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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE MÉRIDA TESIS “COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE ACEITES ESENCIALES OBTENIDOS DE CINCO ESPECIES DE PLANTAS CULTIVADAS EN YUCATÁN.” PARA OPTAR AL GRADO DE: DOCTOR EN CIENCIAS DE LOS ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA PRESENTA: M. en C. DURCY VERENICE RUIZ CIAU ASESOR: DR. ENRIQUE SAURI DUCH DR. LEOVIGILDO QUIJANO MÉRIDA, YUCATÁN, MÉXICO. 23 DE FEBRERO DE 2017 ÍNDICE Índice de Tablas i Índice de Figuras iii Resumen vi Capítulo I Introducción 1 Antecedentes 3 1.1. Aceites esenciales 3 1.2. Mercado, usos y aplicaciones 5 1.3. Composición química 9 1.4. Factores que pueden influir en la composición 12 1.5. Métodos de extracción 15 1.6. Identificación 23 1.7. Actividad biológica 27 1.7.1. Actividad antioxidante 28 1.7.2. Reacciones SET y reacciones HAT 35 1.7.3. DPPH (radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) 37 1.8. Toxicidad de los aceites esenciales 41 1.9. Condiciones geobotánicas del Estado de Yucatán 44 1.9.1. Clima 44 1.9.2. Los suelos 46 1.9.3. La vegetación 47 1.10. Familia Asteraceae o Compuesta 48 1.10.1. Teresita (Montanoa speciosa) 50 1.11. Familia Lamiaceae 51 1.11.1. Romero (Rosmarinus officinalis) 52 1.11.2. Poleo (Mentha pulegium) 53 1.11.3. Menta (Mentha piperita) 54 1.12. Familia Gramínea o Poaceae 55 1.12.1. Té limón (Cymbopogon citratus) 56 1.13. Importancia del estudio 57 1.14. Objetivos 59 1.14.1. Objetivo general 59 1.14.2. Objetivos específicos 59 Capítulo II Materiales y Métodos 2.1. Estrategia general de trabajo 60 2.2. Material vegetal 62 2.2.1. Recolecta 62 2.2.2. Extracción 63 2.3. Características físicas 64 2.4. Composición química y cuantificación 65 2.4.1. Instrumentación y condiciones cromatográficas 65 2.4.2. Composición química 66 2.4.3. Análisis cuantitativo 67 2.5. Actividad antioxidante 67 2.5.1. Técnica de DPPH 67 Capítulo III Resultados y discusiones 3.1. Características físicas 3.1.1. Apariencia e índice de refracción 69 3.2. Composición química 3.2.1. Índices de Kóvats experimentales 74 3.2.2. Aceite esencial de Montanoa speciosa (teresita) 78 3.2.3. Aceite esencial de Cymbopogon citratus (yerba limón, lemongrass) 87 3.2.4. Aceite esencial de Rosmarinus officinalis (romero) 97 3.2.5. Aceite esencial de Mentha piperita (menta) 108 3.2.6. Aceite esencial de Mentha pulegium (Menta poleo, poleo) 118 3.3. Actividad antioxidante 3.3.1. Ensayo de DPPH 129 Capítulo IV Conclusiones 136 Referencias 141 i ÍNDICE DE TABLAS Pág Tabla 1.1 Principales aplicaciones de los aceites esenciales en el mercado…………………………….………………………... 6 Tabla 1.2 Precios de aceites esenciales. Diciembre de 2007…… 8 Tabla 1.3 Composición de algunos aceites esenciales .…………… 9 Tabla 1.4 Constantes físicas de disolventes orgánicos utilizados en MAE………………………………………………………. 19 Tabla 1.5 Métodos de extracción a nivel laboratorio empleados para la obtención de aceites esenciales……………………………………………………. 20 Tabla 1.6 Rendimientos de algunos aceites esenciales obtenidos a nivel industrial…………………………………………….. 21 Tabla 2.1 Partes vegetales utilizadas para la obtención de aceites esenciales……………………………………………………. 61 Tabla 3.1 Características físicas de los aceites esenciales obtenidos en el estudio…………………………………….. 70 Tabla 3.2 Características físicas del aceite esencial de Montanoa speciosa……………………………………………………… 71 Tabla 3.3 Índices de refracción del aceite esencial de Montanoa speciosa……………………………………......................... 72 Tabla 3.4 Índices de refracción de los aceites estudiados…………………………………………………… 72 Tabla 3.5 Serie de n-alcanos empleados para la determinación de Índices de Kóvats…………………………………………… 74 Tabla 3.6 Estándares de terpenos e Índices de Kóvats…………................................................................ 75 ii Tabla 3.7 Composición química del aceite esencial de Montanoa speciosa DC…………………………………………………. 80 Tabla 3.8 Distribución por grupos de los componentes identificados en los aceites esenciales de Montanoa speciosa DC…………………………………………………. 85 Tabla 3.9 Composición química de los aceites esenciales de Cymbopogon citratus……………………………………….. 89 Tabla 3.10 Distribución por grupos de los componentes identificados en el aceite esencial de Cymbopogon citratus………………………………………………………... 95 Tabla 3.11 Composición química de las hojas de Rosmarinus officinalis……………………………………………………... 99 Tabla 3.12 Distribución por grupos de los componentes identificados en el aceite esencial de Rosmarinus officinalis……………………………………………………... 105 Tabla 3.13 Composición química de las hojas de Mentha piperita……………………………………………………….. 110 Tabla 3.14 Distribución por grupos de los componentes identificados en el aceite esencial de Mentha piperita……………………………………………………….. 115 Tabla 3.15 Composición química del aceite esencial de las hojas de Mentha pulegium……………………………………………. 120 Tabla 3.16 Distribución por grupos de los componentes identificados en el aceite esencial de Mentha pulegium……………………………………………………… 126 Tabla 3.17 Porcentajes de inhibicicón de DPPH de los aceites esenciales……………………………………………………. 130 Tabla 3.18 Capacidad antioxidante de los aceites esenciales cultivados en Yucatán………………………………………. 133 iii Tabla 3.19 Actividad antioxidante o porcentajes de inhibición de aceites esenciales……………………………………… 134 ÍNDICE DE FIGURAS Pág Figura 1.1 Principales países importadores y exportadores de aceites esenciales..…………………………………….…… 7 Figura 1.2 Ejemplos de algunos compuestos monoterpénicos…….. 10 Figura 1.3 Ejemplos de compuestos sesquiterpénicos……….......... 11 Figura 1.4 Ejemplos de algunos compuestos de la serie aromática………………………………………..…………… 11 Figura 1.5 Formación y metabolización celular de las ERO (Especies reactivas de oxígeno)………………..……….. 29 Figura 1.6 Mapa de climas del Estado de Yucatán…..……………. 45 Figura 1.7 Montanoa speciosa DC.………………………………….. 50 Figura 1.8 Rosmarinus officinalis………………………………….… 52 Figura 1.9 Mentha pulegium……………………………………….… 53 Figura 1.10 Mentha piperita………………………………………….… 54 Figura 1.11 Cymbopogon citratus…………………………………..…. 56 Figura 2.1 Equipo de hidrodestilación……………………………….. 63 Figura 2.2 Diagrama de la extracción por hidrodestilación……………………………………………… 64 Figura 2.3 Refractómetro de Abbe…………………………………….. 64 Figura 3.1 Espectros de masas de estándares de monoterpenos………………………….….………………… 76 Figura 3.2 Espectros de masas de estándares de sesquiterpenos…………………….…….………………….. 77 Figura 3.3 Perfil cromatográfico del aceite esencial de las hojas de Montanoa speciosa DC…………………………………….. 78 iv Figura 3.4 Perfil cromatográfico del aceite esencial de las flores de Montanoa speciosa DC…………………………………….. 79 Figura 3.5 Compuestos mayoritarios de la serie sesquiterpénica encontrados en el aceite esencial………………………… 84 Figura 3.6 Compuestos de la serie monoterpénica identificados en el aceite esencial………………………………….…........... 84 Figura 3.7 Compuestos de la serie aromática encontrados en el aceite esencial….…………………………………………… 84 Figura 3.8 Perfil cromatográfico del aceite esencial de Cymbopogon citratus (AE-1) de la época de secas………………………….…………...…………………. 87 Figura 3.9 Perfil cromatográfico del aceite esencial de Cymbopogon citratus (AE-2) de la época de lluvias…………………………………………………………. 88 Figura 3.10 Principales compuestos mayoritarios encontrados en C. citratus……………………………………………………….. 93 Figura 3.11 Perfil cromatográfico del aceite esencial de Rosmarinus officinalis (AE-1) de la época de secas………………………………………………………… 97 Figura 3.12 Perfil cromatográfico del aceite esencial de Rosmarinus officinalis (AE-2) de la época de lluvias………………………………………………………… 98 Figura 3.13 Principales compuestos mayoritarios encontradosen R. officinalis…………………………………………………….. 103 Figura 3.14 Compuestos mayoritarios adicionales encontrados en el aceite esencial de R. officinalis de la época de secas…………………………………………………………. 104 Figura 3.15 Compuestos mayoritarios adicionales encontrados en el aceite esencial de R. officinalis de la época de lluvias………………………………………..……………….. 104 v Figura 3.16 Perfil cromatográfico del aceite esencial de M. piperita (AE-1) de la época de secas……………………………………………………. 108 Figura 3.17 Perfil cromatográfico del aceite esencial de M. piperita (AE-2) de la época de lluvias…..……………………………………………………. 109 Figura 3.18 Principales compuestos mayoritarios encontrados en M. piperita AE-1 (secas)……………………………………… 114 Figura 3.19 Principales compuestos mayoritarios encontrados en M. piperita AE-2 (lluvias)……………………………………… 114 Figura 3.20 Perfil cromatográfico del aceite esencial de M. pulegium (AE-1) en la época de secas…………….……………………………………………. 118 Figura 3.21 Perfil cromatográfico del aceite esencial de M. pulegium (AE-2)en la época de lluvias…………………………………………………………. 119 Figura 3.22 Principales compuestos mayoritarios encontrados en AE- 1 y AE-2 de M. pulegium…………………………… 124 Figura 3.23 Principales compuestos mayoritarios encontrados en AE- 1 de Mentha pulegium……………………………… 125 Figura 3.24 Principales compuestos mayoritarios encontrados en AE- 2 de Mentha pulegium……………………………… 125 Figura 3.25 Porcentajes de captura de radicales de DPPH en los aceites evaluados……………………………………….. 132 vi RESUMEN Tradicionalmente, los compuestos sintéticos como butil hidroxi anisol (BHA) y butil hidroxitolueno (BHT), se han utilizado como antioxidantes en los productos a base de aceite. Sin embargo, se ha comprobado que algunos de estos compuestos son peligrosos para la salud, debido a que son carcinogénicos. Esto ha hecho que exista un creciente interés hacia la actividad antioxidante de los compuestos naturales, en donde las plantas aromáticas se han utilizado tradicionalmente en la medicina popular así como para extender la vida útil de los alimentos. De aquí que la extracción de sustancias naturales con actividad antioxidante, para reemplazar a los conservadores sintéticos de alimentos ha adquirido gran importancia. Hasta hace poco, los aceites esenciales habían sido los más estudiados desde el punto de vista del sabor y fragancia química para su empleo para aditivos de alimentos, bebidas y otros alimentos. Actualmente, sin embargo, los aceites esenciales y sus componentes están ganando un creciente interés debido a su situación relativamente segura, su amplia aceptación por los consumidores y sus múltiples aplicaciones funcionales. Muchos autores han reportado actividad antimicrobiana, antioxidante, antifúngica y captadora de radicales por las especias y aceites esenciales y, en algunos casos, se ha comprobado una aplicación directa relacionada con la alimentación. A pesar de que México cuenta con una inmensa biodiversidad, se han reportado pocos estudios acerca de las propiedades biológicas de los aceites esenciales de plantas que crecen en este país. Los objetivos del presente estudio son determinar la composición química de los aceites esenciales cultivados en Yucatán, la actividad captadora de radicales libres y los usos potenciales de los aceites esenciales obtenidos por hidrodestilación. vii Cinco aceites esenciales de las partes aéreas de Cymbopogon citratus (Poaceae), Rosmarinus officinalis (Lamiaceae), Mentha piperita (Lamiaceae), Mentha pulegium (Lamiaceae) y Montanoa speciosa (Asteraceae), fueron obtenidos por hidrodestilación, y fueron caracterizados por medio de CG-EM y su uso potencial evaluado mediante el análisis de su composición química. Asimismo, se determinó la propiedad captadora de radicales libres, mediante el ensayo con el radical de 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH). La caracterización por CG-EM de los aceites esenciales de Cymbopogon citratus, Mentha pulegium, Mentha piperita y Rosmarinus officinalis reportó un alto porcentaje de compuestos monoterpénicos oxigenados. En tanto, que los aceites esenciales extraídos de Montanoa speciosa, mostraron un mayor porcentaje de compuestos sesquiterpénicos. Los aceites esenciales analizados son similares en composición a lo reportado en otros países, con la excepción de Mentha pulegium, ya que no se encontró pulegona, piperitona, isomentona, piperitenona mentona, y neoisomentol, compuestos quimiomarcadores de esta planta. Los aceites esenciales hidrodestilados obtenidos a partir de Montanoa speciosa, Mentha piperita, Mentha pulegium, Cymbopogon citratus y Rosmarinus officinalis cultivados en Yucatán, mostraron actividad captadora de radicales libres. Los aceites esenciales de Cymbopogon citratus, mostraron la mayor actividad en el ensayo del radical DPPH. El mayor efecto antioxidante se obtuvo con el aceite de Cymbopogon citratus AE-1, que presentó el doble de la actividad antioxidante de Trolox, similar a la quercetina y un poco menor que el ácido ascórbico (vitamina C), estos compuestos fueron empleados como referencias. viii RESUME Traditionally, chemically synthesized compounds, such as butylated hydroxy-anisole (BHA) and butylated hydroxytoluene (BHT), are used as antioxidants in oil products. However, some of these compounds have been troubled for their safety because is proved to be carcinogeneic. Therefore, there is an increasing interest in the antioxidative activity of natural compounds. Aromatics plants have traditionally been used in folk medicine as well as to extend the shelf life of foods. The extraction of natural substances with antioxidant activity, to replace synthetic food preservatives has gained great importance. Until recently, essential oils have been studied most from the viewpoint of their flavour and fragrance chemistry only for flavouring foods, drinks and other goods. Actually, however, essential oils and their components are gaining increasing interest because of their relatively safe status, their wide acceptance by consumers, and their exploitation for potential multi-purpose functional use. Many authors, in fact, have reported antimicrobial, antifungal, antioxidant and radical-scavenging properties by spices and essential oils and, in some cases, a direct food-related application has been tested. Despite the fact that México has an immense biodiversity, few studies have been reported on the biological properties of essential oils from plants that grow in this country. The objectives of the study is to determine the chemical composition of essential oils grown in Yucatan, the free radical scavenging activity and the potential uses of essential oils obtained by hydrodistillation. Five essential oils from aerial parts and different of, namely, Cymbopogon citratus (Poaceae), Rosmarinus officinalis (Lamiaceae), Mentha piperita (Lamiaceae), Mentha pulegium (Lamiaceae) and Montanoa speciosa (Asteraceae), were obtained by ix hydrodistillation, and were characterized by mean of GC–MS and evaluated for their food functional ingredient related properties. Radical-scavenging properties were tested by mean of 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) assay. The characterization by GC-MS from essential oils of Cymbopogon citratus, Mentha pulegium, Mentha piperita and Rosmarinus officinalis detected in a higher percentage monoterpenes oxygenated compounds. The essential oils extracted from Montanoa speciosa, shows a higher percentage from sesquiterpenes compounds. Essential oils analyzed are similar in composition to that reported in other countries, with the exception of Mentha pulegium, which was not found pulegone, piperitone, isomenthone, piperitenone menthone, and neoisomenthol, quimiomarkers compounds of this plant. Essentialoils hydrodistillated obtained from Montanoa speciosa, Mentha piperita, Mentha pulegium, Cymbopogon citratus and Rosmarinus officinalis grown in Yucatan, showed scavenging activity of free radicals. The essential oils of Cymbopogon citratus, showed the highest activity in the DPPH radical assay. The greatest antioxidant effect was obtained with the oil of Cymbopogon citratus AE-1, which was twice the antioxidant activity of trolox, similar to the activity of quercetin and slightly lower than ascorbic acid (vitamin C), those compounds were employed as references. Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 1 Capítulo I INTRODUCCIÓN En los últimos años se ha incrementado el interés de investigadores e industriales hacia el uso de productos de origen natural debido a su disponibilidad, menores efectos laterales o toxicidad así como una mejor biodegradabilidad en el medio ambiente, todo esto comparado con los antibióticos y preservativos disponibles en mercado actual. Los aceites esenciales se encuentran dentro de este grupo de productos naturales que han atraído interés, ya que poseen como característica una amplia variedad de actividades biológicas, entre las que destacan diferentes aplicaciones como antibióticos, antioxidantes, agentes de protección de cultivos, entre otros. Las características de crecimiento de las plantas dependen del tipo de suelo y factores climáticos ecológicos. Debido a esto, la composición y rendimiento de los aceites esenciales pueden variar, lo que modifica a su vez la actividad que puedan presentar. Los aceites esenciales están constituidos principalmente por una mezcla compleja de compuestos orgánicos; encontrándose en la literatura datos relacionados con la composición química, identificación y cuantificación de sus componentes; asimismo existen estudios que sugieren actividades antibacterianas, antifúngicas, antioxidantes, entre otros, tanto para el aceite completo, como para sus constituyentes mayoritarios. La importancia del estudio de las propiedades de los aceites esenciales obtenidos de plantas medicinales es reconocida a nivel mundial y puede ayudar al descubrimiento de sustancias con uso potencial terapéutico, como preservativos para alimentos o como inhibidores de patógenos de enfermedades transmitidas por alimentos. El valor económico y la aplicabilidad industrial de las esencias están directamente relacionados con su Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 2 composición química, que determina todas las otras propiedades macroscópicas (fisicoquímicas, olor, etc.) y las de la actividad biológica. México, es un país con una enorme riqueza natural, situado en tercer lugar mundial en diversidad biológica, sólo detrás de Brasil y Colombia. La enorme riqueza de la flora Mexicana consiste en, al menos, 21 600 especies y a pesar de que no ha sido completamente explorada, se estima que estas especies se encuentran distribuidas en 166 familias de las cuales sobresalen por su mayoría las familias Asteraceae, Fabaceae, Euphorbiaceae, Lamiaceae y Solanaceae. Los aceites esenciales se encuentran ampliamente distribuidos en unas 60 familias de plantas que incluyen las Compuestas, Labiadas, Lauráceas, Mirtáceas, Pináceas, Rosáceas, Rutáceas, Umbelíferas, etc. Se conocen alrededor de 3000 tipos de aceites esenciales, pero sólo 300 tienen importancia comercial. El establecimiento de la composición química de los aceites esenciales y de sus propiedades biológicas, es una tarea importante, ya que a partir de los resultados, se puede evaluar el potencial económico de la producción del aceite esencial de las plantas a estudiar, pudiendo ser fuentes alternativas de desarrollo económico para pequeños y medianos agricultores, ya que en México, pese a su diversidad florística, la industria de los aceites está muy poco desarrollada. De Romero (Rosmarinus officinalis), Menta (Mentha piperita), Té limón (Cymbopogon citratus), Poleo (Mentha pulegium) y Teresita (Montanoa speciosa), se obtienen aceites esenciales. Estas plantas han podido ser cultivadas en Yucatán, en donde los factores climáticos y de cultivo son aspectos importantes a tener en cuenta para poder determinar el potencial de estos aceites esenciales al compararlos con los obtenidos de su lugar de origen, los cuales ya tienen aplicación práctica como aromatizantes, agentes de sabor, y/o principios activos en preparados farmacológicos, cosméticos, perfumes y aditivos en alimentos, entre otros. Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 3 ANTECEDENTES 1.1. ACEITES ESENCIALES Los aceites esenciales se encuentran ampliamente distribuidos en plantas que incluyen las Compuestas, Labiadas, Lauráceas, Mirtáceas, Pináceas, Rosáceas, Rutáceas, Umbelíferas, etc (Bruneton, 2003). Se les pueden encontrar en diferentes partes de una misma planta: en las hojas (ajenjo, albahaca, eucalipto, hierbabuena, mejorana, menta, pachulí, romero, salvia, etc.), en las raíces (angélica, cúrcuma, jengibre, sándalo, sasafrás, valeriana, vetiver, etc.), en el pericarpio de fruto (cítricos como limón, mandarina, naranja, etc.), en las semillas (anís, cardamomo, hinojo, comino, etc.), en el tallo (canela, etc.), en las flores (lavanda, manzanilla, piretro, tomillo, rosa, etc.) y en los frutos (nuez moscada, perejil, pimienta, etc.) (Evans et al., 2004). Están constituidos por una mezcla muy compleja de compuestos, cuyas características principales son su volatilidad y origen vegetal; son solubles principalmente en etanol, cloroformo, aceites fijos e insolubles en agua. Son los principales responsables de las fragancias florales y su composición y propiedades sensoriales varían aún en la misma planta (Geisner, 1980; Dudareva et al., 2006) La síntesis y acumulación de un aceite esencial, generalmente van asociadas a la presencia de estructuras histológicas especializadas, localizadas en determinados puntos de otros tejidos, frecuentemente situadas sobre o en la proximidad de la superficie de la planta (Bruneton, 2003; Evans et al., 2004). Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 4 Estas formaciones son las siguientes (Bruneton, 2003; Evans et al., 2004): Células con esencia (Lauráceas, Zingiberáceas). Pelos secretores estipitados (Pelargonium) o sesiles y con cabeza pluricelular (Labiadas). Bolsas (o cavidades) secretoras esquizógenas (Mirtáceas) o esquizolisígenas (Rutáceas, Burseráceas). Canales secretores (Terebináceas, Umbelíferas, Compuestas). Los aceites esenciales se pueden clasificar según diferentes criterios: por su consistencia, origen y naturaleza química de los componentes mayoritarios. De acuerdo a su consistencia los aceites esenciales se clasifican en esencias fluidas, bálsamos y oleorresinas. Las esencias fluidas son líquidos volátiles a temperatura ambiente. Los bálsamos son de consistencia más espesa, son poco volátiles y propensos a sufrir reacciones de polimerización, por ejemplo el bálsamo de copaiba, el bálsamo de Perú, Benjuí, bálsamo de Tolú, Estoraque, etc. Las oleorresinas tienen el aroma de las plantas en forma concentrada y son típicamente líquidos muy viscosos o sustancias semisólidas (caucho, gutapercha, chicle, oleorresina de paprika, de pimienta negra, de clavero, etc.) (Bruneton, 2003; Bretmaier, 2006). De acuerdo a su origen los aceites esenciales se clasifican como naturales, artificiales y sintéticos. Los naturales se obtienen directamente de la planta y no sufren modificaciones físicas o químicas posteriores, debido a su rendimiento tan bajo son muy costosas. Los artificiales se obtienen a través de procesos de enriquecimientode la misma esencial con uno o varios de sus componentes, por ejemplo, la mezcla de esencia de rosa, geranio y jazmín enriquecida con linalol, o la esencia de anís enriquecida con anetol. Los aceites esenciales sintéticos como su nombre lo indica, son los producidos por la combinación de sus componentes los cuales, la mayoría de las veces son producidos síntesis química. Estos son Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 5 más económicos y por lo tanto son mucho más utilizados como aromatizantes y saborizantes (esencia de vainilla, limón, frutilla, etc.) (Bruneton, 2003; Bretmaier, 2006). Desde el punto de vista químico y a pesar de su composición compleja los aceites esenciales se pueden clasificar de acuerdo a los componentes mayoritarios. Según esto, los aceites esenciales ricos en monoterpenos se denominan aceites esenciales monoterpénicos (por ejemplo: hierbabuena, albahaca, salvia, etc.). Los ricos en sesquiterpenos son los aceites esenciales sesquiterpénicos (por ejemplo: copaiba, pino, junípero, etc.). Los ricos en fenilpropanoides son los aceites esenciales fenilpropanoides (por ejemplo: clavo, canela, anís, etc.) (Bruneton, 2003; Bretmaier, 2006). 1.2. MERCADO, USOS Y APLICACIONES Aunque no se conoce exactamente la función biológica de los aceites esenciales en el reino vegetal, se sabe que pueden tener acción protectora contra plantas parásitas y pueden estar implicados en interacciones planta-animal. Asimismo, juegan un papel importante en la donación de hidrógeno y reacciones de óxido- reducción como precursores de energía o afectando la transpiración u otros procesos fisiológicos (Longenau, 1989; Harborne, 1984; Bretmaier, 2006). Se han analizado más de tres mil aceites esenciales, de los cuales aproximadamente trescientos aceites tienen un alto valor comercial y se utilizan ampliamente en diferentes ramas de la industria (alimentos, jabones, ambientadores, perfumes, cosméticos, licores, insecticidas, fármacos, etc.) (Tabla 1.1) (Gil et al., 2005). Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 6 Tabla 1.1 Principales aplicaciones de los aceites esenciales en el mercado 1. Adhesivos Pegamentos para porcelanas y cauchos 2. Industria alimentaria animal Comidas preparadas y piensos 3. Industria automovilística Limpiaparabrisas y ambientadores 4. Repostería Condimentos, saborizantes y aromatizantes 5. Chicles Saborizantes 6. Condimentos Saborizantes, colorantes 7. Dentríficos Saborizantes, colorantes 8. Insecticidas Repelentes, aromatizantes 9. Industria alimentaria Aromatizantes, saborizantes, bebidas, sopas, adobos….. 10. Productos de limpieza Aromatizantes 11. Pintura Disolventes, barnices 12. Perfumería y cosmética Aromatizantes, colorantes 13. Industria farmacéutica Principios activos, aromatizantes, saborizantes, colorantes 14. Industria tabaquera Aromatizantes (Gil et al., 2005) Los aceites esenciales tienen características sensoriales muy similares a la materia prima de donde provienen; pero con una potencia o intensidad hasta 100 veces mayor; por esta razón se usan en concentraciones que van de 0.01 a 0.1% para aromatizar diversos alimentos, bebidas, perfumes, etc. La característica de enmascarar aromas y sabores para darles uno más agradable los hace ideales Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 7 como aditivos en formulaciones farmacéuticas y de alimentos. Algunos aceites volátiles son poderosos antisépticos externos e internos, otros son sedativos, estimulantes del apetito; analgésicos, hemolíticos o antienzimáticos. Algunos son tóxicos para bacilos, germicidas, etc. (Rogers, 1994; Badui, 1993; Schery, 1972). El valor comercial y el uso de un aceite esencial dependen básicamente de su composición química, la cual a su vez está condicionada por diversos factores de tipo botánico y agrícola. La composición final del aceite depende fuertemente del método de extracción (Gil et al., 2005). Según United Nations Statistics Division (UNContrade), las exportaciones mundiales de aceites esenciales y resinoides para el 2006, fueron de US$1,993 millones, siendo Estados Unidos el principal país exportador. Francia sigue teniendo el liderazgo dentro de los importadores, pues en este país se encuentran las más importantes casas de fragancias y perfumes cuya materia prima dependen de los aceites esenciales para su producción (Figura 1.1). Figura 1.1 Principales países importadores y exportadores de aceites esenciales En el caso de las importaciones de Europa provenientes de terceros países, los países en desarrollo representan un fuerte proveedor del bloque comercial, pues representa el 37% del total de las importaciones. Así, durante el 2002 la UE Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 8 importó un total de €423 millones y para finales de 2006 ascendió a €441 millones. (Tabla 1.2) (UNComtrade; Legiscomex.com, 2006). Tabla 1.2 Precios de Aceites esenciales. Diciembre de 2007 Producto Precio por €/kg Clavo 20-25 Canela 14-18 Pimienta 29-36 Jengibre 30-35 (China) Jengibre 90-120 (India) Cardamomo 90-100 (Guatemala) Naranja (dulce) 2-3 Naranja (agria) 45-50 Bergamota 70-90 Limón 20-25 Lima-limón 20-25 Lavanda 35-45 Lavandín 17-22 Menta 30-25 Mentol 15 Eucalipto 4-5 Geranio 60-70 Citronela 6-8 Lemongrass 7-10 (India) (Market News Service, 2007) La calidad del producto se determina por las características y consistencia del aceite y sus propiedades organolépticas (olor). Un requerimiento adicional es la consistencia de la calidad. El mercado es de productores a brokers (distribuidores), los cuales mezclan y rectifican los aceites de muchos productores y de regiones para enviar productos preformulados a los manufactureros. Las ventas a las casas de fragancias por parte de los productores pueden ocurrir, pero rquieren de esfuerzos constantes. Un aspecto importante a considerar en la Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 9 comercialización es el nivel de pesticidas. La parte superior del mecado (casas de sabores y fragancias) cuenta con equipo de detección de residuos. 1.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA Los aceites esenciales son muy complejos en su naturaleza química, están constituidos por compuestos orgánicos con diferentes grupos funcionales, estados de oxidación y grados de insaturación (Bruneton, 2003). La mayoría de ellos están compuestos principalmente de monoterpenos y sesquiterpenos, además de pequeñas cantidades de diterpenos y compuestos no volátiles; en raros casos aminas, cianuros, sulfuros, compuestos nitro y quinonas (Tabla 1.3). Se pueden agrupar en dos series, caracterizadas por sus orígenes biosintéticos distintos: la serie terpénica (monoterpenos y sesquiterpenos) y la serie (mucho menos frecuente) de los compuestos arénicos derivados del fenilpropano (Keville et al., 1995; Rogers, 1994; Dudareva et al., 2006). Tabla 1.3 Composición de algunos aceites esenciales Aceite esencial Especie de la Planta Composición química Romero Rosmarinus officinalis Pineno, canfeno, cineol, alcanfor, limoneno, borneol, cariofileno, etc. Menta Mentha piperita Mentol, mentona, mentolfurano, pineno, limoneno, cariofileno, etc. Limón Citrus limón Pineno, limoneno, citronelol, citral, geraniol, felandreno, etc. Rosa Rosa centifolia Geraniol, citronelol (46-57%), eugenol, etc. Jazmín Jasminun grandiflorum Alcohol bencílico, linalol, geraniol, farnesol, pineno, citral, etc. Geranio Pelargonium sp. Geraniol, linalol, citronelol, citral, pineno, mentol, etc. (Pengelly, 2004) Composición químicay actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 10 Serie terpénica En el caso de los aceites esenciales, únicamente se encontrarán los terpenos más volátiles, es decir, aquellos cuyo peso molecular no sea demasiado elevado: como es el caso de los monoterpenos y sesquiterpenos. La diversidad de las estructuras, se explica por la gran reactividad de los carbocationes implicados en los procesos biosintéticos (Bruneton, 2003; Pengelly, 2004). A. Monoterpenos En general son tóxicos a insectos (actúan como insecticidas). Los piretroides se presentan en hojas y flores de los crisantemos y de muchas plantas de las Asteraceas (Compuestas). Estos compuestos se emplean como biopesticidas e insecticidas naturales. A veces estas plantas se cultivan alternando con otros cultivos en parcelas ecológicas. También son producidas a escala industrial por métodos biotecnológicos, a partir del cultivo in vitro de células o tejidos. Los principales constituyentes de esta serie son hidrocarburos acíclicos, monocíclicos, bicíclicos o policíclicos. Van acompañados de sus derivados oxigenados: alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres, éteres (Figura 1.2) (Bruneton, 2003; Pengelly, 2004). O O 3-CARENOVERBENENO ISOFENCONA CRISANTEMONA OH OH OH MIRCEN-8-OL P-CIMENO -TERPINEOL ISOPULEGOL TUYONA H O Figura 1.2. Ejemplos de algunos compuestos monoterpénicos Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 11 B. Sesquiterpenos Están definidos como un grupo de compuestos de C15, derivados del ensamble de tres unidades de isoprenoide; se encuentran principalmente en las plantas superiores, aunque también en invertebrados. Las estructuras de los sesquiterpenos presentan sistemas acíclicos, mono, bi, tri y tetracíclicos. Algunos tienen la función de feromonas y hormonas juveniles. Son generalmente tóxicos a herbívoros (insectos y mamíferos) (Figura 1.3) (Pengelly, 2004). OH OH OH COOH O OH FARNESOL NEROLIDOL -BISABOLENO -CADINENO -SELINENO CARIOFILENO CAROTOLÁCIDO ABSCÍSICO Figura 1.3 Ejemplos de compuestos sesquiterpénicos Serie aromática Estos compuestos contienen un anillo de benceno con un grupo propano (C3) como cadena lateral. Biogenéticamente, estos arenos son productos del metabolismo del ácido sikímico (Figura 1.4). El precursor más común es el ácido cinámico. Este grupo incluye algunos aldehídos, fenoles y ésteres fenólicos (Pengelly, 2004; Bretmaier, 2006). O O OH O ISOEUGENOLSAFROL O ANETOL Figura 1.4 Ejemplo de algunos compuestos de la serie aromática Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 12 1.4. FACTORES QUE PUEDEN INFLUIR EN LA COMPOSICIÓN Existen muchos factores que influyen sobre la composición y el rendimiento del aceite esencial de una planta, entre ellos figuran (Gil et al., 2005): Condiciones geobotánicas del medio (clima, altitud, tipo de suelo, cantidad de lluvias, etc.). Método de cultivo (uso de fertilizantes, abono, pesticidas, otros químicos, etc.). Época de recolección y parte de la planta (raíz, tallo, hojas, semillas, etc.). Modo de manejo y almacenamiento del material vegetal (fresco, seco, fermentado, etc.). Método de obtención del aceite (destilación, maceración, prensado, extracción con disolventes, extracción con fluidos supercríticos, etc.). Edad de la planta y estado fenológico. De manera general, se considera que las características anteriormente citadas se derivan de 5 aspectos principales, los cuales son: A) Origen botánico Aunque resulte evidente, se debe subrayar, que la composición de un aceite esencial está en función de la especie productora. Desgraciadamente, en el mercado abundan productos, en los cuales la denominación botánica, incluso el origen geográfico, no se especifica con todo el rigor deseable. Por ejemplo, una esencia de tomillo puede provenir de Thymus vulgaris L., especie oficinal con timol, o también de T. capitatus Hoff. y Link., con carvacrol, que es el tomillo de Creta (y también el orégano de España), o también de T. satureioides Casson y Bal., tomillo de Marruecos con borneol, de T. zygis L., tomillo de España con timol, etc. (Bruneton, 2004; Gil et al., 2005; Pengelly, 2004). Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 13 B) Quimiotipo El quimiotipo tiene importancia porque una misma especie de planta aromática puede producir aceites esenciales muy diferentes según el lugar de crecimiento, terreno, clima, etc. El romero y el tomillo, entre otros tienen esta particularidad. En el tomillo de los carrascales del Sur de Francia (T. vulgaris), especie vegetal botánicamente homogénea y cariológicamente estable, se puede distinguir siete quimiotipos: con timol, carvacrol, geraniol, linalol, -terpineol, 4-trans-tuyanol y 8- cis-mircenol; en España se encuentra además un quimiotipo con eucaliptol. El mismo fenómeno se observa en otras especies del género (Bruneton, 2004; Gil et al., 2005; Pengelly, 2004). C. Ciclo vegetativo Para una especie dada, la proporción de los diferentes constituyentes del aceite esencial, puede variar de manera importante a lo largo de su desarrollo. Así, en la menta, el neomentol y la mentona que predominan al comienzo del periodo de floración, disminuyen posteriormente. El catabolismo de estos derivados da lugar a la acumulación de mentol y de un compuesto no volátil, el glucósido de neomentilo. Se ha observado variaciones de composición en el transcurso del nictámero. Por estos motivos, se comprende fácilmente que es necesario elegir razonadamente la fecha de recolección (Bruneton, 2004; Gil et al., 2005; Pengelly, 2004). D. Factores de entorno Las condiciones climáticas y la naturaleza del suelo, influyen directamente en la producción de aceite esencial. Lo mismo ocurre con las prácticas de cultivo: densidad de plantación, intensidad y modalidades de riego, utilización de abonos, etc. (Bruneton, 2004; Gil et al., 2005; Pengelly, 2004). Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 14 E. Procedimiento de obtención La composición del producto comercial, puede ser diferente de la mezcla contenida en los órganos secretores del vegetal y el producto obtenido por hidrodestilación, raramente será idéntico al que resulte de la extracción con disolventes volátiles; esto depende de la labilidad y la reactividad, de las moléculas constituyentes de estas mezclas naturales que fácilmente se isomerizan, racemizan, recombinan, oxidan. Por ejemplo: el cariofileno presente en el aceite esencial (hidrodestilado) de clavo, no se encuentra en la concreta obtenida por extracción (Bruneton, 2004; Gil et al., 2005; Pengelly, 2004). Mentha piperita, planta aromática de la cual se obtienen aceites esenciales para comercialización, ha sido estudiada para determinar los factores que afectan la calidad y composición de su aceite esencial. Se ha encontrado que existen cuatro variedades de menta (Japanese mint, Spear mint, Bergamot mint y Pepper mint), y a su vez, cada una de ellas presenta diferentes quimiotipos (Dhananjay, 2010). Por ejemplo, de la variedad japonesa existen 6 quimiotipos, cuyo contenido de mentol va de 70% hasta 84%. Se han realizado estudios donde se analizó el potencial de la industria de los aceites esenciales de menta, y se encontró que dependiendo de la variedad y por consiguiente del contenido de un determinado compuesto el precio de dicho aceite esencial varía en el mercado (Gobierno de Chihuahua, 2003). Rosmarinus officinalis es otro aceite esencial en el que se evaluaron factores que afectan la calidad y contenido, los investigadores determinaron que existen variaciones en la composición (tanto en perfil como en porcentaje) conrespecto a la localización y fuente de población y fenología (Guazzi et al., 2001; Porte et al., 2000; Ouhada, 2000; Boutekedjiret et al., 1999). Monetti et al., 1998, reportaron que el suelo de granito es mejor para el rendimiento y calidad del aceite que el suelo calcáreo. Otro estudio realizado determinó que el empleo de biofertilizantes y fertilizantes inorgánicos incrementan el cultivo de la planta así como el Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 15 rendimiento del aceite (Peter, 2004) y que la aplicación de hierro incrementa la concentración de verbenona en el aceite esencial (Moretti et al., 1998). También que la influencia del genotipo de la planta, edad de la hoja y otras condiciones de cultivo afectan la calidad del aceite, especialmente a los principios antioxidantes (Hidalgo et al., 1998). Boutekedjiret et al., 1999, reportaron una variación en rendimiento y calidad dependiente de la fenología; ya que para un mejor rendimiento, el período de floración es el ideal para recolectar las plantas. En un estudio realizado por Boutekedjiret et al., 1997, se determinó que el aceite esencial obtenido de las hojas y flores es de mejor calidad que el aceite obtenido de la destilación de la planta completa; asimismo, se compararon los métodos de extracción para evaluar el términos de rendimiento y perfil de calidad, encontrando que la destilación con vapor de agua fue el más adecuado para la obtención de aceites esenciales. 1.5. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Los aceites esenciales pueden ser obtenidos por hidrodestilación, destilación con vapor, extracción con disolventes volátiles, “enfleurage”, hidrodifusión o extracción por CO2; adicionalmente está la expresión del pericarpio o prensado en frío. También se ha desarrollado y reportado en los últimos años, la irradiación por microondas (o proceso asistido por microondas, MAP por sus siglas en inglés) (Bruneton, 2003; Lahlou, 2004). Algunos de los métodos anteriormente mencionados: Arrastre con vapor de agua. Esta técnica es muy utilizada especialmente para esencias fluidas, especialmente las utilizadas en perfumería. Se utiliza a nivel industrial debido a su alto rendimiento, la pureza del aceite obtenido y porque no requiere tecnología sofisticada. Puede haber tres variantes según la textura y la Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 16 fragilidad de la materia prima a tratar (Bruneton, 2003; Rogers, 1984; Vankar, 2004): a) La primera posibilidad consiste en sumergir directamente el material vegetal a tratar (intacto o groseramente pulverizado), en agua que se somete a ebullición. Los principios volátiles son arrastrados y después de condensar el destilado, se separan por decantación. b) Los productos que pueden alterarse, por una ebullición prolongada, se sumergen en agua, seguidamente, los compuestos volátiles son arrastrados por el vapor producido por un generador, separado e inyectado directamente en el medio. c) El tercer caso es aquel en el que la muestra está directamente sometida a la acción de una corriente de vapor, sin maceración previa. El agua saturada de aceite esencial, que se recupera en el destilado, se reenvía al destilador (en el primer caso); al final de la operación puede ser utilizada o reextraída con un disolvente volátiles. En la expresión, el material vegetal (pericarpio) es exprimido mecánicamente para liberar el aceite de las cavidades secretoras y posteriormente es recolectado y filtrado. Este método es utilizado para el caso de las esencias de cítricos. Existen distintas variantes en la aplicación de este principio (Bruneton, 2003; Rogers, 1984; Vankar, 2004): a) Rallado de las pieles en corriente de agua, separación de la fase acuosa y del aceite esencial por centrifugación. b) Aplastamiento de los frutos enteros entre dos cilindros metálicos, eliminación de los desechos sólidos, separación por centrifugación de los zumos de frutos y de los aceites esenciales. Se recupera una nueva porción de aceite esencial, por arrastre con vapor de agua de los materiales sólidos residuales, pero este es de peor calidad. c) Presión directa de los frutos partidos privados de su zumo. Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 17 En el método de extracción con disolventes volátiles, la muestra seca y molida se pone en contacto con disolventes tales como alcohol, cloroformo, etc. Estos disolventes solubilizan y extraen otras sustancias tales como grasas y ceras, obteniéndose al final una esencia impura. La selección del disolvente pretende que sea capaz de disolver rápidamente todos los principios y la menor cantidad de materia inerte, que tenga un punto de ebullición bajo y uniforme que permita eliminarlo rápidamente, pero evitando pérdidas por evaporación, químicamente inerte, para no reaccionar con los componentes de los aceites, no inflamable y barato. Se utiliza a escala de laboratorio pues a nivel industrial resulta costoso por el valor comercial de los disolventes, porque se obtienen esencias impurificadas con otras sustancias y además por el riesgo de explosión e incendio característico de muchos disolventes orgánicos volátiles (Bruneton, 2003; Vankar, 2004; Cseke et al., 2006). En el método de enflorado o enfleurage, el material vegetal (generalmente flores) es puesto en contacto con una grasa. La esencia es solubilizada en la grasa que actúa como vehículo extractor. Se obtiene inicialmente una mezcla (concreto) de aceite esencial y grasa la cual es separada posteriormente por otros medios fisicoquímicos. En general se recurre a la adición de alcohol caliente a la mezcla y su posterior enfriamiento para separar la grasa (insoluble) y el extracto aromático (absoluto). Esta técnica es empleada para la obtención de esencias florales (rosa, jazmín, azahar, etc.), pero su bajo rendimiento y la difícil separación del aceite extractor la hacen costosa (Bruneton, 2003). El método de extracción con fluidos supercríticos es uno de los desarrollos más recientes. El material vegetal cortado en trozos pequeños, licuado o molido, se empaca en una cámara de acero inoxidable y se hace circular a través de la muestra un fluido en estado supercrítico (por ejemplo CO2), las esencias son así solubilizadas y arrastradas y el fluido supercrítico, que actúa como disolvente extractor, se elimina por descomprensión progresiva hasta alcanzar la presión y Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 18 temperatura ambiente, y finalmente se obtiene una esencia cuyo grado de pureza depende de las condiciones de extracción. Presenta varias ventajas como rendimiento alto, es ecológicamente compatible, el disolvente se elimina rápidamente e inclusive se puede reciclar, y las bajas temperaturas utilizadas para la extracción no cambian químicamente los componentes de la esencia, sin embargo, el equipo requerido es relativamente costoso, ya que se requieren bombas de alta presión y sistemas de extracción también resistentes a altas presiones (Bruneton, 2003; Cseke et al., 2006). En el método de destilación y extracción simultánea (Lickens-Nickerson) se produce la separación y concentración de los componentes volátiles de muestras termosensibles por destilación y extracción simultánea mediante disolventes orgánicos. Mediante este método, se favorece la extracción en fase vapor y se minimizan las pérdidas de compuestos muy volátiles. Se puede trabajar a presión reducida, para obtener altos valores de recuperación sin recurrir a fuertes calentamientos de la muestra, así como a presión atmosférica (Blanch et al., 1992). La extracción asistida por microondas (MAE) se utilizó por primera vez en 1986 por Ganzler et al., parala extracción de grasas y antinutrientes de alimentos y pesticidas de suelos. En 1993, Pare patentó un proceso llamado proceso asistido por microondas (MAP por sus siglas en inglés) para la extracción de aceites esenciales de materiales biológicos. Esta técnica se extendió posteriormente a aplicaciones analíticas y de gran escala. Su alta eficiencia es su mejor ventaja comparado con métodos tradicionales como el soxhlet. Se puede lograr el mismo recuperado en un tiempo más corto (20-30 minutos) y con menor cantidad de disolvente (30 mL) (Tabla 1.4). Dado que la MAE es algo exhaustiva, normalmente los extractos contienen especies interferentes que requieren un pretratamiento (Cseke et al., 2006; Kou et al., 2003). Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 19 Tabla 1.4 Constantes físicas de disolventes orgánicos utilizados en MAE P. eb. Presión de vapor ’ Momento dipolar Tan Disolvente (°C) (kPa) (debye) (x 104) Diclorometano 40 58.2 8.93 1.14 - Acetona 56 24.6 20.7 2.69 - Metanol 65 16.7 32.7 2.87 6400 Hexano 69 16.0 1.88 <0.1 - Acetato de etilo 77 9.74 6.02 1.88 - Agua 100 101.4 78.3 1.87 1570 Los puntos de ebullición se determinaron a 101.4 kPa, el vapor de presión se determinó a 25°C, la constante dieléctrica se determinó a 20°C y el momento dipolar a 25°C. (Cseke et al., 2006) En general, para describir la composición de los metabolitos secundarios volátiles y semivolátiles de plantas, es necesario combinar varias técnicas de aislamiento. Así, los métodos de arrastre con vapor y destilación-extracción simultánea con disolventes recuperan con mayor eficiencia monoterpenos y sus derivados oxigenados. El método de extracción de Likens y Nickerson separa y concentra los componentes volátiles de muestras termosensibles por destilación y extracción simultánea mediante disolventes orgánicos; favorece la extracción en fase vapor y minimiza las pérdidas de compuestos muy volátiles, además de que permite utilizar indistintamente disolventes orgánicos de mayor o menor densidad que el agua (Gil et al., 2005; Jalal et al., 2009). En la Tabla 1.5 se muestran algunos ejemplos de diversos estudios realizados para la extracción de los aceites esenciales a nivel laboratorio, así como los métodos empleados para tal fin (Bottia et al., 2007; Martínez et al., 2007; Rehman et al., 2008; Gómez et al., 2001; Benkaci-Al et al., 2006; Cañizares et al., 2007; Phutolhawong et al., 2007; Williams et al., 2004; Kosar et al., 2005; Bendahou et al., 2008; Münevver et al., 2004; Gören et al., 2004; Bassole et al., 2005; Ávila et al., 2006). Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 20 Tabla 1.5 Métodos de extracción a nivel laboratorio empleados para la obtención de aceites esenciales Año y autores de estudio Aceite esencial Método de extracción 2007. Bottia et al.. Piperaceae Destilación - Extracción simultánea 2007. Martínez et al.. yerbamate Destilación - Extracción simultánea 2008. Rehman et al.. Camellia sinensis Destilación - Extracción simultánea 2006. Benkaci-Al et al.. Nigella sativa L. Extracción asistida con microondas 2001. Gómez et al. Aceites esenciales Extracción Asistida con microondas vs destilación. 2007. Cañizares et al.. Vainilla Extracción asistida por microondas (focalizado) vs extracción soxhlet vs ultrasonido. 2007. Phutolhawong et al.. Cinnamomum iners Reinw. ex Bl Extracción asistida por microondas vs hidrodestilación. 2004. Williams et al.. Capsicum Extracción asistida por microondas (focalizado) vs Extracción con reflujo. 2005. Kosar et al.. Metabolitos volátiles secundarios. Extracción asistida por microondas vs hidrodestilación. 2008. Bendahou et al.. Origanum glandulosum Desf Hidrodestilación vs Extracción asistida por microondas. 2004. Münevver et al.. Origanum acutidens Hidrodestilación vs extracción soxhlet. 2004. Gören et al.. Satureja thymbra Hidrodestilación. 2005. Bassole et al.. Lippia chevalieri y Ocimum canum Hidrodestilación 2006. Ávila et al.. Diplostephium tolimense cuatrec (Asteraceae) Maceración vs extracción soxhlet. Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 21 A nivel industrial se utilizan principalmente hidrodestilación o arrastre con vapor de agua y los aceites se separan por densidad y no es necesario el empleo de disolventes. Una alternativa que se menciona en la mayoría de los reportes, es la utilización de trampas tipo Clevenger, el cual es adoptado como método de extracción ya que no utiliza disolvente, lo que genera diversas ventajas. En la Tabla 1.6 se puede observar a nivel industrial el método de extracción utilizado y los rendimientos obtenidos en aceites esenciales (Gobierno de Guatemala, 2009). Tabla 1.6 Rendimientos de algunos aceites esenciales obtenidos a nivel industrial MÉTODO EXTRACCIÓN RENDIMIENTO PLANTA Arrastre de vapor El vapor atraviesa la muestra, extrae y arrastra el aceite esencial. Tiempo de extracción 3 ó 4 horas. Separación aceite-agua: por densidad Menores al 1% Orégano fresco: 0.2 % Orégano seco: 1 - 2.5% Romero fresco: 0.6 % Romero seco: 0. 88% Albahaca fresca: 0.6% Albahaca seca: 1.11 % Menta seca: 1 – 2.5% Menta fresca: 0.2 -0.5 % Manzanilla flores secas: 0.4% (Gobierno de Guatemala, 2009). Mendivelso et al., (2007) realizaron un estudio donde analizaron la influencia del método de extracción y el tiempo de crecimiento de la planta sobre el rendimiento y la composición de los metabolitos volátiles de la especie Pelargonium graveolens (Geraniacea). Encontraron que las fracciones volátiles obtenidas por los diferentes métodos de extracción (hidrodestilación asistida por microondas y destilación-extracción simultánea) eran ricas es citronelol, además de que se encontraban presentes geraniol, citral, acetato de geranilo y otros compuestos de gran interés en la industria perfumística y cosmética. Además, la composición química relativa de los aceites obtenidos por los métodos anteriores fue similar en las dos etapas de crecimiento evaluadas. Se encontró que la extracción- Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 22 destilación simultánea fue el método más efectivo para aislar monoterpenos oxigenados. En el mismo año, Richter y Schellenberg, compararon diferentes métodos de extracción con relación a la transformación que sufren los compuestos originales, particularmente por el tiempo de exposición. Los aceites analizados fueron Origanum majorana L., Carum carvi L., Salvia officinalis L., Thymus vulgaris L. Los resultados mostraron que la microextracción en fase sólida es el método más adecuado para realizar un rápido monitoreo de la composición aromática. Mientras que la hidrodestilación se emplearía para la determinación del contenido de aceite esencial y preparación de extractos. En el 2008, Liang et al., realizaron la extracción por hidrodestilación del aceite esencial de las flores de siete poblaciones de Salvia miltiorrhiza Bge., con un rendimiento de 0.2%. Se identificaron un total de 82 compuestos en todas las muestras. Los componentes fueron principalmente monoterpenos, sesquiterpenos, ácidos grasos y alcanos. El análisis por cromatografía de gases-detector de ionización de flama y cromatografía de gases-espectrometría de masas mostró que los componentes predominantes del aceite esencial fueron -cariofileno, óxido de -cariofileno, -cariofileno, cadineno y ácido hexadecanoico. En el 2008, Leitao et al., realizaron el análisis de la composición química del aceite esencial extraídos de las hojas y flores de Lippia lacunosa y Lippia rotundifolia (Verbenaceae)por cromatografía de gases-detector de ionización de flama y cromatografía de gases-espectrometría de masas. Los componentes mayoritarios de flores y hojas de L. lacunosa fueron mirceno (14.7% y11.9%), mircenona (45.2% y 64,2%), Z-ocimenona (5.7% y 5.2%) y E-ocimenona (14.7% y 4.1%), respectivamente, mientras que para L. rotundifolia fueron -pipeno (8.7% y 1.8%), mirceno (5.1% y 3.6%), limoneno (26.0% y 7.9%), cis-pinocanfeno (4.5% y 3.1%) y mirtenal (22.3% y 16.7%), respectivamente. El aceite esencial de L. lacunosa Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 23 exhibió un fuerte y agradable aroma a mango, el cual fue relacionado con la presencia de mirceno y mircenona. Los resultados obtenidos relacionados con la marcada diferencia en composición química pueden constituir una valiosa herramienta para la clasificación botánica. 1.6. IDENTIFICACIÓN En la primera mitad de este siglo, la identificación de los componentes de aromas era un trabajo muy difícil, debido a que no se contaba con la resolución y precisión necesaria para analizarlos. Los avances en el análisis por medio de instrumentos electrónicos modernos han puesto al descubierto la complejidad cualitativa y cuantitativa de los aceites esenciales. Así, algunos pueden estar compuestos hasta por un 99% de un mismo componente orgánico, mientras que otros pueden contener más de 150 componentes. La espectrometría de masas, la resonancia magnética nuclear, la espectrofotometría infrarroja y ultravioleta, la cromatografía en capa delgada y en particular la cromatografía de gases han contribuido considerablemente al análisis de los componentes minoritarios en estos productos (Dudareva, 2006; Rogers, 1984; Primo, 1990). La cromatografía de gas-líquido acoplada a la espectrometría de masas (CG-EM) es aceptada generalmente, como un método a escoger para separar e identificar los componentes volátiles de los aceites esenciales. Y debido al gran poder de resolución que esta técnica tiene, es posible analizar mezclas complejas, que contienen más de 100 componentes, pudiendo utilizarse para la identificación de éstos, las bases de datos que se han desarrollado, las que contienen miles de espectros de compuestos; teniendo su principal aplicación en el estudio de la variación química intraespecífica y pudiendo utilizarse en el control de calidad de los aceites volátiles (Lahlou, 2004; Kameoka, 1986; Corticchiato et al., 1992). Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 24 Las técnicas espectrométricas son las más apropiadas para la identificación de componentes, sin embargo, precisan del aislamiento de éstos. Por este motivo, se emplean en combinación con una técnica de fraccionamiento como la cromatografía de gases para el estudio de mezclas químicas, ccomo es el caso de los aceites esenciales. El funcionamiento de la espectrometría de masas se basa en la capacidad de ionización que presenta una molécula orgánica en estado de vapor al ser bombardeada por un haz de electrones de energía aproximada de unos 70 eV. La molécula absorbe parte de esa energía utilizándola para desprenderse de un electrón, transformándose así en un ión molecular con carga positiva y un electrón desapareado. La energía adicional del haz de electrones de bombardeo puede disiparse en la ruptura de enlaces del ión molecular, produciéndose nuevos fragmentos de iones positivos de menor masa y de radicales neutros. El conjunto de máximos espectrosales que corresponden a cada uno de los iones fragmentados de la molécula original da lugar al espectro de masas, a tavés del cual se obtiene información de la fórmula molecular verdadera, ya que determina de manera exacta su masa atómica (Davis, 1997). La utilización conjunta de la cromatografía de gases y espectrometría de masas permite aunar las notables cualidades de separación de la primera, con las propiedades analíticas de la segunda. Adicionalmente, se desarrollaron varios métodos en los que se usa los índices de retención relativos para reproducir la identificación de compuestos en cromatografía de gases. Generalmente, los valores de retención son expresados en relación a estándares o compuestos no presentes en el material (McNair et al., 1998). En general, los índices denotan el comportamiento de retención de los compuestos de interés de acuerdo a una escala uniforme, determinada por una serie de sustancias estándar estrechamente relacionadas (Aromdee, 2012). Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 25 El índice de retención de Kovats (propuesto en 1958), usa una serie homóloga de n-parafinas como estándares contra las mediciones de los volúmenes de retención ajustado de los solutos de interés. La elección de las n-parafinas se basa no solo en su relativa disponibilidad sino también en su baja polaridad y que están libres de puentes de hidrógeno (McNair et al., 1998). El índice de retención de Kovats (I), asigna un valor de 100 veces el número de carbonos para cada una de las n-parafinas. Entonces, el hexano tiene un valor de 600, el heptano 700 en todas las fases líquidas. Cuando una serie homóloga de hidrocarburos es cromatografiada, las fuerzas intermoleculares son relativamente constantes y la separación es controlada principalmente por diferencias en la presión de vapor (como reflejo de sus puntos de ebullición). El cromatograma producido muestra una relación logarítmica entre el número de carbonos y los tiempos de retención ajustados, reflejando la tendencia de los puntos de ebullición entre los miembros de una serie homóloga (McNair et al., 1998). La fórmula propuesta por Kóvats en 1958, se caracteriza por realizarse en un sistema bajo condiciones isotérmicas de elución y empleando n-parafinas con número impar de átomos de carbono (McNair et al., 1998; Zellner et al., 2008): En donde z y z +1 son n-alcanos con z y z+1 números de átomos de carbono, respectivamente y s se refiere al soluto o analito. Van den Dool y Kratz en 1963, propusieron una generalización en el sistema de índices de retención, para temperaturas lineales programadas en cromatografía de gases, ya que cuando se aplica una temperatura programada la serie de n- parafinas eluye de modo lineal (McNair et al., 1998; Hérent, 2007; Zellner et al., Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 26 2008), lo que da lugar a la siguiente ecuación, que se conoce como índice de retención lineal (LRI, por sus siglas en inglés) (Aromdee, 2012): En donde: t = tiempo de retención del compuesto o analito. n = número de carbonos del alcano precedente. n+1 = número de carbonos del alcano subsecuente. Sin embargo, cuando la serie de n-parafinas empleados como referencias contiene únicamente átomos de carbono par o impar se aplica la siguiente fórmula (Zellner et al., 2008): Donde: X= compuesto problema tRx = tiempo de retención del compuesto problema tRN = tiempo de retención del alcano normal eluido antes que X tR(N+n) = tiempo de retención del alcano normal eluido después de X N = número de átomos de carbono del alcano normal eluido antes que X n = diferencia de número de átomos de carbono de los alcanos normales eluidos antes y después que X N + n = número de átomos de carbono del alcano normal eluido después de X. Lesueur et al. (2008), realizaron el análisis de la composición química y actividad antimicrobiana del aceite esencial aislado de las partes aéreas de Acronychia pedunculata (L) Miq. El análisis realizado por GC (índices de retención), GC-EM y NRnNR NRxRs x tt tt nNI ,)(, ,, 100100 Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción27 RMN-13C condujo a la identificación de 34 compuestos, siendo un total de 92.8% del aceite. Los constituyentes mayoritarios fueron -pineno (57.4%) y (E) cariofileno (13.6%) además de una actividad significativa contra Salmonella enterica y Staphylococcus epidermidis. 1.7. ACTIVIDAD BIOLÓGICA En años recientes, se ha observado un resurgimiento de los productos naturales tradicionales tanto en medicina como en la preservación de alimentos y cosméticos. La evidencia anecdótica y el uso tradicional de plantas como medicinales proporcionan las bases para indicar cuáles aceites esenciales y extractos de plantas pueden ser utilizados para condiciones médicas específicas. Históricamente, muchos aceites y extractos de plantas han sido utilizados como antisépticos tópicos o han sido reportados por tener actividades antimicrobianas (Kalemba y Kunicka, 2003.; Hammer et al., 1999). Debido a esto, los aceites esenciales de plantas pueden ofrecer un gran potencial; lo que ha llevado a un estudio amplio y sistemático de la composición y actividad antimicrobiana, en donde las propiedades antimicrobianas de los aceites esenciales y sus constituyentes han sido ampliamente revisados. Los aceites esenciales son utilizados en la industria de los perfumes, cosméticos, farmacéutica, agrícola y alimentaria. Además de que se sabe que poseen una amplia gama de actividades biológicas, incluyendo propiedades antibacterianas, antifúngicas, antivirales, antitoxigénicas, antiparasitarias e insecticidas (Hammer et al., 1999; Chemat et al., 2007; Wallace, 2004). Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 28 1.7.1. Actividad antioxidante Los radicales libres son moléculas parcialmente reducidas que poseen un electrón adicional en estado desapareado o impar en el orbital externo. Esta configuración electrónica confiere a estas moléculas inestabilidad y fácil reacción con lípidos, proteínas y ácidos nucleicos de su entorno provocando un gran daño en ellas y en las membranas celulares (Vaquero et al., 2005; Criado et al., 2009). Como la mayoría de los radicales de interés biológico derivan del oxígeno o del nitrógeno, a estos se les conoce habitualmente como ERO o ERN. Las principales ERO son el anión superóxido (O2●▬) y sus derivados el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo. La vida en un entorno rico en oxígeno (el elemento más abundante de nuestro planeta) ha supuesto la adaptación de los organismos a la convivencia con esta molécula y con sus derivados, las especies reactivas de oxígeno (ERO), los cuales se han integrado de manera imprescindible en la señalización intracelular (Vaquero et al., 2005; Criado et al., 2009). La oxidación también puede afectar a los alimentos, donde es una de las principales causas de deterioro químico, resultando en rancidez y/o deterioro de la calidad nutricional, color, sabor, textura y seguridad de los alimentos. Se ha estimado que la mitad de los cultivos frutales y vegetales se pierden debido a reacciones deteriorativas postcosecha (Antolovich et al., 2002). Las ERO presentes en el organismo son mayoritariamente de procedencia endógena, aunque también pueden ser generadas en respuesta a estímulos externos como la luz ultravioleta, la radiación ionizante, fármacos o agentes tóxicos (Figura 1.5). Como consecuencia del metabolismo celular normal, los organismos aeróbicos están sujetos a la constante producción de pequeñas y controladas cantidades de ERO. Sin embargo, en determinadas circunstancias, como el estrés metabólico, la mitocondria puede convertirse en fuente incontrolada Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 29 de ERO, hecho que se ha asociado al envejecimiento y al desarrollo de diversas afecciones como son el cáncer, la diabetes mellitus, las enfermedades pulmonares, neurodegenerativas, cardiovasculares, etc. (Vaquero et al., 2005; Criado et al., 2009). Figura 1.5 Formación y metabolización celular de las ERO (especies reactivas de oxígeno) En el organismo existen antioxidantes endógenos que evitan las reacciones en cadena que generan los radicales libres. Se pueden clasificar en las siguientes categorías (Aruoma, 1999): Sistemas enzimáticos capaces de inhibir a los ROS. Superóxido dismutasa (SOD), que elimina el anión superóxido mediante su conversión a peróxido de hidrógeno. Las células humanas poseen una enzima SOD en la mitocondria con manganeso en su centro activo, y una enzima SOD con zinc y cobre en su centro activo, presente en mayor cantidad en el citosol. Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 30 Enzimas capaces de descomponer ciertos intermediarios de la oxidación no radicálicos: Catalasas presentes en los peroxisomas, que transforman el peróxido de hidrógeno en H2O y O2. Glutation peroxidasa (GSHPX), que requiere selenio en su centro activo y que elimina el peróxido de hidrógeno y otros hidroperóxidos, transformando el glutation reducido o GSH en glutation oxidado o GSSG. Glutation reductasa, que regenera el GSH desde el GSSG, con NADPH como fuente de poder reductor. Sistemas no enzimáticos, como ciertas moléculas capaces de quelar metales – transferrina, lactoferrina, hemopoxina, ceruloplasmina, etc. Para mantener el control oxidativo celular, el organismo cuenta con un complejo sistema antioxidante basado en el engranaje funcional de compuestos enzimáticos y no enzimáticos. Esta estructura se compone de elementos hidrofílicos (Vitamina C) lipofílicos (ubicuinol, vitamina E) y tioles (GSH, tiorredoxina, ácido lipoico) cuya interacción es esencial para mantener el equilibrio redox del complejo. Este concepto de red descubre la importancia de diseñar tratamientos basados en una interacción de antioxidantes más que en suplementos aislados (Antolovich et al., 2002). Es también importante incidir en la naturaleza lipofílica o hidrofílica de las moléculas antioxidantes, lo cual determina su distribución bien en las membranas o bien en la fracción hidrosoluble celular, donde están destinadas a mantener el equilibrio redox (Antolovich et al., 2002). Un antioxidante puede ser definido como cualquier sustancia que puede estar presente a bajas concentraciones, comparado con las de las sustancias oxidables, Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 31 retardando o inhibiendo significativamente la oxidación del sustrato (Antolovich et al., 2002; Fennema, 1996). El antioxidante al reaccionar con el radical libre le cede un electrón oxidándose a su vez y transformándose en un radical libre débil, con escasos o nulos efectos tóxicos y que en algunos casos como la vitamina E, pueden regenerarse a su forma primitiva por acción de los otros antioxidantes (Barbosa et al., 2008). Tienen diferentes mecanismos de acción; unos impiden la formación de los radicales libres y/o especies reactivas (sistema de prevención), otros inhiben la acción de los radicales libres (sistema barredor) y otros favorecen la reparación y la reconstitución de las estructuras biológicas dañadas (sistema de reparación) (Barbosa et al., 2008). Cada antioxidante posee una afinidad hacia un radical libre o hacia varios, puede actuar en los diferentes procesos de la secuencia oxidativa y tener más de un mecanismo de acción (Barbosa et al., 2008). Los antioxidantes se clasifican en endógenos, fabricados por la propia célula y exógenos, que ingresan en el organismo a través de la dieta o de suplementos con formulaciones antioxidantes. Numerososos trabajos han demostrado la existencia de una correlación entre el consumo de una dieta rica en alimentos de origen vegetal con un menor riesgo de desarrollar ciertasenfermedades, como enfermedades cardiovasculares, procesos degenerativos relacionados con la edad como el Alzheimer, procesos inflamatorios, ciertos tipos de cáncer, etc. (Halliwell, 1997; De la Fuente, 2002; Stanner, 2004). Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 32 Entre otros compuestos bioactivos, los alimentos vegetales son ricos en antioxidantes, que incluyen distintos grupos de compuestos de naturaleza química diversa. Estos compuestos pueden actuar como antioxidantes primarios, reaccionando directamente con los radicales libres (en cuyo caso suelen dar lugar a un nuevo radical, menos reactivo que el radical libre original), o como antioxidantes secundarios, potenciando otros sistemas antioxidantes, como ciertas enzimas (Halliwell, 1997; De la Fuente, 2002; Stanner, 2004). El creciente interés por los posibles efectos beneficiosos de los antioxidantes ha hecho que se desarrollen una gran capacidad de métodos para determinar la capacidad antioxidante de extractos de alimentos. Se han planteado una serie de condiciones que debería reunir un procedimiento estandarizado de médida de capacidad antioxidante in vitro (Frankel et al., 2000; Prior et al., 2005; Fernández et al., 2006; Halliwell, 2002; Matsukawa et al., 1997): Evaluar reacciones de transferencia de electrones y de átomo de hidrógeno. Especificar el sustrato de oxidación. Medir reacciones químicas que de hecho ocurran en reacciones potenciales, es decir, asegurar que el sustrato y el modo de inducir la oxidación son relevantes como fuentes de daño oxidativo. Ser sencillo. Tener un mecanismo y un punto final definido. Poseer una instrumentación más o menos disponible. Tener una buena reproducibilidad entre días. Ser adaptable para medir antioxidante hidrofílicos y lipofílicos. Usar distintas fuentes de radicales. Ser adaptable para análisis rutinarios a gran escala. Sin embargo, la realidad es que no existe ningún método en la actualidad que reúna tales características y es difícil que llegue a ser posible evaluar la capacidad Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 33 antioxidante de una muestra por un solo método, en vez de por la combinación de varios, como se hace en la actualidad. Esto se debe a varias razones; en primer lugar, los antioxidantes pueden ejercer su acción mediante mecanismos muy diversos (pueden suprimir la generación de los primeros radicales que inician el daño oxidativo, capturar radicales libres, quelar metales, formar complejos, reducir algunos compuestos, inducir la actividad de sistemas biológicos antioxidantes...) y en un mismo alimento puede haber mezclas de diferentes antioxidantes con distintos mecanismos de acción y entre los que, además, se pueden establecer reacciones sinérgicas, por lo que serán necesarios distintos análisis para poder considerar las posibles mecansismo de acción de todos los antioxidantes presentes en un alimento (Mantle et al., 1998; Yu et al., 1999; Frankel et al., 2000; Karadog et al., 2009). Por otro lado, además del mecanismo de reacción, existen otros factores que también deben considerarse al determinar la capacidad antioxidante de muestras tan complejas como son los extractos de alimentos, tales como las propiedades coloidales del sustrato, el estado de oxidación y la localización del antioxidante en las distintas fases, la composición del sistema, el tipo de sustrato oxidable, el modo de provocar la oxidación, la naturaleza heterogénea y heterofásica del sistema, las interacciones con otros componentes, etc. (Mantle et al., 1998; Yu et al., 1999; Frankel et al., 2000). Por ejemplo, en lo que se refiere a las emulsiones, los antioxidantes lipofílicos son mejores para las emulsiones o/w, porque se sitúan entre el agua y el aceite, protegiendo el aceite, mientras que los hidrofílicos se disuelven en la fase acuosa. A su vez, los antioxidantes hidrofílicos son mejores para medios aceitosos, porque se sitúan entre el medio y el aire, protegiendo al aceite, mientras que los lipofílicos se disuelven en el medio. Esto se conoce como paradoja polar de Porter (Frankel et al., 2000). Así mismo, se debe tener en cuenta que muchos compuestos que previenen la oxidación lipídica no lo hacen con la de proteínas o ADN, o incluso la potencian, como ocurre con el BHA, que oxida el ADN, aunque no a las concentraciones que se pueden ingerir Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 34 habitualmente (Aruoma, 1999). Así mismo, la vitamina E impide la oxidación inducida por iones metálicos o por peroxinitrito, pero no la inducida por hipoclorito ni la oxidación lipídica inducida por lipooxigenasa (Niki, 2002). Por todas estas razones, un gran número de autores han planteado la necesidad de combinar más de un método de medida en la determinación de la capacidad antioxidante in vitro (Frankel et al., 2000; Sanchez-Moreno, 2002; Aruoma, 1999; Prior et al., 2005). En cualquier caso, todos los ensayos in vitro sobre capacidad antioxidante de extractos de alimentos, deben completarse con ensayos in vivo, así como con estudios sobre el posible efecto prooxidante de estos compuestos a dosis elevadas (Frankel et al., 2000), ya que en estos compuestos existe un delicado equilibrio entre actividad antioxidante y prooxidante. Finalmente, habrá que considerar si los compuestos responsables de esta capacidad antioxidante son o no biodisponibles en el tracto gastrointestinal y, por tanto, podrán ejercer de hecho ese efecto beneficiosos que potencialmente poseen, así como el grado de retención de ese compuesto en los tejidos. Esta biodisponibilidad vendrá determinada, entre otros factores, por la naturaleza química de estos compuestos, sus efectos dentro de la matriz alimentaria, la combinación de alimentos en la dieta y el estado general de salud (Aruoma, 1999; Fernández et al., 2006; Halliwell, 2002). Otro aspecto a considerar en la determinación de capacidad antixidante in vitro es que, debido a las múltiples modificaciones hechas en cada uno de los métodos existentes, muchas veces la comparación entre resultados, aun correspondiendo al mismo método de medida, se deben efectuar con precaución, ya que pueden haber existido cambios en la manipulación, en la temperatura del ensayo, en la variedad de la muestra o sus condiciones de procesado,en el modo de combinar las muestras con los reactivos (por ejemplo, tiempo de exposición de los compuestos activos a los reactivos, etc.), en la metodología empleada en la Composición química y actividad antioxidante de aceites esenciales……… Introducción 35 extracción (tamaño de partícula, ciclos de extracción, modo de agitación de la muestra, relación muestra:solvente, etc.) (Bompadre et al., 2004; Mukhopadhyay et al., 2006) Así mismo, el hecho de que en el sistema a analizar haya una alta o una baja actividad de agua es también importante, ya que este factor afecta a la migración de compuestos, puede producir fenómenos de cristalización, coalescencia, complejación, colapsos de estructuras, etc. (Mukhopadhyay et al., 2006) Además, se debe tener en cuenta el hecho de que, en la literatura, los resultados para un mismo método se expresan de múltiples formas, lo que dificulta su comparación (Villaño et al., 2005). 1.7.2. Reacciones SET y reacciones HAT Aunque existen una gran cantidad de mecanismos por los que los antioxidantes alimentarios pueden ejercer su acción, entre aquellos compuestos que reaccionan directamente con los radicales libres, deteniendo el proceso en cadena de oxidación lipídica (chain-breaking), esta reacción se puede llevar a cabo por dos posibles vías: reacciones de transferencia de un átomo de Hidrógeno (Hidrogen Atom Transfer, HAT)
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