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Facultad de Ciencias Veterinarias -UNCPBA- Evolución de la calidad microbiológica de la Ricotta hasta su fecha de vencimiento. Lavigna, Maria Laura- Ferreyra, Maria Alejandra- Bruschi, Julieta. Mayo, 2018 Tandil Evolución de la calidad microbiológica de la Ricotta hasta su fecha de vencimiento. Tesis de la Carrera de Licenciatura en Tecnología de los Alimentos, presentada como parte de los requisitos para optar al título de grado de Licenciado del estudiante: Lavigna, Maria Laura. Directora: Bruschi, Julieta. Codirectora: Ferreyra, Maria Alejandra. Evaluador: Vega, Maria Fernanda. Dedicatorias: A mi mamá Margarita, por brindarme la oportunidad de estudiar y llegar a ser la que soy, por enseñarme a seguir luchando con la mejor predisposición, aunque el camino se haga difícil, por mostrarme siempre la verdad, aunque la garganta duela, por ayudarme a conocer a mí papá sin rencores, aunque el corazón esté roto, pero sobre todo…Por ser mi mamá! A mi familia por el acompañamiento y apoyo incondicional que recibí durante todo el transcurso de la carrera, permitiéndome, llegar hasta este momento tan importante de mi vida. A Pablo A. Florez por ser el gran Maestro de mi vida, que logró despertar en mí una parte desconocida…este proyecto no estaría concluido sin su paso por mi vida. Agradecimientos: A Vet. Cristina Micheo y Lic. Alejandra Ferreyra por el acompañamiento, ayuda, paciencia y asesoramiento durante el desarrollo de este proyecto. A Vet. Bruschi Julieta, por aceptar brindarme asistencia en la finalización de este deseo sin condiciones. A Enrique Dominicis por la generosidad que tuvo al brindarme la oportunidad de trabajar y aprender, en su fábrica. A todo el personal de la empresa, por explicarme y ayudarme sin condiciones cuando me surgía alguna duda en la sala de elaboración. A mis amigos por ser mi sostén y contención. A la Tec. Barrocal Sofía, e Ing. Contardi Ignacio por incitar a que concluya mi tesis con sus consejos, apoyo, sinceridad e incondicionalidad. A todos, por hacer real mí sueño con su presencia… MUCHAS GRACIAS!. Resumen La utilización de lactosuero como materia prima para la elaboración de queso ricotta, es una práctica conocida en las Pequeñas y Medianas Empresas (PYME) elaboradoras de quesos, donde antiguamente era vertido en ríos u otros cuerpos de agua, o se suministraba como alimento para animales, provocando serios problemas de contaminación. La producción de queso ricotta es llevada a cabo mediante la aplicación de calor y la adición de una solución ácida, lo que logra que la proteína presente en el suero lácteo precipite y forme conglomerados característicos de este queso. Además, la ricotta es un producto que se considera perecedero debido a su alto contenido de humedad y su pH cercano al neutro, por lo cual tiene una vida útil limitada. El objetivo de este proyecto fue evaluar la evolución microbiológica de la ricotta a lo largo del período establecido por una PYME (20 días) que elabora queso ricotta de manera diaria, ya que el Código Alimentario Argentino (C.A.A) no dispone de datos específicos en cuanto a su fecha límite para el consumo, sino que establece una estabilización de sólo 24 horas. Inicialmente se evaluó la calidad físico- química y microbiológica de la materia prima (suero de quesos) procedente de dos elaboraciones de quesos, como así también se caracterizó el proceso productivo, presentando su diagrama de flujo y verificando la implementación de Buenas Prácticas de Manufactura (B.P.M) y Procedimientos Operativos Estandarizados de Saneamiento (P.O.E.S). Por último, se estudió el comportamiento microbiológico (recuentos de coliformes a 30 °C, coliformes a 24 °C y hongos y levaduras) cada 5 días y hasta el día 24 de almacenamiento con el objetivo adicional de validar la vida útil de dicho producto. Por los resultados obtenidos se concluye que resulta indispensable evaluar la vida útil del producto, ya que al conocer su calidad microbiológica se pueden establecer medidas preventivas, intensificar el seguimiento y control del proceso productivo. Palabras clave: Lactosuero, ricotta, vida útil, calidad microbiológica, prerrequisitos. Índice 1. INTRODUCCION ........................................................................................... 1 2. MARCO TEORICO ........................................................................................ 2 2.1 Situación de producción lechera en Argentina. ......................................... 2 2.2 Leche. Definición y composición química. ................................................ 3 2.2.1 Agua. .................................................................................................. 4 2.2.2 Grasa. ................................................................................................ 4 2.2.3 Proteínas. ........................................................................................... 5 2.2.4 Carbohidratos. .................................................................................... 6 2.2.5 Minerales, vitaminas, sales y enzimas. .............................................. 6 2.3 Queso ....................................................................................................... 7 2.3.1 Definición y elaboración. .................................................................... 7 2.3.2 Coagulación y desuerado. .................................................................. 7 2.4 Suero ........................................................................................................ 8 2.4.1 Definición ........................................................................................... 8 2.4.2 Composición del suero. ...................................................................... 9 2.4.3 Proteínas del suero. Importancia y composición. ............................. 10 2.4.4 Desnaturalización proteica. .............................................................. 13 2.4.5 Aprovechamiento del suero. ............................................................. 18 2.5 Ricotta ..................................................................................................... 19 2.5.1 Definición y composición .................................................................. 19 2.5.2 Proceso de elaboración de la ricotta. ............................................... 21 2.5.3 Vida útil de la ricotta ......................................................................... 22 2.6 Microorganismos indicadores de la calidad de los alimentos ................. 23 2.6.1 Características de microorganismos Coliformes. ............................. 23 2.6.2 Características de hongos. ............................................................... 24 3. OBJETIVOS ................................................................................................. 26 3.1 Objetivo general ...................................................................................... 26 3.2 Objetivos particulares ............................................................................. 26 4. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 27 4.1 Ubicación y características de la empresa .............................................. 27 4.2 Elaboración de ricotta con suero de quesería ......................................... 27 4.3 Diagrama de flujo del proceso productivo en fábrica. ............................. 31 4.4 Caracterización de materia prima: suero de quesos. .............................. 32 4.4 Caracterización de queso ricotta. ........................................................... 335. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. ................................................................... 36 5.1 Evaluación del proceso productivo del queso ricotta .............................. 36 5.2 Resultados de las determinaciones de suero de quesería. .................... 37 5.2.1 Análisis físico- químico del suero lácteo. .......................................... 37 5.2.2 Análisis microbiológico del suero lácteo. .......................................... 38 5.3 Evolución de la calidad microbiológica de la ricotta. ............................... 38 5.3.1 Recuento de bacterias coliformes a 30°C. ....................................... 39 5.3.2 Recuento de bacterias coliformes a 45°C. ....................................... 40 5.3.3 Recuento de Hongos y levaduras .................................................... 41 5.3.4 Evolución microbiológica de la Ricotta – Elaboración N°1 ............... 43 5.3.5 Evolución microbiológica de la Ricotta – Elaboración N°2 ............... 44 6. CONCLUSIONES ........................................................................................ 45 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 47 8. ÍNDICE DE TABLAS .................................................................................... 49 9. ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................. 49 1 1. INTRODUCCION El suero de quesería, generalmente considerado como un subproducto contaminante, en ocasiones es vertido en cursos de agua originando problemas de contaminación. Si se considera su alto valor nutricional, este subproducto puede ser utilizado como materia prima para la elaboración de ricotta (Porras, 1999). La ricotta es un precipitado de las proteínas séricas, albúmina y lactoglobulina, que atrapan en su estructura a la lactosa y a la materia grasa remanentes en el suero de quesería (FAO, 1985). Se compone de 68,3% de agua, 14,9% de proteínas, 12,6% de grasa, 2,7% de carbohidratos y 1,5% de minerales (Hough et al., 1999). La calidad de este alimento presenta un estado dinámico ya que sus propiedades se modifican hacia niveles más bajos conforme avanza el tiempo respecto a la fecha de elaboración, como así también sufre un cambio en su perfil microbiológico. Todo esto es denominado; vida útil de un alimento. Resulta de interés tener en cuenta que la variación en el perfil microbiológico de la ricotta puede deberse a una materia prima de calidad deficiente, contaminaciones en el proceso productivo ya sea mediante el personal o por equipamiento en condiciones de limpieza incorrecta o manipulación errónea del consumidor. El C.A.A. establece parámetros microbiológicos para quesos de muy alta humedad, entre los cuales queda incluido la ricotta. Dichos parámetros serán utilizados como referencia para evaluar la variación microbiológica como así también validar la vida útil de este producto. 2 2. MARCO TEORICO 2.1 Situación de producción lechera en Argentina. Es en la región pampeana (Santa Fe, Córdoba, Buenos Aires, La Pampa y Entre Ríos) donde la producción lechera Argentina muestra todo su potencial concentrándose en ella las principales cuencas lecheras y casi la totalidad de los tambos e industrias del sector (INTA, 2012).(Figura 1). En 2016 la actividad lechera continuó su localización principalmente en las provincias de Santa Fe (34,6%), Córdoba (30,9 %) y Buenos Aires (22,5%). Figura 1. Localización de la producción primaria. En 2015 la producción de leche se estimaba en 11.200 millones de litros con un incremento del 8,8 % entre 2010 y 2015. De la producción primaria el 93 % aproximadamente se utilizaba para su procesamiento en la industria, mientras que el 7 % restante no poseía un circuito formal. El 18,4 % de la producción de leche cruda era consumida como leche fluida, mientras que el 74,6 % se destinaba a la elaboración de productos lácteos, del cual el 55 % era destinado a la fabricación de quesos, 28 % a la 3 elaboración de leche en polvo y en menor porcentaje seguía la producción de yogurt, manteca, dulce de leche, postres flanes y leche condensada. Además con una participación mucho más pequeña pero que se encuentra con un mercado en alza están las caseínas, caseinatos y suero como suplementos dietarios. El lactosuero es la sustancia que se adquiere por separación del coágulo de leche en la fabricación de queso y representa aproximadamente el 85-90% del volumen de la leche. Contiene compuestos de alto valor nutritivo y funcional que justifican en gran medida la necesidad de evaluar sus posibilidades de aprovechamiento y valor agregado, entre las que pueden destacarse; suero en polvo, polvo de suero desmineralizado, concentrado proteico soluble, lactosa, minerales, proteína aislada de suero y elaboración de queso Ricotta (Ministerio de Haciendas y Finanzas Públicas, 2016). Por otro lado, la práctica de desechar el suero en cursos de agua causa serios problemas de contaminación, debido a que el mismo presenta una demanda biológica de oxígeno (DBO) muy elevada de aproximadamente unos 35000 a 50000 mg O2/lt (INTI, 2010) provocando una deficiencia de oxígeno disuelto en el agua para que los seres vivos de dichos cursos cumplan su rol biológico. Esta situación, como la anterior, también obliga a buscar alternativas del manejo del suero, de manera que se pueda aprovechar sus componentes y reducir su efecto negativo en el ambiente (Scott, 1991). Como opción a este inconveniente, la elaboración del queso Ricotta es una alternativa sostenible ya que permite recuperar una gran parte de la proteína soluble del suero, que la convierte en un producto nutritivo y de gran valor agregado, así como también el suero remanente de dicha elaboración presenta una cantidad considerable de sólidos y una DBO menor (Porras, 1999). 2.2 Leche. Definición y composición química. Según el Artículo 554 del Código Alimentario Argentino (C.A.A), “Con la denominación de leche sin calificativo alguno, se entiende el producto obtenido por el ordeño total e ininterrumpido, en condiciones de higiene, de la vaca lechera en buen estado de salud y alimentación, provenientes de tambos inscriptos y habilitados por la Autoridad Sanitaria Bromatológica Jurisdiccional y sin aditivos de ninguna especie.” 4 Debido a que la leche es un producto segregado por las glándulas mamarias de las hembras mamíferas para alimentar a sus crías, constituye un fluido biológico muy complejo que contiene gran variedad de componentes y posee características físicas únicas. El componente mayoritario de la leche de vaca es el agua y el resto (sólidos totales) comprende principalmente lípidos, proteínas y carbohidratos que son sintetizados en la glándula mamaria. También contiene en pequeñas cantidades, compuestos minerales y otras sustancias hidro y liposolubles. Sin embargo, la composición varia ampliamente, dependiendo de diversos factores entre los que se destacan: especie (Tabla 1), raza e individuo, estado de lactación, edad, enfermedades y nutrición (Robinson, 1987). Tabla 1. Composición general de la leche en diferentes especies (por cada 100 g). Especie / Nutriente (g). Vaca Búfala Mujer Agua 88 84 87.5 Energía (Kcal.) 61 97 7.0 Proteína 3.2 3.7 1.0 Grasa 3.4 6.9 4.4 Lactosa 4.7 5.2 6.9 Minerales 0.72 0.79 0.2 2.2.1 Agua. Constituye un 86-88 % aproximadamente y es la fase dispersante, en la cual los glóbulos grasos y demás componentes se encuentran emulsionados o suspendidos. Las sustancias proteicas se encuentran formando un coloide mientras que la lactosa y las sales se hallan en forma de solución verdadera. (Gómez et al., 2005). 2.2.2 Grasa. Es el componente que presenta mayor variabilidad y se encuentra en forma de glóbulos pequeños emulsionadosen la fase acuosa de la leche. Los glóbulos están compuestos por triglicéridos y otras sustancias lipídicas como esteroles, monoglicéridos, fosfolípidos etc. (Dergal, 1990; Lorca et al., 2005). Estos últimos forman parte de la capa de los glóbulos de grasa para evitar que la misma se aglutine y pueda separarse de la fase acuosa (Gómez et al., 2005). 5 Además, la grasa sirve como medio de transporte de las vitaminas liposolubles (A, D, E y K) y tiene relación directa con el sabor de la leche (Porras, 1999). 2.2.3 Proteínas. La leche contiene 30-36 g/l de proteína total, la cual posee calidades nutritivas de muy alto valor biológico, entre las que se destacan, αs1-caseína, αs2 – caseínas, β-caseínas, κ-caseínas, α-lactoalbúminas, β-lactoglobulinas e inmunoglobulinas (Fennema, 2010). Las proteínas de la leche pueden separarse en dos fracciones, caseínas y proteínas del suero. La caseína supone el 80 %; mientras que las seroproteinas el 20 % restante. La caseína es un complejo de fosfoproteínas y glicoproteínas que está en forma de suspensión coloidal, en micelas estabilizadas, que no se coagulan al calentar la leche a 100 °C pero sí al bajar el pH a 4,65 (Yúfera, 1998). Según Fenema (2010) la cuajada formada por aglomeración de micelas de caseína durante la fabricación de queso retiene la mayoría de la proteína total de la leche, mientras que, las restantes proteínas son retenidas en el suero del queso, y es por esto que se denominan proteínas séricas. Las principales proteínas no caseínicas, proteínas del suero, son la α- lactolabúmina y la β-lactoglobulina; sus cadenas constan, respectivamente, de 123 y 162 aminoácidos (componente básico de las proteínas); la primera tiene cuatro enlaces disulfuro y la segunda dos enlaces disulfuro y un grupo sulfhidrilo (Robinson, 1987). Ambas permanecen en solución frente a la acción de ácidos o del cuajo debido a una fuerza estabilizadora que se debe al agua de hidratación, no obstante cuando se las somete al calor, coagulan debido a su acción deshidratante. Es por esto que estas proteínas se encuentren en el suero de la leche obtenido luego de su coagulación (Gómez y Alava, 2010). La albúmina es la proteína de la leche que, a diferencia de la caseína, se desnaturaliza con facilidad al suministrarle calor, mientras que la caseína es relativamente estable al calor. Debido a esto, durante el proceso de calentamiento a altas temperaturas se destruye gran parte de la proteína sérica (Gómez et al., 2005). 6 2.2.4 Carbohidratos. El hidrato de carbono más importante de la leche es la lactosa, el cual es un disacárido formado por glucosa y galactosa. Representa el 97.5 % de los glúcidos de la leche y se encuentra totalmente disuelto en la fase acuosa de la leche (Gómez y Alava, 2010). Además, es el componente que menos variaciones presenta y es el principal factor de maduración y fermentación de los productos lácteos (Porras, 1999). 2.2.5 Minerales, vitaminas, sales y enzimas. En cuanto a minerales, en la leche de vaca, se pueden reconocer el sodio, magnesio, potasio, calcio, hierro, cobre, fósforo, fluoruro, yoduro y en menor cantidad aluminio, molibdeno y plata. El calcio se encuentra ligado a la caseína, así como también en la membrana de los glóbulos grasos junto con hierro, cobre, magnesio, manganeso, fósforo y zinc (Gómez et al., 2005). Es de importancia tecnológica, el contenido de calcio, ya que es necesario para la coagulación de la leche con el cuajo, reacción que ocurre en la fabricación de quesos. Además, la leche contiene vitaminas liposolubles (A, D, E, K) e hidrosolubles (B, C), carotenos, nicotinamida, biotina, y ácido fólico, las cuales presentan variaciones en su concentración debido a alimentación, clima, época del año, tratamientos térmicos, entre otros (Gómez y Alava, 2010). Conjuntamente, las sales de la leche se encuentran en dispersión iónica en una proporción de 0,6-1.0%, entre los que se hallan; fosfato de potasio, calcio y magnesio, cloruros de sodio y potasio, citratos, sulfatos y carbonatos. Por otro lado, la leche contiene enzimas entre las que se destacan las hidrolasas (lipasas, fosfatasa, amilasa y lactasa) y las oxidoreductasas (catalasa y peroxidasa) donde la acción de cada una de ellas es específica y actúan a un pH y a una temperatura óptimas (Gómez et al., 2005). 7 2.3 Queso 2.3.1 Definición y elaboración. Según el artículo 605 del CAA, “Se entiende por queso el producto fresco o madurado que se obtiene por separación parcial del suero de la leche o leche reconstituida, o de sueros lácteos, coagulados por acción física, del cuajo, de enzimas específicas, de bacterias específicas, de ácidos orgánicos, solos o combinados, todos de calidad apta para uso alimentario; con o sin el agregado de sustancias alimenticias y/o especias y/o condimentos, aditivos específicamente indicados, sustancias aromatizantes y materiales colorantes”. La clasificación de los mismos es de acuerdo al contenido de materia grasa y al contenido de humedad. A su vez Dergal (1990) define el queso como el producto que resulta de la precipitación de las caseínas, que deja como residuo el llamado suero de la leche. Para llevar a cabo este proceso se emplean dos métodos: por medio de la renina o cuajo, o bien, acidificación cercana al punto isoeléctrico de las caseínas (pH 4.6). Los pasos fundamentales para la elaboración de quesos incluyen la pasteurización de la leche, coagulación de la caseína, el cortado del coágulo, la eliminación del suero (desuerado), el salado, el prensado y la maduración (si se requiere). 2.3.2 Coagulación y desuerado. En el proceso de coagulación, el cuajo actúa sobre las caseínas de la leche en tres fases. En la primera fase, la enzima fracciona la cadena de aminoácidos de la K- caseína por la unión establecida entre un residuo de fenilalanina y otro de metionina. Esta hidrólisis da lugar a la formación de para-K-caseína y un macropéptido. En la segunda fase ocurre la coagulación y se da cuando la temperatura es lo suficientemente elevada y cuando existen en el medio; iones calcio. En la tercera fase la k- caseína ejerce una influencia estabilizadora sobre las micelas de caseína, pero ya formada la para-k-caseína y existiendo en el medio; iones calcio, la influencia estabilizadora desaparece y las micelas se combinan entre sí dando lugar a la formación de un coágulo que engloba el resto de los componentes de la leche. Este proceso se conoce como 8 coagulación enzimática, no obstante la proteína de la leche también puede ser separada mediante la adición de soluciones ácidas (Scott, 1991). El resultado es un precipitado rodeado del suero lácteo que se recupera al abrir la válvula correspondiente de la tina (Dergal, 1990). Porras (1999) añade que, luego del proceso de coagulación se genera el suero lácteo, el cual puede ser utilizado para la fabricación de otro queso conocido como ricotta. Este queso se obtiene de la coagulación de las proteínas solubles de la leche que permanece soluble en el suero después de la fabricación de queso por vía enzimática. 2.4 Suero 2.4.1 Definición Se define como el líquido resultante de la coagulación de la leche en la fabricación de queso, tras la separación de la mayor parte de la caseína y la grasa (Madrid, 1999). Según el Artículo 582 del C.A.A "Con la denominación de Sueros de Lechería, se entienden los líquidos formados por parte de los componentes de la leche, que resultan de diversos procesos de elaboración de productos lácteos, a saber: 1. Suero de queso: es el subproducto líquido proveniente de la elaboración de quesos. 2. Suero de manteca: es el subproducto líquido proveniente del batido de la crema en la obtención de manteca. 3. Suero de caseína: es el subproducto líquido proveniente de la elaboración de caseínas. 4. Suerode ricotta: es el líquido resultante de precipitar por el calor, en medio ácido, la lactoalbúmina y la lactoglobulina del suero de queso. Cuando estos productos se utilicen como materias primas para la elaboración de productos alimenticios, deberán ser pasteurizados o esterilizados antes o durante el proceso de elaboración de dichos productos, no debiendo presentar un recuento mayor de 100 bacterias coliformes/g después del tratamiento térmico. Queda prohibido alimentar animales con sueros de lechería que no hayan sido pasteurizados o esterilizados. Se exceptúa de esta exigencia los sueros 9 provenientes de procesos de elaboración en los que se aplicaron dichos tratamientos". 2.4.2 Composición del suero. El lactosuero contiene la mayor proporción del agua contenida en la leche, en la que se encuentran todas las sustancias solubles, como la lactosa, las proteínas solubles (lactoalbúmina y lactoglobulina), las sales minerales solubles y algo de grasa (Luquet, 1993). Según Madrid (1999) la composición del suero varía con la leche utilizada, con el tipo de queso a fabricar y del sistema de coagulación: 1. Por coagulación al cuajo (utilizando coagulante), se obtiene un suero dulce que apenas contiene calcio. Su pH es de 6 a 6.6. 2. Por acidificación (utilizando cultivos lácticos), se obtiene un suero ácido con un pH de 4.3 a 4.7. La Tabla 2 brinda la composición de ambos tipos de suero (%). Tabla 2. Composición de suero dulce y suero ácido. Tipo de suero/ Componente Suero dulce Suero ácido Humedad 93-94 94-95 Grasa 0.2-0.7 0.04 Proteínas 0.8-1 0.8-1 Lactosa 4.5-5.0 4.5-5.0 Sales minerales 0.05 0.4 Además, tanto la composición del suero, como la cantidad generada, dependen de diversos factores: A) El tipo de queso: El suero obtenido por kilogramo de queso varia de cuatro litros de suero por kilogramo de queso para los frescos, hasta 11.3 kilogramos de suero por kilogramo de queso para los de pasta dura. B) El proceso aplicado: b1) Si se parte de leche fresca o si se están usando técnicas de extensión o recombinación. 10 b2) El tratamiento térmico empleado: si la temperatura es mayor a 80 °C para “mejorar rendimientos”, disminuye el porcentaje de proteína del suero resultante. b3) La forma de coagulación: Usando cuajo, usando acidificación directa, o empleando cultivos. b4) El cuajo empleado: microbiano, quimosina o mezclas de quimosina/pepsina. Esto influye principalmente en el amargor residual del suero por inactivación incompleta de las enzimas proteolíticas. Los múltiples factores, así como también el hecho de que en ocasiones los fabricantes de queso tienen que variar su proceso para poder hacer frente a los cambios de precio y disponibilidad de las materias primas, hacen que resulte muy difícil obtener un lactosuero de composición constante (Jaime Valencia, 2008). 2.4.3 Proteínas del suero. Importancia y composición. En comparación con las caseínas, la influencia que tienen las seroproteinas sobre las propiedades físico-químicas de la leche cruda es muy baja pero durante el tratamiento térmico adquieren gran importancia y, desde un punto de vista comercial, la importancia de estas proteínas, en el suero, va en aumento (Robinson, 1987). A diferencia de las caseínas, las proteínas del suero son compactas, globulares y solubles a un intervalo de pH muy amplio (incluso a pH ácidos, siempre y cuando no se hayan desnaturalizado por el calor). En estado natural no se asocian con las caseínas, pero en las leches tratadas térmicamente y homogeneizadas, hay una fracción que sí lo hace al formar un complejo con las micelas. En general son muy sensibles a las temperaturas altas y en menor grado a pH ácido (contrario a lo que ocurre con las caseínas), debido a que se encuentran muy hidratadas y no tienen tanta carga eléctrica externa, son las primeras proteínas de la leche en desnaturalizarse y su calentamiento libera grupos sulfhidrilo que reducen el potencial de oxidorreducción, lo que inhibe de forma parcial las reacciones de oxidación (Dergal, 1990). Estas proteínas tienen un considerable interés debido a su alto valor nutritivo resultante de su composición química, la cual es muy rica en aminoácidos esenciales, especialmente lisina y triptófano. 11 Son solubles en agua, con la que forman soluciones coloidales perfectas a concentraciones de hasta el 25 %. Tienen un gusto neutro, y por tanto son mucho más agradables de consumir que las caseínas y los caseinatos. Su color puede variar de blanco a crema, según la naturaleza del lactosuero utilizado. Tienen propiedades funcionales muy interesantes, como son su poder emulsionante en presencia de materia grasa, su poder gelificante por coagulación con el calor y su poder espumante (Luquet, 1993). Las proteínas solubles se distinguen de las caseínas por su estructura, composición y propiedades. Se clasifican en tres grupos: Albúminas: β-lactoglobulina y α-lactoalbúmina. Globulinas: inmunoglobulinas. Proteasas-peptonas. La β-lactoglobulina y la α-lactoalbúmina al igual que las caseínas, tienen una carga negativa neta al pH de la leche; 6.6-6.8, sin embargo, a diferencia de las caseínas, la secuencia de distribución de los residuos hidrófobos, polares y cargados es bastante uniforme. Consecuentemente, estas proteínas se pliegan intramolecularmente, para alojar en su interior gran cantidad de sus residuos hidrófobos para que no ocurran grandes interacciones con otras proteínas. Como muestra la figura 2, la estructura ternaria de la β-lactoglobulina contiene una forma en β-tonel además de una sola α-hélice corta superficial. El centro del β-tonel forma una bolsa hidrófoba que junto con la α- hélice crean un bolsillo superficial, lo cual hace que la β-lactoglobulina se una a muchas moléculas hidrófobas pequeñas con diferentes afinidades. La estabilidad estructural de la β-lactoglobulina es tal que experimenta cambios estructurales irreversibles en el intervalo de temperaturas de muchos procesos térmicos de la leche y productos lácteos, por lo que su funcionalidad es muy sensible al control preciso de tales tratamientos. 12 Figura 2. Estructura tridimensional de la β-lactoglobulina. Las flechas representan la beta láminas; las cintas, las estructuras secundarias; las espirales, las hélices alfa. La estructura de la α-lactoalbúmina es muy compacta, siendo casi esférica. Contiene cuatro α-hélices, varias 310–hélices y una lámina β-antiparalela. (Figura 3).Con los enlaces disulfuro intactos, tal como se encuentra la proteína en la leche, la estructura terciaria se despliega y repliega reversiblemente. Aunque la α-lactoalbúmina se desnaturaliza a una temperatura más baja que la β-lactoglobulina, la transición es reversible excepto a temperaturas muy altas. Así, la α-lactoalbúmina, no es irreversiblemente termodesnaturalizada bajo la mayoría de las condiciones de procesado de la leche (Fennema, 2010). 13 Figura 3. Estructura tridimensional de la α-lactoalbúmina. Las inmunoglobulinas son glicoproteínas capaces de aglutinar distintos tipos de bacterias y esporas por lo que se consideran una de las principales sustancias antibacterianas de la leche. Son las proteínas más termosensibles del suero. Las proteasas y peptonas constituyen una fracción compleja formada por una mezcla heterogénea de polipeptidos que permanecen solubles después del calentamiento de la leche a 95°C durante 20-30 minutos seguidos de una acidificación a pH 4.6. Tienen alta estabilidad térmica (Fennema, 2010). 2.4.4 Desnaturalización proteica. La estructura nativa de una proteína es el resultado neto de diversas interacciones atractivas y repulsivas que provienen de diferentes fuerzas moleculares y de la interacción de diversos grupos con el disolventede su entorno, el agua. Sin embargo, la estructura nativa depende considerablemente del ambiente en el que la proteína se encuentre. El estado nativo (proteína individualizada) es termodinámicamente el más estable, con la mínima energía libre posible en las condiciones fisiológicas. Cualquier cambio de este ambiente como modificaciones de pH, la fuerza iónica, la temperatura, la composición del disolvente, etc. forzará a la molécula a asumir una nueva estructura. 14 Se llama desnaturalización a las modificaciones de las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria, sin escisión de los enlaces peptídicos del esqueleto de una proteína (Fennema, 2010). Los efectos de la desnaturalización proteica son múltiples, pero se destacan: El descenso de la solubilidad, a consecuencia del desenmascaramiento de grupos hidrófobos. La modificación de la capacidad de fijación de agua. Perdida de actividad biológica (por ej., enzimática o inmunológica). La incapacidad de cristalizar. Entre otros. (Fennema ,1993) Las proteínas globulares, cuando están completamente desnaturalizadas, adquieren una configuración semejante a un enrollamiento al azar. Además, la desnaturalización es un fenómeno que implica la transformación de una estructura plegada, bien definida, formada en condiciones fisiológicas, a un estado desplegado, en condiciones no fisiológicas. Al medir los cambios de una propiedad física o química, y en función de un agente desnaturalizante o de la temperatura, muchas proteínas globulares monoméricas exhiben perfiles de desnaturalización como el de la figura 4. Los términos γN y γD son los valores de los estados nativos y desnaturalizado, respectivamente, de una proteína. Para la mayoría de las proteínas, a medida que aumenta la concentración de desnaturalizante(o la temperatura), el valor de γ permanece inicialmente constante y cambia de una forma abrupta por encima de un punto crítico, de γN a γD, en un rango estrecho de concentración de desnaturalizante, o de temperatura. La pendiente de la gráfica de transición observada para la mayoría de las proteínas globulares monoméricas indica que la desnaturalización proteica es un proceso cooperativo. Es decir, que una vez que una molécula proteica empieza a desplegarse, o una vez que se han roto pocas interacciones, un ligero incremento de la concentración del agente desnaturalizante o de la temperatura despliega por completo la totalidad de la molécula. Esta cooperatividad del desplegamiento sugiere que las proteínas globulares sólo pueden hallarse en el estado nativo o en el estado desnaturalizado; que no son posibles estados intermedios (Fennema, 2010). 15 Figura 4. Curvas de desnaturalización típicas; γ representa cualquier propiedad física o química, de la molécula de proteína mensurable y que cambie al variar la conformación; Y N e Y D son los valores de Y para los estados nativos y desnaturalizado, respectivamente. 2.4.4.1 Agentes desnaturalizantes Agentes físicos. a) Temperatura. Cuando se calienta gradualmente una proteína en disolución, por encima de una temperatura critica, sufre una transición abrupta de un estado nativo al desnaturalizado. La temperatura en el punto medio de la transición, donde el cociente de concentración de los estados nativos y desnaturalizados vale 1, se conoce como temperatura de desnaturalización (Td) o de fusión (Tf). El mecanismo por el que se induce la desnaturalización es muy complejo e implica fundamentalmente la desestabilización de interacciones no covalentes primordiales. La temperatura de desnaturalización de la α-lactoalbúmina y de la β- lactoglobulina es de 83°C (Fennema, 2010). La susceptibilidad de las proteínas a la desnaturalización por el calor depende de numerosos factores, como la naturaleza de la proteína, la concentración de 16 la misma, la actividad de agua, el pH, la fuerza iónica, y la naturaleza de los iones presentes. Esta desnaturalización va muy frecuentemente acompañada de un descenso de la solubilidad de la proteína, debido a la exposición de los grupos hidrófobos y a la agregación de las moléculas proteicas desplegadas y de un aumento en la capacidad de absorción de agua de las proteínas. Numerosas proteínas tanto nativas como desnaturalizadas, tienden a migrar a la interfase, con los grupos hidrófilos proyectados hacia la fase acuosa y los hidrófobos hacia la fase apolar, no acuosa (Fennema, 1993). b) Tratamientos mecánicos. La cizalladura mecánica intensa generada por la agitación, el amasado, el batido, etc., puede desnaturalizar las proteínas. Se debe a la incorporación de burbujas de aire y la adsorción de las moléculas de proteína en la interfase aire-liquido. Como la energía de esta interfase es mayor que la de la fase acuosa, las proteínas sufren cambios conformacionales en la interfase (Fennema, 2010). Los repetidos estiramientos modifican la red proteica, principalmente por disrupción de la α-hélice. c) Interfases. Las moléculas proteicas que se adsorben a las interfases de agua-aireo o agua y fases solidas o liquidas no acuosas, suelen quedar irreversiblemente desnaturalizadas. La velocidad de adsorción, que se detiene cuando la interfase se encuentra saturada con proteína desnaturalizada (PD), se ve controlada por la velocidad a que difunde hacia la interfase la proteína nativa (PN). La figura 5 representa la transición de una proteína globular, en disolución acuosa, de una forma nativa (Fig.5 A) a una forma desnaturalizada adsorbida a la interfase agua/fase no acuosa (Fig.5 C.) La desnaturalización proteica comienza con la difusión de la macromolécula hacia la interfase. En esta etapa, la proteína interacciona con las moléculas de agua de la interfase, de alto nivel energético, al tiempo que se rompen muchos enlaces de hidrogeno proteína-proteína y se producen microdesplazamientos de la estructura. En la etapa siguiente la proteína parcialmente desplegada se 17 hidrata, se activa y se inestabiliza, ya que existen muchos grupos hidrófobos expuestos a la fase acuosa. Los restos hidrófilos e hidrófobos intentan orientarse hacia sus respectivas fases, acuosa y no acuosa, a través de nuevos desplegamientos y de la extensión de la proteína en la interfase. La proteína, así adsorbida en la interfase, se desnaturaliza (Fennema, 1993). Figura 5. Representación esquemática de la conformación de una proteína en la interfase: A) proteína globular nativa en el seno de una disolución acuosa; B) proteína globular próxima a la interfase C) molécula proteica adsorbida, desplegada e hidratada. Agentes químicos. a) Ácidos y álcalis. Los procesos de desnaturalización se ven considerablemente afectados por el pH del medio en el que la proteína se encuentre (Fennema, 1993). A pH de su punto isoeléctrico, las proteínas son más estables frente a la desnaturalización 18 que a cualquier otro pH. A pH neutro, la mayoría de las proteínas están cargadas negativamente. La energía repulsiva electrostática neta es pequeña si se compara son las otras interacciones favorables, por lo que la mayor parte de las proteínas son estables a pHs próximos a la neutralidad. Sin embargo, a valores de pH extremos, las fuertes repulsiones electrostáticas intermoleculares causadas por la elevada carga neta determinan el hinchamiento y el desplegamiento de las moléculas proteicas. b) Sales caotrópicas. Las sales afectan a la estabilidad de las proteínas por dos vías distintas. A concentraciones bajas, los iones interaccionan con las proteínas vía interacciones electrostáticas inespecíficas. Esta neutralización electrostática de las cargas de las proteínas suele estabilizar su estructura. La neutralización completa de las cargas por los iones sucede a fuerzas iónicas inferioresa 0.2 y es independiente de la naturaleza de la sal. Sin embargo, a concentraciones más altas (>1 M), las sales tienen efectos ion especifico que influyen sobre la estabilidad estructural de las proteínas (Fennema, 2010). 2.4.5 Aprovechamiento del suero. La fabricación de queso, tanto por los sistemas tradicionales como por los modernos dan inevitablemente lugar a la producción de una gran cantidad de suero (cerca del 83% del volumen total de la leche empleada). Desde el punto de vista industrial y de la salud pública, resulta difícil apartar el problema de la eliminación del suero del de la propia tecnología de la fabricación del queso, ya que la eliminación de aquél se está convirtiendo en uno de los problemas de mayor importancia. Los queseros han considerado durante largo periodo que el suero era un producto de desecho, y se vertía al mar, a los ríos, canteras o lugares más o menos adecuados o también se empleaba para la alimentación animal. Sin embargo, en los últimos veinte años, con la aparición de medidas tendentes a paliar la polución que impiden la utilización de los ríos y torrentes como lugar de vertido, esta tendencia ha cambiado. Por otro lado se ha tomado conciencia de su elevado valor nutritivo, tanto para el hombre como para los animales, lo 19 que motivo la iniciación de investigaciones para el descubrimiento de nuevos métodos de aprovechamiento (Scott, 1991). A continuación, se indican algunos de los sistemas potencialmente utilizables para el aprovechamiento del suero: -Piensos para cerdos y aves. -Inclusión en alimentos para niños o inválidos y alimentos dietéticos. -Bebidas carbónicas y fermentadas. -Precipitados de albúminas y globulinas como aditivos alimentarios -Preparados cosméticos y farmacéuticos -Fabricación de alcohol, lactosa y jarabes de galactosa/glucosa. -Quesos de suero, Ricotta, Ziger, Urda, etc. -Como medio de fermentación para la fabricación de antibióticos, combustibles (metano), biomasa para la producción de alimentos, o cerveza. - Suero en polvo, a base de concentrar los sólidos por evaporación y secado. - Suero en polvo desmineralizado. - Lactosa obtenida por concentración, cristalización y separación. - Concentrados proteínicos obtenidos por ultrafiltración del suero. En la actualidad se están haciendo otros aprovechamientos tales como la producción de alcohol, vitamina B12 (el suero es muy rico en esta vitamina), urea, amoníaco, lactatos (Madrid, 1999). 2.5 Ricotta 2.5.1 Definición y composición “Con la denominación de Ricotta, se entiende el producto obtenido por precipitación mediante el calor en medio ácido producido por acidificación, debida al cultivo de bacterias lácticas apropiadas o por ácidos orgánicos permitidos a ese fin, de las sustancias proteicas de la leche (entera, parcial o totalmente descremada) o del suero de quesos”. Deberá cumplir con las siguientes exigencias: a. Masa: compacta, finamente granulosa, desmenuzable; sabor y aroma poco perceptibles; color blanco- amarillento uniforme. b. Estabilización mínimo 24 hs. c. Forma: de acuerdo con el envase. El envase será bromatológicamente apto de conformidad con el presente Código con materiales adecuados para las 20 condiciones de previstas de almacenamiento y que confieran una protección apropiada contra la contaminación. d. Se mantendrá en fábrica y hasta su expendio a una temperatura inferior a 10°C. e. Queda prohibido su fraccionamiento en los lugares de expendio. f. Rotulado: Deberá efectuarse en conformidad con las exigencias establecidas en el presente Código. g. La ricotta elaborada con suero de quesos podrá ser adicionada de leche y/o crema. Se reconocen tres variedades, las que deberán responder en su rotulado y composición a las siguientes: • Ricotta con Crema: agua, máx.: 75,0%, grasas (s/extracto seco): más de 11,0% • Ricotta Semigrasa: agua, máx.: 77,0%, grasas (s/extracto seco): 5,0-11,0% • Ricotta Magra: agua, máx. 80,0%, grasas (s/extracto seco): menos de 5,0%.” (Código Alimentario Argentino, Articulo 614 Res Conj. SPyRS y SAGPA N° 33/2006 y N° 563/2006). A su vez, la Ricotta es un precipitado de las proteínas séricas, albúmina y lactoglobulina, que atrapan en su estructura a la lactosa y a la materia grasa remanentes en el suero de quesería (FAO, 1985). Su elaboración se basa en la desnaturalización y coagulación de la proteínas del suero (α-lactoalbúminas y β- lactoglobulinas) cuando éste es calentado a temperaturas superiores a los 85 °C (Fernández et al., 2014). Sin embargo, según Scott, 1991 cuando el ingrediente principal del queso Ricotta es la leche, la coagulación de la proteína se puede llevar a cabo mediante la adición de sustancias ácidas o la aplicación de temperatura. Mientras que, cuando el ingrediente principal es el suero, la coagulación de la proteína se realiza de forma simultánea con la adición de una sustancia ácida y el aumento de temperatura. Su composición química presenta 68,3% de agua, 14,9% de proteínas, 12,6% de grasa, 2,7% de carbohidratos y 1,5% de minerales según Hough et al., 1999. Es de consistencia débil, color blanco, sin olor y de sabor dulce (Carminati et al., 2002). Al poseer un contenido de humedad elevado y un pH inicial cercano a 6, este queso es susceptible al deterioro bacteriano y su vida 21 útil es limitada, a pesar de estar bajo temperaturas de refrigeración (Hough et al., 1999). Por otro lado, la producción de ricotta representa una forma interesante de utilización integral del suero, sin requerir grandes instalaciones o equipos, ni gastos de elaboración, por lo cual se logra un producto de fácil comercialización a bajo costo (FAO, 1985). La ricotta es también llamada requesón por Jay, 1994 y Ricottone o queso de suero definida así por Scott, 1991. 2.5.2 Proceso de elaboración de la ricotta. Este queso deriva de la familia de los quesos de suero. Se fabrican distintos tipos que van desde las cuajadas del tipo Cottage blando a las de los quesos duros para gratinar. Se elaboran con leche entera o con suero, solo o mezclado con leche. Su coagulación es del tipo ácido y por calor. El queso Ricottone se elabora solo con suero (Scott, 1991). Para la elaboración de queso ricotta se hace necesario precipitar los sólidos que éste contiene y para lograr esto es preciso bajar el pH del suero hasta 4,7 agregando solución de ácido cítrico al 50 % (pH=2). Simultáneamente se eleva la temperatura hasta 90-95 °C, sin llegar hasta el punto de ebullición. Luego, se procede a la recolección de la proteína coagulada mediante un filtro que permite la salida del resto de materia líquida (suero remanente). Por último la ricotta se envasa y se refrigera hasta la realización de las pruebas sensoriales por un panel escogido al azar (Porras, 1999). (Figura 6). Figura 6. Diagrama de flujo del proceso de elaboración de queso ricotta (Porras, 1999). 22 2.5.3 Vida útil de la ricotta Según Carillo y Reyes, 2013 la vida útil de un alimento se define como el tiempo finito después de su producción en condiciones controladas de almacenamiento, en las que presentará una pérdida de sus propiedades fisicoquímicas y sufrirá un cambio en su perfil microbiológico. Mientras que, Gómez, 1999 describe la vida de anaquel de un producto como el período de tiempo a partir de la fecha de producción, durante el cual éste mantiene una calidad aceptable o se conserva óptimo para el consumidor. Entre los factores que pueden afectar la duración de la vida útil se encuentra la materia prima, la formulación del producto, le proceso aplicado, las condiciones sanitarias del proceso, envasado, almacenamiento y distribución y las prácticas de los consumidores. A su vez, para lograr estimar la vida útil de un alimento, es necesario conocer cuáles son los cambios negativosque puede sufrir el alimento a evaluar. A partir de tal conocimiento, es necesario seleccionar aquellas mediciones que indiquen que un componente ha tenido una disminución en su concentración inicial o un deterioro. Además, puede partirse del recuento inicial de un microorganismo indicador o un grupo de microorganismo para detectar en qué momento la presencia o cuenta del microorganismo en cuestión no cumple con las especificaciones sanitarias contempladas en la normativa vigente de un país (Carillo y Reyes, 2013). El requesón es alterado por bacterias, por levaduras y por mohos. La forma de alteración por bacterias más habitualmente presentada es un estado conocido como cuajada viscosa. Existen referencias que entre los microorganismos que con mayor frecuencia causan esta alteración se encuentran especies de Alcaligenes, si bien en la misma han sido implicadas especies de los géneros Pseudomonas, Proteus, Enterobacter y Acinetobacter. Los mohos de los géneros Penicillium, Mucor, Alternaria y Geotrichum crecen bien en el requesón al cual comunican los sabores a pasado, a enmohecido, a rancio y a fermentado. Se comprobó que la vida útil del requesón fabricado a escala comercial era acortada por levaduras y mohos. Si bien el 48 % de las muestras contenía Coliformes, estos microorganismos no aumentaron en el requesón después de haber sido conservado a 4,4°C durante 16 días (Jay, 1994). 23 2.6 Microorganismos indicadores de la calidad de los alimentos Los microorganismos indicadores de la calidad microbiológica o vida útil de los alimentos son microorganismos y/o sus productos metabólicos cuya presencia en alimentos concretos en cantidades determinadas puede ser utilizada para evaluar la calidad existente o, mejor, para predecir la vida útil de los alimentos. Estos microorganismos deben cumplir los siguientes criterios -Estar presentes y ser detectables en todos los alimentos cuya calidad (o falta de la misma) se debe evaluar. -Su multiplicación y su número deben tener una relación directa negativa con la calidad del alimento. -Ser detectados y contados fácilmente y se deben poder diferenciar claramente de otros microorganismos. -Se deben poder contar en un corto espacio de tiempo, a ser posible en una jornada de trabajo. -Su crecimiento no debe ser obstaculizado por otros componentes de la flora del alimento (Jay, 1994). Algunos de los microorganismos indicadores de calidad higiénica son; mesófilos viables, coliformes totales y mohos y levaduras. 2.6.1 Características de microorganismos Coliformes. El grupo de microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción etc.), estos microorganismos se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias (Camacho et. Al, 2009). Para su estudio, estos microorganismos se dividen en dos grupos: 1-El grupo de bacterias coliformes totales que comprende todos los bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios facultativos, no formadores de esporas capaces de fermentar la lactosa produciendo ácido y gas a una temperatura de 32 °C dentro de un período de 24 a 48 horas. (Robinson, 1987). Este grupo está formado principalmente por cuatro géneros: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella (Camacho et. Al, 2009). 24 Por lo que estos microorganismos son indicadores de calidad higiénica, es decir, su presencia en los alimentos indica el grado de contaminación de la materia prima, fallas en los procesos de elaboración o re contaminaciones posteriores (Robinson, 1987). 2-El grupo de coliformes fecales que está constituido por bacterias Gram- negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 horas de incubación a 44.5 ±0.1 °C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli como principal indicador de inocuidad. Otra de sus características es la facultad para producir indol en agua peptonada (Camacho et. Al, 2009). La presencia de estos microorganismos se utiliza para indicar una contaminación potencialmente peligrosa, ya que su hábitat natural es el intestino del hombre y animales de sangre caliente (Robinson, 1987). Por lo tanto la presencia de microorganismos Coliformes en el queso ricotta y en determinadas cantidades se emplean para evaluar la calidad existente en la misma así como también predecir su vida útil. 2.6.2 Características de hongos. Los mohos y levaduras también son indicadores de calidad higiénica. La capacidad de estos organismos para atacar a muchos alimentos se debe en gran parte a sus necesidades ambientales relativamente versátil. La mayoría de las levaduras y los mohos son aerobios obligados (necesitan oxígeno libre para el crecimiento), el rango de pH para su crecimiento es bastante amplio; pH 2-8 y la temperatura (10-35°C) también es amplia. Los requisitos de humedad es de aw: 0,85 o menos, aunque las levaduras requieren generalmente una actividad de agua superior (Tournas, 1998). Debido a la composición de la ricotta, y su alta proporción de agua, es un alimento fácilmente alterable por los hongos. Pueden causar malos olores, sabores desagradables y la decoloración de las superficies de alimentos. La ricotta es considerada un queso de muy alta humedad sin bacterias lácticas. Deberá cumplir con los siguientes requisitos microbiológicos según el artículo 605 incisos F del CAA: 25 Tabla 3. Quesos de muy alta humedad sin bacterias lácticas en forma viable y abundante (humedad > 55 %). Referencias: n: número de unidades de muestra analizada. c: número máximo de unidades de muestra cuyos resultados pueden estar comprendidos entre m (calidad aceptable) y M (calidad aceptable provisionalmente). m: nivel máximo del microorganismo en el alimento, para una calidad aceptable. M: nivel máximo del microorganismo en el alimento, para una calidad aceptable provisionalmente. (1) Compendium of methods for the microbiological examinations of foods. 3º Edición. Editado por Carl Vanderzant y Don F. Splittstoesser. Fuente: ICMSF - Métodos de muestreo para análisis microbiológicos. Método de toma de muestra: FIL 50 C: 1999. Microorganismos Criterios de Aceptación Categoría ICMSF Método de Ensayo Coliformes /g. (30°C) n = 5 c =2 m=100 M=1000 5 FIL 73A : 1985 Coliformes /g. (45°C) n = 5 c =2 m=100 M=500 5 APHA 1992, Cap.24(1) Estafilococos coagulasa. positiva/g. n = 5 c =1 m=10 M=100 8 FIL 145:1990 Hongos y levaduras/g. n = 5 c =2 m=500 M=5000 2 FIL 94B:1990 Salmonella spp/ 25 g. n = 5 c =0 m=0 10 FIL 93 A: 1985 Listeria monocytogenes/ 25 g. n = 5 c =0 m=0 10 FIL 143:1990 26 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo general Evaluar la evolución microbiológica de la ricotta a lo largo del período establecido por una PYME, el cual es de 20 días. 3.2 Objetivos particulares Evaluar la calidad físico-química y microbiológica de la materia prima (suero de quesería) utilizada para elaborar la ricotta. Caracterizar el proceso de elaboración de ricotta. Validar la vida útil de la ricotta elaborada en la PYME. 27 4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 Ubicación y características de la empresa El estudio se realizó en una fábrica de lácteos ubicada al sur de la Provincia de Buenos Aires donde se procesan aproximadamente 20000 litros de leche por día. La misma cuenta con un laboratorio de control de calidad interno donde se analizaron las muestras del presente proyecto. 4.2 Elaboración de ricotta con suero de quesería Inicialmente se evaluó cada etapa del proceso productivo de la ricotta, con la finalidad de documentarloy elaborar para esta empresa en particular su diagrama de flujo y los parámetros a controlar. Se verificó la implementación de buenas prácticas de manufactura (B.P.M) y procedimientos estandarizados de saneamiento (P.O.E.S.) por el personal de la empresa, como así también se controló la posible existencia de variaciones productivas utilizando tanto suero de queso cremoso como suero de queso barra. Para la elaboración de ricotta, se utilizó como materia prima, suero lácteo procedente de dos elaboraciones de quesos: en la tina número uno, se elaboró queso cremoso y en la tina número dos, se procesó queso barra, ambas con una capacidad de 3000 litros. Luego de obtener el suero remanente de la producción de queso cremoso y barra, se procedió a elaborar la ricotta, empleando el proceso de elaboración que se detalla a continuación: El lactosuero procedente de las diferentes elaboraciones de quesos, fue bombeado a las tinas encamisadas de producción de ricotta, con una capacidad de 1500 litros cada una (Figura 7) y con paletas mezcladoras. 28 En esta primer etapa, en agitación continua, el lactosuero, se encontraba con una temperatura de 39-47 ° Celsius (dependiendo del queso elaborado con anterioridad) y una acidez de 9-11 °Dornic, con lo cual fue necesario aumentar la temperatura, empleando vapor, hasta 90- 92°C, y a su vez disminuir la acidez a 6-7 °D, que se logró adicionando 500 mL de hidróxido de sodio (NaOH) (Figura 8), buscando eliminar el posible desarrollo de microorganismos patógenos y producir una precipitación leve de las proteínas séricas. Una vez alcanzada la temperatura deseada se adicionó una mezcla de 1,90 kg de cloruro de calcio (Cl2 Ca) y 100 mL de ácido acético en 11 litros de agua, lo cual fue vertido en la tina y se dejó reposar aproximadamente 5 minutos. Al cabo de dicho tiempo se observó la precipitación de las proteínas séricas, las que ascendieron a la superficie formando los grumos característicos del queso ricotta. (Figura 9). Figura 7: Tinas de elaboración de Ricotta Figura 8: Tratamiento térmico y adición de NaOH. 29 Figura 9: Precipitación de proteínas. Posteriormente, se agitó suavemente en intervalos, permitiendo la cocción de los grumos. Luego de 20 minutos, se obtuvo un producto final de grumos firmes y consistentes. A continuación se llevó a cabo el desuerado de la tina (Figura 10), mediante la apertura de válvula inferior de la misma, para luego extraer los grumos de ricotta colocándolos en moldes higienizados y desinfectados con cloro (Figura 11). Estos moldes fueron prensados durante aproximadamente 10 minutos de cada lado, con el objetivo de eliminar la mayor cantidad de suero y que adopte su presentación final (Figura 12). Figura 10: Desuerado Figura 11: Moldeado 30 A continuación, los moldes desnudos fueron colocados en la cámara frigorífica (aproximadamente a 3°C) (Figura 13), donde finalizó el escurrimiento del suero y disminuyó su temperatura, hasta su posterior envasado al vacío (Figura 14). Figura 12: Prensado. Figura 13: Almacenamiento. Figura 14: Envasado al vacío 31 4.3 Diagrama de flujo del proceso productivo en fábrica. A continuación se elaboró el diagrama flujo de la elaboración del queso ricotta. v Figura 15: Diagrama de flujo: Proceso productivo de ricotta. Recepción de Materia Prima Tratamiento térmico 90-92 °C Precipitación de proteínas Cocción Desuerado Moldeado Prensado Refrigeración y almacenamiento 3 °C Envasado Suero Lácteo 39-47 °C Vapor Regulador de acidez Adición de Cl2Ca y ácido acético Suero remanente 32 4.4 Caracterización de materia prima: suero de quesos. Para el muestreo de materia prima, se obtuvieron cuatro muestras de suero de 120 mL cada una, utilizando recipientes estériles para su recolección (Figura 16); dos muestras de la tina N°1 y dos muestras de la tina N°2. Las muestras fueron extraídas antes de realizar el tratamiento térmico. Se realizaron las siguientes determinaciones: a) Determinaciones físico- químicas - Determinación de pH, por método potenciométrico utilizando un pH metro con electrodos de penetración, marca Hanna, modelo HI 9126. - Determinación de acidez titulable, mediante titulación ácido-base, utilizando como indicador fenolftaleína al 2% y solución tituladora de Hidróxido de sodio (NaOH) a 0,1 N (método AOAC 16a ED .947.05). - Determinaciones de humedad y composición química del suero lácteo , se empleó el equipo EKOMILK de la marca comercial Milkana, modelo KAM 98-2AM b) Determinaciones microbiológicas de suero lácteo: Los análisis microbiológicos se realizaron sobre muestras de suero lácteo luego de realizar el tratamiento térmico, evaluándose el recuento de bacterias coliformes a 30 °C, recuento de bacterias coliformes a 45 °C y por último el Figura 16: Muestras de suero de queso cremoso 33 recuento de hongos y levaduras, considerándose las exigencias establecidas en el artículo 582 del C.A.A. correspondiente a sueros de lechería. Para los cuales se utilizó la siguiente metodología: - Recuento de coliformes a 45 °C / mL, según Norma APHA 1992 Cap.24 (1). - Recuento de coliformes a 30°C / mL, según Norma FIL 73 A: 1985. - Recuento de hongos y levaduras / mL, según Norma FIL 94B:1990. Se tomaron 10 mL de suero y se adicionaron 90 mL de agua peptonada estéril al 0.1 %, siendo esta la primer dilución. A partir de la misma, se realizaron las diluciones sucesivas, extrayendo 1 mL de la primer dilución, colocándolo en un tubo que contenía 9 mL de agua peptonada y así sucesivamente con las diluciones consecutivas. Por otro lado, se prepararon los medios de cultivo en placas de Petri como Yeast Estract Glucose Chloranphenicol Agar (YGC), a su vez se preparó el cultivo Violet Red Baile Agar (VRBA) según lo indicaba el envase, como así también las placas PETRIFILM. Para los recuentos de coliformes a 30 °C se realizó siembra en profundidad, utilizando VRBA y se incubaron las placas por 48 horas. Para el recuento de coliformes a 45 ° C se sembró las placas PETRIFILM por 48 horas y para el recuento de hongos y levaduras se realizó siembra en superficie, incubando las placas a temperatura ambiente, en conservadora de poliestireno expandido, durante 5 días. 4.4 Caracterización de queso ricotta. Una vez obtenido el producto final, se tomaron dos muestras de ricotta en su envase original (envasado al vacío) de aproximadamente 4,5 kg, y se colocaron en recipientes higienizados y desinfectados con su respectivas tapas. La muestra uno correspondió al producto trabajado en la tina uno, procedente de suero de queso cremoso y la muestra dos perteneció al producto trabajado en la tina dos procedente de suero de queso barra. Como referencia, se identificó, la elaboración 1 como originaria de la tina uno y la elaboración 2 como procedente de la tina 2. El día de producción y toma de muestras, se estableció como día 0 (cero). 34 Se llevaron a cabo los análisis microbiológicos a los días subsiguientes: 5, 10, 15, 20, 22 y 24 días. Durante dicho período, los recipientes fueron almacenados en heladera de la fábrica marca Patrick modelo HPK 135 CD-A, donde se midió la temperatura de la misma con una frecuencia diaria a lo largo de todo el estudio, utilizando termómetro digital de punción, marca Luft Germany (-50º C/ +150ºC), el cual se verificó mensualmente contra un termómetro patrón. Por otro lado, la frecuencia de limpieza de la heladera se realizó conuna periodicidad de 60 días. Para evaluar la calidad microbiológica de la ricotta se consideraron sólo algunas de las exigencias establecidas en el artículo 605 del CAA correspondiente a los criterios microbiológicos para quesos de muy alta humedad (valor >55%), sin bacterias lácticas en forma viable y abundante, debido a que las instalaciones en el laboratorio de la fábrica no son las adecuadas para la realizar la totalidad de los ensayos. A saber, los recuentos serán: - Recuento de coliformes a 45 °C / mL, según Norma APHA 1992 Cap.24 (1). - Recuento de coliformes a 30°C / mL, según Norma FIL 73 A: 1985. - Recuento de hongos y levaduras / mL, según Norma FIL 94B:1990. Se pesaron 10 g de ricotta y se diluyeron en 90 mL de agua peptonada estéril, siendo esta la primer dilución, a partir de la cual se realizan las sucesivas diluciones, tomando 1 mL de la primer dilución y colocándolo en un tubo con 9 mL de agua peptonada al 0.1 %, y realizando las diluciones subsiguientes. Para los recuentos de coliformes a 30 °C se realizó siembra en profundidad, utilizando VRBA y se incubaron las placas por 48 horas. Para el recuento de coliformes a 45 ° C se sembró las placas PETRIFILM por 48 horas y para el recuento de hongos y levaduras se realizó siembra en superficie, incubando las placas a temperatura ambiente en conservadora de poliestireno expandido durante 5 días. Además la toma de muestra de ricotta se realizó en las extremidades del producto y de forma opuesta, cada vez que se tomaba la muestra, como enseña el esquema: 35 1: Primer muestreo. Día cero 2: Segundo muestreo. Día cinco 3: Tercer muestreo. Día diez 4: Cuarto muestreo. Día quince 5: Quinto muestreo. Día veinte 6: Sexto muestreo. Día veintidós 7: Séptimo muestreo. Día veinticuatro. 36 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 5.1 Evaluación del proceso productivo del queso ricotta Al observar y controlar las distintas etapas de la elaboración, se demostró que no existen variaciones en el manejo de los diferentes tipos de suero, a excepción de la temperatura con que estos quesos abordan a la tina inicial; el suero de queso cremoso lo hizo a 37°C mientras que el suero de queso barra a 47 °C. Luego se empleó exactamente la misma metodología de elaboración indistintamente de los sueros empleados. Al realizar el monitoreo en cuanto a implementación de B.P.M. y P.O.E.S se pudo verificar que el personal cumple eficazmente con dichos prerrequisitos, ya que se comprobó: -Lavado de manos con posterior colocación de alcohol en gel. -Lavado de botas blancas en sector sanitario antes del ingreso a planta de producción. -Vestimenta de color blanco en condiciones higiénicas. -No utilización de alhajas. -Uso de cofias descartables. Como así mismo pudo observarse: -Implementación de lavados de tinas entre una elaboración y la subsiguiente con agua potable. -Utilización de recipientes higienizados y sanitizados tanto para colocar el producto final como insumos. No obstante, se pudo verificar en un sector de poca superficie una deficiencia en el drenaje de agua; desagote ralentizado, debido a un atoramiento en tuberías, el cual ya había sido informado al área de mantenimiento. Por otro lado, en la finalización del proceso productivo, específicamente la etapa de refrigeración y almacenamiento, pudo notarse la presencia de pequeñas manchas negras en la pared de la cámara frigorífica (paneles de pvc), con características similares a hongos, que se localizaban áreas cercanas a la puerta de ingreso de la cámara frigorífica. 37 5.2 Resultados de las determinaciones de suero de quesería. 5.2.1 Análisis físico- químico del suero lácteo. En la tabla 4 se muestran los resultados obtenidos a partir de las determinaciones fisicoquímicas y composicionales que se realizaron sobre el suero lácteo. Tabla 4. Resultados fisicoquímicos y composicional de suero lácteo. Muestra/ Determinación 1C 2C 3B 4B Valor normal (Según Scott, 1991) pH 6,41 6,39 6,20 6,31 6-6,6 Acidez titulable(°Dornic) 9,0 9,5 10,0 10,0 S/ D Proteína (g%) 0,78 0,80 0,81 0,83 0,8-1 Grasa (g%) 0,65 0,63 0,50 0,49 0,2-0,7 Lactosa (g%) 4,24 4,20 4,80 4,75 4,5-5,0 Agua (g%) 93,57 93,69 93,79 93,80 93-94 Referencias: S/D: Sin datos de autor. 1C: Muestra suero N°1 de queso cremoso. 2C: Muestra suero N°2 de queso cremoso. 3B: Muestra suero N°3 de queso barra. 4B: Muestra suero N°4 de queso barra. Como puede observarse en la Tabla 4, el suero utilizado como materia prima tanto de tina N°1(suero de queso cremoso) como de tina N° 2 (suero de queso barra), fue un suero dulce debido a su pH (6-6,3). Este valor fue el esperado debido a que en la elaboración de los quesos se utilizó cuajo para coagular la caseína. Por otro lado, las diferencias observadas en cuanto a su composición nutricional; grasas, proteínas y lactosa se presentaron debido a las variaciones de temperatura en la elaboración de estos quesos. 38 5.2.2 Análisis microbiológico del suero lácteo. Los resultados promedio arrojaron los siguientes valores: Tabla 5. Resultados microbiológicos de suero lácteo. Los resultados obtenidos al evaluar la calidad microbiológica del suero, tanto del suero de queso cremoso (Suero1) como del suero de queso barra (Suero 2), mostraron un recuento de bacterias coliformes dentro del parámetro establecido en el artículo 582 del CAA, el cual indicó que debe ser menor a 100 Unidades Formadoras de Colonia por gramo (UFC/g), una vez realizado el tratamiento térmico. Por los resultados expuestos pudo concluirse que la materia prima empleada para la fabricación de queso ricotta presentó buena calidad microbiológica y composicional. Además, se pudo verificar que el tratamiento térmico empleado en esta elaboración fue adecuado, óptimo y eficaz para lograr una baja carga bacteriana inicial. 5.3 Evolución de la calidad microbiológica de la ricotta. El monitoreo de la temperatura en la heladera manifestó resultados con una variabilidad de 0,7 °C. Las mediciones mostraron un valor mínimo de 5,4 °C y un valor máximo de 6,1 °C, para el estudio completo de este ensayo. No obstante en los días de almacenamiento número 10 y 12, se dio aviso que durante horas nocturnas y por un período de 15 minutos, aproximadamente, se registró una interrupción en el suministro de energía eléctrica, en la totalidad de las instalaciones debido a fallas eléctricas. Esta anomalía si bien pudo afectar de forma indirecta al estudio, no tiene incidencia relevante ya que la interrupción de suministro fue por un período breve, considerando que la heladera no fue abierta y la temperatura de Muestra Coliformes a 30 °C (UFC/g) Coliformes a 45 °C (UFC/g) Hongos y levaduras (UFC/g) Valor máx. de Coliformes en C.A.A (UFC/g) Suero 1 < 10 < 10 < 10 < 100 Suero 2 < 10 < 10 < 10 < 100 39 refrigeración se mantuvo al menos por unas horas, una vez iniciada la interrupción. Los resultados microbiológicos exhibieron los datos que se detallan a continuación. 5.3.1 Recuento de bacterias coliformes a 30°C. Tabla 6. Ricotta: Recuento de bacterias coliformes a 30ºC (UFC/g). Muestra /Días de almacenamiento 0 5 10 15 20 22 24 Elaboración Nº 1 45 100 389 569 712 900 1020 Elaboración Nº 2 20 56 302 485 619 800 998 Figura 17: Curva de crecimiento de microorganismos Coliformes a 30 °C en queso ricotta. En la figura 17 se registró el comportamiento de la carga de microorganismos coliformes a 30 °C presentes en el queso ricotta en almacenamiento a temperatura de refrigeración promedio de 5,7 °C; para el tiempo de 24 días, en dos elaboraciones. En la elaboración uno se observó una evolución de microorganismos que presentó, en su primer fase, un comportamiento estable o de latencia y luego 0 200 400 600 800 1000 1200 0 510 15 20 22 24 R e c u e n to d e C o li fo rm e s a 3 0 ° C ( U F C / g ) Días de almacenamiento Bacterias Coliformes a 30°C Elaboración Nº 1 Elaboración Nº 2 M: 1000 UFC/g m: 100 UFC/g 40 un crecimiento exponencial de microorganismos coliformes. El día de almacenamiento número 24 el recuento alcanzó 1024 UFC/g, valor el cual supera el límite establecido que es de 1000 UFC/g. En la Elaboración 2 se observó una evolución microbiológica similar a la Elaboración 1, presentando recuento con valores menores a esta última y el día de almacenamiento 24 el recuento no superó el límite máximo de microorganismos, siendo 998 UFC/g. Si bien los valores obtenidos reflejaron una calidad higiénica deficiente ya sea por fallos en el proceso productivo o contaminaciones posteriores al tratamiento térmico en ambas elaboraciones, podría estimarse que, en cuanto al recuento coliformes a 30 °C la aptitud microbiológica de la ricotta supera los 20 días de almacenamiento. Sin embargo, se debe sugerir a la fábrica investigar el origen de la contaminación y plantear medidas preventivas para disminuir la carga microorganismos coliformes. 5.3.2 Recuento de bacterias coliformes a 45°C. Tabla 7.Ricota: Recuento de bacterias coliformes a 45ºC (UFC/g). Muestra/Días de almacenamiento 0 5 10 15 20 22 24 Elaboración Nº 1 20 50 152 320 400 450 495 Elaboración Nº 2 15 45 120 280 356 420 470 0 100 200 300 400 500 600 0 5 10 15 20 22 24 R e c u e n to d e c o li fo rm e s a 4 5 ° C (U F C /g ) /g Días de almacenamiento Bacterias Coliformes a 45 °C Elaboración Nº 1 Elaboración Nº 2 M: 500 UFC/g m: 50 UFC/g Figura 18: Curva de crecimiento de microorganismos Coliformes a 45°C en queso ricotta. 41 En la figura 18 se registró el comportamiento de la carga de microorganismos coliformes a 45 °C presentes en el queso ricotta en almacenamiento a una temperatura de refrigeración promedio de 5,7 °C, para el tiempo de 24 días, en dos elaboraciones. Como pudo observarse en la Elaboración 1 existió un crecimiento constante los primeros días de almacenamiento y luego presentó una evolución de forma exponencial de microorganismos. Para el día de almacenamiento 24 hubo un recuento de 495 UFC/g, valor el cual, no superó el límite máximo de microorganismos en la ricotta para una calidad aceptable provisoriamente. En la Elaboración 2, se observó un crecimiento de microorganismos también de forma exponencial sin superar el valor máximo establecido en CAA. Además el recuento de microorganismos de esta elaboración presentó valores menores que la que exhibió la elaboración uno. Aunque en ambas elaboraciones el recuento de coliformes a 45 °C, no excedió el nivel máximo (500 UFC/g) para una calidad aceptable provisoriamente, del mismo modo que en el comportamiento de coliformes a 30°C, puede concluirse que las medidas higiénicas no son las adecuadas, estimando una aptitud microbiológica del producto final de 24 días para el recuento de coliformes a 45 °C. 5.3.3 Recuento de Hongos y levaduras Tabla 8. Ricota: Recuento de Hongos y levaduras (UFC/g). Muestra/día de almacenamiento 0 5 10 15 20 22 24 Elaboración Nº 1 1210 1500 3860 4950 5998 6750 7812 Elaboración Nº 2 998 1350 3650 4400 5200 6510 7320 42 Figura 19: Curva de crecimiento de Hongos y levaduras en queso ricotta. En la figura 19 se registró el comportamiento de la carga de Hongos y levaduras presentes en el queso ricotta en almacenamiento a temperatura de refrigeración promedio de 5,7 °C, para el tiempo de 24 días, en dos elaboraciones. Como lo indicó el gráfico, la Elaboración 1 presentó un recuento de hongos y levaduras de 4950 UFC/g a los 15 días, el cual se aproxima al límite de 5000 UFC/g, por lo que se deduce que entre el día 16 o 17 alcanzó el límite máximo de recuento de hongos y levaduras. Posteriormente el crecimiento continuó de forma exponencial hasta el día 24 llegando a 7812 UFC/g. En la Elaboración 2 se observó que el día de almacenamiento 20 el recuento de mohos y levaduras es de 5200 UFC/g, el cual excedió el nivel máximo permitido y puede estimarse que el día 17 o 18 el recuento estaría en cercanías a dicho límite. El recuento de hongos y levaduras en ambas elaboraciones resulta relevante debido a que la enumeración de estos microorganismos alcanzó el valor máximo promedio, para una calidad aceptable, unos 8 o 9 días anteriores a lo que ocurre con los microorganismos coliformes. Esto pudo deberse, 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 0 5 10 15 20 22 24R e c u e n to d e H o n g o s y l e v a d u ra s ( U F C /g ) Días de almacenamiento Hongos Y Levaduras Elaboración Nº 1 Elaboración Nº 2 M: 5000 UFC/g m: 500 UFC/g 43 posiblemente, a la presencia de hongos en el lugar de almacenamiento y refrigeración de los moldes desnudos, es decir a una limpieza deficiente de la cámara frigorífica que afectó de forma negativa a la calidad y vida útil del queso ricotta. 5.3.4 Evolución microbiológica de la Ricotta – Elaboración N°1 Figura 20: Evolución microbiológica de queso ricotta- Elaboración N°1 En la figura 20 se puede observar el comportamiento de la carga de microorganismos coliformes y hongos y levaduras presentes en el queso ricotta en almacenamiento a temperatura de refrigeración 6 °C, para el tiempo de 24 días, en la elaboración número uno. En esta elaboración, que es procedente de suero de queso cremoso, se verificó una evolución de microorganismos que se da, en una primera fase, de manera estable y posteriormente presentó un comportamiento de forma exponencial, tanto en el crecimiento de microorganismos coliformes a 30°C como microorganismos a 45 °C, sin obtener valores que excedan el límite máximo, no obstante la evolución de hongos y levaduras si bien se dio de forma exponencial lo hace de una manera abrupta en comparación con los 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 0 5 10 15 20 22 24 U F C /g Días de almacenamiento Elaboración N°1 Hongos y LevadurasColiformes a 30 °C Coliformes a 45 °C 44 microorganismos coliformes, a lo largo de todo el ensayo, alcanzando el valor límite máximo a los 17 días. Puede concluirse que en esta elaboración la vida útil de la ricotta se vio afectada negativamente debido al elevado recuento de hongos y levaduras presentes en ella. 5.3.5 Evolución microbiológica de la Ricotta – Elaboración N°2 Figura 21: Evolución microbiológica de queso ricotta- Elaboración 2. En la figura 21 se verifica el comportamiento de la carga de microorganismos coliformes y hongos y levaduras presentes en el queso ricotta en almacenamiento a temperatura de refrigeración 6 °C, para el tiempo de 24 días, en la elaboración número 2. En esta elaboración, que es originaria de suero de queso barra, se verificó una evolución de microorganismos que se dio de forma exponencial, tanto en el crecimiento de microorganismos coliformes a 30°C como microorganismos a 45 °C, no obstante ningún valor obtenido superó el límite máximo establecido para cada recuento además que los mismos presentaron valores menores a los obtenidos en la Elaboración 1. 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 0 5 10 15 20 22 24 U F C /g Días de almacenamiento Elaboración 2 Hongos y Levaduras Coliformes a 30 °C Coliformes a 45 °C 45 Por otro lado, la evolución de hongos y levaduras se presentó de manera similar al comportamiento obtenido en la Elaboración 1. Por ello, también puede concluirse que en esta elaboración la vida útil de la ricotta se ve afectada de forma negativa debido al elevado recuento de hongos y levaduras presentes en ella. 6. CONCLUSIONES La información obtenida en esta tesis fue considerada de gran utilidad por la PYME en donde se realizó el trabajo, ya que le permitió determinar que el
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