serotipos de Salmonella pertenecen a Salmonella enterica subespecie enterica y habitan en aves y mamíferos (Dwight et al., 2004). Cualquier microorganismo puede asociarse con enfermedad en el hombre, la mayor parte de los aislamientos humanos se encuentran en el subgrupo I (Martínez, 1995 ; Mitchell et al., 2001). Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ CARACTERÍSTICAS BIOQUIMICAS La Salmonella es una bacteria gram negativa, anaerobia facultativa, no fermenta la lactosa con excepción de Salmonella entérica subespecie arizonae y diarizonae, crece a 37°C y pertenece a la familia Enterobacteriaceae. La mayor parte de las cepas son móviles y producen ácido sulfhídrico a partir de una fuente inorgánica de tiosulfato de azufre excepto la especie typhi, casi todos los aislamientos producen gas a partir de la glucosa (Joklik et al., 1994). Cuadro 1. Pruebas Bioquimicas de Salmonella spp. PRUEBA BIOQUIMICA RESULTADO Rojo de Metilo Positiva Voges-Proskauer Negativa Urea Negativa Citrato Positiva Motilidad Positiva Indol Negativa Ornitina Positiva Lisina Hierro Agar Positiva Ácido Sulfhídrico Positiva Las tres especies de Salmonella y las seis subespecies de Salmonella enterica pueden ser diferenciadas por estas pruebas bioquímicas (Gyles et al., 2004). ESTRUCTURA ANTIGÉNICA Los antígenos H y O son los principales antígenos utilizados en la serotipificación de la Salmonella. Los antígenos O son similares a los de otras enterobacterias, pero los antígenos H son diferentes en el sentido de que son difásicos, es decir tienen dos fases Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ antigénicas mayores; la fase 1 o fase específica donde los antígenos son compartidos por pocos microorganismos y solo reaccionan con antisueros homólogos (Ebans et al., 2005). Mientras que los antígenos de la fase 2 o fase no específica reaccionan con antisueros heterólogos y muchos microorganismos comparten los antígenos (Grimont et al., 2000). En el actual formato de Kauffmann-White que divide a la Salmonella en grupos serológicos mayores designados con las letras mayúsculas A a I, sobre la base de antígenos O comunes. (Joklik et al., 1994). Los antígenos capsulares desempeñan un papel menor en la clasificación del género, ya que no todos los serotipos de Salmonella lo tienen. Los antígenos Vi (polisacáridos capsulares) son antifagocíticos y constituyen importantes factores de virulencia para Salmonella typhi. El antígeno Vi del serotipo typhi puede impedir la destrucción del microorganismo en estado intracelular (Levinson, 2006). HOSPEDADORES ESPECÍFICOS El reservorio del género de Salmonella es el tracto intestinal de los animales de sangre caliente y fría (Mader, 2006). Las fuentes de contaminación incluyen suelos contaminados, vegetación, agua y productos de origen animal como carne, leche, huevo, harina de pescado y las heces de animales infectados (Songer y Post, 2005 ; Silvia, 2003 ; Mitchell y Shane, 2000). Salmonella enterica serovariedades typhi y paratyphi se ha logrado aislar de humanos, Salmonella dublin en ganado, Salmonella choleraesuis en cerdos, Salmonella pullorum y Salmonella gallinarum en aves, Salmonella abortus equi en equinos, Salmonella abortus ovis en borregos y Salmonella entérica subespecies arizonae y Salmonella entérica subespecies diarizoniae son generalmente aisladas de reptiles. (Mader, 2006) Los saurios y las serpientes usualmente son asintomáticos y comúnmente infectados con diferentes serotipos. Salmonella entérica subespecie entérica solo se ha logrado aislar de mamíferos y aves. (Gyles et al, 2004 ; Dwight et al., 2004). Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ PATOGÉNESIS Aunque muchos aspectos de la patogenia de Salmonella, son poco conocidos, en particular la relación entre las toxinas de Salmonella y el daño celular, así como algunas de las características generales asociadas con la virulencia (Quinn y Markey, 2002). La virulencia de Salmonella se basa en la habilidad de invadir las células del hospedador, replicarse en ellas y resistir la digestión por los fagocitos y la destrucción de los componentes del complemento del plasma. Después de la adhesión, probablemente a través de la fijación fimbrial a la superficie de las células de la mucosa intestinal, la bacteria induce la destrucción de las membranas celulares. Lo que facilita la absorción de las bacterias en las vesículas de membrana, que a menudo se unen (Gyles et al., 2004). El organismo se replica en estas vesículas y eventualmente son liberados de la célula, que sostienen sólo daños leves o transitorios. El proceso de invasión es mediado por un número de genes cromosómicos, mientras que el crecimiento en las células del huésped depende de la presencia de plásmidos de virulencia. La resistencia a la digestión por los fagocitos y la acción letal de los componentes del complemento facilita la propagación del organismo dentro de los hospederos. Los efectos tóxicos de la oxidación de radicales libres producidos por los fagocitos reducen al mínimo las actividades bacterianas de catalasa y superóxidodismutasa. La resistencia del complemento es parcialmente dependiente de la longitud de las cadenas de antígeno O de los lipopolisacáridos (Levinson, 2006). Las largas cadenas de los lipopolisacaridos previenen a los componentes del complemento de la forma de complejo de ataque a la membrana y la interacción con daños en la membrana de la célula bacteriana. El lipopolisacárido es responsable también de los efectos endotóxicos de las salmonelosis, esto puede contribuir a la inflamación local como respuesta a los daños de las células intestinales epiteliales y dando como resultado el desarrollo de una diarrea (Songer y Post, 2005). DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO El aislamiento de Salmonella spp. constituye un diagnóstico de laboratorio positivo para la enfermedad de Salmonelosis (Levinson, 2006). Durante los estadíos agudos de la Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ gastroenteritis el número de microorganismos en las heces es abundante por lo que la materia fecal es la muestra de elección. La Salmonella puede aislarse en cualquier medio empleado para el aislamiento de bacterias entéricas incluyendo Mac Conkey y Eosina Azul de Metileno (Joklik et al., 1994). La sangre es la mejor muestra para la detección de una septicemia (Dwight et al., 2004). A la necropsia se observa una gastritis, enteritis o gastroenteritis necrótica, con depósitos de fibrina (secreción inflamatoria) en toda la mucosa intestinal y gástrica. También se encuentra ensanchada esta mucosa, enrojecida (enteritis hemorrágica en muchas ocasiones) y repleta de células inflamatorias (leucocitos) y bacterias. Puede o no haber hepatitis asociada, viéndose en ese caso un punteado amarillento difuso en toda la estructura del hígado. (Jacobson et al., 2007). Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ 3. ANTECEDENTES Los microorganismos pueden interaccionar con los animales en varias formas; como simbiontes, comensales, saprófitos o como patógenos. Los patógenos a su vez pueden establecer estados de desequilibrio con el medio ambiente y el hospedador desarrollando procesos de enfermedad, de portador yde reservorio; las interacciones entre ellos y el hospedador pueden ser evaluadas de diversas maneras .Por medio de la histopatología, el desarrollo, tipo de anticuerpos y alteraciones fisiológicas de los organismos (Mader, 2006). Se considera a los reptiles como portadores asintomáticos de Salmonella y en algunas referencias se les involucra como microbiota normal de los reptiles, considerando que tienen un papel como saprófitos en ellos, pero que bajo ciertas condiciones pueden desarrollar enfermedad. Estas interacciones exigen establecer medidas de cuarentena y de prevención en los animales (Girling y Raiti, 2004). Es común que en las colecciones herpetológicas se cuente con un área de cuarentena para los animales que ingresan a la colección, en ella permanecen de 30 a 45 días dependiendo del manejo particular; sin embargo dadas las altas condiciones de estrés a las que se somete a los animales silvestres desde su captura hasta su depósito en una colección, es muy posible el desarrollo de enfermedades en ellos; pero el tiempo que pasa desde su ingreso hasta la expresión de enfermedad es altamente variable (Mader, 2006 ; Fowler, 1986 ; Frank et al 2006). El primer caso en reptiles de Salmonella se dio en 1944 en serpientes (Mitchell y Shane, 2000), la importancia zoonótica de la salmonelosis fue reconocida cuando un niño de siete meses adquirió la enfermedad de una tortuga que mantenían como mascota. En 1946, se había descubierto el riesgo potencial al aislar Salmonella spp. de tortugas Salmonella hartford y otros dos serotipos de Salmonella fueron aislados en tortugas (Guillou et al., 2007 ; Martínez y Soler, 2001). En 1968, en respuesta a la asociación de salmonelosis humana y tortugas mantenidas como mascotas, el estado de Washington emitió una legislación según la cual las tortugas vendidas en este Estado deben de tener un certificado de que están libres de Salmonella. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Esto era imposible, ya que no hay forma de demostrar que una tortuga está libre de Salmonella spp., en gran parte debido a la variabilidad en la excreción del microorganismo, esta regulación paró el comercio de tortugas en Washington. Subsecuentemente, los departamentos de salud pública de otros estados inspeccionaron la incidencia de tortugas asociada a salmonelosis (Mader, 2006). En Nueva Jersey, en 124 familias con niños de uno a diez años diagnosticados con salmonelosis, se encontró que el 22.7% eran propietarios de tortugas contra solo un 5.7% de las familias control. El serotipo más frecuentemente aislado fue Salmonella java. La enfermedad era mucho más común en los propietarios de tortugas que en los vecinos de sus alrededores (Martínez y Soler, 2001). Entre 1965 y 1968 en Seattle-King Country área de Washington vieron que la legislación no había, provocado ningún efecto en la incidencia de la Salmonelosis. Los niños menores de diez años eran los que tenían mayor riesgo. Y eran una proporción significativa (30.3- 30.6%) en la asociación tortugas-Salmonella, en 1968-69 se promulgó la regulación. Otros estudios epidemiológicos demostraron que el 14% de los casos de salmonelosis en Estados Unidos tenían relación con tortugas. Esto basado en un cálculo aproximado de que 15 millones de tortugas que fueron vendidas anualmente en Estados Unidos en 1971, con una vida media en cautiverio de dos meses, y 60 millones de familias con un 4.2% propietarias de tortugas. Basado en una estimación de 15 millones de tortugas vendidas anualmente, el riesgo de infectarse con Salmonella proveniente de tortugas era aproximadamente del 2% (Martínez y Soler, 2001). En 1972, el Departamento de Salud, Educación y Bienestar Social, Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA), prohibieron la importación de tortugas, huevos de tortugas y el transporte interestatal de las tortugas sin certificado libre de Salmonella spp. El certificado se daba tras la detección de excreción de Salmonella spp mediante el estudio bacteriológico del agua donde habían permanecido las tortugas durante 72 horas, esto se le realizaba a 60 tortugas de cada a lote a comercializar. Este método fallaba, ya que tortugas con el certificado de libres de Salmonella luego se demostraba que tenían Salmonella (Madsen, et al., 1994 ; Capewell, 2011). Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Actualmente se conocen más de 2000 serotipos de Salmonella implicadas en zoonosis reptilianas. Algunos de estos serotipos pueden aislarse de cualquier reptil y son diferentes de los comúnmente asociados con la enfermedad humana. La variabilidad en la excreción de Salmonella spp por los reptiles contribuye a la dificultad de aislar los organismos e identificación de portadores. En tortugas que son consideradas negativas por análisis cloacal rutinario y análisis de agua durante periodos de 6 meses puede activarse la excreción del organismo. La fase latente de excreción puede verse interrumpida por el estrés. Un organismo puede ser positivo en cultivo de heces o de cloaca y negativo el día siguiente (Martínez et al., 2001). Las tortugas están infectadas entre un 12% y un 85%, las serpientes entre un 16% y un 92% y los lagartos entre un 36% y un 77%. (Aguillon et al., 2007). La infección por Salmonella en reptiles usualmente no muestra signos de enfermedad, y la relación suele ser saprofita. Las infecciones experimentales en serpientes, tortugas y lagartos por inoculación oral produjo eliminación fecal con enfermedad observable en el hospedador o formación de aglutinaciones, indicadoras de algún tipo de respuesta inmunológica. La infección vía subcutánea, intracardiaca o intraperitoneal produjeron la evolución de aglutinaciones específicas. Algunos tipos de Salmonella pueden estar implicados en enfermedades espontáneas en reptiles con manifestaciones de septicemia, neumonía, celomitis, abscesos, granulomas, shock hipovolémico y muerte (Mader, 2006). Los Reptiles, incluyendo lagartos y serpientes están implicados en casos de salmonelosis humana y es causa de infección en ganado y aves de corral. Según los Centros de Control de Enfermedades (Center for Disease Control (CDC)) Salmonella marina es poco común como causa de enfermedad en humanos. Desde 1979 a 1989 en CDC recibió notificación de solo 18 aislamientos en humanos y 28 aislamientos de animales en los Estados Unidos. De los 28 aislamientos no humanos, 19 eran de reptiles y 9 de estos de iguanas (Martínez et al., 2001). El problema de la Salmonella spp se agrava porque se exige un certificado de salud para importar reptiles, pero no se exige cuarentena o inspecciones sanitarias. Por esto aunque Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ los animales no lleguen infectados a la tienda de animales, pueden infectarse por el contacto con otros reptiles o por medio de fómites. (Mader, 2006). El tamaño de los reptiles hace que en muchas ocasiones se produzcan compras compulsivas e incluso que se piense en estos como mascotas para los niños; los cuales, junto a los ancianos e inmuno suprimidos, son los que tienen un mayor riesgo potencial de sufrir esta zoonosis. (Pough et al., 2004). Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ 4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general: Evaluar el papel patológico de Salmonella spp. en reptiles mantenidos en cautiverio en el Herpetario Reptilium del Zoológico de Zacango y en el Herpetario de la Universidad de Puebla. 4.2 Objetivos particulares: 1.- Detectar la presencia deSalmonella spp mediante cultivos bacteriológicos de heces en los reptiles mantenidos en cautiverio. 2.- Determinar la presencia de anticuerpos séricos contra las Salmonellas spp en los reptiles positivos. 3.- Correlacionar los hallazgos de anticuerpos séricos, aislamiento bacteriológico, hábitat, especie animal y aspectos comunitarios para establecer el papel patogénico de Salmonella en los reptiles. 5. HIPÓTESIS La infección por Salmonella spp en reptiles en cautiverio tiene un papel como patógeno. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ 6. JUSTIFICACIÓN Hace algunos años los reptiles no eran considerados como mascotas y su presencia era limitada en lugares específicos incluyendo zoológicos y herpetarios (John et al., 1997). Pero en los últimos diez años se ha observado un incremento de la importancia de las especies silvestres como mascotas principalmente las tortugas terrestres, tortugas acuáticas, saurios y serpientes. (Mader, 2006) Debido a la importancia que tienen los reptiles como mascotas actualmente y a la poca información que se tiene sobre los microorganismos patógenos que los afectan, especialmente serovariedades de Salmonella spp el impacto de esta en la salud humana y animal ha creado la necesidad de métodos rápidos para su detección. Salmonella spp en reptiles se puede presentar como una infección inaparente (Mader, 2006), Salmonelosis es una de las enfermedades infecciosas más importantes tanto en humanos como en animales alrededor del mundo (Frank et al., 2005). Los reptiles pueden infectarse de Salmonella spp mediante el contacto directo con otro reptil infectado (Frank et al., 2002), mientras que los casos de salmonelosis en humanos son asociados al alimento pero actualmente se ha notado un incremento en los casos de salmonelosis en humanos después del contacto con reptiles (Hemsworth et al., 2006 ; Hidalgo y Perèz, 2008). Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ 7. MATERIAL Y MÉTODOS DESCRIPCIÓN DEL ÁREA DE ESTUDIO El Herpetario Reptilium del Zoológico de Zacango se encuentra en Santa María Nativitas, Calimaya, Estado de México a 10 km de Toluca, por la carretera 55 a Ixtapan de la Sal, Vía Metepec. Tiene una altitud de 2910 m sobre el nivel del mar, por lo que la mayor parte del año presenta un clima semifrío, con temperaturas entre los 12ᵒC a 16ᵒC. El Herpetario de la Escuela Superior de Medicina Veterinaria y Zootecnia de A.C. está ubicada en Cholula, Centro Atzompa de los reyes, calle Victoria No. 31. Se encuentra a 2150 metros sobre el nivel del mar. UMA “Los Amatones” , ubicado en el km 1 de la carretera Tlalixcoyan- Piedras Negras del Ejido Los Amatones en el municipio de Tlalixcoyan , Veracruz, dentro de las coordenadas geográficas 18ᵒ 48´ de Latitud Norte y 96ᵒ 04´ de Longitud Oeste, con una altitud de 10 metros sobre el nivel del mar. Se sitúa en la región climática “Am” que corresponde al tipo cálido húmedo con una precipitación media anual de 1,302.2 mm. y presenta un período de sequía de seis meses al año. La temperatura media anual es de 25.8ᵒC. Su vegetación es de tipo selva baja caducifolia, sabana y vegetación secundaria. UMA “Laguna de Jade” Municipio Tierra Blanca Veracruz. El municipio de Tierra Blanca posee 1,467 km², está ubicado en las coordenadas 18ᵒ 27´ latitud norte y 96ᵒ 21´ longitud oeste. Posee una altitud de 60msnm y limita al norte con Omealca, Cotaxtla y Tlalixcoyan, al sur con el estado de Oaxaca, Tres Valles y Cosamaloapan, al este con Ixmatlahuacan e Ignacio de la llave y al oeste Omealca y el estado de Oaxaca. Su clima va de cálido a sub- húmedo. (López, 2008) “Veracruz Salvaje” se localiza en Manuel Avila Camacho No. 1395 Col. Flores Magón. Colinda al norte con el municipio de La Antigua y el Golfo de México; al sur con los municipios de Medellín y Boca del Río; al este con el Golfo de México y al oeste con los Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ municipios de Manlio Fabio Altamirano y Paso de Ovejas. Altitud de 1 msnm. Latitud 19ᵒ 12´30” Norte y longitud 096ᵒ 07´59” Oeste. El clima es tropical cálido, con una temperatura media anual de 25.3 °C y precipitación media anual de 1500 mm. En las figuras de la 1 a la 5 se muestran algunas imágenes de los sitios muestreados. Figura 2. Herpetario de la Universidad de Puebla Figura 1. Herpetario Reptilium del Zoológico de Zacango Figura 4. UMA Laguna de Jade Figura 3. UMA Amatones Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Los aislamientos se obtuvieron a partir de un muestreo al azar de 36 reptiles del Herpetario Reptilium del Zoológico de Zacango, 19 reptiles del Herpetario de la Universidad de Puebla, 40 reptiles de Amatones, 15 reptiles de Laguna de Jade y 8 reptiles del Herpetario Veracruz Salvaje. AISLAMIENTO DE Salmonella spp El presente trabajo se realizó en el laboratorio 3 de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria en Salud Animal (UIMSA) de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM. Carretera Teoloyucan Km. 2.5 Colonia San Sebastian Xhala, Cuautitlán Izcalli. Esta zona se orienta geográficamente a 19ᵒ 40´50” latitud norte y a los 99ᵒ 12´25” longitud oeste, su altura sobre el nivel del mar es de 2252m. La temperatura promedio anual en esta área es de 16ᵒC y cuenta con 600mm de precipitación pluvial. Todas las muestras una vez sembradas por la técnica Americana en agar Mac Conkey (MAC) (BBL)®y agar Eosina Azul de Metileno (EMB) (Bioxon)®fueron incubadas a 37°C por 24 horas, en estos dos cultivos exclusivamente se realizó observación de la morfología colonial incluyendo crecimiento, tamaño, pigmentación, características ópticas, forma, márgenes, elevación y color, el mismo día también se incubaron en Caldo Tetrationato (Bioxon)® incubado a 37°C por 19 horas, después se sembraron en agar Salmonella Shigella (SS) (Bioxon)®, agar Verde Brillante (VB) (Bioxon)®, agar Sulfito de Bismuto (SB) (Bioxon)® 37°C por 24 horas, se seleccionaron 5 colonias características de Salmonella y se sembraron por la técnica Americana en agar Nutritivo (AN)(BBL) incubando a 37°C por 24 horas una vez obtenidas colonias aisladas se procedió a realizar la clonación de colonias las cuales fueron sembradas nuevamente en agar Nutritivo (AN)(BBL) incubado a 37°C por 24 horas, se efectuó la identificación bioquímica (Bailon L, et al., 2004). En total se obtuvieron 5 cepas de cada caso. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Las cepas fueron codificadas para un manejo adecuado con las siglas LGC (Lizbeth González Cáceres) seguidas de un número progresivo de acuerdo al orden en que se obtuvieron y trabajaron. IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA Se realizaron las siguientes pruebas primarias: Tinción de Gram Se procedió a preparar un frotis con una asada de la colonia de la bacteria elegida, la cual se colocó en un portaobjetos y se agregó una asada de solución salina fisiológica se hicieron movimientos en forma circular con el asa, posteriormente este frotis se paso por el mechero hasta que la muestra se fijó y se procedió a teñirla, se colocó el colorante Cristal Violeta por 1 minuto y se lavo, después se colocó Lugol por 1 minuto y únicamente se decantó posteriormente se decoloró con Alcohol-Acetona por no más de tres segundos y se lavó, por último se tiñó con Safranina durante 1 minuto, se lavó, secó y observóal microscopio para identificar las bacterias Gram positivas o Gram negativas (Bailon L, et al., 2004). Catalasa Con un asa de inoculación, se transfirió la bacteria del centro de una colonia a la superficie del portaobjetos. Se agregó 1 ó 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3%. Si hubo efervescencia (burbujas) se consideró catalasa positiva y si no se observo efervescencia se consideró catalasa negativo (Bailon L, et al., 2004). Oxidasa Se virtió el reactivo de 1% de Tetrametil-p-phenylendiamina en solución en la caja de Petri conteniendo el papel filtro, con un palillo de madera se transfirió la bacteria del centro de la colonia a la zona mojada por el reactivo. Una reacción positiva se indicó por la apariencia de un color púrpura oscuro en el papel filtro en menos de 10 segundos mientras que una reacción negativa se indicó por la ausencia del color purpura en el papel filtro (Bailon L, et al., 2004). Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ OBTENCIÓN DE MUESTRAS En saurios y tortugas se recolectaron muestras de heces mediante un hisopo por vía rectal Fig. 6, las muestras se manejaron en caldo nutritivo como medio de transporte. En serpientes las muestras de heces se obtuvieron por medio de un masaje en el último tercio del cuerpo, Fig. 7 las heces se manejaron en bolsas estériles y en refrigeración como transporte. Al día siguiente fueron sembradas en agar Mac Conkey, agar Eosina Azul de Metileno y en Caldo Tetrationato (Levinson Warren, 2006). Figura 5. Herpetario Veracruz Salvaje Figura 6. Obtención de muestra fecal a través de la cloaca de una iguana utilizando un hisopo. Figura 7. Obtención de muestra fecal a través de un masaje en el último tercio del cuerpo de una serpiente. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Pruebas Secundarias: Rojo de Metilo y Voges Proskauer (MR-VP) (Bioxon)® Con un asa de inoculación se tomó una muestra de la colonia y se inoculó por agitación del asa en el medio líquido se incubó a 37ᵒC durante 24 h, posteriormente en Rojo de Metilo se agregaron 4 gotas del reactivo rojo de metilo y si el medio viró a rojo se consideró positivo si permaneció amarillo se considero negativo. En cuanto a Voges Proskauer si después de agregar 3 gotas de alfa naftol y 3 gotas de hidróxido de potasio al 40% se volvió rosa o rojo el medio se considero positivo si permaneció amarillo se considero negativo (Bailon L, et al., 2004). Urea (Bioxon)® Se inoculó por medio de agitación del asa bacteriológica, se incubó a 37ᵒC durante 24h, se consideró positivo cuando hay un vire a rosa mexicano y negativo cuando se quedó rosa (Bailon L, et al., 2004). Citrato de Simmons (Merck)® Se inoculó por estría continua en la superficie, se incubó a 37ᵒC durante 24h y se consideró positivo si se cambio a color azul el medio y negativo si se quedó de color verde (Bailon L, et al., 2004). Pruebas Múltiples: Movilidad, Indol y Ornitina (MIO) (Bioxon)® Se inoculó por picadura, se incubó a 37ᵒC durante 24h y se consideró movilidad positiva cuando se presenció un enturbamiento del medio si solo se observó desarrollo en la zona de la picadura se consideró movilidad negativa. En cuanto a la interpretación de indol si después de agregar una o dos gotas del reactivo de Kovacs se formó un anillo rojo se consideró positivo y negativo de formarse un anillo amarillo. Para la interpretación de descarboxilación de la ornitina se considero positivo cuando cambio a color purpura el medio y se consideró negativo cuando cambio a color amarillo el medio de la ornitina (Bailon L, et al., 2004). Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Triple Hierro Azúcar (TSI) (Bioxon)® Se inoculó por picadura en el fondo y estría en la superficie, se incubó a 37ᵒC durante 24h. Cuando se observó fermentación de la glucosa solamente la flauta se puso roja y el fondo amarillo, cuando hubo fermentación de glucosa y lactosa la flauta y fondo fueron amarillos, si no se presenció fermentación de glucosa ni lactosa la flauta se pusó roja y el fondo no tuvó cambios de color o se quedó rojo, se observaron burbujas en el medio con la producción de gas y una coloración negra del medio con la producción de acido sulfhídrico. Lisina Hierro Agar (LIA) (Bioxon)®. Se inoculó por picadura en el fondo y estría en la superficie, se incubo a 37ᵒC durante 24h. Cuando hubó descarboxilación de la lisina el medio se volvió de color morado más intenso cuando no hubo descarboxilación de la lisina el medio se puso de color amarillo, cuando el medio se puso rojo es que hubo desaminación y cuando en el medio hubo una coloración negra es que hubo producción de acido sulfhídrico (Bailon L, et al., 2004). Una vez realizadas las pruebas primarias, secundarias y múltiples se realizó la clasificación de la bacteria mediante el Manual for the identification of medical bacteria (Mac Faddin, 1990). MUESTREO SANGUÍNEO Se obtuvó a partir de 11 reptiles del Herpetario Reptilium del Zoológico de Zacango y 14 reptiles del Herpetario de la Universidad de Puebla. Se recolectaron muestras sanguíneas mediante jeringas de 1ml, 3ml o 5ml dependiendo del tamaño del reptil con 0.1ml de Heparina INHEPAR (PISA) por cada mililitro, la punción se realizó en serpientes en la vena coccígea y en saurios en la vena coccígea o vena yugular (Mader, 2006), posteriormente la muestra se introdujó en un tubo de DRY EDTA (Venoject II) y en tubo de gel AUTOSEP (Venoject II) y se pusieron en refrigeración como Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ medio de transporte y al día siguiente se procesaron en el laboratorio (Feldeman et al., 2000 ; Voight, 2000 ; Reagane e Irizarry, 2008). AGLUTINACIÓN Aglutinación Antisuero Polivalente A-I, Vi (BIO-RAD) (SEROBAC) En un tubo de ensaye se pusieron 400 microlitros de solución salina y se agregó con un asa de inoculación la muestra de la bacteria previamentesclasificada como Salmonella spp y por medio de agitación con el asa bacteriológica hasta que quedó turbio. Posteriormente en un portaobjetos se pusieron tres asadas del contenido del tubo de ensaye y se agregaron 50 microlitros del antisuero, mientras que nuestro testigo se preparó poniendo en un portaobjetos 50 microlitros de solución salina y tres asadas de la bacteria. Figura 8. Obtención de muestra sanguínea a través de la vena coccígea de una serpiente. Figura 9. Obtención de muestra sanguínea de la vena yugular de una iguana. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Aglutinación Antígeno 35C y Antigeno 35D Con las cepas LGC-35C y LGC 35D se preparó una solución de Antígeno para realizar prueba de aglutinación en busca de Anticuerpos en animales sospechosos al aislamiento de Salmonella spp. En un portaobjetos se colocaron 50 microlitros de Antígeno 35C o Antígeno 35D y se añadieron a cada uno 50 microlitros del plasma problema, se mezcló con movimientos circulares por 5 minutos y se observó al microscopio a 10x para ver la aglutinación. Para el control negativo se utilizó solución salina en lugar de plasma. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ 8. RESULTADOS De los 119 reptiles evaluados en este estudio se obtuvieronun total de 289 cepas, a las cuales se les realizó la identificación bioquímica, obteniendo 47 (16%) cepas de Salmonella spp. y 244 (84.4%) cepas pertenecientes a otros géneros lo cual se muestra en los cuadros 1, 2, 3 y 5. En el Herpetario Reptilium de 36 reptiles muestreados solo 13 (36%) de los cuales 8 sanos y 5 enfermos fueron positivos a Salmonella spp. En el Herpetario de la Universidad de Puebla de 19 reptiles sin historia clínica 4 (21%) fueron positivos a Salmonella spp. En la UMA “Amatones” de 40 reptiles sin historia clinica, 1(2.5%) fue positivo al aislamiento de Salmonella spp. En la UMA “Laguna de Jade” de 15 reptiles sin historia clinica, 5 (33%) fueron positivos al aislamiento de Salmonella spp. En cuanto al Herpetario de Veracruz Salvaje de 8 reptiles con irregularidad en el consumo de alimento, solo 1 (11%) fue positivo al aislamiento de Salmonella spp. (Cuadro 2) El resultado de la aglutinación con el suero polivalente a las 47 cepas de Salmonella, 40 fueron positivas a la prueba de aglutinación con suero polivalente. (Cuadro 3) En la aglutinación del plasma de reptiles positivos al aislamiento de Salmonella spp con las cepas aisladas de Salmonella spp 35C y 35D fueron positivos en los cinco casos como lo podemos observar en el cuadro 4. Aparte del aislamiento de Salmonella spp se lograrón aislar otras bacterias de importancia para los reptiles. (Cuadro 5) Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Cuadro 2. Animales Trabajados GÉNERO ESPECIE CANTIDAD GÉNERO ESPECIE CANTIDAD Agkistrodon bilineatus 2 Ctenosaura pectinata 1 Agkistrodon contortrix 1 Drymarcon corais 1 Artropoides mexicanus 1 Elaphe guttata albina 1 Atropoides olmec 1 Eunectes notaetus 1 Bitis gabonica 1 Ghoperus berlandieri 2 Boa constrictor 3 Iguana iguana 60 Botriechis schlegeli 1 Leiheterodon madagascariensis 1 Bothrops asper 2 Morelia viridis 1 Chamaeleo melleri 1 Naja kaouthia albina 1 Charina trivirgata 4 Naja sp 2 Chelios fimbriatus 1 Oxibelis fulgidus 1 Crotalus molossus 1 Phyton burmes 1 Crotalus molossusnigrescens 2 Pituophis deppei 7 Crotalus polystictus 1 Phyton molurus 2 Crotalus rabus 3 Phyton regius 2 Crotalus scutulatussalvini 1 Phyton sp 1 Crotalus simus 2 Trachemys scriptaelegans 2 Crotalus triseriatus 3 TOTAL: 119 Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Cuadro 3. Resultados de los aislamientos de Salmonella spp.realizados a partir de las muestras de reptiles. CASO AISLAMIENTO PCR GEN InvA CASO AISLAMIENTO PCR GEN invA LGC/ 4D Salmonella spp. NEGATIVO LGC/ 39 E Salmonella spp. NR LGC/ 4E Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 40 A Salmonella spp. NR LGC/ 6D Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 40 C Salmonella spp. NR LGC/ 6E Salmonella spp. NR LGC/ 42A Salmonella spp. NR LGC/ 12C Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 46A Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 13C Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 46B Salmonella spp. NR LGC/ 16D Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 46C Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 16E Salmonella spp. NR LGC/ 46D Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 17D Salmonella spp. NR LGC/ 46 E Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 18D Salmonella spp. NR LGC/ 49D Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 19A Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 49E Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 19B Salmonella spp. NR LGC/ 51A Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 20A Salmonella spp. NR LGC/ 51B Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 20B Salmonella spp. NR LGC/ 51C Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 22A Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 51D Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 22B Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 51E Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 22C Salmonella spp. NR LGC/ 70A Salmonella spp. NR LGC/ 31C Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 100A Salmonella spp. NR LGC/ 31 D Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 102A Salmonella spp. NR LGC/ 31E Salmonella spp. POSITIVO LGC/ 104A Salmonella spp. NR LGC/35C Salmonella spp. NR LGC/ 105A Salmonella spp. NR LGC/ 35D Salmonella spp. NR LGC/ 111A Salmonella spp. NR LGC/ 39B Salmonella spp. NR LGC/ 113A Salmonella spp. NR LGC/ 39D Salmonella spp. NR *NR= No Realizado Salmonellas spp que se lograrón aislar pudieran pertenecer a alguno de los siguientes grupos: Salmonella kaufmannii, Salmonella enterica, Salmonella enteritidis serotipo xyz, Salmonella subgenus I, Salmonella salamae, Salmonella dar-es salaam, Salmonella subgenus II, Salmonella arizonae, Salmonella subgenus III Arizona arizonae A. hinshawii. Mientras se realizó este trabajo en otro se realizó la técnica de PCR con el oligonucleótido del gen InvA de algunas de las cepas. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Cuadro 4. Resultado de la Aglutinación con Antisuero Polivalente CASO Antisuero Polivalente A-I, Vi (BIO-RAD) (SEROBAC) CASO Antisuero Polivalente A-I, Vi (BIO-RAD) (SEROBAC) LGC/ 4D Negativo LGC/ 39 E Negativo LGC/ 4E Positivo LGC/ 40 A Positivo LGC/ 6D Positivo LGC/ 40 C Positivo LGC/ 6E Positivo LGC/ 42A Negativo LGC/ 12C Positivo LGC/ 46A Positivo LGC/ 13C Positivo LGC/ 46B Positivo LGC/ 16D Positivo LGC/ 46C Positivo LGC/ 16E Positivo LGC/ 46D Positivo LGC/ 17D Positivo LGC/ 46 E Positivo LGC/ 18D Positivo LGC/ 49D Positivo LGC/ 19A Positivo LGC/ 49E Positivo LGC/ 19B Positivo LGC/ 51A Positivo LGC/ 20A Positivo LGC/ 51B Positivo LGC/ 20B Positivo LGC/ 51C Positivo LGC/ 22A Positivo LGC/ 51D Positivo LGC/ 22B Negativo LGC/ 51E Positivo LGC/ 22C Positivo LGC/ 70A Positivo LGC/ 31C Positivo LGC/ 100A Positivo LGC/ 31 D Positivo LGC/ 102A Positivo LGC/ 31E Positivo LGC/ 104A Positivo LGC/35C Positivo LGC/ 105A Positivo LGC/ 35D Positivo LGC/ 111A Positivo LGC/ 39B Negativo LGC/ 113A Negativo LGC/ 39D Negativo Se utilizó el antígeno polivalente A-I, Vi (Bio Rad ®) Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Cuadro 5. Resultados de la Aglutinación empleando las cepas aisladas de Salmonella 35C, 35D. PLASMA PROVENIENTE DE ANTIGENO 35C ANTIGENO 35D REPTIL 12 POSITIVO POSITIVO REPTIL 13 POSITIVO POSITIVO REPTIL 100 POSITIVO POSITIVO REPTIL 102 POSITIVO POSITIVO REPTIL 113 POSITIVO POSITIVO El antígeno se preparó utilizando las cepas de Salmonella 35C y 35D, se colocaron 10ml del plasma y 10ml de la suspensión bacteriana. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ Cuadro 6. Otras bacterias aisladas durante el presente trabajo a partir de heces de los reptiles. ESPECIE GENERO Proteus morganii Proteus spp Citrobacter freundii Citrobacter koseri Citrobacter spp Klebsiella ozaenae Yersenia enterocolitica Yersenia spp Pseudomona picketti Pseudomona pseudomallei Escherichia coli Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ 9. DISCUSIÓN En cuanto al estado de salud de los reptiles del Herpetario Reptilium de Zacango, 18 reptiles estaban aparentemente sanos y 18 reptiles presentaron algún padecimiento de acuerdo a los datos que se lograron obtener de la amnamesis. En el Herpetario de la Universidad de Puebla, UMA “Amatones”, UMA “Laguna de Jade” y en Veracruz Salvaje 8 reptiles, ninguno de los lugares mencionados contaba con historia clínica. La falta de datos para la historia clínica de reptiles de acuerdo con Mader (2006) se debe a que noexiste un protocolo adecuado para el llenado de bitácoras y así tener un seguimiento del reptil en cuestión, también se debe de tomar en cuenta que algunos de los reptiles muestreados en el Herpetario Reptilium eran de nuevo ingreso por lo cual no se contaba con datos acerca de ellos. La falta de historia clínica puede deberse a diversas razones como el número alto de animales que se manejan, no tener un protocolo a seguir para la historia clínica, la dificultad de manejo y la falta de datos anteriores de los animales ya que la mayoría se obtuvieron por decomisos. En todos los casos hubo un porcentaje significativo de aislamiento de Salmonella spp (Mader 2006), por lo que se recomienda un mejor sistema de prevención, ya que la historia clínica del reptil, contar con tapetes sanitarios en cada area así como la desinfección constante de las mismas y diversos protocolos, como pueden ser poner en cuarentena al reptil antes de ponerlo en contacto con el resto de los reptiles, chequeos continuos del reptil, desparasitaciones, estudios de laboratorio como coprocultivo y biometría hemática. Tanto para las personas que colaboran en estos lugares como para el reptil ya que estos están asociados con la salmonelosis en humanos como lo refiere John et al., (1997). La frecuencia del aislamiento de Salmonella spp en los diferentes lugares muestreados. Como primer lugar de frecuencia fue el Herpetario de Reptilium con 29 cepas de Salmonella, el segundo lugar de frecuencia fue del Herpetario de la Universidad de Puebla Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ con 9 cepas de Salmonella spp, en tercer lugar de frecuencia tenemos la UMA “Laguna de Jade” con 5 cepas de Salmonella spp y en cuarto lugar de frecuencia tenemos a la UMA “Amatones” y Veracruz Salvaje con una cepa de Salmonella spp en cada caso. Se debe de tomar en cuenta que la mayoría de los reptiles muestreados en el Herpetario Reptilium eran de nuevo ingreso provenientes en su mayoría de decomisos o condiciones deplorables. En el caso del Herpetario de Puebla se contaba con un hacinamiento y malas condiciones de higiene. Tanto en Reptilium como en Puebla que fueron los dos lugares con mayor frecuencia de Salmonella spp, el estrés constante a los que son sometidos los animales, mala higiene y lugares pequeños pueden favorecer la presencia de ciertas enfermedades (Martínez et al., 2001). En la UMA “Amatones”, UMA “Laguna de Jade “ y Veracruz Salvaje la frecuencia de Salmonella fue menor, esto debido a que en la UMA “Amatones” y la UMA “Laguna de Jade” los reptiles se encontraban en condiciones muy parecidas a la de su medio ambiente y el manejo al cual son sometidos es minimo, mientras que en Veracruz Salvaje el espacio de los animales es muy grande y el reptil pequeño lo cual le permite a este tener un habitat grande y así evitar el estrés (Mader, 2006). El muestreo sanguíneo presentó varias dificultades, una de ellas fué el tamaño del reptil debido a que en reptiles pequeños no se logró obtener muestra sanguínea (Mader 2006).En la prueba de aglutinación con el antisuero polivalente de 47 cepas de Salmonella spp solo siete cepas dieron negativo a la aglutinación con el suero polivalente, especificando que este suero solo abarca de los serogrupos A al I y capsular Vi, por lo que las siete cepas negativas a la aglutinación del suero polivalente pertenecen a otros serogrupos. La aglutinación de las cepas 35c, 35d con el suero de cinco reptiles positivos al aislamiento de Salmonella spp fue positivo en los cinco casos. Lo que indica que los cinco reptiles al presentar anticuerpos contra Salmonella tuvieron o tienen la infección. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ La presencia de Salmonella spp en los reptiles constituye un serio problema de salud pública (Martínez et al., 2001) ya que en los últimos años un alto porcentaje de Salmonella en humanos está asociadoa los reptiles como mascotas. En cuanto a las bacterias que se lograron aislar la de mayor importancia zoonótica fue la Salmonella spp (Mader 2006) de la cual se aislaron 38 cepas que equivale al 16% de las 289 cepas aisladas en total en 17 reptiles que equivale al 29% de los 119 reptiles que se muestrearon, de los cuales 12 estaban sanos y 5 enfermos. 10 cepas de Salmonella spp y 28 cepas de Salmonella kaufmannii, S. enterica, S. enteritidis serotipo xyz, S. salamae, S. arizonae lo que concuerda con Chen C et al., (2010) obteniendo como mayor porcentaje de aislamiento a Salmonella entérica. Solo el 28% de los reptiles fueron positivos al aislamiento de Salmonella spp, un 28% (13) en serpientes de 45, un 80% (4) en saurios de 5 y un 0% en 5 tortugas, lo que concuerda con Frank (2005) en un 59.4% (47) de 79 saurios fueron positivos a Salmonella spp. No solo se logró aislar Salmonella spp sino también otras bacterias de importancia zoonótica con un orden de frecuencia de la siguiente manera Proteus, Citrobacter, Pasterella, Escherichia coli. Así como otras bacterias entéricas no zoonóticas pero de importancia para los reptiles como son Klebsiella, Pseudomonas, Yersinia lo cual concuerda con (Mader, 2006) y (Aguillón, et al., 2007) como bacterias que se logran aislar conmunmente de la cloca de los reptiles. La correlación de los hallazgos de anticuerpos séricos, aislamiento bacteriológico, hábitat, especie animal y aspectos comunitarios nos indica que los repiltes positivos al aislamiento bacteriológico de Salmonella spp y a la presencia de anticuerpos séricos tienen la enfermedad y son portadores sanos o portadores enfermos de está ya que solo dos de los cinco reptiles positivos a anticuerpos séricos estaban enfermos y tres de los reptiles estaban aparentemente sanos lo que concuerda con (Mader, 2006) y (Ebani, 2005) en Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ cuanto a que los reptiles no necesariamente deben presentar una signología para estar enfermos. La correlación de las pruebas de laboratorio antes mencionadas con la especie, hábitat y aspectos comunitarios nos indica que la especie del reptil no influye en la presencia de Salmonella spp ya que esta enfermedad se da en todos los reptiles sin importar su especie, sin embargo el hábitat en el que se encuentre el reptil es de suma importancia ya que con estudio se comprobó que mientras el reptil está en condiciones parecidas a su medio ambiente, con espacio suficiente, sin ser sometido a tanto manejo y estrés, la presencia de Salmonella spp, en los reptiles llega a ser mínima (Frank ,2008) (Hidalgo, 2007). Esto nos indica que solo clínicamente no podemos descartar la presencia de enfermedad en el reptil debido a su asintomatología y por lo tanto muchas veces necesitamos de pruebas de laboratorio como nos indican Mader (2006) y Aguillón (2007). Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ 10. CONCLUSIONES *Salmonella spp se pudo aislar de reptiles enfermos y clínicamente sanos. *El aislamiento de Salmonella spp fue de mayor prevalencia en el Herpetario Reptilium. *La UMA “Laguna de Jade” fue el segundo lugar de mayor prevalencia donde se aísló Salmonella spp. *El Herpetario de la Escuela Superior de Medicina Veterinaria y Zootecnia de A.C. fue el tercer lugar con mayor prevalencia de aislamiento de Salmonella spp. *La UMA “Amatones” y Veracruz Salvaje fueron el cuarto lugar con mayor prevalencia de aislamiento de Salmonella spp. *En total se aislaron 289 cepas de las cuales 45 (16%) fueron de Salmonellaspp. *Se aislaron bacterias potencialmente patógenas para el humano como Salmonella spp, Proteus spp, Citrobacter spp, Pasteurella spp, Escherichia coli. *38 cepas aisladas pertenecen a alguno de los grupos A- I. *Los cinco sueros utilizados de reptiles para la aglutinación con el Antígeno 35c y 35d fueron positivos a la aglutinación de ambos antígenos, confirmando que los cinco reptiles han tenido la infección. *No fue posible la correlación del aislamiento bacteriológico con el estado clínico debido a la falta de Historia Clinica. *El tamaño pequeño de los reptiles, la dificultad del muestreo sanguíneo y obtención de poca muestra sanguínea fue insuficiente para realizar análisis sanguíneos. Print to PDF without this message by purchasing novaPDF (http://www.novapdf.com/) http://www.novapdf.com/ http://www.novapdf.com/ 11. LITERATURA CITADA 1) Aguillón DR, Lazcano D, Rámirez R, Bacterias cloacales y Evaluación Herpetofauna del Parque Ecológico Chipinque, Universidad Autónoma de Nuevo Léon, 2007. 2) Capewell L., Snakes and Frogs, HHS Health Beat, Junio 3 del 2011. 3) Chen C, Chen W, Chin S, Lai Y, Tung K, Chio C, Hsu Y, Chang C, Prevalence and antimicrobial susceptibility of Salmonellae isolates from reptlies in Taiwan, American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, J Vet Diagn Invest, 2010: 44-50. 4) Dwight CH, Mac Lachlan NJ, Walker RL. Veterinary Microbiology. 2nd ed. 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Literatura Citada
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