Descarga la aplicación para disfrutar aún más
Vista previa del material en texto
Proyecto CGPI 20060807 ������������ Estudio del aislado Bacillus sp DAF1 y de su acción antibiótica. Dr. Ramón Cruz Camarillo Director del proyecto ENCB-IPN ������������ ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������1 ������������ ESTUDIO DEL AISLADO Bacillus subtilis DAF-1; SU PERFIL EXOENZIMÁTICO Y SU ACCIÓN ANTIBIÓTICA 1.0 INTRODUCCION 1.1 Procedencia y características relevantes de la cepa DAF-1 En la Isla de Trinidad en Sudamérica, algunas personas utilizan de manera empírica las hojas de una planta (Spondia mombin) para tratar las micosis dérmicas. El tratamiento consiste en la frotación de las hojas sobre las zonas enfermas. Como es frecuente en estos casos, no existen estudios sobre la efectividad de este tratamiento, y se desconoce también cual pudiera ser el mecanismo de acción. De haber un efecto antibiótico real, éste podría deberse a alguna sustancia vegetal que es liberada de las hojas durante los frotamientos sobre la piel dañada. Menos probable sería la participación de una flora microbiana con capacidad antifúngica, que se encuentre en el filoplano de las hojas utilizadas, porque habría que aceptar que aún cuando su concentración celular es baja, es capaz de producir y acumular una suficiente cantidad de antibiótico sobre la superficie de las hojas. Por lo tanto, puede ser sólo un hecho casual que se haya aislado de una muestra de las hojas de Spondia mombin una bacteria que secreta un antibiótico muy activo contra una cepa de Trichophyton rubrum. El aislamiento de esta bacteria fue realizado en el laboratorio de los doctores David Ammons y Joanne Rampersad, de la University of West Indies de la Isla de Trinidad, en Sudamérica. Preliminarmente la bacteria fue denominada: Bacillus sp. DAF-1 (de Dermatophyte Anti-Fungal ). Resulta oportuno indicar que el aislamiento de bacterias productoras de antibióticos con acción antifúngica, a partir de la superficie de hojas vegetales es un hecho conocido y reportado. Por ejemplo, en la patente 20030186852 (USA), referente a la producción de formulados para el control biológico de cultivos de interés agrícola, se menciona el uso de una cepa de Bacillus subtilis que produce sustancias insecticidas, antifúngicas y antibacterianas. Esta cepa particular fue aislada de hojas de una planta silvestre (Heins et al. 2003). La presencia de una flora antimicótica en la superficie foliar, ha permitido suponer que se trata de un mecanismo natural que permite proteger a las plantas del ataque de hongos fitopatógenos. ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������2 ������������ Por todo lo anterior sería importante estudiar un microorganismo que ha sido aislado de la superficie de una planta y con posible actividad antifúngica y sobre otro tipo de microorganismos y que también pudiera producir algún otro compuesto de interés biotecnológico. Es así que se estableció un convenio extra-oficial de colaboración científica entre el laboratorio de los Doctores David Ammons y Joanne Rampersad y el de Enzimas Microbianas de la ENCB, basado en un interés mutuo en el área de la Biotecnología Microbiana. En el caso concreto del aislado DAF-1 interesa conocer por una parte su identidad taxonómica y sus características morfológicas y bioquímicas; y por otro, investigar su potencial como productor de sustancias de interés económico como antibióticos y enzimas extracelulares. Uno de los primeros pasos de la presente investigación fue identificar la cepa DAF-1, para definir si este microorganismo pudiera ser patógeno. En el Laboratorio de Bacteriología Médica de la ENCB, la cepa DAF-1 fue identificada como Bacillus subtilis por pruebas bioquímicas API 50 CHB y posteriormente con apoyo del Dr. Jorge E. Ibarra del CIVESTAV Irapuato se verificó su identidad mediante la secuenciación de genes en su 16S rDNA; por las pruebas anteriores se tiene un 99 % de seguridad que la cepa en estudio es Bacillus subtilis. 1.3 Generalidades sobre Bacillus subtilis Bacillus subtilis es una bacteria Gram-positiva, aerobia facultativa. Es un bacilo unicelular que rara vez se agrega en cadenas, y que produce una endospora resistente al calor y otros agentes físicos y químicos. Además presenta motilidad mediante flagelos perítricos. Su pared celular está compuesta de 75 % de fosfolípidos. Es una bacteria que puede crecer en un medio mínimo sin requerir factores de crecimiento, por lo que se puede aislar de agua, suelo, aire y residuos de plantas en descomposición. También se le ha aislado de suelos contaminados (http://textbookofbacteriology.net/resantimicrobial.html). B. subtilis puede producir gran cantidad y variedad de enzimas extracelulares que le permiten degradar pectina y otros polisacáridos de origen vegetal como el almidón. También ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������3 ������������ produce proteasas, DNasas, lipasas, y otras. Esto le permite degradar una gran variedad de sustratos, lo que propicia su crecimiento en una diversidad de habitats. ������������ Una de las características más importantes de B. subtilis es su elevada velocidad de crecimiento, y también que puede secretar una gran cantidad de enzimas. Algunas veces éstas pueden producirse en gran cantidad, tal es el caso de la celulasa extracelular producida por la cepa B. subtilis KMS-635, la cual se produce a niveles de 20-25 g/L (Schallmey et al. 2004). Por estas razones y por ser una bacteria con pocas exigencias nutricionales, inocua y de fácil manejo, B. subtilis se ha utilizado en multiples procesos industriales. Las principales enzimas producidas en el ámbito industrial por esta bacteria son amilasas, proteasas alcalinas (8.5 y 10.3-10.8), pectinasas, β-glucanasas, celulasas, y xilanasas. Además, esta especie es utilizada también para producir nucleótidos, vitaminas como riboflavina y suplementos alimenticios como el ácido poli-γ- glutámico ( Rao et al. 1998, Dauner et al 2002, Schallmey et al. 2004). Es interesante resaltar que aunque dentro del género Bacillus se encuentran B. anthracis, un microorganismo en extremo patógeno hacia el hombre y algunos animales, así como B. cereus que causa gastroenteritis en humanos, B. subtilis es una especie libre de exotoxinas y endotoxinas, por lo que la Food and Drug Administration (USA) le ha otorgado el status de organismo GRAS, o generalmente seguro (generally regarded as safe) (Stein 2005). Por otra parte es conveniente aclarar, que B. subtilis es la bacteria Gram-positiva, más estudiada; en particular la cepa Marburg 168, de la cual se conoce su genoma completo desde 1997, encontrándose que al menos 4 % de los 4.2 Mbp de tal genoma codifican para proteínas involucradas en la biosíntesis de metabolitos antimicrobianos (Kunst et al. 1997). Esto explica porqué B. subtilis es uno de los microorganismos más utilizados en procesos biotecnológicos. En años recientes la mayoría de los estudios referentes a esta especie se han enfocado a la producción de proteínas heterologas, por ser posible controlar sus niveles de expresión y hacer posible la sobreproducción de sustancias de interés mediante la modificación de zonas promotoras en genes de expresión ( Westers et al. 2003). Por lo anterior, no es de extrañar que una de las áreas de estudio con esta especie, y en general con el género Bacillus sea la producción de antibióticos, la cual comenzó en los años 70s y continua vigente en nuestros días. Refiriéndose sólo a B. subtilis se han descrito ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������4 ������������ alrededor de 24 antibióticos, los cuáles presentan gran diversidad estructural como se refiere a continuación. 1.4 Generalidades en relación con los antibióticos del género Bacillus En 1977 Katz y Demain publicaron una revisión de los compuestos con actividad antibiótica producidos por el género Bacillus. Sus características más relevantes son: � La mayoría tienen naturaleza peptídica y están compuestos enteramente de aminoácidos, pero pueden poseer también residuos de ácidos grasos. � Sus pesos moleculares son menores al de las proteínas, y van desde 270 (bacilisina) hasta 4,500 (licheniformina). � Un mismo microorganismo puede producir familias de antibióticos, los cuales pueden diferir en unos cuantos aminoácidos. � La mayoría de los antibióticos peptídicos son de estructura cíclica. Unos pocos son de estructura lineal (edeina, gramicidinas). � Frecuentemente los antibióticos peptídicos contienen aminoácidos que son únicos, y por tanto no se encuentran en las proteínas, tales como D-aminoácidos, aminoácidos básicos (ornitina, ácido diaminobutirico), β-aminoácidos, dehidroaminoácidos (dehidroalanina) y aminoácidos con átomos de azufre (lantionina). � Los antibióticos peptídicos de Bacillus no contienen residuos de ácidos N-metilamino, como ocurre con los péptidos sintetizados por hongos y actinomicetos. � Los péptidos-antibióticos de Bacillus son generalmente resistentes a la hidrólisis por peptidasas y proteasas de origen animal y de plantas.���� ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������5 ������������ Entre los principales productores de antibióticos del género Bacillus se encuentran: B. brevis (gramicidina, tirotricina); B. cereus (cerexina, zwittermicina); B. circulans (circulina); B. laterosporus ( laterosporina); B. licheniformis (bacitracina); B. Polymyxa (polimixina, colistina); B. pumilus (pumulina); B. subtilis (bacitracina A, plipastatina, surfactina, bacilisina, bacilomicina, fengicina, subtilina, micobacillina, etc.).(Ozcengiz, et al. 1990; Vollenbroich et al. 1997; Tsuge et al. 1999, Yu –Shu et al. 2002). 1.5 Antibióticos producidos por B. subtilis Los antibióticos producidos por esta bacteria se pueden clasificar en dos clases. Los de origen ribosomal como: Tas A, subtilisina y sublacina, los cuales son sintetizados durantela fase de crecimiento exponencial, y los de origen no ribosomal, que se producen en la fase estacionaria, los cuales generalmente son oligopéptidos cíclicos que contienen una cadena de ácidos grasos como ocurre en la surfactina, iturinas, bacilomicinas , fengicina y micosubtilina (Feigneir et al. 1996, Stöver y Driks 1999). 1.5.1 Antibióticos de origen ribosomal Stöver y Driks (1999) estudiaron la secreción de un agente proteico antibacteriano al que llamaron Tas A, con peso molecular de 31 kDa, la cual era secretada al comienzo de la esporulación, y luego incorporada dentro de las esporas. Sus estudios mostraron que esta proteína era activa contra algunas bacterias de interés clínico como Enterobacter cloacae, Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, pero no contra E. aerogenes y Pseudomonas aeruginosa. Por su parte Schnell et al. (1988), reportaron otro antibiótico de origen ribosomal, producido por la cepa de B. subtilis ATCC 6633, al que se denominó subtilina lantionina. Esta sustancia posee puentes meso-lantionina y 3-metil-lantionina. Además contiene aminoácidos inusuales como deshidroalanina y deshidrobutirina. Se encontró que su estructura es muy similar al de la nisina, un antibiótico usado como conservador en los alimentos. La subtilina es ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������6 ������������ activa contra bacterias Gram-positivas como Propionibacterium acnes, Micrococcus lentus, y algunas especies de los géneros Staphylococcus, Streptococcus y Clostridium. 1.5.2 Antibióticos de origen no ribosomal Rogers et al. (1965) reportaron que la cepa de B. subtilis A14 producía durante la fase estacionaria un compuesto antibacteriano activo contra S. aureus, al cual se denominó bacilisina. Se encontró que se trataba de un dipéptido L-alaninil-[2,3–epoxiciclohexano-4]-L- alanina). El mismo compuesto fue aislado en B. subtilis 168 por Hilton et al. en 1988. Por otro lado, la surfactina es un antibiótico cicloheptapeptídico con una unión B-hidroxi a grupos carboxilo e hidroxilo de un ácido graso. Este antibiótico lo produce no solamente B. subtilis, sino también B. pumilus, B. licheniformis y B. amyloliquefasciens (Peypoux et al. 1999 y Stein 2005). Mucho se ha especulado sobre la función de este antibiótico, y estudios recientes parecen indicar que está involucrado en la formación de biopelículas (Hofemeister et al. 2004). Aún cuando el estudio de los antibióticos de B. subtilis es un área cada vez más compleja, dista mucho de haberse agotado. La búsqueda de antibióticos de origen microbiano va en incremento, pues la mayoría de los antibióticos sintéticos causan efectos secundarios no deseados.������������ Como es lógico, un paso importante en el estudio de los antibióticos es establecer su espectro de acción, su naturaleza química, y de ser posible llevar a cabo su purificación. A continuación se presentan algunos casos. 1.6 Antibióticos de origen bacteriano. Su purificación y espectro de acción Wakayama et al. (1984), realizaron la purificación parcial por cromatografía en capa fina de un antibiótico producido por un aislado identificado tentativamente como Bacillus cereus ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������7 ������������ SW . Encontraron que el péptido estaba compuesto por ácido aspártico, serina, ácido glutámico, leucina, tirosina, prolina y un ácido desconocido, en una proporción 2:1:1:1:1:1:1. Este antibiótico inhibía el crecimiento de hongos y levaduras, como Conidiobolus lamprauges, Fusarium oxysporum, Aspergillus nidulans, Eurotium chevalieri, Mucor rouxianus, Penicillium chrysogenum, Cryptococcus luteolus, Hansenula wingei y Saccharomyces cerevisiae. Sin embargo no inhibía el crecimiento de las bacterias S. aureus, B. subtilis, E. coli, Serratia marcescens y Proteus vulgaris. Zheng et al. (1999), reportaron la purificación de la bacteriocina subtilosina, producida por la cepa B. subtilis JH64.2. Este compuesto fue purificado mediante cromatografía de intercambio iónico y por filtración en gel. Por su parte Hagelin et al. (2004), reportaron una familia de 20 nuevos péptidos cíclicos con actividad antibiótica, al que denominaron complejo maltacina, el cual es activo contra C. albicans, T. Mentagrophytes, A. Fumigatus y S. aureus. La cepa utilizada fue aislada del suelo e identificada como B. subtilis. La caracterización de los péptidos fue llevada a cabo mediante espectrometría de masas y espectrofotometria UV-IR. Ström et al. en 2002, encontraron dipéptidos cíclicos con actividad antifúngica, pero con un espectro de acción pequeño, pues solamente eran activos contra unos cuantos hongos y levaduras. Estos compuestos fueron producidos por Lactobacillus plantarum cepa MILAB 393. Dicha cepa fue aislada de pasto y el ensayo de su actividad inhibitoria se realizó en placa. Los microorganismos sensibles fueron A. Fumigatus, Fusarium sporotrichoides y la levadura Kluyveromices marxianus. La purificación de los antibióticos se llevó a cabo por HPLC, y la identificación de las estructuras mediante el uso de resonancia magnética nuclear (RMN), espectrofotometria de masas (MS) y por cromatografiía de gases (CG). Los dipéptidos encontrados fueron ciclo (L-Phe-L-Pro) y ciclo( L-Phe-trans-4-OH-L-Pro) y ácido fenil-láctico. Un año después en 2003, Sjögren, & Magnusson reportaron que ácidos grasos 3-hidroxi, secretados por otra bacteria ácido-láctica (Lactobacillus plantarum MiLAB14) presentaban también actividad antifúngica. Los compuestos encontrados fueron ácido3-(R)-hidroxidecanoico, ácido 3-hidroxi-5-cis dodecanoico y ácido 3-( R)-hidroxitetradecanoico y la máxima producción de estos compuestos ocurría alrededor de las 38 h de incubación del cultivo. Lo antes mencionado muestra la importancia de estudiar cómo se producen los ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������8 ������������ compuestos antibióticos microbianos, que tan amplio es su espectro de acción, así como las condiciones y el momento en que se producen. También da pistas sobre la metodología que se emplea para su aislamiento, purificación y caracterización. En suma, considerando que la cepa B. subtilis DAF-1, aislada del filoplano de las hojas de Spondia mombin, presenta actividad contra una cepa de T. rubrum causante del pie de atleta, se puede especular que pudiera actuar también contra otros hongos, y probablemente contra diversas bacterias. Además, debe tener la capacidad de producir enzimas de interés biotecnológico. La comprobación de estos supuestos constituye la base del presente estudio. 2. OBJETIVO Estudiar el aislado B. subtilis DAF-1 en su capacidad para producir sustancias de interés biotecnológico, como enzimas y antibióticos. 3. METAS 3.1 Estudiar el perfil enzimático extracelular de la cepa B. subtilis DAF-1. 3.2 Reunir una colección, lo más amplia posible, de bacterias y hongos de interés médico, agrícola y biotecnológico, que sirva como blanco para estudiar el espectro antibiótico de DAF-1. 3.3 Averiguar cualitativamente la capacidad antibiótica de B. subtilis DAF-1 sobre el aservo microbiano reunido previamente. 3.4 Establecer un ensayo para evaluar cuantitativamente el efecto antibiótico de los filtrados de DAF-1 sobre microorganismos de interés médico. 3.5 Investigar la cinética de producción del antibiótico usando microorganismos de ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������9 ������������ interés médico como blanco. 3.6 Fraccionar por métodos cromatográficos o mediante extracción con solventes, el o los antibióticos más activos. 3.7 Identificar la naturaleza química de las sustancias activas usando las técnicas analíticas pertinentes. 4 JUSTIFICACIÓN El estudio de la producción de sustancias de interés biotecnológico por el aislado B. subtilis DAF-1 se justifica por las siguientes razones: 4.1 Bacillus sp. DAF-1, ya ha sido identificado por pruebas bioquímicas como B. subtilis; esta especie es considerada como generalmente segura (GRAS), y por tanto su empleo biotecnológico no ofrece riesgos a la salud. 4.2 Se tiene como antecedente que B. subtilis DAF-1 produce un antibiótico activo contra una cepa del hongo dermatofito T. rubrum; por lo tanto podría actuar también sobre otros microorganismos de interés médico. 4.3 Dado el incremento en las infecciones por hongos, resulta de interés el estudio de nuevas cepas que eventualmente pudieran producir antimicóticos más eficaces. 4.4 Considerando que B. subtilis es una bacteria productora de diversos compuestos de interés económico, puede especularse que B. subtilis DAF-1 debe producir también gran cantidad de enzimas extracelulares. Algunas de estas podrían tener importancia biotecnológica. 5. MATERIALES Y METODOS 5.1 Integración de la colección microbiana ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������10 ������������ Para estudiar el aislado B. subtilis DAF-1, se procedió a conformar una colección bacteriana y de hongos que abarcaran microorganismos de interés médico, agrícola y biotecnológico. A continuación se mencionan los laboratorios que nos proporcionaron los microorganismos. Microorganismos de interés médico.- Laboratorio de Bacteriología Médica de la ENCB; Laboratorio de Micología Médica de la Escuela de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí y el Laboratorio de Micología de la UAM-Xochimilco. Microorganismos de interés agrícola.- Laboratorio de Fitopatología de la ENCB. Microorganismos de interés biotecnológico.- Laboratorio de Micología de la UAM-Xochimilco y el Laboratorio de Enzimas Microbianasde la ENCB. 5. 2. Conservación de los microorganismos 5.2.1 A corto plazo Para la conservación a corto plazo de la mayoría de los microorganismos, se hicieron resiembras en tubos inclinado de agar nutritivo (AN), y agar soya triptocaseina (TSA) para las bacterias; y de agar extracto de papa (PDA) y agar dextrosa Sabourad (SDA) para los hongos. Las bacterias y hongos levaduriformes se sembraron por estría; los hongos filamentosos por picadura. Una vez que se realizó la siembra, se incubó a 28°C durante 24 h para las bacterias y de 48 h a 120 h para los hongos. Una vez que el microorganismo creció, se conservó en refrigeración a 4°C. Las resiembras se repitieron de la misma forma cada mes para bacterias, y cada tres meses para hongos. 5. 2. 2 A largo plazo La cepa B. subtilis DAF-1 se conservó a largo plazo por liofilización de la siguiente manera. Primero se cultivó en matraz Erlenmeyer de 125 mL, conteniendo 25 mL de caldo nutritivo, a 28 °C durante 24 h a 180 rpm. Posteriormente se sembró masivamente en placas de agar nutritivo, y se colocaron tiras de papel filtro estéril. Se incubó a 28 °C durante 24 h. Luego cada tira de papel filtro con crecimiento microbiano fue colocada en tubos de plástico estériles y que previamente se habían sellado por calor en un de sus extremos. Los tubos con las tiras de papel fueron transferidos a un frasco estéril, y sometidos a congelación en una ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������11 ������������ mezcla de hielo seco y alcohol. Se procedió enseguida a liofilizar por un periodo aproximado de 8 h. Después los tubos fueron sellados por calor. Finalmente se verificó la pureza del liofilizado reactivando la cepa en un medio líquido de caldo nutritivo y haciendo luego una resiembra en placa de agar nutritivo. Después de una incubación de 24 h, se verificó la pureza colonial y microscópica. 5.3. Evaluación del perfil exoenzimático de DAF-1 5.3. 1 Ensayos en medio sólido El medio base utilizado estaba compuesto por NaCl 0.250 g; KH2PO4 0.375 g, Na2CO3 0.375 g, MgSO4 0.275 g; extracto de levadura 1 g y casaminoácidos 1 g, para 1 L de agua. El pH se ajustó a 6.5. Como fuente de carbono se añadieron los diferentes inductores (Ver tabla 1) y se adicionó finalmente el agar bacteriológico al 1.5 %. La inoculación se realizó mediante picadura usando palillos estériles, a partir de cultivos frescos (24 h) crecidos a 28 °C en placas de agar nutritivo. Una vez realizada la inoculación, se incubó a 28°C durante periodos desde 24 hasta 120 h, dependiendo de la enzima a evaluar. La actividad se determinó mediante la relación diámetro del halo de hidrólisis entre el diámetro de la colonia. En algunos casos fue necesario añadir reveladores para observar mejor los halos de hidrólisis. La tabla 1 resume información concerniente a estas pruebas, y las cepas utilizadas como testigos positivos. ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������12 ������������ Tabla 1.- Enzimas evaluadas en medio sólido ACTIVIDAD EXOENZIMATICA INDUCTOR INDICADORES Y/O AGENTE REVELADOR TESTIGO POSITIVO OBSERVACION FUENTE BIBLIOGRAFICA Amilasas Almidón al 1 % Solución de lugol al 1% (solución reveladora) B. thuringiensis Halos de hidrólisis, sobre un fondo azul producido por la reacción del yodo (lugol) con el almidón remanente. Dhawale et al. 1982. Esterasas Tween 80 No requiere S. marcescens Halos granulosos de oleato de calcio formados alrededor de las colonias. Lovell & Bibel, 1977. Elastasas Elastina al 0.3 % No requiere B. thuringiensis Halos transparentes de hidrólisis de elastina. Kaur et al. 1998, Janda 1986. Fosfolipasas Yema de huevo al 3 % No requiere B. thuringiensis Halos opacos alrededor de las colonias producidas por las lecitinasas. Crisope et al. 1976. Lipasas Mantequilla Resarzurina al 5% (solución indicadora) S. marcescens Halos de hidrólisis de color rosa producidos por el vire del indicador resarzurina. Nava 1995. Nucleasas (DNasas) DNA al 0.03% Azul de ortotoluidina al 0.0025 % (solución indicadora) S. marcescens Halo de hidrólisis de color rosa alrededor de la colonia por el vire del indicador azul de ortotoluidina. Lachica et al. 1971. Pectinasas Pectina al 1 % Cetrimida al 5 % Erwinia carotovora Halo transparente de hidrólisis alrededor de la colonia que es revelado al adicionar la solución de Cetrimida. Hubbel et al. 1978. Proteasas Caseina al 2 % HgCl2 al 1% S. marcescens Halos transparentes alrededor de la colonia por la digestión de caseína. Rojas Avelizapa et al. 1999. Quitinasas Quitina coloidal al 10 % No requiere S. marcescens Halos transparentes alrededor de la colonia por la hidrólisis de la quitina. Rojas Avelizapa et al. 1999. Quitosanasas Quitosana coloidal al 2.5 % No requiere B. thuringiensis Halos transparentes alrededor de la colonia por hidrólisis de la quitosana. Sánchez Pérez, 2000. ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������13 ������������ 5.3.2 Ensayos en medio líquido Las actividades de quitinasas, celulasas, queratinasas y colagenasas se evaluaron mediante técnicas en cultivo sumergido, utilizando 5 mL del medio sintético basal ya descrito, adicionando los diferentes inductores que se presentan en la tabla 2. Los cultivos fueron incubados a 28°C, 180 rpm, durante periodos de 24 h hasta 120 h. Algunas pruebas se basan en medir la absorbancia a 595 nm, del colorante azul brillante de remazol liberado de los diferentes sustratos teñidos, los cuales son solubilizados por las correspondientes actividades enzimáticas. Como testigos positivos se inocularon matraces con cepas productoras patrón, y como testigos negativos se utilizaron matraces sin inocular. Sólo en el caso de las quitosanasas se utilizó como inductor un sustrato sin teñir (quitosana). La enzima secretada al medio degrada el polímero hasta pequeños oligosacáridos, los cuales tienen capacidad reductora, y por lo mismo pueden ser evaluados mediante la técnica de Miller con ácido 3,5 dinitrosalicílico. El compuesto anaranjado formado se evaluó a 535 nm ( ver tabla 2). Tabla 2.- Enzimas evaluadas en medio líquido. ACTIVIDAD EXOENZIMATICA INDUCTOR � max TESTIGO POSITIVO FUENTE BIBLIOGRAFICA Quitinasas Quitina coloidal al 2% (teñida con azul brillante de remazol) 595 nm S. marcescens Gómez Ramírez, 1999. Queratinasas Lana al 0.4 % (teñida con azul brillante de remazol). 595 nm B. thuringiensis Cedillo Robles, 1998. Celulasas Celulosa coloidal al 5 % (teñida con azul brillante de remazol). 595 nm Trichoderma viridae Poincelot and Day, 1972. Colagenasas Colágeno al 0.4 % (teñido con azul brillante de remazol) 595 nm S. marcescens O´Brien & Davis et al. 1982 Quitosanasas Quitosana coloidal al 2.5 % 535 nm B. thuringiensis Sánchez-Pérez, 2003. ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������14 ������������ 5.4 Determinación del espectro antibacteriano de la cepa DAF-1 5.4.1 Preparación de las “placas césped” Las bacterias “blanco” a estudiar se inocularon por asada en matraces Erlenmeyer de 125mL, conteniendo 25 mL de caldo nutritivo, y se incubaron a 28°C, durante 18 h a 180 rpm. Posteriormente se realizaron 3 pases sucesivos, inoculando cada vez 0.1 mL de suspensión bacteriana fresca en 25 mL de caldo nutritivo. Del último cultivo se tomó una alícuota de 0.5 mL y se mezclo suavemente con 50 mL de agar nutritivo fundido y mantenido a 50 °C. Finalmente se adicionaron 4 mL de esta mezcla sobre placas conteniendo 21 mL de agar nutritivo ya solidificado. 5.4.2 Ensayo del efecto antibacteriano Las placas césped se inocularon en la parte central por picadura con la cepa DAF-1, usando palillos estériles. El inóculo de DAF-1 provenía de placas de agar nutritivo sembradas por estría cruzada, e incubadas a 28°C, durante 24 h. Las placas “césped” inoculadas se incubaron a 28 °C durante 24 a 48 h. La acción antibacteriana se apreció por los halos de inhibición formados alrededor de la cepa DAF-1. 5.5. Determinación del efecto antifúngico de la cepa DAF-1 Para la determinación de la actividad antifúngica en hongos levaduriformes se utilizó la metodología de las “placas césped”, en agar dextrosa Sabourad. Para evaluar la actividad antifúngica contra hongos filamentosos, cada uno de éstos se sembró en el centro de una placa de agar papa dextrosa y se incubó a 28°C, por periodos de 24 h o 48 h. Posteriormente se hicieron cuatro inoculaciones simétricas por picadura de la cepa DAF-1 en torno a la colonia fúngica y se continuó incubando bajo las mismas condiciones por periodos de hasta 2 semanas. La acción antifúngica se manifestó como halos de inhibición alrededor de la cepa DAF-1. ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������15 ������������ 5.6 Ensayo de la acción antibiótica usando un extracto libre de células de DAF-1 5.6.1 Cinética de crecimiento y producción de compuestos antibacterianos de DAF-1 B. subtilis DAF-1 se cultivó en matraces de 125 mL conteniendo 25 mL de caldo nutritivo. La incubación se llevó a cabo a 28°C, 180 rpm. Cada 3 h se colectaron muestras en las primeras 24 h de incubación. Posteriormente se tomaron muestras cada 6 h hasta cumplirse las 222 h que duró el estudio. Utilizando una alícuota de 0.1 mL de las muestras colectadas se determinó la concentración bacteriana por cuenta viable. El resto de la muestra se centrifugó a 6000 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se filtró por membranas Millipore (Millex, con tamaño de poro de 0.22 µm, en condiciones de esterilidad. Los filtrados obtenidos se sometieron a un tratamiento térmicoa ebullición durante 10 minutos para eliminar la acción de enzimas extracelulares, y finalmente se conservaron en congelación. 5.6.2 Preparación del filtrado libre de células. Inicialmente se evaluó la acción antibiótica utilizando los filtrados libres de células. Sin embargo, para obtener efectos más claros, dichos filtrados se concentraron 10 veces mediante liofilización. Posteriormente se impregnaron discos de papel filtro en condiciones de esterilidad, con 200 µL del filtrado concentrado. 5.6. 3. Ensayo de la acción antibiótica contra cepas tipo. Para ensayar el efecto antibiótico del filtrado libre de células ya concentrado, se eligieron los siguientes microorganismos blanco. Como representativa de bacteria Gram (+) se escogió a Staphylococcus aureus ATCC 25923. Como representativa de bacteria Gram (-) se utilizó Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Como hongo levaduriforme se escogió Candida albicans EH-155. Se prepararon las “placas césped” como se mencionó anteriormente, y se colocaron radialmente varios círculos de papel filtro impregnados con 200 µL del extracto concentrado. Las placas se incubaron a 28°C, durante un lapso de 24 a 48 h y se midieron los halos de inhibición. ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������16 ������������ 6. RESULTADOS Y DISCUSION 6.1 Perfil exoenzimático 6.1.1 Evaluación en medio sólido La cepa de interés, Bacillus subtilis DAF-1, fue proporcionada por los Dres. David Ammons y Joanne Rampersad, de la University of West Indies de la Isla de Trinidad en Sudamérica. Los datos concernientes a su perfil enzimático utilizando ensayos en placa, se muestran en la Tabla 3. En cada caso la actividad de la cepa problema se compara con la de un testigo positivo, generalmente un buen productor de la enzima en cuestión. Tabla 3. Evaluación mediante ensayos en placa de algunas enzimas extracelulares de Bacillus subtilis DAF-1 Enzima Cepas utilizadas � colonia (mm) � halo de hidrólisis (mm) Relación de diámetros Enzimas proteolíticas Proteasa Testigo (+) Sm WF 5 24 4.8 DAF-1 10 32 3.2 Elastasa Testigo (+) Bt-NGRA 8 19 2.38 DAF-1 8 13 1.62 Enzimas que degradan lípidos o sustancias similares Lipasa Testigo (+) SmWF 2 5 2.5 DAF-1 1 3 3 Fosfolipasa Testigo (+) Bt-NGRA 8 21 2.62 DAF-1 11 13 1.18 Esterasa Testigo (+) SmWF 2 7 3.5 DAF-1 6 14 2.33 Enzimas que degradan polímeros Amilasa Testigo (+) Bt-HD1 12 16 1.33 DAF-1 7 12 1.71 Pectinasa Testigo (+) Erwinia carotovora 3 9 3 DAF-1 3 12 4 Quitinasa Testigo (+) SmWF 11 22 2.2 DAF-1 3 NSD - Quitosanasa Testigo (+) Bt-132 10 14 1.4 DAF-1 2 NSD - Nucleasa (DNasa) Testigo (+) SmWF 4 22 55 DAF-1 0.5 5 4 NSD.- No se observó halo de actividad enzimática. ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������17 ������������ 6.1.2. Evaluaciones en cultivo sumergido. Los resultados de las cinéticas de producción de colagenasa, queratinasa, quitinasa y celulasa, que se realizaron en cultivo sumergido, pusieron de manifiesto que la cepa DAF-1 llegó a producir mayores niveles de queratinasa y colagenasa que las cepas patrón. Como es habitual en este tipo de cinéticas, los trazos fueron completamente distintos e individuales para cada cepa utilizada. También se hizo un estudio de la producción de celulasas en cultivo sumergido, utilizando celulasa coloidal teñida con azul de Coomassie. En este estudio se utilizó el hongo celulolítico Trichoderma viridae como testigo positivo. Al cabo de 96 h, las lecturas a 595nm fueron 1.3 para el testigo y 0.203 para DAF-1, lo que permite, suponer que esté último produce celulasas en baja proporción. Cabe agregar que en los ensayos en placa, los resultados fueron dudosos tanto para quitinasa como para celulasa, pero al realizar las pruebas en cultivo sumergido en presencia de los sustratos teñidos correspondientes, se encontró que DAF-1 producía bajos niveles de quitinasa y celulasa. Si se examinan globalmente los datos referentes a la producción de enzimas extracelulares por B subtilis DAF-1, cabría hacer los siguientes comentarios. DAF-1 produjo niveles elevados de la mayoría de las enzimas ensayadas, por ejemplo amilasa, pectinasa, proteasa (caseinasa), elastasa, colagenasa, queratinasa, lipasa, fosfolipasa y esterasa. En cambio produjo modestas cantidades de quitinasa, DNasa y celulasa. La alta capacidad amilolítica de DAF-1 no es sorprendente, pues la producción industrial de este tipo de enzimas se lleva a cabo con cepas debidamente seleccionadas de B. subtilis. Lo mismo ocurre para la producción de proteasas de muy diversos tipos. Una prueba de la capacidad proteolítica de DAF-1, es que produjo enzimas capaces de hidrolizar substancias proteicas tan diversas como caseína, queratina, elastina y colágena. Algo semejante ocurrió al estudiar las lipasas, pues DAF-1 produjo enzimas extracelulares capaces de hidrolizar lípidos típicos, como los presentes en la mantequilla, o lípidos más complejos como las lecitinas presentes en la yema de huevo, por las fosfolipasas. También produjo esterasas capaces de hidrolizar sustratos semejantes a los lípidos, por tener ácido oleico o esteárico, ������������ ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������18 ������������ unido por un enlace ester a una molécula más compleja como ocurre en el detergente Tween 80. Adicionalmente, otra enzima producida abundantemente por DAF-1 fue la pectinasa. Esta enzima se considera típica de B. subtilis, y es una enzima muy utilizada en diversos procesos industriales. Cabría añadir por último, que la cepa en estudio B. subtilis DAF-1 produjo niveles bajos de quitinasa y celulasa, pero nada de quitosanasa, lo cuál es típico de diversas especies del género Bacillus. Lo mismo ocurrió con la producción de DNasas. En suma, B. subtilis DAF-1 es una bacteria interesante en cuanto a su perfil enzimático extracelular. Sería conveniente hacer un estudio más amplio al respecto, con el objeto de encontrar enzimas novedosas que pudieran ser de interés biotecnológico. Una que pudiera ser interesante es la queratinasa, para aprovechar biotecnológicamente algunos desechos industriales como las plumas de aves, que en enormes cantidades se producen en los rastros respectivos. La cepa DAF-1 presenta una mayor actividad enzimática que las cepas testigo, en las pruebas de proteasas, elastasas, pectinasas, colagenasas y queratinasas. Esto indica que sería importante realizar estudios posteriores para tener mayor información sobre estas actividades enzimáticas, que podrían ser de interés biotecnológico. Cabe resaltar que B. subtilis por su capacidad de producir enzimas, es utilizado también para la producción de saborizantes. Además por sobrevivir en un amplio intervalo de pH alcalino (6.5 - 8.5) es utilizada también para el tratamiento de aguas residuales que contienen materiales de origen orgánico, junto con otras bacterias del mismo género como B. licheniformis. De este modo se logra la disminución de carbohidratos, proteínas, grasas, aceites e incluso papel. Por otro lado, B. subtilis también es empleado como ingrediente en alimentos para animales, debido a su status de bacteria GRAS, y en humanos se ha utilizando en la industria panadera, y como ingrediente de algunas comidas y bebidas (©2006 BIO-CAT INC). ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������19 ������������ 6.2 Ensayo de la acción antibiótica de DAF-1 6.2.1 Integración de la colección microbiana, para realizar los ensayos 6.2.1.1. Colección bacteriana Se conoce que las bacterias de la especie B. subtilis son capaces de secretar una gran variedad de sustancias antibióticas. Para conocer el espectro de acción de los antibióticos producidos por DAF-1, se procedió a conformar una colección microbiana. La tabla 4 muestra la colección bacteriana reunida. Dentro de esta colección se incluyeron principalmente bacterias de interés médico. Tabla 4. Colección bacteriana reunida para la presente investigación Microorganismo / cepa Forma Gram Área de interés Característica especial Procedencia Aeromonas hydrophila Sch3 Bacilo - Médico sanitario Contaminantes en alimentos marinos y agua. LBM Aeromonas hydrophila 839T Bacilo - Médico sanitario Contaminantes en alimentos marinos y agua. LBM Aeromonas hydrophila 54W Bacilo - Médico sanitario Contaminantes en alimentos marinos y agua. LBM Aeromonas hydrophila 56 W Bacilo - Médico sanitario Contaminantes en alimentos marinos y agua. LBM Aeromonas hydrophila 65 W Bacilo - M édico sanitario Contaminantes en alimentos marinos y agua. LBM Bacillus thuringiensis HD1 Bacilo + Biotecnológico Producción de cristales insecticidas LEM Bacillus thuringiensis NGRA Bacilo + Biotecnológico Producción de cristales insecticidas. LEM Erwinia carotovora Bacilo - Fitopatógeno Produce pectinasas, es responsable de la pudrición blanda de la papa. LEM Escherichia coli 0536 Bacilo - Médico Causa diarrea en niños. LBM Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Bacilo - Médico Puede invadir y causar infecciones de diversa gravedad. LBM Salmonella typhi 6539 Bacilo - Médico Puede producir fiebre tifoidea si presenta el serotipo específico LBM Salmonella typhimuriumm 14028 Bacilo - Médico sanitario Aislado de toxiinfecciones alimentarias. LBM Serratia marcescens WF Bacilo- Médico� Patógeno oportunista, cepa no pigmentada. LBM ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������20 ������������ Serratia marcescens NIMA Bacilo - Médico������������ Patógeno oportunista, cepa no pigmentada. LEM Serratia marcescens WTR Bacilo - Médico� Origen hospitalario. Patógeno oportunista, cepa no pigmentada. LEM Staphylococcus aureus ATCC 25923 coco + Médico������������ Presenta varios factores de virulencia como: proteína A, hemolisinas, exotóxinas. Resistencia a agentes antimicrobianos. LBM LBM.- Laboratorio de Bacteriología Médica de la ENCB. LEM .- Laboratorio de Enzimas Microbianas de la ENCB. Tomado de (http://textbookofbacteriology.net/staph.html) Las bacterias Gram (-), poseen una pared celular compuesta de lipopolisacáridos (LPS), la cual les confiere ciertas características patógenicas. Dentro de este grupo se encuentran las enterobacterias, que tienen importancia médica por producir infecciones nosocomiales y septicemia, En la tabla 4 se resumen algunas características relevantes de las diferentes bacterias incluidas como blanco para probar los antibióticos de DAF-1. Con respecto a las bacterias Gram (+), solo se trabajó con S. aureus Este microorganismo es importante en el área médica ya que puede producir infecciones con inflamación en las heridas, que pueden llegar a ser de tipo sistémico y ocasionar la muerte; esto ocurre, cuando la infección no es correctamente tratada y el microorganismo llega al torrente sanguíneo (http://textbookofbacteriology.net/staph.html). 6.2.1.2 Colección de hongos filamentosos y levaduriformes. Con respecto a la colección fúngica reunida, está se presenta en la tabla 5. Se incluyen principalmente tres áreas de interés:médica, fitopatológica y entomopatogenica. ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������21 ������������ Tabla 5. Colección de hongos reunida para la presente investigación Nombre Clase Pared celular Área de interés Procedencia Hongos filamentosos Alternaria sp. Hifomiceto Quitina-β-glucano Entomopatógeno CIEP Aspergillus flavus Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista, productor de micotoxinas entomopatógeno, fitopatógeno y zoopatógeno. LEM Aspergillus flavus sp. Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista, productor de micotoxinas, entomopatógeno, fitopatógeno y zoopatógeno. LF Aspergillus fumigatus Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista. LEM Aspergillus niger H-179 Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista. Biotécnológico LEM Aspergillus niger Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista. Biotécnológico. CIEP Curvularia sp. Quitina-β-glucano������������ Produce queratitis ocular. CIEP Fusarium sp. Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Fitopatógeno LF Helmintosporium sp. Quitina-β-glucano������������ Fitopatógeno LF Metharizium anisopliae var. Acridum EH-500 Quitina-β-glucano������������ Entomopatógeno Fitopatógeno. LM Metharizium anisopliae 4681 Quitina-β-glucano������������ Entomopatógeno LM Metharizium anisopliae var. Acridum EH-500 Quitina-β-glucano������������ Entomopatógeno. LM Mucor rouxii 080503 Zigomiceto Quitina- quitosana Produce mucomicosis gástrica. Biotecnológico. LEM Paecilomycyces fumosoroseus EH-452 Quitina-β-glucano Entomopatógeno, bioinsecticida. LM Paecilomyces fumosoroseus EH-506 Quitina-β-glucano������������ Entomopatógeno, bioinsecticida. LM Paecilomyces fumosoroseus EH-511 Quitina-β-glucano������������ Entomopatógeno, bioinsecticida. LM Penicillium sp. Euascomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista. Biotécnológico. LF Trichophyton rubrum Hifomiceto Quitina-β-glucano������������ Patógeno oportunista. Biotécnológico. LM Trichoderma viridae Euascomiceto Quitina-β-glucano������������ Celulolítico, antagonico de fitopatógenos. LEM Verticillium lecanii EH-457 Quitina-β-glucano������������ Fitopatógeno LM Hongos levaduriformes Verticillium lecanii EH-457 Quitina-β-glucano Entomopatógeno LM Candida albicans EH-155 Blastomiceto manano-β-glucano Patógeno oportunista LM Candida albicans Blastomiceto manano-β-glucano Médico CIEP Cryptococcus neoformans basidiomiceto Quitina-β-glucano Médico CIEP CIEP.- Facultad de Ciencias Químicas. Laboratorio de Micología Médica de la Escuela de Medicina, Universidad Autónoma de San Luís Potosí LEM .- Laboratorio de Enzimas Microbianas de la ENCB. LF.- Laboratorio de Fitopatoligía de la ENCB. LM.- Laboratorio de micología de la UAM-Xochimilco.������������ ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������22 ������������ 6.2.2 Espectro antibacteriano de la cepa DAF-1 De la colección utilizada en este punto, se consideraron como representativas dos bacteria, una Gram (+) y otra Gram (-). La primera fue Staphylococcus aureus ATCC2593 y la otra Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; ambas proporcionadas por el laboratorio de Bacteriología Médica de la ENCB. La figura 1 muestra los halos de inhibición alrededor de la colonia DAF-1, sembrada por picadura al centro de una placa “césped” preparada con las bacterias blanco. Puede observarse que en ambos casos hubo inhibición del crecimiento. Figura 1 .- Acercamientos fotográficos que muestran los halos de inhibición del crecimiento de las bacterias representativas de interés médico. S. aureus (A) y P. aeuruginosa (B). Las fotografías fueron tomadas después de una incubación de 24 h a 28 °C. ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ���A Bacterias representativas Gram ( + ) Gram ( - ) Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923 ATCC 27853 ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ��� ���B ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������23 ������������ Cuando se realizó el espectro de acción antibiótica de DAF-1 sobre diferentes enterobacterias de interés médico, se encontró que todas las bacterias utilizadas en este punto presentaron efecto inhibitorio alrededor de la colonia DAF-1. De los resultados referidos puede concluirse que el espectro de acción antibacteriana de DAF-1 es muy amplio, pues inhibió el crecimiento de todos los microorganismos utilizados. Los halos de inhibición fueron evidentes y bien definidos alrededor de la colonia de DAF-1. 6.2.3 Espectro antifúngico de la cepa DAF-1 Aproximadamente la mitad de los hongos filamentosos en estudio fueron sensibles a los antibióticos producidos por la cepa B. subtilis DAF-1. Estos fueron: Alternaria sp.; Aspergillus niger (2 cepas); Curvularia sp.; Fusarium sp.; Helmintosporium sp.; Mucor rouxii; Trichoderma viridae y Paecilomyces fumosoroseus (3 cepas). Los hongos filamentosos que no tuvieron sensibilidad antifúngica fueron: Aspergillus flavus sp. (2 cepas), Aspergillus fumigatus, Metharizium anisopliae (3 cepas), Trichophyton rubrum y Verticillium lecanii. La cepa T. rubrum no presentó inhibición en su crecimiento hifal, este dato es distinto al observado previamente en ensayos realizados en la isla de Trinidad, lo que sugiere que la sensibilidad entre cepas puede ser distinta. No es de extrañar que algunas cepas adquieran la capacidad de resistencia a bacterias productoras de antibióticos. Un ejemplo son los estudios realizados por Lee et al. (2005), quienes encontraron que ciertos hongos entomopatógenos como, Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviride, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces tenuipes y Verticillium lecanii eran capaces de producir sustancias que les conferían resistencia a bacterias productoras de antibióticos como B. subtilis. Con respecto a los hongos levaduriformes ensayados, todas las cepas presentaron inhibición de su crecimiento (ver figura 2). Esto es importante, puesto que en los últimos años se ha encontrado que C. albicans se encuentra cada vez más frecuentemente en casos clínicos de candidiasis, principalmente, como un patógeno oportunista. Cryptococcus neoformans en cambio es patógeno primario involucrado en micosis sistémicas de pulmones, piel, huesos, visceras, y sistema nervioso central. ������������ ������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������������������ ������������������������������������������������������������ ������������24 ������������ Hasta este momento tenemos que B. subtilis DAF-1 es una bacteria que presenta un amplio espectro de acción antifúngica, principalmente con los hongos levaduriformes. En la figura 2 se pueden apreciar que los halos de inhibición alrededor de la colonia DAF-1, se encuentran bien definidos, y hasta se podría considerar que el tamaño de éstos halos son constantes en las tres cepas estudiadas. Los resultados obtenidos sugieren que C. Albicans y C. neoformans serían buenos candidatos para probar los productos que se obtengan de las cinéticas de producción del compuesto o los compuestos antibióticos. Si comparamos los diámetros de halos de inhibición obtenidos en el espectro antibacteriano son de menor tamaño que los obtenidos en los hongos levaduriformes. Siendo así, que sería recomendable elegir a los hongos levaduriformes como microorganismos blanco para los próximos experimentos. Con respecto a los hongos filamentosos, se puede afirmar que existe efecto inhibitorio, sin embargo este efecto es parcial y de diferente proporción para los diferentes hongos. Aproximadamente solo el 50 % de los hongos filamentosos fueron inhibidos en su crecimiento hifal. Figura 2.- Fotografías que muestran los halos de inhibición del crecimiento de algunos hongos levaduriformes. Las placas conteniendo la levadura se trabajaron de la misma
Compartir