A synthetic biology approach to self-regulatory recombinant protein production in Escherichia coli

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A synthetic biology approach to self-regulatory recombinant protein production in Escherichia coli
Un acercamiento por medio de biología sintética a un sistema autorregulado de producción de proteínas recombinantes en E. coli
En Journal of biological engineering 6. 2012.
Martin Dragonsits 1,3,4 
Daniel Nicklas 2, 4
Ilias Tagkopoulos 1,4
Abstract
Background: Recombinant protein production is a process of great industrial interest, with products that range from pharmaceuticals to biofuels. Since high level production of recombinant protein imposes significant stress in the host organism, several methods have been developed over the years to optimize protein production. So far, these trial-and-error techniques have proved laborious and sensitive to process parameters, while there has been no attempt to address the problem by applying Synthetic Biology principles and methods, such as integration of standardized parts in novel synthetic circuits.
Results: We present a novel self-regulatory protein production system that couples the control of recombinant protein production with a stress-induced, negative feedback mechanism. The synthetic circuit allows the downregulation of recombinant protein expression through a stress-induced promoter. We used E. coli as the host organism, since it is widely used in recombinant processes. Our results show that the introduction of the selfregulatory circuit increases the soluble/insoluble ratio of recombinant protein at the expense of total protein yield. To further elucidate the dynamics of the system, we developed a computational model that is in agreement with the observed experimental data, and provides insight on the interplay between protein solubility and yield.
Conclusion: Our work introduces the idea of a self-regulatory circuit for recombinant protein products, and paves the way for processes with reduced external control or monitoring needs. It demonstrates that the library of standard biological parts serves as a valuable resource for initial synthetic blocks that needs to be further refined to be successfully applied in practical problems of biotechnological significance. Finally, the development of a predictive model in conjunction with experimental validation
Proteínas recombinantes: también llamadas proteínas quiméricas o proteínas heterólogas, son aquellas que se obtienen al expresar un gen clonado en una especie o una línea celular distinta a la célula original.
Las estrategias tradicionales para expresión de proteínas recombinantes involucran células transfectadas con vectores de DNA que contienen la secuencia del gen y el posterior cultivo de las células. Típicamente, las células son lisadas para extraer la proteína expresada para su subsecuente purificación. Se usan sistemas de expresión de proteínas in vivo tanto en procariotas como en eucariotas. Cada tipo de sistema depende del objetivo y tiene sus propias ventajas y retos.
Expresión de proteínas en bacterias
Son populares porque las bacterias son fáciles de cultivar, crecen rápido y producen grandes cantidades de proteínas recombinantes. Sin embargo, muchas proteínas de eucariotas a menudo no son funcionales en bacterias porque sus células no tienen las herramientas para generar las modificaciones post traduccionales requeridas. También, muchas proteínas se vuelven en insolubles al convertirse en cuerpos de inclusión lo que dificulta su recuperación sin dañarlas.
*Cuerpos de inclusión: Son gránulos de material orgánico o inorgánico, algunas veces rodeados de membrana. En general funcionan como almacenamiento de compuestos energéticos que son usados como fuente de energía (polisacáridos, lípidos, polifosfatos). El glucógeno constituye el principal elemento almacenado por las enterobacterias (40% de su peso). Algunas pseudomonas acumulan carbono como ácido poli-α-hidroxibutirato y las micobacterias contienen gránulos de polifosfato.
Brock
Inclusiones celulares
Las células procariotas suelen presentar inclusiones. Las inclusiones actúan como reservas energéticas y reservorios de carbono, pero también pueden tener funciones especiales. A menudo se pueden ver directamente con el microscopio óptico, y suelen estar envueltas por una membrana de una sola capa (no unitaria) que deja la inclusión fuera de la célula. Almacenar carbono y otras sustancias en forma insoluble es una ventaja para las células, porque reduce el estrés osmótico que se produciría si la misma cantidad de sustancia estuviera disuelta en el citoplasma.
Algunas cosas que se almacenan: polímeros de almacenamiento de carbono (Uno de los cuerpos más comunes en las procariotas es el ácido poli-B-hidroxibutírico (PHB)), polifosfato, azúfre, minerales de carbonato y magnetosomas (inclusiones de almacenamiento magnéticas, magnetita Fe3O4, crean campo magnético que les permite ubicarse) .
Problemas en la expresión de genes de mamíferos en bacterias
Aunque normalmente se quiere producir una gran cantidad de mRNA y conseguir traducirlo para obtener cantidades grandes de proteína, una superproducción masiva de proteínas extrañas puede ser dañina para la célula hospedadora. Por tanto, es importante regular la expresión de los genes clonados. 
La regulación de la transcripción por una proteína represora es una forma útil de controlar un gen clonado. Un represor fuerte puede bloquear completamente la síntesis de las proteínas que están bajo su control uniéndose al operador. Cuando se necesita que el gen se exprese, se añade el inductor.
Entre estos problemas se incluyen los siguientes: 1) los genes eucarióticos deben ser ubicados bajo en control de promotores bacterianos; 2) los intrones se deben eliminar; (3) la preferencia codónica puede hacer necesaria la modificación de secuencias génicas, y (4) muchas proteínas de mamíferos tienen que ser modificadas después de la traducción para producir la forma activa, y las bacterias no pueden realizar la mayoría de estas modificaciones. 
En ocasiones, la síntesis de una proteína en un nuevo hospedador va acompañada de problemas adicionales. Por ejemplo, algunas proteínas son susceptibles de degradación por parte de proteasas intracelulares, por lo que pueden destruirse antes de ser aisladas. Además, algunas proteínas eucarióticas son tóxicas para los hospedadores procariotas, de manera que la célula hospedadora del vector de clonación puede morir antes de sintetizar una cantidad suficiente del producto deseado. Estos problemas se pueden solucionar modificando el hospedador o el vector.
En ocasiones, cuando las proteínas foráneas se producen en gran exceso, forman cuerpos de inclusión dentro del hospedador. Los cuerpos de inclusión consisten en una proteína insoluble agregada que con frecuencia se pliega de forma incorrecta o está parcialmente desnaturalizada, y suelen ser tóxicos para la célula hospedadora. Aunque los cuerpos de inclusión son relativamente fáciles de purificar debido a su tamaño, la proteína que contienen suele ser muy difícil de disolver y puede estar inactiva. Una posible solución para este problema consiste en utilizar un hospedador que produzca un exceso de chaperonas moleculares que ayuden a conseguir el plegado correcto.
Las proteínas desnaturalizadas se agregan al atraerse entre sí por sus aminoácidos hidrofóbicos
IbpA y B Inclusion-body Binding Protein (Small Heat shock proteins Ibp) También hsIS y htpE
Associates with aggregated proteins, together with IbpB, to stabilize and protect them from irreversible denaturation and extensive proteolysis during heat shock and oxidative stress. Aggregated proteins bound to the IbpAB complex are more efficiently refolded and reactivated by the ATP-dependent chaperone systems ClpB and DnaK/DnaJ/GrpE. Its activity is ATP-independent. (Este sistema se encarga de recuperar proteínas de daño causado por el calor que genera agregados)
clpB acts before DnaK, in the processing of protein aggregates. Protein binding stimulates the ATPase activity; ATP hydrolysis unfolds the denatured protein aggregates, which probably helps expose new hydrophobicbinding sites on the surface of ClpB-bound aggregates, contributing to the solubilization and refolding of denatured protein aggregates by DnaK. Unfolded proteins bind initially to DnaJ; upon interaction with the DnaJ-bound protein, DnaK hydrolyzes its bound ATP, resulting in the formation of a stable complex. GrpE releases ADP from DnaK; ATP binding to DnaK triggers the release of the substrate protein, thus completing the reaction cycle. Several rounds of ATP-dependent interactions between DnaJ, DnaK and GrpE are required for fully efficient folding.)
Cada una de IbpA y B son monómeros. Forms homomultimers of about 100-150 subunits at optimal growth temperatures. Conformation changes to monomers at high temperatures or high ionic concentrations.
Escherichia coli
Las Proteobacteria son, con mucho, el filo más extenso y metabólicamente más diversificado de Bacteria. Más de un tercio de las especies de Bacteria que han sido caracterizadas se incluyen en este grupo.
Todas las proteobacteria son gram negativas.
Las Enterobacteriales, comúnmente llamadas bacterias entéricas, comprenden un grupo filogenético relativamente homogéneo dentro de las Gammaproteobacteria formado por bacilos gramnegativos aerobios facultativos, que no esporulan y que son inmóviles o móviles por flagelos periticos
Las bacterias entéricas son oxidasa negativas y catalasa positivas. También producen ácido a partir de la glucosa y reducen nitratos pero solo hasta nitritos. Tienen exigencias nutricionales sencillas y fermentan azúcares. 
En la fermentación ácido-mixta se forman cantidades significativas de tres ácidos: acético, láctico y succínico. También se forma etanol, CO2 y H2, pero no butanodiol. CO2 y H2 en cantidades iguales.
Otras fermentaciones: butanodiólica, láctica, etc.
Operon tet - tetR - tetO
El operón Tetraciclina en bacterias. En ausencia del antibiótico (tet) el represor /(TetR) permanece unido a secuencias operadoras (tetO) de los genes tetR y tetA, impidiento su transcripción. Tan pronto aparece la tetraciclina en el medio intracelular se combina con un catión de magnesio y se une al represor TetR, que cambia de configuración y se libera del operador, reactivando así tanto la producción de más represor como la síntesis de TetA, que bombea el antibiótico al exterior.
TetR is used in artificially engineered gene regulatory networks because of its capacity for fine regulation of promoters. In the absence of Tc or analogs like ATc, basal expression of TetR-regulated promoters is low, but expression rises sharply in the presence of even a minute quantity of Tc.
Operón lac
 
T7 RNA polymerase
Del bacteriófago T7
Polimerasa tiene una afinidad muy alta con su promotor y tiene un alto nivel de expresión
Promotor 5’ 3’ TAATACGACTCACTATAGGGAGA
Tasa de error: 10-4
Velocidad: 230 bases por segundo
pET23b - Backbone
Resistencia a ampicilina
T7 promotor y terminador
*El pET23 solo tiene el terminador
Resumen
E. coli C41 (DE3) es una cepa que produce RNA polimerasa del bacteriófago T7, es muy afín a su sitio de reconocimiento y por lo tanto transcribe mucho. PLac (Promotor del operón de lactosa) controla la producción de polimerasa T7.
Cuando agregamos IPTG, dispara la producción de polimerasa T7.
Gen de GFP tiene el promotor de T7, por lo que al haber pol T7, se unen muchas y aumenta su producción 
GFP mutante forma cuerpos de agregación fácilmente
Ibp (Inclusion-body Binding Proteins) A y B son formadas por el promotor del operador IbpAB que se activa bajo el estrés causado por cuerpos de inclusión.
Se le puso el gen de tetR (Proteína represora) al promotor de IbpAB. En estrés, producimos tetR
tetR es una proteína represora que se une al operador TetO, al estar junto al promotor para polimerasa T7, inhibe su unión y no deja que se junte para transcribir.
Usaron una tetR con un tag de degradación para reducir su vida media 
Si no se une la polimerasa no se transcribe GFP
Se reduce el estrés y se deja de producir tetR, dentro de poco tiempo es degradada 
Se vuelve a activar el promotor y se comienza a transcribir GFP
Al final quedaron 2 plásmidos:
Uno (pET23b_TetO) con el gen para hacer RNA polimerasa T7 bajo el PLac, un promotor PT7_TetO para pol T7 (Promover transcripción) seguido de tetO (Donde se une tetR) y luego el espacio para el gen de rProt (Proteína recombinante), en este caso, el gen de GFP mutada (para formar cuerpos de inclusión). Y resistencia a ampicilina.
Otro (pNF_TetR) con promotor mutado de PIbpAB (Para que se active al haber cuerpos de inclusión) con la proteína represora tetR. Y resistencia a cloranfenicol.
Experimentos
Integración del operador Tet y promotor de estrés (Fig.2)
Se insertó el operador Tet en el vector pET a dos bp de distancia del promotor de T7. Se comparó la diferencia de producción de GFP entre plásmido pET23 sin TetO (Gris) y plásmido pET23 con TetO (Gris oscuro) y descubrieron que no afectaba. (Esto porque necesita que haya tetR para que haya represión).
En contraste, cuando pusieron TetR con un Promotor de arabinosa en un segundo plásmido para ver qué tanto inhibía la producción de GFP sí hubo resultados significantes. 
IPTG dispara producción de de polimerasa T7, lo que aumenta la producción de GFP
Cuando agregaban arabinosa se empezaba a producir TetR y detenía producción de GFP
Barra gris sin TetO, Barra negra con TetO.
PIbpAB se activa bajo el estrés causado por los cuerpos de inclusión. Para ver qué tanto se activaba con la producción de GFP, pusieron RFP en un plásmido con el promotor de IbpAB y comprobaron que la producción de GFP activaba PlbpAB
Barra gris agregando IPTG para promover GFP. Barra negra sin IPTG.
Expresión basada en retroalimentación
Pusieron el gen de tetR bajo el control del promotor PIlbAB salvaje y esto nos dio el plásmido pNF_TetR. Se analizó qué tanto inhibía al primer plásmido y nos dio una reducción en la cantidad de GFP producida con respecto a donde no estaba el segundo plásmido (más del 70%). Esto es indeseable porque disminuía demasiado la producción. Entonces hicieron mutaciones en el sitio de unión al ribosoma de la proteína y en el promotor PIbpAB para que fueran menos afines y se produjera menos TetR
A) Análisis de producción de GFP sin el sistema represor
B) Promotor WT con strong RBS. Sistema normal
C) Promotor mutante m3_2 con strong RBS
D) Promotor mutante m4_5 con weak RBS: este fue el bueno al final
Entre más fuertes los RBS y el promotor tenemos más producción de TetR y por lo tanto baja más la de GFP
En la figuritas chiquitas tenemos la respuesta del promotor PIbpAB al estrés producido por GFP. Lo midieron porque pusieron RFP junto a TetR con las mutaciones en el promotor y en el RBS.
Gris – Promotor WT. Negro – Promotor mutante
En todos a las 2 horas pusieron IPTG para aumentar la producción de GFP.
Influencia del stress feedback system en la solubilidad de las proteínas
Cuando el estrés provoca la producción de TetR, detiene la producción de GFP en lo que baja el estrés, esto le da oportunidad a las chaperonas de procesar las proteínas que ya se han producido.
No FB - Sin feedback system. 
Produce más proteína pero a la vez la mayor cantidad de proteína insoluble. No produce TetR porque no tiene ese segundo plásmido
WT FB-1 y 2- RBS y PIbpAB WT, sin modificaciones variaciones debido a los clones. Alguno de los de abajo (Figura 1s).
mFB-1 – Mutación 3_1 en el promotor PIbpAB y strong RBS
mFB-2 – Mutación (supongo que la misma 3_1 para comparar efecto del RBS) y weak RBS
Figurita en C, comparación de SDS PAGE de muestra sin GFP y con GFP, y en cada uno la cantidad soluble y la insoluble. La concentración fue calculada con un software (GelAnalyzer).
B) Producción de GFP relativa al de mayor producción (Sin FB) tomado como 1.
C) De su GFP, el % que fue soluble. 
El que tuvo más soluble fue el WT-FB2 pero a la vez es el que menos cantidad de GFP produjo.
D) Western Blot de TetR mostrado de forma relativa. La menor cantidad (mFB-2) tomado como 1. 
Efecto delmedio en la producción de la proteína recombinante (GFP)
Usaron varias fuentes de carbono para ver su efecto en la producción.
M9 minimal medium (M9) is commonly used for the cultivation of bacteria. It is comprised of a M9 minimal salts base formulation that can be supplemented with various amino acids and carbon sources. Solo tiene sales, tú le pones el C.
LB (Lysogenia broth) Caldo de Lisogenia. Usa extracto de levadura como fuente de C.
A) M9 con glucosa: la glucosa inhibe el promotor Lac, probablemente por ello hay menos GFP que en B
B) M9 con glicerol
C) Medio LB: promueve el crecimiento muy rápido de la bacteria. Probablemente por ello al inicio tenemos este pico en producción que va a generar estrés, producir una respuesta fuerte del represor y posteriormente se inhibe la producción hasta que se estabiliza de nuevo el sistema.
Modelo matemático
Para calcular producción de PR con distintos cambios en el sistema, salió como esperaban
Métodos
E. coli DH5a del protocolo de Hanahaan para transformación eficiente. Se usaron para toda la clonación de plásmidos.
Método de transformación por choque térmico
E. coli BL21 tiene ARN Polimerasa T7 con promotor lac para ser inducido con IPTG. 
E. coli C41. (Descubierta por Miroux) Proviene de BL21. Tiene polimerasa T7 y mucho mayor resistencia al estrés y permite seguir produciendo proteínas. Se uso como célula host.
Medios LB y M9 con antibióticos y cloranfenicol.
Densidad óptica de los cultivos se mide a 600 nm.
In general, cells should be harvested towards the end of the log phase, using the optical density of the samples to determine when this point has been reached. Cells are routinely grown until the absorbance at 600 nm (known as OD600) reaches approximately 0.4 prior to induction or harvesting.
Mediciones de luz
GFP can be excited by the 488 nm laser line and is optimally detected at 510 nm.
Ellos la excitaron a 485 y absorbieron a 535
RFP can be excited by the 488 nm or 532 nm laser line and is optimally detected at 588 nm.
Peroxidasa de rábano. Emite cuando se oxida por PHR usando peróxido de hidrógeno como agente oxidante. Horseradish peroxidase catalyses the oxidation of luminol to 3-aminophthalate via several intermediates. Midieron a 520 nm
Para clonación usaron enzimas de restricción que compraron de New England Biolabs.
Taq Polimerasa se uso para el screening and error prone PCR, para mutar promotor PIbpAB porque no tiene actividad de proof-reading
Taq es de la eubacteria termofílica: Thermus aquaticus.
Error-prone PCR is the most efficient method to introduce random mutations by reducing the fidelity of the DNA polymerase. However, a highly efficient process is required for constructing and screening a diverse mutagenesis library since a large pool of transformants is needed to generate a desired mutant. 
Metemos cantidades desbalanceadas de tipos de nucleótido, exceso de MgCl2 y un poco de MnCl2.
Exceso de MgCl2 provoca que la polimerasa actúe muy rápido a costa de especificidad. 
Pfu polimerasa viene de Pyrococcus furiosus, 
Para otras PCR se usó PfuTurbo proofreading polymerase, que es una modificación de la Pfu, que es muy precisa y le pusieron un enhancer de ArchaeMaxxx lo que permite que se produzca mucho 
Para mutar el RBS se hizo mismatch oligonucleotide PCR.
Según entiendo al primer lo hacemos manualmente con las mutaciones deseadas y luego hacemos que copie lo demás de la secuencia original y ya tenemos nuestro gen de la proteína con la mutación en el RBS 
Para análisis de solubilidad hicieron extracciones, iniciando por lisis celular con detergentes y luego lisis sónica. Después centrifugaciones donde separaron el sobrenadante que tiene las proteínas solubles y el pellet con las insolubles. 
El pellet se resuspendió y a ambos se les hizo SDS PAGE (SDS- Poly Acrilamide Gel Electrophoresis)
Se escanearon los geles con el software GelAnalyzer para conocer tamaños (distancia del pozo) y cantidad (intensidad de la banda).
Para el western de TetR blotearon a una membrana de PVDF (Fluoruro de polivinilideno), se bloqueó (Con TBS, Tween 20 y suero bovino). Se detecto TetR con suero de anticuerpo policlonal anti TetR de conejo conjugado con peroxidasa de rábano.
IPTG vs Lactose
IPTG (Isopropil-B-1-tiogalactopiranósido) es una exosa con un azufre en el C 1 unido a un isopropil.
 
Traditionally, inclusion bodies are solubilized using high concentration of denaturants and chaotropes like urea and guanidine hydrochloride (GdnHCl)
For proteins containing multiple cysteine residues, β-mercaptoethanol or dithiothreitol are added in these solubilization agents to reduce incorrect disulfide bonds. 
Solubilization of inclusion bodies using high concentration of chaotropes results in complete disruption of protein structure. This, in some cases, leads to aggregation of protein molecules during refolding process