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Derecho Constitucional I

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MÉRIDA

TESIS
“ACTIVIDAD ANTITROMBÓTICA Y ANTICARIOGÉNICA DE
FRACCIONES PEPTÍDICAS DEL FRIJOL X´PELON (Vigna
unguiculata).”

PARA OPTAR AL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA

PRESENTA:
L.N. MARIBEL GERÓNIMO ALONSO

ASESORES:
DRA. ELIZABETH DE LA LUZ ORTIZ VÁZQUEZ
DR. DAVID BETANCUR ANCONA
MÉRIDA, YUCATÁN, MÉXICO.
05 DE FEBRERO 2015
ii

iii

AGRADECIMIENTOS

A mis asesores de tesis: Dra. Elizabeth de la Luz Ortiz Vázquez y Dr. David Abram
Betancur Ancona, por el invaluable apoyo brindado tanto de manera profesional como
personal. Mi más sincero y profundo agradecimiento por la dedicación, el tiempo, espacio,
los consejos y la mistad otorgado durante este tiempo.

Al comité reviso de tesis: Dr. Jorge Carlos Ruiz Ruiz, Dr. Víctor Manuel Toledo López,
Dr. Luis Fernando Cuevas Glory por su valiosa contribución al enriquecimiento a esta
tesis.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por la beca de estudios de
la Maestría con clave 15312-Ciencia Básica y el apoyo económico recibido para la
realización de la tesis “Actividad antitrombótica y anticariogénica de fracciones peptídicas
del frijol x´pelon (vigna unguiculata)” en el proyecto “Actividad biológica de fracciones
péptidicas derivadas de la hidrólisis enzimática de proteínica de frijoles lima (Phaseolus
lunatus) y Caupí (Vigna unguiculata).

Al laboratorio de Ciencias de los Alimentos de la Facultad de Ingeniería Química,
campus de ciencias Exactas e Ingenierías de la Universidad Autónoma de Yucatán,
por las facilidades otorgadas para la realización del trabajo experimental.

DEDICATORIAS

A Dios por haberme permitido llegar a realizar mi sueño, por todo el amor con el
que me rodea y porque nunca me abandona.

A mis tíos (Eduardo Félix y Antonia Gerónimo) por haberme ayudado en mi
educación y desarrollo como persona, por haberme apoyado en todo momento.
Mil gracias, Dios los recompensara.

A todos mis amigos pero en especial a Thalía López y Mariana Delgadillo; mil
gracias por sus críticas constructivas, por todos los momentos que hemos pasado
juntas y porque han estado conmigo siempre aunque sea solo para dar lata.

A todos mis profesores del posgrado y también aquellos de toda la vida, por su
paciencia y firmeza en la enseñanza, porque de alguna manera forman parte de
lo que ahora soy.

Índice
Resumen
I.-Introducción………….……………………………………………………………...……..3
II.-Antecedentes.……………………………………………………………………...……..5
II.1.-Composición química del Vigna unguiculata……………………………..…….…..5
II.2.-Fuentes para la obtención de concentrados proteínicos……………..…….……..6
II.3.-Hidrolizados proteínicos………………………………………………..……….........7
II.4.-Hidrólisis enzimática…………………………………………………..……………..10
II.5.-Alimentos funcionales…………………………………………………...…………...12
II.6.-Actividades biológicas………………………………………………………..……...13
II.6.1.-Actividad Antitrombótica………………………………………………………...…14
II.6.2.-Actividad anticariogénica……………………………………………………...…..18
III.-Objetivos……….……………………………………………………………....….……21
IV.-Materiales y métodos…………………………………………………..……………..22
IV.1.-Obtención de la materia prima…………………………………….….…………...22
IV.2.-Obtención de la harina del Vigna unguiculata……………………….….……….23
IV.3.-Obtención del concentrado proteínico…………………………….………….…..23
IV.4.-Composición proximal del concentrado proteínico ………………………..……24
IV.5.-Biocatalisis…………………………………………….……………………….……24
IV.5.1.-Sistema Alcalase® -Flavourzyme®……………………………………….……25
vi

IV5.2.-Sistema Pepsina-Pancreatina………………………………………..…….……..25
IV.6.-Grado de hidrólisis (GH)………………………………………….…………………26
IV.7.-Fraccionamiento por ultrafiltración……………………………..…...……….…….27
IV.8.-Bioactividades in vitro………………………………………………....………….…29
IV.8.1.-Actividad antitrombótica………………………………………..……………....…29
IV.8.2.-Actividad anticariogénica…………………………………………………….……30
IV.9.-Determinación del perfil de aminoácidos……………………….………………….31
IV.10.-Análisis estadístico…………………………………………………….……………32
V.-Resultados…………………………………………………………...………….……….33
V.1.-Composición química de harina y concentrado del V. unguiculata……………..33
V.2.-Hidrólisis del concentrado proteínico y Grado de Hidrólisis (GH)……….………34
V.3.-Fracciones peptídicas y determinación proteica…………………..………..…….35
V.4.-Bioactividades antitrombótica y anticariogénica………………………………..…37
V.5.-Perfil de aminoácidos………………………………………………...………...…….41
V.6.-Conclusiones………………………………………………………………….……….42
V.7.-Referencias………………………………………………………….…..….......…….44

vii

Índice de figuras
Figura 2.1. Hidrólisis enzimática de proteínas……………………….………………….10
Figura 2.2. Esquema de actividad catalítica de proteasas……………………………11
Figura 4.1. Diagrama de flujo del desarrollo experimental…………………………….22
Figura 4.2. Proceso de ultrafiltración de los hidrolizados proteínicos de V.
unguiculata…………………………………………………………………………..….…..28
Figura 5.1. Grado de hidrólisis para Pepsina-Pancreatina y Alcalase®-Flavourzyme®
de las proteínas V. unguiculata……………………………………………….…….……34
Figura 5.2. Porcentaje de proteínas de las fracciones peptídicas obtenidas por
ultrafiltración de los sistemas Pepsina-Pancreatina y Alcalase®-
Flavourzyme®………………………………………………………………...…......…….36
Figura5.3. Inhibición sobre la agregación plaquetaria del V. unguiculata...…......….37
Figura 5.4. Porcentaje de la inhibición de la desmineralización de calcio y fósforo con
el sistema Pepsina-Pancreatina del hidrolizado V. unguiculata…...…………….……39
Figura 5.5. Porcentaje de la inhibición de la desmineralización de calcio y fósforo con
el sistema Alcalase®-Flavourzyme® del hidrolizado del V.
unguiculata)…………………………………………………………………..….......……..40

viii

Índice de tablas
Tabla 2.1. Composición química de la harina del Vigna unguiculata (% base
seca)………………………………………………………………………………………..…5
Tabla 2.2. Péptidos biológicamente activos y sus efectos en el organismo (Millán y
Vioque, 2002; Iwaniak y Minkiewicz, 2007)…………………………….……………….14
Tabla 4.1. Diluciones de la curva estándar de L-serina…………………………….....26
Tabla 5.1. Composición química de la harina y del concentrado del V. unguiculata (%
b.s.)………………………………………………………………………………….….……33
Tabla 5.2. Perfil de aminoácidos del hidrolizado de V. unguiculata en los sistemas
Alcalase®-Flavourzyme® y Pepsina Pancreatina (g/100g de proteína)………….….41

Resumen
Los biopéptidos pueden ejercer un importante papel en la regulación y la modulación
metabólica, que sugiere su uso potencial como nutracéuticos e ingredientes de
alimentos funcionales para promoción de la salud y la reducción del riesgo de
enfermedad. El objetivo del trabajo fue evaluar la actividad biológica antitrombótica y
anticariogénica in vitro a los hidrolizados y fracciones proteínicas de la leguminosa
Vigna unguiculata obtenidas por hidrólisis proteica in vitro. Se obtuvieron hidrolizados
proteínicos a partir del concentrado del frijol x’pelon por acción de sistemas
enzimáticos con Pepsina-Pancreatina y Alcalase®-Flavourzyme®. Se determinó la
composición proximal, así como el grado de hidrólisis de las fracciones peptídicas,
las cuales se ultrafiltraron y posteriormente se les evaluó la actividad biológica. Los
resultados indicaron que el concentrado tuvo 68.29% de proteína en base seca,
5.72% de cenizas, 0.08% de fibra cruda, 2.97% grasa y 22.94% de extracto libre de
nitrógeno. La hidrólisis enzimática con el sistema de Pepsina-Pancreatina y
Alcalase®-Flavourzyme® fue extensiva con 34.94% y 81.43%, respectivamente. En
cuanto a la actividad antitrombótica, presentaron mayor actividad biológica las
fracciones peptídicas obtenidas con Alcalase®-Flavourzyme® con 100% de
inhibición plaquetariamientras que con Pepsina- Pancreatina fue 77.41%. La mayor
actividad anticariogénica se obtuvo con el sistema Pepsina- Pancreatina con 61.55%
y 56.07% de la desmineralización de calcio y fósforo, respectivamente. Considerando
la inhibición de la agregación plaquetaria y la protección al esmalte de los dientes de
ambos sistemas, el hidrolizado proteico de la leguminosa V. unguiculata podría ser
utilizado como fuente de péptidos bioactivos y su posterior utilización para desarrollar
alimentos con efectos beneficiosos a la salud.

Abstract
Biopeptides may play an important role in metabolic regulation and modulation,
suggesting potential use as nutraceuticals and functional food ingredients for health
promotion and disease risk reduction. The objective of this work was to evaluate the
antithrombotic and anti-cariogenic bioactivity in vitro, from both protein hydrolysates
and their fractions of x'pelon bean (Vigna unguiculata), obtained by biocatalysis.
Protein hydrolysates were obtained from the concentrate x'pelon bean enzyme
systems by action of Pepsin-Pancreatin® and Alcalase-Flavourzyme®. Proximate
composition and the hydrolysis degree of peptide fractions were determined, which
were subjected to ultrafiltration and then were evaluated for bioactivity. The results
indicated that the concentrate was 68.29 % protein on a dry basis, 5.72 % ash, 0.08
% crude fiber, 2.97% fat, and 22.94 % nitrogen free extract. Enzymatic hydrolysis with
Pepsin-Pancreatin® and Alcalase-Flavourzyme® systems were extensive with 34.94
% and 81.43 % respectively. As for the antithrombotic activity, fractions obtained with
Alcalase-Flavourzyme® showed higher bioactivity peptide with 100% platelet
inhibition whereas Pepsin-Pancreatin® was 77.41 %. Most anti-cariogenic activity
was obtained with the Pepsin-Pancreatin® system, 61.55 % and 56.07 % of
demineralization of calcium and phosphorus, respectively. Considering inhibition of
platelet aggregation and protection tooth enamel of both systems, x'pelon bean
hydrolysates could be used as a source of bioactive peptides and its subsequent use
to develop foods with beneficial health effects.

I. Introducción
Las leguminosas al igual que los cereales y los alimentos de origen animal, son
fuentes importantes de nutrientes en la dieta humana, suministrando energía,
proteínas alto valor biológico, vitaminas esenciales y minerales. Estos alimentos, han
sido objeto de estudios en los últimos años ya que se han reconocido que contienen
componentes que pueden afectar la salud; ha motivado a científicos a buscar
clarificar el papel de los componentes alimenticios en el mantenimiento de la salud y
prevención de enfermedades. En este sentido, se han reportado las propiedades de
actividades biológicas de un número importante de componentes que contienen
proteínas específicas, péptidos y ácidos grasos que poseen actividad biológica.
Los péptidos bioactivos o biopéptidos han sido definidos como fragmentos
específicos de proteínas, ya sean de animal o vegetal, que tienen un impacto positivo
sobre funciones del cuerpo humano y pueden influir definitivamente en la salud y vas
más allá de la nutrición normal y adecuada. Dependiendo de la secuencia de
aminoácidos de los péptidos, es la afección que tendrá en los principales sistemas
del organismo: cardiovascular, nervioso, gastrointestinal e inmune.
Hasta el momento, los péptidos que han sido descritos tienen propiedades
estructurales en común, cadena corta de aminoácidos (de 2 a 9 aminoácidos),
residuos aminoácidos hidrófobos en adición de grupos prolina, lisina o arginina, y
resistencia de peptidasas digestivas.
La finalidad de conocer que fragmento de una proteína específica tiene actividad
biológica es para buscar alternativas a los medicamentos, que tengan la misma
función pero que no conlleve un efecto secundario; ya existe la creciente
preocupación por parte de la población con respecto a los efectos negativos de
algunos ingredientes químicos sintéticos y el aumento en la preferencia por
compuestos naturales.

El objetivo de la presente investigación fue evaluar la actividad biológica
antitrombótica y anticariogénica in vitro a los hidrolizados y fracciones proteínicas de
la leguminosa Vigna unguiculata obtenidas por hidrólisis proteica in vitro

II. Antecedentes
II.1. Composición química del Vigna unguiculata
La composición química del Vigna unguiculata se puede observar en la tabla 1, como
se ha mencionado, las variaciones en los diferentes componentes se deben a las
prácticas agronómicas que van desde la siembra hasta el almacenamiento de los
granos. Una porción de frijol cocido es de 86g y aporta 114 Kcal, tiene 7.6 g de
proteínas, 0.5 g de lípidos, 20.4 g de hidratos de carbono, 7.5 g de fibra dietética; que
es 50-65% de hidratos de carbono, 20-29 % de proteínas, 16-20% de fibra, 3-10% de
cenizas y 1-3% de lípidos. Las vitaminas que contiene en su mayoría son del
complejo B (Tiamina [B1], Riboflavina [B2], Niacina [B3], Folacina [B9]), entre los
minerales se encuentran el potasio, fósforo, magnesio, zinc, hierro y calcio; y los
fitoquímicos que se encuentran son isoflavonas, saponinas,lectinas, polifenoles
(Pérez et al., 2008, Casanova, 2002).

Tabla 2.1. Composición química de la harina del Vigna unguiculata (% base seca)

Componente
Casanova
2002
Polanco
2001
Sánchez
2013
Sosa
2008
Proteína
cruda (g)
24.20 24.22 29.27 27.85
Fibra cruda
(g)
6.30 3.49 3.14 1.10
Grasa cruda
(g)
1.20 2.18 1.45 1.26
Cenizas (g) 3.50 3.32 4.32 1.58
Extracto libre
de nitrógeno
(g)
54.40 66.79 61.82 68.21

Las leguminosas son deficientes en aminoácidos azufrados (metionina y cisteína) y
al complementarse con los cereales la complementación aminoacídica es
equivalente al de origen animal (Bourges, 1987; Potter y Hotchkiss, 1999).

II.2. Fuentes para la obtención de concentrados proteínicos
Existen varios métodos para la precipitación de las proteínas, tales como
disminución de la solubilidad (precipitación isoeléctrica), desnaturalización selectiva o
afinidad. En esta investigación se utilizó la precipitación isoeléctrica el cual consiste
en el fraccionamiento en húmedo, método reportado por Betancurt et al., (2004); y
consiste en suspender la harina en agua destilada, hacer un ajuste de pH alcalino
para la solubilización de las proteínas y posteriormente se ajusta al pH ácido para la
precipitación de las proteínas a punto isoeléctrico, obteniendo como producto final el
concentrado de proteínas puro. Las ventajas del método es que la operación se
adapta a fácilmente a gran escala, se utilizan equipos sencillos, se puede realizar de
forma continua y se dispone de diversos agentes precipitantes.
Las fuentes proteicas son diversas, las de origen animal son consideradas de alto
valor biológico por contener proporciones de aminoácidos esenciales que cubren las
necesidades humanas; sin embargo, la disponibilidad y el costo son factores claves
en la elección de la fuente proteínica a utilizar y es por esa razón que se han
buscado materias primas alternas. Una de esas opciones es el usar proteínas de
origen vegetal y la principal fuente son las leguminosas ya que presentan mayor
contenido de proteínas que los cereales (6-10%) así como desechos generados en
las industria extractivas, por ejemplo la industria extractiva de aceite.
(Dávila et al., 2003; Martínez, 1998). En 1997 Fernández-Quintela et al.,
concentraron proteínas de guisante, haba y soya de los cuales obtuvieron contenidos
mayores al 80%; de igual forma se han obtenido concentrados de las leguminosas
Phaseolus lunatus y Mucuna pruriens (Torruco, 2009; Tovar, 2011).

Los concentrados proteínicos, son productos que contienen en mayor porcentaje
proteínas queel material de partida, aproximadamente un 70% en base seca ya que
durante el proceso de elaboración se eliminan, grasas, carbohidratos y otros
componentes (Badui, 2006; Shallo et al., 2001). Los concentrados proteínicos tienen
diversas aplicaciones dependiendo de su grado de hidrólisis; la mayor parte de la
aplicación tiene lugar en los alimentos tradicionales, para tener éxito es necesario
que el concentrado mantenga la calidad, es decir, que mantenga un color, sabor,
aroma, textura, composición química y nutricional similar a los tradicionales; estas
características marcan la pauta para el grado de sustitución. Los concentrados
proteínicos pueden ser modificados químicamente, como por ejemplo mediante
acilación para mejorar propiedades como la solubilidad o mediante desamidación
ácida para mejorar otras propiedades funcionales (Chau et al., 1997).
Para mejora la nutrición es el uso principal que se les da a los concentrados
proteínicos; formulas infantiles, suplementos y complementos alimenticios para
adultos.
A partir de los concentrados proteínicos se pueden obtener los hidrolizados proteicos
por reducción de la longitud de las cadenas de aminoácidos que conforman las
proteínas.

II.3. Hidrolizados proteínicos
Los hidrolizados proteínicos han sido empleados para reducir la alergenicidad a
ciertas proteínas nativas, para suministrar requerimientos nutrimentales, para
producir péptidos con actividades biológicas específicas como por ejemplo la
antitrombótica, anticariógena, antioxidante y antihipertensiva. Así mismo pueden
potenciar características funcionales como cambios de solubilidad, viscosidad, sabor,
propiedades de formación de espuma y emulsión, entre otros (Janitha et al., 2002;
Van der Ven et al., 2002b). Otra aplicación ampliamente utilizada de los hidrolizados

proteínicos es el usarlos como fuente de nitrógeno en la formulación de dietas
enterales destinadas a la alimentación infantil o adultos enfermos; el diseño de este
tipo de dietas entéricas es para que se puedan absorber en el intestino sin una
digestión previa en el estómago, este tipo de dietas son esenciales en el tratamiento
de pacientes con desordenes estomacales, así como en lactantes con síndromes de
malabsorción – nutrición (Lebenthal et al., 1983).
Los hidrolizados proteínicos no solamente son usados en la industria alimentaria,
sino también como fuente de fermentación para el crecimiento de microorganismos
como es el caso de las proteínas hidrolizadas derivadas de levaduras o caseína; otro
uso es en cosmética para el tratamiento del cabello y así mismo pueden ser usados
como fertilizantes vegetales (Vioque y Millán, 2001).
La esencia de la hidrólisis proteínica es la ruptura del enlace peptídico y en
consecuencia la generación de péptidos de menor tamaño e incluso aminoácidos
libres. La ruptura de los enlaces peptídicos puede llevarse a cabo por diferentes
métodos los cuales poder ser químicos o biológicos (Vioque y Millán, 2001). El
proceso más recomendado para la hidrólisis es el biológico sobre todo cuando los
productos serán utilizados en el campo de la nutrición, pues se sabe que los
procesos químicos pueden generar compuestos indeseables (Were et al., 1997;
Chan y Ma, 1999). En cuanto a la hidrólisis química, ésta puede destruir la forma L
de los aminoácidos y producir la forma D de los mismos, así también forma
sustancias toxicas como la lisinoalanina que reduce la biodisponibilidad de los
aminoácidos (Lahl y Braun, 1994).
Ahora bien, para definir el uso que tendrá el hidrolizado es necesario saber y conocer
su grado de hidrólisis (GH); el grado de hidrólisis es el porcentaje de enlaces
peptídicos rotos en relación a la proteína original. El GH se determina por las
condiciones utilizadas tales como la concentración de sustrato, relación de enzima-
sustrato, el tiempo de incubación, pH y temperatura (Vioque y Millán, 2001). El GH se
clasifica en tres grupos: a) hidrolizados con bajo grado de hidrólisis (1-10%), son

usados para mejorar las propiedades funcionales tales como la solubilidad, el poder
emulsificante, la capacidad espumante y la absorción de agua y aceite; son
hidrolizados ideales para la elaboración de productos de panadería, helados,
mayonesas y derivados de la carne (Vioque et al., 2006); b) hidrolizados con un
grado de hidrólisis variable, generalmente alto y son usados como “flavorizantes”
porque aportan sabor y aroma; en este caso el “flavor” va en función del sustrato
usado y las condiciones de la hidrólisis y pueden aportar sabor y olor a los alimentos
que se añaden. El “flavor” va a depender de la cantidad y del tipo de péptido liberado;
quizás el factor principal en la determinación del “flavor” sea la interacción de estos
aminoácidos con otros componentes tales como azúcares o lípidos. Esta interacción
puede producirse mediante las reacciones de Millard, generando así compuestos
secundarios volátiles responsables del olor y sabor en el producto el cual se utiliza
para realzar el sabor. Este tipo de hidrolizado es usado en sopas, comidas pre-
cocidas, productos de carne y salsa (Vioque et al., 2006); c) hidrolizados con alto
grado de hidrólisis (mayor al 10%) también llamados hidrolizados extensivos y son
utilizados en la alimentación especializada (Vioque et al., 2006). Algunas fórmulas en
las que se usan los hidrolizados extensivos son: fórmulas infantiles hipo-alergénicas,
fórmulas destinadas a nutrición clínica en pacientes con enfermedades
gastrointestinales, renales y hepáticas y suplemento proteínico (Mahmoud, 1994;
Clemente et al., 1999; Vioque et al., 2006).
Otro uso que se le da a los hidrolizados proteínicos es en el desarrollo de productos
promotores de la salud conocido globalmente como alimentos funcionales; el
alimento funcional es un alimento convencional o similar en apariencia, que se
consume como parte de la dieta normal y que tiene un efecto fisiológico beneficioso
y/o reduce el riesgo de enfermedades crónicas más allá de las funciones
nutricionales básicas (López, 2007). Un producto nutracéutico a diferencia de los
alimentos funcionales, es un bioactivo aislado o purificado a partir de un alimento que
se suministra en una matriz no alimentaria (píldoras, capsulas o ampollas) y que se
usa para mejorar la salud, en dosis que exceden aquellas que pueden ser obtenidas

a partir del alimento natural. De esta manera es como han surgido al mercado
alimentos con elevado contenido de diferentes componentes bioactivos cómo: ácidos
grasos, péptidos bioactivos, antioxidantes, carbohidratos prebióticos, vitaminas o
minerales y bacterias prebióticas, entre otros (Juárez, 2007).

II.4. Hidrólisis enzimática
La generación de hidrolizados proteínicos por vía enzimática consiste en involucrar
enzimas que catalicen la ruptura de enlaces peptídicos (Figura 1), generando así
péptidos de menor tamaño y en ocasiones aminoácidos libres (Manninem, 2004;
Vioque y Millán, 2001).
Figura 2.1. Hidrólisis enzimática de proteínas.

Las proteasas son enzimas que hidrolizan los enlaces peptídicos con diferentes
grados de intensidad y de selectividad. Existen tanto de origen vegetal, animal y
microbiano. La acción que pueden presentar puede ser endopeptidasa [endo] o
exopeptidasa [exo] (Figura 2). Las endopeptidasas hidrolizan enlaces peptídicos a lo
largo de la cadena mientras que las exopeptidasas, si remueven el ultimo aminoácido
del extremo carboxilo son carboxipeptidasas y si remueven el ultimo aminoácido del
extremo amino son aminopeptidasas (Badui, 2006).

Las proteasas son fundamentales para la recuperación de proteínas presentes en
materiales de desperdicio (material de desecho de las industrias), las cuales al ser
hidrolizadas eliminan las características de olor, color y sabor de la proteína original
(López-Munguía,1986).

Figura 2.2. Esquema de actividad catalítica de proteasas

Las proteasas específicas para la obtención de hidrolizados proteínicos son a) la
Alcalase®, utilizada para la obtención de hidrolizados proteicos de diferentes grados
de hidrólisis; esta enzima se obtiene del Bacillus licheniformis, la parte activa es la
Subtilisina A, tiene un rango de pH de 6.5 a 8.5 y una temperatura óptima de 55 a
70°C. Sus principales blancos son las uniones peptídicas de aminoácidos
hidrofóbicos terminales Leu, Tyr y Val, el sabor amargo de los hidrolizados disminuye
debido al tipo de ruptura; b) Flavourzyme® es un complejo enzimático ya que
presenta corte endo y exo, ésta enzima está diseñada para hidrolizar proteínas en
condiciones alcalinas, neutras o ligeramente ácidas; puede utilizarse para eliminar el
sabor amargo en hidrolizados parciales y así mismo se pueden obtener -con esta
enzima- hidrolizados exhaustivos mediante la acción secuencial con endoproteasas.
Flavourzyme® es una proteasa de origen microbiano y se obtiene se obtiene de la
cepa del Aspergillus oryzae y tiene un rango de acción óptimo a pH 5.0 – 7.0 con un
rango de temperatura de 70 a 80°C de igual forma que la Alcalase®, se caracteriza
por Hidrolizar los enlaces que unen a los péptidos con los aminoácidos hidrofóbicos
terminales (Clemente et el., 1999; Kristinsson et al., 2000; Fischer et al., 2001);

c) La pepsina es la principal enzima gástrica que degrada las proteínas en el
estómago durante la digestión, tiene actividad endopeptidasa, hidrolizando
preferentemente por el extremo C-terminal de los residuos aromáticos Fen, Tir, Trp.
Es secretada en el estómago como pepsinogeno, que es el precursor inactivo que se
convierte en su forma activa a pH 1.5 con una temperatura de 37°C y se desactiva
permanentemente con un pH superior a 6. Su acción rompe largas cadenas de
polipéptidos en cadenas más cortas, es decir que su acción genera algunos
aminoácidos libre pero la mayoría son oligopéptidos (Megías et al., 2004). d) Por su
parte la pancreatina incluye proteasas como la tripsina, quimotripsina, elastasa, y
carboxipeptidasas, así como enzimas amilasa y lipasa pancreática y nucleasas. La
tripsina, quimotripsina y elastasa son serinoproteasas, con actividad endopeptidasa.
Tiene un pH óptimo de 7 a una temperatura de 37°C; la hidrólisis con pancreatina
resulta ser una mezcla de pequeños oligopéptidos (60-70%) y aminoácidos libre (30-
40%) que son absorbidos a lo largo del intestino delgado (Sewlad y Jakubke, 2002).

II.5. Alimentos funcionales
Los alimentos funcionales son aquellos que proporcionan un efecto beneficioso para
la salud independientemente del aporte de nutrientes; no constituyen en el sentido
estricto, un grupo de alimentos como tal, más bien son resultados de la adición,
sustitución o eliminación de ciertos componentes a los alimentos usuales. Los
alimentos funcionales no solo se refiere a productos elaborados, también lo hace
hacia alimentos tradicionales como aceite de oliva, tomate, legumbres entre otros
que contienen componentes con propiedades beneficiosas para la salud (Sociedad
Española de Nutrición Comunitaria [SENC], 2005). Los alimentos funcionales
complementan la función nutritiva y la prevención de enfermedades; las cantidades
ingeridas deben ser las normales consumidas en la dieta; así mismo la presentación
de un alimento funcional tiene que ser simple, es decir sin modificar sus
características, nunca presentarse en capsulas o comprimidos (SENC, 2005).

Como ya se ha mencionado anteriormente, un alimento funcional es el que contiene
un componente benéfico para las salud; una alternativa podría ser la adición de
péptidos bioactivos a los alimentos que no los contienen. Los péptidos bioactivos se
definen como secuencias de aminoácidos inactivos en el interior de la proteína
precursora y ejercen determinadas actividades biológicas tras su liberación mediante
la hidrólisis química o enzimática (Meisel, 1998). Generalmente son péptidos
pequeños, de 3 a 20 aminoácidos, aunque en algunas ocasiones pueden exceder
esta longitud (Pihlanto-Leppälä, 2000; Shaidi y Zhong, 2008); tras la administración,
los péptidos bioactivos pueden ejercer su efecto sobre los sistemas cardiovascular,
digestivo, inmunológico y nervioso (FitzGerald, 2000; Korhonen y Pihlanto, 2003). Se
evidencia que estos péptidos pueden atravesar el epitelio intestinal y llegar a los
tejidos periféricos vía circulación sistémica, pudiendo ejercer así funciones
específicas a nivel local, en el tracto gastrointestinal y a nivel sistémico. Dentro de
estas actividades, los péptidos bioactivos podrían influir en el metabolismo celular y
actuar como vasorreguladores, factores de crecimiento, inductores hormonales y
neurotransmisores (Robert y Zaloga, 1994).

II.6. Actividades biológicas
En la secuencia primaria de una proteína hay determinadas regiones que una vez
liberadas y activadas mediante hidrólisis por acción de enzimas específicas o durante
los procesos de elaboración de un producto, pueden presentar actividades biológicas
y funcionales que pueden ser regulatorias en el cuerpo humano y las cuales son
adecuadas para la nutrición (Vioque y Millán, 2001). A continuación se presenta en el
Tabla 2 diferentes tipos de péptidos bioactivos y sus efectos sobre la salud.

Tabla 2.2. Péptidos biológicamente activos y sus efectos en el organismo (Millán y
Vioque, 2002; Iwaniak y Minkiewicz, 2007).
Péptidos bioactivos Efecto benéfico
Opioides Regulan el tránsito intestinal y mejoran
la digestión y adsorción
Inmunomoduladores Estimula la respuesta inmune
Transportadores de minerales Mejoran la absorción de minerales y
metales
Antitrombóticos (anticoagulantes) Reducen los riesgos de padecer
trombosis arterial o venosa.
Antihipertensiva (inhibidores de la
enzima convertidora de Angiotensina-I)
Reducen el riesgo de padecer
enfermedades cardiovasculares
Antioxidantes Previenen enfermedades degenerativas
y de envejecimiento
Antimicrobianos Reducen el riesgo de infecciones
Hipocolesterolémicos Reducen el riesgo de padecer
enfermedades cardiovasculares
Reguladores del tránsito intestinal Reducen la proliferación de tumores
cancerígenos

II.6.1. Actividad antitrombótica
Cada año las enfermedades no transmisibles (ENT) causan la muerte a más de 36
millones de personas y las enfermedades cardiovasculares constituyen el 48%; el
80% de las defunciones por ENT se originan en países de ingresos bajos y medios.
Entre los factores de riesgos se encuentran el consumo de tabaco, inactividad física,
uso nocivo del alcohol y hábitos dietéticos no saludables (Organización Mundial de la
Salud [OMS], 2013).

En 1930, las enfermedades cardiovasculares ocupaban el 10° lugar, para 1980 se
posicionó en el 4° lugar y para el año 2012 obtuvo el 1er lugar (DEAE/DIE/SS, 2013).
Un coágulo y un trombo se forman de la misma forma; sin embargo, la formación del
coágulo es una respuesta homeostática de alto valor biológico y el cual tiene por
objetivo evitar la muerte por hemorragia, mientras tanto la formación de un trombo es
un estado patológico. La diferencia radica en que después de una lesión vascular, el
coágulo homeostático se forma sin ocluir el vaso ni se extiende a lo largo del lumen,
ocurre y se mantiene en el sitio y tiempo necesario para ser luego reemplazado por
tejido conectivo. Así, el inicio, crecimiento y mantenimiento del coágulo están
regulados en el tiempo y en el espacio (Lobato-Mendizabál y Majluf-Cruz, 2000).
El proceso de coagulación está formado por la hemostasia y la fibrinólisis, depende
del vaso sanguíneo, las células hemáticas circulantes, la hemostasia y sus
reguladores (Majiluf, 2007). La hemostasia es un proceso fisiológico que mantiene la
sangre en estado líquido,así también induce la formación de un tapón hemostático
en los sitios donde hay lesión vascular; una alteración en este proceso hemostático
llevará a la formación de trombosis. Los trombos se clasifican en: trombos arteriales
y cardiacos, los venosos y los desarrollados sobre las válvulas cardiacas (Kumar et
al., 2008; Majiluf, 2007; Schunke, Schulte y Schumacher, 2006).
La trombosis es la obstrucción local del flujo de sangre por una masa en algún vaso
arterial o venoso, los tejidos irrigados por el vaso obstruido sufren isquemia (Kumar
et al., 2008; Fattorusso y Ritter, 2001). La formación del trombo está influenciada por
la triada de Virchow, la cual consiste en a) lesión endotelial, b) la estasis o
turbulencia del flujo sanguíneo y c) la hipercoagulabilidad de la sangre. La lesión
endotelial se da porque hay pérdida física del endotelio local lo cual produce
exposición de la matriz extracelular subendotelial entonces hay adhesión de
plaquetas, liberación de factor tisular y la depleción local de prostaglandina tipo 2
[PGI2] y plasminógeno [PA] (Braunwald et al., 1998; Kumar et al., 2008; Majiluf, 2007;
Tamayo y Corella, 2007).

Por su parte, la turbulencia causa lesión o disfunción endotelial; al alterar el flujo
laminar la plaquetas se acercan al contacto con el endotelio, evitan la dilución de los
factores de coagulación activados por la sangre, retrasan el flujo de inhibidores de
factores de coagulación y permiten la formación de trombos favoreciendo así la
actividad celular endotelial predisponiendo a trombosis local (Majiluf, 2007). La
hipercoagulabilidad es la alteración en las vías de la coagulación de los que
predisponen a la trombosis. Las causas primarias son: mutaciones del Factor II,
mutación del gen de Metiltetrahidrofolato y deficiencia de la proteína C; las causas
secundarias pueden deberse a la inmovilización prolongada, infarto de miocardio,
fibrilación auricular y dolor tisular, entre otros. Por otro lado, la hipercoagulabilidad
puede ser adquirida como el uso de anticonceptivos orales y el estado
hiperestrogénico del embarazo, los cuales pueden estar parcialmente causados por
aumento de la síntesis hepática de factores de coagulación y una reducida síntesis
de antitrombina III. En los canceres diseminados la liberación de productos tumorales
pro-coagulantes predisponen a trombosis y en la edad avanzada el aumento de la
susceptibilidad a la agregación plaquetaria y una reducida liberación de PGI por el
endotelio predispone a la hipercoagulabilidad (Braunwald, 1998; Fattorusso y Ritter,
2001).
La coagulación se puede llevar a cabo por dos vías: intrínsecas y extrínsecas. Se
llama coagulación extrínseca cuando la cascada de coagulación es provocada por
algún factor externo a los componentes sanguíneos.
La trombosis en sí, implica cuatro pasos fundamentales: 1) la activación de la
glucoproteina GP IIb/IIIa (complejo receptor) por medio de agonistas como el ADP,
trombina y colágeno; 2) la adhesión de las plaquetas, al haber lesión endotelial las
plaquetas son capaces de pegarse a las proteínas del colágeno expuestas que
contienen factor von Willenbrand; una vez adheridas las plaquetas liberarán difosfato
de adenosin (ADP), serotonina y tromboxano A2, estos últimos estimulan la
vasoconstricción y ayudan a disminuir el flujo sanguíneo al vaso dañado. La
liberación de ADP y tromboxano A2 vuelven “pegajosas” a otras plaquetas (Ira Fox,

2003). 3) y se lleva a cabo la agregación plaquetaria mediada por el fibrinógeno y su
receptor la GP IIb/IIIa mediante la secuencia tripeptidica Arg-Gli-Asp localizada en
una de las cadenas del fibrinógeno, y 4) la coagulación (Majiluf y Espinosa, 2007;
Miyashita et al., 1999). Toda la cascada de coagulación requiere Ca2+ y fosfolípidos
que son proporcionados por las plaquetas.
Como se ha mencionado anteriormente, el trombo puede ocluir vasos sanguíneos e
interrumpir el flujo normal de sangre. Para que esto no suceda se emplean
medicamentos que ayudan a inhibir el mecanismo de agregación plaquetaria;
algunos de ellos son: aspirina, inhibe la formación de prostaglandina; la cumarina
inhibe la acción de la vitamina K; la heparina inhibe la actividad de la trombina; el
citrato se combina con el Ca2+ (Ira Fox, 2003). En general, los fármacos
antitrombóticos actúan mediante tres mecanismo a) inhiben el funcionalismo
plaquetario, b) inhiben el proceso de coagulación plasmática y c) aceleran la lisis del
coágulo ya formado. Sin embargo, el uso prolongado de estos fármacos puede
provocar efectos adversos gastrointestinales y alergias y otros como la triclopidina
puede causar una severa neutropenia (Aranza, 2004; Llanos, 2001).
Debido a los efectos secundarios se ha favorecido la nueva búsqueda de otros
agentes para prevenir o tratar la trombosis. Los péptidos bioactivos con capacidad
antitrombótica pueden inhibir el funcionalismo plaquetario ya que actúan como
antagonistas del fibrinógeno y se unen a la GP IIb/IIIa. Se han aislados péptidos con
efecto antitrombóticos a partir de la proteína k-caseina procedente de la leche de
vaca. Chim (2011) reportó péptidos antitrombóticos aislados del pepino de mar;
Tovar (2011) reportó péptidos antitrombóticos del frijol terciopelo (Mucuna pruriens)
y Córdoba (2013) reportó actividad antitrombótica a partir el frijol lima (Phaseolus
lunatus).
La agregación plaquetaria es un paso crítico en la formación de trombos y está
mediada por el enlace del fibrinógeno y su receptor, la glucoproteína GPIIb/IIIa de la
membrana de las plaquetas, la cual involucra el reconocimiento de la secuencia Arg-

Gli-Asp (RGD) del fibrinógeno. Es concebible por lo tanto, que los péptidos que
contienen la secuencia RGD puedan ser capaces de antagonizar el acoplamiento del
fibrinógeno a la GPIIb/IIIa, resultando en la inhibición de la agregación de plaquetas.
En la secuencia RGD, una unidad catiónica, en este caso el grupo guanidino de la
cadena lateral de la Arg y la estructura del ácido β-carboxílico de la Asp, es requerida
para la actividad inhibitoria. Además, la distancia entre estos grupos funcionales
catiónicos y aniónicos es un factor importante en potencia. El fibrinógeno enlaza
sitios de la GPIIb/IIIa, la cual tiene un número de residuos de Asp, y a causa de esto
el grupo guanidino de la Arg, en el caso de compuesto tipo-RGD, se piensa que
puede estar involucrado en la ligadura iónica con el grupo carboxilato del Asp en la
GPIIb/IIIa. Con base en lo anterior, los péptidos que son antagonistas del fibrinógeno
y se fijan a GPIIa/IIIa son útiles en la prevención de la trombosis y en los regímenes
de tratamiento post-angioplastia o post-trombolíticos (Miyashita et al., 1999).

II.6.2. Actividad anticariogénica
La caries dental es una enfermedad destructiva de las estructuras de los dientes y es
también de las más frecuentes. Es una enfermedad multifactorial, que precisa para
su desarrollo la interacción de factores como la resistencia del huésped, las
relaciones microbianas, las características de la saliva y del sustrato, así como el
tiempo para actuar (García et al., 2008). Actualmente se reconoce que una cavidad
es la última manifestación de una infección bacteriana. Las bacterias presentes en la
boca forman una comunidad compleja que se adhiere a la superficie del diente en
forma de una biopelícula, comúnmente denomina placa dental (Kidd and Fejerskov,
2003).
Los ácidos que producen las bacterias cariogénicas contribuyen a la disminución del
pH el cual afecta el esmalte causando la pérdida de mineral de la estructura dental
(Kidd and Fejerskov, 2003).

La caries dental involucra la desmineralización del esmalte dental (solubilización de
calcio y fósforo); esta desmineralización es ocasionada por la acción de ácidos que
provienen de manera directa delos alimentos consumidos o indirectamente como
resultado de la fermentación por la placa bacteriana de los residuos de alimentos que
quedan entre los dientes o adheridos a estos. Después de la desmineralización se
crean pequeñas cavidades donde se alojan las bacterias que al metabolizar azúcares
de los restos de los alimentos producen ácidos creando un ambiente acidúrico. En la
cavidad bucal se encuentra millones de bacterias y el Streptococcus mutans es el
más frecuente, el más crítico y es el que más se asocia con el problema de la caries
(Canseco, 2001; García et al., 2008). Ésta bacteria puede fermentar los hidratos de
carbono para formar ácido láctico, los ciclos repetitivos de la generación ácida puede
dar lugar a la disolución microscópica de minerales del esmalte del diente y a la
formación de una mancha blanca o marrón opaca en la superficie del diente.
Los mecanismos naturales para evitar la desmineralización son: la saliva como
amortiguador de pH natural, la deglución, la higiene que permite la formación de una
capa/película de materia orgánica la cual protege el esmalte y se forma por la
precipitación de diversos componentes de la saliva; esta película resulta ser muy
benéfica ya que además de proteger el esmalte, reduce la fricción entre los dientes y
proporciona una matriz para la remineralización del órgano dentario afectado
(Canseco, 2001). Un método que posiblemente sería efectivo para reducir la
formación de ácidos podría ser el evitar consumir alimentos ricos en azúcar y ácidos.
Otras propuestas están basadas en la formación de una barrera física por la
adsorción de algún péptido bioactivo, de igual forma podrían actuar como
amortiguador de pH para la neutralización de los ácidos con los péptidos bioactivos
(Warner et al., 2001).
Warner et al., (2001) reportó que el caseinofosfopéptido tiene una reducción de
pérdida de calcio de 80.2%, el suero lácteo de elaboración de queso cottage tiene
44% de reducción de pérdida de calcio y el suero lácteo ácido un 48.5%; en cuanto a
la reducción de la pérdida del fósforo fue de 81.8%, 18.2% y 39.4% respectivamente.

Por su parte Córdova (2013), obtuvo que el concentrado proteínico del Phaseolus
lunatus presentó una reducción en la disociación de calcio del 77.3% y en cuanto a
fósforo del 76.9%.
Se están desarrollando productos para la prevención de la caries que contengan
mayor concentración de calcio y fósforo, que son los principales componentes del
esmalte dental. Los productos lácteos, como la leche y el queso pueden prevenir la
caries dental ya que se han demostrado las distintas investigaciones que el efecto se
debe a la caseína. Las enzimas de la cavidad bucal producen péptidos a partir de la
proteína láctea; los fosfopeptidos caseicos estabilizan el calcio y el fosfato,
conservándolos en una forma amorfa que no precipita. De esta forma, el calcio y el
fosfato del esmalte, habitualmente insoluble, en presencia de los fosfopéptidos
permanecen solubles y biológicamente disponibles (Marcantoni, 2009).
Los péptidos con capacidad anticariogénica (péptido, calcio y fosfato) son
incorporados a productos y llegan a la cavidad bucal en forma de chicles, pastas
dentífricas; los péptidos se ligan a la superficie de los dientes a la biopelícula, a las
bacterias, a los tejidos blando y dentina proporcionando un depósito de calcio y
fosfato biodisponibles y solubles en la saliva y en las superficies dentarias. El fosfato
de calcio amorfo se libera del complejo de fosfopéptidos caseicos cuando el pH
desciende. Así se previene la desmineralización y se promueve la remineralización
del esmalte (Marcantoni, 2009).

III. Objetivos
Objetivo general
Evaluar la actividad biológica antitrombótica y anticariogénica in vitro a los
hidrolizados y fracciones proteínicas de la leguminosa Vigna unguiculata obtenidas
por hidrólisis proteica in vitro.

Objetivos específicos
1. Obtener hidrolizados proteínicos a partir del concentrado proteínico de la
leguminosa Vigna unguiculata empleando los sistemas enzimáticos Alcalase-
Flavourzyme® y Pepsina-Pancreatina.
2. Separar por ultrafiltración las fracciones peptídicas derivadas de la hidrólisis
enzimática.
3. Determinar las actividades antitrombótica y anticariogénica in vitro a los
hidrolizados y las fracciones peptídicas.
4. Determinar el perfil de aminoácidos a las fracciones con mayor actividad
biológica.

IV. Materiales y métodos
A continuación se muestra de manera general la metodología desarrollada mediante
el siguiente diagrama (Figura 3).

Figura 4.1. Diagrama de flujo del desarrollo experimental.

IV.1. Obtención de la materia prima
Los granos del frijol x’pelón se adquirieron en el mercado público de la ciudad de
Mérida Yucatán México; de la cosecha de Mayo del 2013. Fueron trasladados al
Laboratorio de Ciencias de los Alimentos en la Facultad de Ingeniería Química de la
Universidad Autónoma de Yucatán donde se procesaron.

Granos del frijol
x´pelon
Harina Almacenamiento
Concentrado
proteínico
Composición
proximal del
concentrado
proteínico
Biocatálisis :
Alcalase-
Flavourzyme®
pepsina-
pancreatina
Fraccionamiento
por ultrafiltración
Bioactividades:
antitrombotica y
anticariogénica
Perfil de
aminoácidos

IV.2. Obtención de la harina del Vigna unguiculata
Para la obtención de la harina, primeramente los granos se limpiaron manualmente,
se secaron en estufa a 60°C por 3 horas para facilitar el desprendimiento de la
cascarilla y seguidamente se molieron en un molino mecánico de discos, esto para
triturar los granos y separar por fricción la cascarilla. Una vez libre de cascarilla, los
granos se molieron en un molino Cyclotec 1093 (Tecator Swenden) para disponer de
una harina fina con un tamaño de partícula capaz de atravesar el tamiz de malla 80 y
100.

IV.3. Obtención del concentrado proteínico
Para obtener el concentrado proteínico se utilizó el método reportado por Betancur et
al. (2004) con algunas modificaciones; el cual consistió en un fraccionamiento en
húmedo de los componentes de la harina por solubilización alcalina y precipitación al
punto isoeléctrico. El proceso se llevó a cabo por lotes de 1 Kg harina que fueron
suspendidos en agua destilada (1:6 p/v); se ajustó el pH a 11 con solución NaOH 1 N
y se homogenizó por una hora con un agitador mecánico (Caframo RZ-1) a 400 rpm.
Se tamizó en mallas 60 y 100, el bagazo se lavó cinco veces con 200 mL de agua
destilada y luego -el residuo fibroso- fue desechado. El líquido se dejó reposar por 90
minutos aproximadamente y posteriormente se sifoneó el sobrenadante cuidando de
no remover el precipitado. El precipitado se lavó con 1.5 L de agua destilada por
cada lote y se dejó reposar 45 minutos, se sifoneó por segunda y nuevamente el
precipitado se lavó con agua, se dejó reposar y por tercera vez se sifoneó. Ya que se
recolectó todo el sobrenadante se ajustó el pH a 4.5 y se centrifugó (Heraeus
megafuge 16R) a 1 317 x g por 20 minutos. Se guardó el precipitado que
corresponde al concentrado proteínico y el sobrenadante fue desechado. Al
concentrado proteínico se le determinó el porcentaje de proteína y porcentaje de
humedad, con estos valores se calculó, se pesó y congeló a -20 ºC, la cantidad

necesaria del concentrado proteínico húmedo para preparar 1 litro de dispersión al
4% de proteína para su posterior hidrólisis.

IV.4. Composición proximal del concentrado proteínico
La composición proximal del concentrado proteínico fue determinada por los métodos
de la AOAC 1997. Humedad (método 925.09) por secado en estufa a 105 °C por 4
horas. Cenizas (método 923.03), residuo inorgánico resultante de la incineración a
550 °C hasta la pérdida total de la materia orgánica (3 horas). Grasa cruda(método
920.39), lípidos libres extraídos con hexano en un sistema soxhlet. Proteína cruda
(método 954.01), por el método de Kjeldahl, por una digestión ácida de la muestra y
luego una destilación alcalina, usando 6.25 como factor de conversión de nitrógeno a
proteína. Fibra cruda (método 962.09), residuo orgánico combustible e insolubles que
se obtiene después de que la muestra fue sometida a una digestión ácida y luego
alcalina. Extracto libre de nitrógeno (ELN) se obtuvo por diferencia al 100% del resto
de los constituyentes.

IV.5. Biocatálisis
Para ambos sistemas se utilizó una suspensión de concentrado proteínico al 4% del
V. unguiculata en 1 L de agua destilada. La digestión enzimática tuvo 90 minutos de
duración durante los cuales se agitó mecánicamente a 300 rpm colocado en baño de
agua, con un termómetro y un electrodo determinó los cambios de temperatura y pH.
La reacción se detuvo por calentamiento a 80°C por 20 minutos. Después, el
hidrolizado se centrifugó (ultracentrífuga LE-80K Beckman) a 16 211xg (12 000 rpm)
por 30 minutos, la porción soluble se reservó para posteriormente hacer la
ultrafiltración.

IV.5.1. Sistema Alcalase®-Flavourzyme®
La primera parte de la digestión tuvo lugar con la enzima Alcalase® la cual duró 45
minutos. La concentración que se usó de sustrato fue de 4%, una relación de
enzima/sustrato de 1:10 v/v (0.3 UAG-1 de Alcalase®); la temperatura de reacción fue
de 50 °C con un pH de 8. Al terminar la primera catálisis con Alcalase® se ajustó a
pH 7 con NaOH 1 N y se agregó la segunda enzima, Flavourzyme®. Para la segunda
enzima se usó la misma concentración de sustrato y una relación de enzima/sustrato
1:10 v/v (50 ULAPg-1), la temperatura fue la misma. Para desactivar a las enzimas
por calentamiento, a 80 °C por 20 minutos. Se dejó enfriar el hidrolizado y se
procedió a centrifuga, el sobrenadante se guardó en congelación para
posteriormente ultrafiltrarlo.

IV.5.2. Sistema Pepsina-Pancreatina
Al igual que el sistema anterior, la reacción consistió en dos tiempos; la primera
reacción se llevó a cabo con la pepsina, se usó una concentración de sustrato al 4%,
una relación de enzima/sustrato de 1/10 v/v; la temperatura de la reacción fue de
37°C a pH 2. La segunda reacción se llevó a cabo con la pancreatina para la cual el
pH fue de 7.5, se ajustó con HCl 1 N; la concentración de enzima/sustrato fue la
misma. Una vez terminada la reacción de catálisis se desactivaron las enzimas por
calentamiento a una temperatura de 80 °C por 20 minutos. Al igual que el sistema
Alcalase®-Flavourzyme® se dejó enfriar el hidrolizado y se procedió a centrifugarse,
el sobrenadante se guardó en congelación para posteriormente ultrafiltrarlo.

IV.6. Grado de hidrólisis (GH)
El porcentaje de grado de hidrólisis se determinó empleando la técnica del
Ortofenilftaldialdehido (OPA) propuesta por Nielsen et al. (2001); la técnica está
basad en la determinación de grupos aminos libres.
Primeramente se preparó una solución madre de L-serina en agua desionizada, para
ello se pesaron 50.2 mg de L-serina en 50 mL de agua desionizada; de ésta solución
se tomaron 150 µL de L-serina y se le añadieron 1350 µL de agua desionizada
obteniendo así la solución estándar de L-serina 1:10 v/v. Ya obtenido la solución
estándar se prosiguió a la preparación de la curva (Tabla 3), empleando como
testigos diferentes volúmenes en µL obtenidos de la dilución 1:10 de la solución del
aminoácidos L-serina y a.5 mL del reactivo OPA.

Tabla 4.1. Diluciones de la curva estándar de L-serina
H2O (µL) L-serina (µL)
Blanco 200 ---
Testigo 1 150 50
Testigo 2 100 100
Testigo 3 50 150
Testigo 4 --- 200

Se prosiguió a la preparación del reactivo OPA (Ortofenilftaldialdehido); para ello se
hicieron 3 soluciones: solución 1: se pesó 1.27 g de tetraborato de sodio y 33.3 mg
de dodecil sulfato de sodio y se disolvieron en 150 mL de agua desionizada. Solución
2: se pesó 26.6 mg de OPA y se diluyo en 0.66mL de etanol. Solución 3 (el
eppendorf debe estar forrado con papel aluminio): se pesó 29.3 mg de DTT (treo-2,3-
dihidroxi-1,4-butanoditiol) y se diluyó en 33.3 mL de agua desionizada. Finalmente se
mezclaron las 3 soluciones anteriores.

Ya que se obtuvo el reactivo OPA se colocaron 1.5 mL del mismo a cada muestra y
testigo, se agregó de uno en uno y se agitó por 5 segundos y luego se esperó 2
minutos para leer en el espectro a 340 nm.
A continuación se prepararon las muestras del hidrolizado; para Alcalase®-
Flavourzyme® se utilizó 7.3233 mg de hidrolizado y para Pepsina-Pancreatina
6.8446 mg de hidrolizado para tener una concentración de proteína al 4%. A las
alícuotas de hidrolizados de ambos sistemas se les agregó 2 ml de SDS al 1%. De la
solución anterior se tomaron 100 µL y se diluyó en 900 µL de SDS al 1% obteniendo
una solución y de ésta solución se tomaron 100 µL y se diluyeron en 100 µL de SDS
al 1%, se les agregó 1.5 mL de OPA, se agitó durante 5 segundos, se esperó 2
minutos y se leyó a 340 nm.
Las absorbancias obtenidas fueron usadas para hallar las concentraciones de grupos
aminos liberados por la hidrólisis. Para ello se usó la ecuación de la recta obtenida
de la curva de calibración de L-serina para finalmente aplicar la siguiente fórmula y
así hallar el porcentaje de %GH = (h/htot) x 100. Donde
h = concentración de grupos aminos libres expresada como meq/g de proteína.
htot = número total de enlaces peptídicos presentes en las proteínas del V.
unguiculata.

IV.7. Fraccionamiento por ultrafiltración
La porción soluble de los hidrolizados fue ultrafiltrada empleando el método de Cho
et al., (2004); se obtuvieron cinco fracciones peptídicas de cada sistema; se utilizaron
cuatro membranas con diferentes cortes de peso molecular: 1 kDa, 3 kDa, 5 kDa y
10 kDa (Figura 4). Para cada una de las fracciones se obtuvieron volúmenes de 450
mL.

Figura 4.2. Proceso de ultrafiltración de los hidrolizados proteínicos de V.
unguiculata.

Se lavó con agua destilada todo el equipo (Amicon M2000), y se desinfectó con
alcohol al 10%; una vez lavado con agua destilada se armó el equipo y con la ayuda
de un embudo de vidrio se agregó la muestra (1.4 L) en el interior del vaso y se cerró
herméticamente; se conectó a la corriente eléctrica y se abrieron las válvulas que
permiten el paso del nitrógeno a una presión entre 40 y 60 Psi a una velocidad de 5
en el M2000 control, el goteo fue constante, una gota por segundo y se dejó
aproximadamente 6 horas para la permeación de la primera membrana. La
ultrafiltración se inició con la membrana de 10 kDa colectando de manera separada
el retenido y el permeado; el permeado se continuó ultrafiltrando por las membranas

restantes de mayor a menor kDa. Durante la semana de la ultrafiltración las muestras
se guardaron en refrigeración a -9 °C. Una vez obtenidas las fracciones se reservó
para secarse a -47°C y 133 x10-3 mbar en una liofilizadora (Labconco Freezone 18
L).

IV.8. Bioactividades in vitro
A los hidrolizados y a las fracciones obtenidas de la ultrafiltración se les determinó la
actividad antitrombótica y anticariogénica.

IV.8.1. Actividad antitrombótica
De acuerdo al método propuesto por Miyashita et al. (1999) y Chrono-Log
Corporation (1979). Se empleó sangre humana fresca obtenida de voluntarios sanos,
sin consumir medicamentos y en ayunas. Las muestras se colectaron en tubos
vacutainer de 4.5 ml con citrato de sodio para evitar su coagulación. Seguidamente,
se centrifugó (centrifuga J-600 SOLBAT®) la sangre a 564.42 x g por 15 minutos, se
recuperó el plasma rico en plaquetas y se midió en el citómetro hemático (Sysmex
modelo Kx-21) el número de plaquetas y se ajustaron en caso de ser necesario, el
número de plaquetas usadas para evaluarla bioactividad fue entre 300 y 400 x 103
/µL. Mientras tanto, la fase residual de las muestras sanguíneas fueron centrifugadas
por segunda vez a 2132.28 x g por 15 minutos y así obtener el plasma pobre en
plaquetas que sirvió como blanco.
Para el ajuste de las plaquetas se usó la siguiente formula: V1C1=V2C2
Dónde:
V1: volumen de plasma rico en plaquetas
C1: concentración de plaquetas iniciales

V2: volumen final que se requerirá del plasma ajustado
C2: concentración de plaquetas en el plasma ajustado
Una vez obtenido el plasma rico en plaquetas y plasma pobre en plaquetas se
continuó a la lectura. Se tomaron alícuotas de 450 µL de plasma rico en plaquetas y
se colocó en las celdas que contenían una barra magnética para la homogenización;
de la misma forma se tomó 450 µL del plasma pobre en plaquetas y se colocó en una
celda sin barra magnética. Ambas celdas se colocaron el agregómetro (Crono-log), la
celda del plasma pobre en plaquetas fue el blanco solamente se requirió una celda. A
las celdas que contenían el plasma rico en plaquetas se les adicionó alícuotas de
fracciones peptídicas a una concentración de 57.2 mg/ml, las fracciones fueron re-
suspendidas en agua destilada a pH 7.2. Las celdas con el plasma y la alícuota de la
fracción peptídica se incubaron a 37°C por 1 minuto para luego adicionarles 10 µL de
una solución acuosa de Difosfato de Adenosina (ADP) 10 µM, se esperó 6 minutos
para su medición. A la muestra testigo no se le adiciono fracción peptídica,
solamente ADP para medir la agregación en condiciones basales.
La agregación de las plaquetas se determinó en el agregómetro como el incremento
en la transmisión de luz del plasma rico en plaquetas, la intensidad fue recogida
gráficamente con la ayuda del programa computacional Aggro/link. El porcentaje de
inhibición plaquetaria se calculó restando el porcentaje de la agregación del plasma
rico en plaquetas con la fracción peptídica al porcentaje de agregación del plasma
rico en plaquetas en condiciones basales (testigo).

IV.8.2. Actividad anticariogénica
Se realizó siguiendo la metodología descrita por Warner et al., (2001), la cual
consiste en usar hidroxiapatita para simular el esmalte dental. Se suspendió 20 mg
de hidroxiapatita en 10 ml de búfer tris-HCl 1 N con pH 7 y se le añadió 4 ml de
muestra (0.8 mg/mL), se agitó por 20 minutos. Seguidamente se le adicionó 10 mL

de acetato de sodio con pH 4.2 y 0.4 M para representar los ácidos orgánicos
presentes en la boca, se agitó por 10 minutos y posteriormente se centrifugó
(centrifuga Hermle) a 2 928 x g por 5 minutos; el sobrenadante se reservó para la
determinación de fósforo y calcio. Para la determinación de fósforo se usó la
metodología descrita en las normas NMX-AA-029-SCFI y NMEXY-100-SCFI- 2004;
mientras que el calcio se determinó con titulación usando EDTA y azul de
hidroxinaftol (Itoh y Ueno, 1970).

IV.9. Determinación del perfil de aminoácidos
A las muestras con las mayores bioactividades se les determinó el perfil de
aminoácidos mediante cromatografía líquida de alta resolución (Alaiz et al., 1992). La
separación de los aminoácidos se llevó a cabo con una columna Nova Pack C18 4
µm de fase reversa (Waters) de 300 x 3.9 mm a una temperatura controlada de 18°
C, usando un sistema de gradiente binario con acetato 25 mM, azida de sodio 0.02%
pH 6.0 (A) y acentonitrilo (B) como solventes. El flujo fue de 0.9 mL/mim y el
gradiente de elución usando: tiempo 0 – 3 min, gradiente línea desde A:B (91:9)
hasta A:B (86:14); tiempo 3 - 13 min, elución con A:B (86:14) 30 – 35 min elución con
A:B (69:31). Como patrón interno se utilizó ácido D, L –α-aminobutírico, calculándose
el contenido de cada aminoácido a partir de recetas de calibrado construidas para
cada uno de ellos. Se pesaron 6 mg de muestra y se le agregaron 1.5 mL de HCl 6
N, se sellaron los viales que contenían las muestras bajo atmósfera de nitrógeno y se
hidrolizó en estufa a 110°C por 20 horas. Después de la hidrólisis, las muestras se
colocaron en estufa de vacío a 60°C par que se evapore el HCl. La derivatización se
llevó a cabo durante 50 minutos a 50°C con etoximetilenmalonato de dietilo, se le
agregó tampón de borato de sodio 1M pH 9 hasta alcanzar el volumen final de 1 mL.
Para la curva de calibración, los aminoácidos estándares que usaron se sometieron a
las mismas condiciones de preparación que las muestras para evitar los errores
producidos por la pérdida de algunos aminoácidos durante la hidrolisis ácida.

IV.10. Análisis estadístico
Los resultados proximales, grado de hidrólisis, bioactividades se les determinó
medidas de tendencia central (media) y dispersión (desviación estándar). También se
analizaron por un análisis de varianza de una vía (ANOVA) con el paquete
Statgraphics plus versión 5.0.

V. Resultados y discusión
V.1. Composición química de harina y concentrado del V. unguiculata
La composición proximal de la harina y del concentrado del V. unguiculata se
muestra en la tabla 4.
Tabla 5.1. Composición química de la harina y del concentrado del V. unguiculata (%
base seca)
Componente Harina Concentrado
Cenizas 4.16±0.04 5.72±0.18
Proteína cruda 22.92±0.62 68.29±0.73
Fibra cruda 1.77±0.10 0.08±0.00
Grasa cruda 1.16±0.07 2.97±0.18
ELN 69.99±0.50 22.94±0.21
ELN= extracto libre de nitrógeno

Como se puede observar en la tabla, el concentrado presenta mayor riqueza proteica
en comparación con la harina sin embargo sigue conteniendo otros componentes
como el extracto libre de nitrógeno que presenta resultado de un 22.94%. El
resultado proteico del concentrado es similar a los reportes para otras variedades; V.
unguiculata L. walp, Sánchez (2013) reportó 63.47%; V. unguiculata, Maldonado
(2006) reportó 82.81%; en comparación con otras leguminosas se puede ver que es
similar; M. pruriens presentó 56.30%, 65.98% (Tovar, 2011; Corzo et al., 2000,
respectivamente), P. lunatus presentó 73.0% (Sosa, 2009). El proceso de obtención
de concentrados proteicos supone una serie de etapas encaminadas a eliminar o
disminuir los componentes no proteicos para conseguir un producto final hasta de un
90% (García et al., 2010). En la primera etapa del proceso se solubilizan las
proteínas para separarlas del resto de los compuestos no solubles; el extracto
obtenido contiene, además de las proteínas el resto de compuestos solubles del

concentrado proteico; las proteínas vegetales son solubles a pH próximos a la
neutralidad sin embrago se extraen las proteínas a pH alcalinos para favorecer la
solubilización de las proteínas desnaturalizadas durante la preparación de los
concentrados. En la segunda etapa se concentran las proteínas por precipitación
isoeléctrica y posteriormente mediante la centrifugación se separaron el restante de
compuestos solubles (Betancurt et al., 2004).

V.2. Hidrólisis del concentrado proteínico y Grado de Hidrólisis (GH)
El hidrolizado obtenido a partir del concentrado proteínico del V. unguiculata con el
sistema Pepsina-Pancreatina con el sistema Alcalase®-Flavourzyme® se muestra en
la Figura 5.

Figura 5.1. Grado de hidrólisis para Pepsina-Pancreatina y Alcalase®-Flavourzyme®
de las proteínas de V. unguiculata.

34.94
81.43
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Pepsina-Pancreatina Alcalase®-Flavourzyme®
Porcentaje de grado de hidrólisis

El hidrolizado con el sistema Pepsina-Pancreatina alcanzó un grado de hidrólisis del
34.94% y el sistema de Alcalase®-Flavourzyme® alcanzó un grado de hidrólisis del
81.43%, estos valores indican que ambos hidrolizados son extensivos; de acuerdo a
Pedroche et al., (2003) estos valores indican que los hidrolizados poseen
propiedades funcionales.
El GH del sistema Pepsina-Pancreatinafue similar al reportado por Ruiz-Ruiz (2010)
del 26.15% del frijol P. vulgaris L y Córdoba-Lizama (2013) reportó del P. lunatus un
GH del 12.4 % con Pepsina 10 min. De la misma forma, el hidrolizado con el sistema
Pepsina-Pancreatina quedó clasificado como hidrolizado extensivo (>10 %). Por otro
lado, el GH del sistema Alcalase®-Flavourzyme® fue superior a los reportados por
Ruiz-Ruiz (2010) que fue de 43.01% del P. vulgaris.
Diversas investigaciones han afirmado que el alto grado de hidrólisis obtenidos por
el Alcalase®-Flavourzyme® puede atribuirse a la baja especificidad que presentan
estas enzimas actuando sobre la mayoría de los enlaces peptídicos; la digestión con
la endoproteasa Alcalase® aumenta el número de sitios activos para la acción de la
endo/exonucleasa Flavourzyme®, de esta forma el sistema Alcalase®-Flavourzyme®
puede hidrolizar una mayor cantidad de enlaces peptídicos durante un tiempo de
reacción (90 minutos). De la misma manera, han afirmado autores que el sistema
Pepsina-Pancreatina presenta un menor grado de hidrólisis en comparación con el
sistema Alcalase®-Flavourzyme® debido a que la pepsina tiene actividad
endopeptidasa e hidroliza preferentemente los enlaces C-terminal de los residuos de
fenilalanina, triptófano y tirosina; por su parte la pancreatina hidroliza
preferentemente los enlaces C-terminal de los residuos de metionina y leucina,
generando así una mezcla de oligopéptidos y aminoácidos libres.

V.3. Fracciones peptídicas y determinación proteica
La porción soluble de los hidrolizados fueron fraccionadas por ultrafiltración,
obteniéndose cinco fracciones peptídicas de diferentes cortes de peso molecular: <1,
3-1, 5-3, 10-5 y >10 kDa. Se les determinó proteínas a las fracciones al igual que a la
porción soluble antes de ser fraccionada. En la tabla 6 se muestra los resultados.

Figura 5.2. Porcentaje de proteínas de las fracciones peptídicas obtenidas por
ultrafiltración de los sistemas Pepsina-Pancreatina y Alcalase®-Flavourzyme®.

Como se pueden observar los resultados, están en un rango de 42.25-68.10% ya
que se trata de fracciones de concentrados proteicos.

42.25
46.77
59.79
62.39
68.1
58.44
54.22
60.16
57.3
52.01 50.66
54.62
0
10
20
30
40
50
60
70
80
<1 3-1 5-3 10-5 >10 Fracción
Soluble
Porcentaje de proteínas de fracciones
Pepsina-Pancreatina Alcalase®-Flavourzyme®

V.4. Bioactividades antitrombótica y anticariogénica
En la figura 7 se pueden observar los valores de inhibición de agregación
plaquetaria.

Figura 5.3. Inhibición sobre la agregación plaquetaria del V. unguiculata.

Como se observa en la tabla, ambos sistemas tuvieron una inhibición de la
agregación plaquetaria teniendo como el valor más bajo de 77.4% del sistema
Pepsina-pancreatina, la concentración que se usó fue de 57.2 mg de proteína/mL. Se
han reportado inhibiciones similares, utilizando pancreatina a 120 minutos y a una
concentración de 170 mg de proteína/mL; Tovar (2011) reportó un 72% de inhibición
de agregación plaquetaria en el hidrolizado de concentrado de M. pruriens. En el
2012, Córdova et al., reportaron 88% de inhibición de la agregación plaquetaria
usando hidrolizado del concentrado proteínico del P. lunatus utilizando Pepsina-
100 100 97.8 100
82.1
77.4
94.7
90.6 91.2
85.8
95.4
100
0
20
40
60
80
100
120
<1 3-1 5-3 10-5 >10 Fracción
Soluble
Actividad antitrombótica
Pepsina-Pancreatina Alcalase-Flavourzyme®

Pancreatina secuencial y Chim en el 2011 reportó 72% de inhibición de la agregación
plaquetaria usando Pepsina-Pancreatina secuencial.
El sistema Alcalase®-Flavourzyme® tuvo valores de inhibición plaquetarias de 82.1%
hasta de 100% y se han reportado valores similares utilizando las mismas enzimas;
Chim (2011) reportó un 79.5% de inhibición de la agregación plaquetaria con el
sistema enzimático Alcalase®-Flavorzyme® para el hidrolizado del concentrado
proteínico de pepino de mar (Isostichopus badionotus) a una concentración de 50
mg/mL.
Estos resultados indican que ambos sistemas generaron péptidos con actividad
antitrombótica. Es posible que los sistemas hayan generado secuencias
aminoacídicas de segmento RGD (Arg-Gly-Asp); el segmento RGD puede ser capaz
de antagonizar el acoplamiento del fibrinógeno a la glicoproteína GPIIb/IIIa de la
membrana de las plaquetas, ya que para la unión es necesario el reconocimiento. La
unidad catiónica del grupo guanidino de la cadena lateral de la Arg y la estructura del
ácido β-carboxilo de las Asp son requeridas para la actividad inhibitoria (Miyashita et
al, 1999). El fibrinógeno enlaza sitios de la GPIIb/IIIa la cual tiene un numero de
residuos de Asp y a causa de esto, el grupo guanidino de la Arg –en el caso del
compuesto tipo-RGD- se piensa que puede estar involucrada en la ligadura iónica
con el grupo carboxilo del Asp en la GPIIb/IIIa. Así pues, los péptidos que se unen a
la GPIIb/IIIa son útiles para la prevención de la trombosis.
Hay otros segmentos que se han aislados de fuentes vegetales y animales; el
segmento KRDS es un tetrapéptido que corresponde a la lactotransferrina que
proviene de la leche que en 1998 se reportó (Ramesh et al.) con una inhibición del
45% de la agregación plaquetaria inducida con ADP a una concentración 750 µM.
como se puede observar los reportes de inhibición plaquetaria han sido similares a
los que se ha obtenido en este trabajo, se puede concluir que los sistemas generaron
fragmentos con actividad inhibitoria de la agregación plaquetaria y que el Vigna

unguiculata es una fuente de péptidos bioactivos para desarrollar productos
funcionales.
La capacidad anticariogénica del sistema Pepsina-Pancreatina se muestra en la
figura 8. Como se puede observar la fracción soluble del concentrado del V.
unguiculata presentó una reducción de la desmineralización de la hidroxiapatita de
61.55% para fósforo y 56.07 para calcio.

Figura 5.4. Porcentaje de la inhibición de la desmineralización de calcio y fósforo con
el sistema Pepsina-Pancreatina del hidrolizado del V. unguiculata.

En el 2001 Warner et al., reportó reducción de la desmineralización para calcio del
80.2%, 44.0% y 48.5% para caseinofosfopéptidos, suero lácteo de la elaboración de
queso cottage y de suero lácteo ácido, respectivamente; de la misma manera reportó
porcentajes de inhibición para el fósforo de 81.8%, 18.2% y 39.4% para las mismas
2.1
26.3
13.4
43.8
55.5
61.5
22.4
41.1
38.3
59.8
55.1 56
0
10
20
30
40
50
60
70
<1 3-1 5-3 10-5 >10 Fracción
Soluble
Inhibición de la desmineralización de calcio y fósforo
sistema Pepsina-Pancreatina
Fósforo Calcio

muestras. En 2013, Córdova et al., reportaron 68.2% y 71.9% de calcio y fósforo
respectivamente del hidrolizado fosforilado con fosfato del P. lunatus, 73.3% y 76.9%
para calcio y fósforo del hidrolizado fosforilado con pirofosfato del mismo frijol; la
enzima empleada en la hidrólisis fue Pepsina.
En la figura 9 se puede observar la capacidad anticariogénica que presentó el
sistema Alcalase®-Flavourzyme® que fue de 58.63% para fósforo y 51.40% para
calcio de la fracción > 10kDa.

Figura 5.5. Porcentaje de la inhibición de la desmineralización de calcio y fósforo con
el sistema Alcalase®-Flavourzyme® del hidrolizado V. unguiculata.

Los péptidos con capacidad anticariogénica (péptido, calcio y fosfato) son
incorporados a productos y llegan a la cavidad bucal en forma de chicles, pastas
dentífricas; los péptidos se ligan a la superficie de los dientes a la biopelícula, a las
bacterias, a los tejidos blando y dentina proporcionando un depósito de calcio y
fosfato biodisponibles y solubles en la saliva y en las superficies dentarias. El fosfato
9.9 12.2
38.5
49.6
58.6
52.9
56
37.3
60.7
39.251.4
39.2
0
10
20
30
40
50
60
70
<1 3-1 5-3 10-5 >10 Fracción
Soluble
Inhibicón de la desmineralización de calcio y fósforo
sistema Alcalase®-Flavourzyme®
Fósforo Calcio

de calcio amorfo se libera del complejo de fosfopéptidos caseicos cuando el pH
desciende. Así se previene la desmineralización y se promueve la remineralización
del esmalte (Marcantoni, 2009).

V.5. Perfil de aminoácidos
En la tabla 5 se puede observar el perfil de aminoácidos de las fracciones que
presentaron mayor bioactividad. El sistema Alcalase®-Flavourzyme® un total de
aminoácidos no polares de 48.13 g/100 de proteína y de aminoácidos polares de
51.86 g/100 de proteína; en comparación con el sistema Pepsina-Pancreatina 35.5
g/100 de proteína de aminoácidos no polares y 64.49 g/100 de proteína de
aminoácidos polares.

Tabla 5.2. Perfil de aminoácidos del hidrolizado de V. unguiculata en los sistemas
Alcalase®-Flavourzyme® y Pepsina Pancreatina (g/100g de proteína).
Aminoácidos Sistema Alcalase®-Flavourzyme® Sistema Pepsina-Pancreatina
No polares
g/100g de proteína Desviación
estándar
g/100g de
proteína
Desviación
estándar
Alanina 2.58 ±0.04 3.67 ±0
Valina 4.63 ±0.06 5.76 ±0.05
Leucina 6.85 ±0.09 8.79 ±0.01
Isoleucina 3.62 ±0.05 4.75 ±0.04
Prolina 6.00 ±1.25 3.69 ±0.14
Fenilalanina 4.50 ±0.05 6.25 ±0.03
Triptófano 18.55 ±0.36 1.32 ±0.05

Metionina 1.35 ±0.01 1.27 ±0.07
Polares
Ac aspártico 10.28 ±0.12 12.05 ±0.02
Ac glutámico 14.99 ±0.23 17.77 ±0.04
Lisina 4.84 ±0.06 6.79 ±0.01
Arginina 6.56 ±0.09 8.88 ±0.03
Histidina 1.82 ±0.02 3.13 ±0.02
Glicina 2.88 ±0.03 4.07 ±0.04
Serina 3.87 ±0.09 4.58 ±0.13
Treonina 2.42 ±0.02 3.7 ±0
Cisteína 1.51 ±0.06 0.17 ±0.07
Tirosina 2.64 ±0.03 3.36 ±0.01

En diversas investigaciones se ha comprobado que los aminoácidos que intervienen
en la inhibición de la agregación plaquetaria son la Asparagina, la Glicina y el ácido
aspártico; se puede observar en la tabla 5, el sistema Alcalase®-Flavourzyme® tuvo
menor liberación de éstos aminoácidos en comparación con el sistema Pepsina
Pancreatina, el cual tuvo mayor hidrólisis de los aminoácidos Asp, Gli y Asp.
Los aminoácidos Metionina y Cisteína son los azufrados de los cuales las
leguminosas carecen, como se puede observar son los valores más bajos y es por
eso que es necesario complementar la alimentación con cereales.

V. Conclusiones
El uso de los sistemas secuenciales compuestos por Alcalase®-Flavourzyme® y
Pepsina- Pancreatina a 90 minutos aplicados al concentrado proteico del Vigna
unguiculata generaron hidrolizados proteínicos extensivos con grados de hidrólisis
mayores a 10 %. Estás hidrólisis producen péptidos con actividad antitrombótica que

alcanzan el1 00% de inhibición plaquetaria y con una actividad anticariogénica
medida como la inhibición de la desmineralización de la placa dental de 56.08% para
calcio y 61.56% para fósforo.
El fraccionamiento del hidrolizado proteico permitió evaluar la bioactividad de cada
fracción y saber con certeza que fracción tiene mayor actividad.
De acuerdo a la literatura revisada, los hidrolizados proteicos extensivos de Vigna
unguiculata podrían ser usados en la alimentación especializada y de igual forma
adicionarlos a productos de uso diario ya que presentan actividades similares a las
reportadas del P. lunatus y M. pruriens. Algunos productos que ya están en el
mercado son gomas de mascar (Xtra care de Trident, Recaldent), malteadas
proteínicas (Biopure), pasta dental (MI Paste, GC Tooth Mousse).

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