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CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL UNIDAD IRAPUATO DEPARTAMENTO DE INGENIERIA GENETICA “Análisis de ideomorfos MAT en Colletotrichum lindemuthianum” Tesis que presenta QFB MÓNICA DEL CARMEN GARCÍA SERRANO Para Obtener el Grado de DOCTORA EN CIENCIAS En la Especialidad de Biotecnología de Plantas Directora de Tesis: Dra. June K. Simpson Williamson Irapuato, Gto. Abril del 2008 Índice General Índice de Tablas y Figuras ................................................................................................. iii DEDICATORIA ......................................................................................................................... v A G R A D E C I M I E N T O S ......................................................................................... vi Resumen ................................................................................................................................... 2 Abstract .................................................................................................................................. 4 1. Introducción ........................................................................................................................ 5 1.1 Genómica y proteómica aplicadas al estudio de hongos modelo ...................... 5 1.2 Saccharomyces cerevisiae ................................................................................ 5 1.3 Candida albicans ............................................................................................... 8 1.4 Neurospora crassa .......................................................................................... 11 1.5 Aspergillus spp. ............................................................................................... 14 1.6 Magnaporthe grisea ......................................................................................... 16 1.7 Fusarium spp ................................................................................................... 17 1.8 Ustilago maydis ............................................................................................... 17 1.9 Estudios genómicos comparativos entre diferentes hongos ............................ 19 1.10 Hongos fitopatógenos como modelo de estudio ............................................ 22 1.11 Colletotrichum lindemuthianum como modelo de estudio .............................. 23 2. Antecedentes ............................................................................................................... 25 2.1 Reproducción asexual en hongos .................................................................... 25 2.2 Reproducción sexual en Ascomicetos ............................................................ 26 2.3 Reproducción sexual en Basidiomicetos ........................................................ 40 2. 4 Reproducción sexual en especies del género Colletotrichum ........................ 41 2.4.1 Biología del género Colletotrichum .................................................................... 41 2.4.2 Regulación genética del desarrollo sexual en el género Glomerella ........... 43 2.4.3. Reproducción sexual en Colletotrichum lindemuthianum ............................. 50 3. Objetivos ............................................................................................................................ 58 3.1 Objetivo General .............................................................................................. 58 3.2 Objetivos Específicos....................................................................................... 58 3.2.1 Clonar el ideomorfo MAT1-2 de de las cepas heterotálicas MU03 y DGO02 de C. lindemuthianum .................................................................................................... 58 3.2.1 Analizar las secuencias del ideomorfo MAT1-2 clonadas. ........................... 58 3.2.2 Determinar el patrón de segregación del ideomorfo MAT1-2 en la progenie obtenida en la cruza de las cepas heterotálicas. ....................................................... 58 3.3.3 Analizar la expresión del ideomorfo MAT1-2 bajo diferentes condiciones de crecimiento. ................................................................................................................ 58 4. Materiales y Métodos ............................................................................................... 59 4.1 Cepas y medios de cultivo. ........................................................................... 59 4.2 Extracción de DNA. (modificado de González-Chavira y col., 1998). ............ 59 4.4 Amplificación de la caja HMG de otros aislados. ....................................... 61 4.5 TAIL-PCR. ....................................................................................................... 61 4.6 Clonación del fragmento de 2 Kb. ................................................................ 63 4.7 Hibridación Southern. ................................................................................... 64 4.8 Análisis de segregantes. ............................................................................... 65 4.9 Extracción de RNA......................................................................................... 65 4.10 Hibridación Northern. .................................................................................. 67 4.11 RT-PCR y análisis de intrones. ................................................................... 67 5. Resultados ..................................................................................................................... 68 5.1 Amplificación de la caja HMG en las cepas parentales. ............................. 68 5.2 Amplificación por PCR de la caja HMG de otros aislados. ........................ 69 5.3 TAIL-PCR. ....................................................................................................... 69 5.3.1 Análisis de la caja HMG. ............................................................................. 73 5.4 Hibridación Southern. ................................................................................... 76 5.5 Análisis de segregantes. ............................................................................... 76 5.6 Análisis de expresión del gen MAT1-2-1. .................................................... 77 5.7 RT-PCR. .......................................................................................................... 79 6. Discusión ........................................................................................................................ 82 6.1 Amplificación de la caja HMG. ...................................................................... 82 6.2 TAIL-PCR. ....................................................................................................... 84 6.3 Hibridación Southern. ................................................................................... 88 6.4 Análisis de segregantes. ............................................................................... 88 6.5 Expresión del gen MAT1-2-1. ........................................................................ 88 6.6 Presencia de Intrones. ................................................................................... 89 7. Conclusiones ............................................................................................................... 90 8. Perspectivas ................................................................................................................. 91 9. Apéndice ............................................................................................................................. 93 9.1 Obtención de núcleos de C. lindemuthianum ............................................. 95 9.2 Obtención de protoplastosde C. lindemuthianum ..................................... 95 9.2.1 Protocolo A para la obtención de protoplastos ......................................... 96 9.2.2 Protocolo B para la obtención de protoplastos ......................................... 98 9.3 Obtención de DNA de alto peso molecular ............................................... 101 9.4 Preparación de los vectores de clonación y transformación .................. 106 9.5 Bioensayos en hipocotilos ......................................................................... 108 9.6 Producción de apresorios ........................................................................... 109 9.7 Conclusiones ............................................................................................... 111 10. Referencias ............................................................................................................... 112 11. ANEXOS .......................................................................................................................... 120 ANEXO 1 ............................................................................................................. 120 Artículo Publicado en Mycologia .......................................................................... 120 ANEXO 2 ............................................................................................................. 121 Artículo Publicado en Mycoscience ..................................................................... 121 iii Índice de Tablas y Figuras Figura 1. Reproducción asexual de S.cerevisiae 25 Figura 2. Reproducción sexual en ascomicetos filamentosos 27 Figura 3. Formación de ascosporas 27 Figura 4. Ciclo de vida de S. cerevisiae 29 Figura 5. Locus MAT en S. cerevisiae 30 Figura 6. Activación-inactivación de los genes del desarrollo sexual en S. cerevisiae 31 Figura 7. Acción de las feromonas en S. cerevisiae 32 Figura 8. Reproducción sexual en N. crassa 34 Figura 9. El locus MAT en las cepas de N. crassa 34 Figura 10. Locus MAT de cepas heterotálicas de P. anserina 36 Figura 11. Locus MAT de cepas heterotálicas deG. Fujikoroi 37 Figura 12. Organización de los genes de del locus MAT en especies homotálicas de S. macrospora 38 Figura 13. Organización del locus MAT en una especie homotálica de C. heterostrophus 39 Figura 14. Ciclo de vida de U. maydis 40 Figura 15. Representación de la organización de los loci MAT en Ustilago maydis 41 Figura 16. Diferentes frutos con antracnosis 42 Figura 17. Modelo de Wheeler 46 Figura 18. Diferentes partes de la planta de frijol infectadas con C. lindemuthianum 51 Figura 19. Peritecios, ascas y ascosporas de C. lindemuthianum 56 Figura 20. Estrategia utilizada para amplificar la caja HMG 61 Tabla 1. Inciadores utilizados para amplificar la caja HMG 61 Figura 21. Localización de los iniciadores utilizados para la primera reacción TAIL-PCR 62 Tabla 2. Iniciadores utilizados en TAIL-PCR 62 Tabla 3. Iniciadores universales para TAIL-PCR 62 Figura 22. Localización de los iniciadores utilizados para realizar la segunda reacción TAIL-PCR 63 Figura 23. Localización de los iniciadores utilizados para amplificar el fragmento de 2 Kb 64 Tabla 4. Iniciadores utilizados para amplificar el ideomorfo 64 Figura 24. Geles que muestran los productos de PCR utilizando iniciadores degenerados y específicos 68 Figura 25. Amplificación de caja HMG de diferentes aislados 69 Figura 26. Esquema de la posición de los marcos de lectura abiertos e intrones en las cepas parentales 71 Figura 27. Alineamiento de secuencias de aminoácidos iv del ideomorfo MAT1-2 en las cepas parentales 72 Figura 28. Comparación de aminoácidos de los ideomorfos MAT1-2 de C. lindemuthanum y C. gloeosporioides 73 Figura 29. Alineamiento de las cajas HMG de diferentes hongos pertenecientes al género Colletotrichum 74 Figura 30. Dendrograma obtenido al analizar las secuencias HMG de diferentes ascomicetos 75 Figura 31. Hibridación tipo Southern en cepas parentales 76 Figura 32. Hibridación tipo Southern en segregantes 76 Tabla 5. Análisis de Chi cuadrada 77 Figura 33. Crecimiento de cepas parentales 78 Figura 34. Expresión del gen MAT1-2-1 79 Figura 35. Comprobación de la presencia del intrón 1 80 Figura 36. Comprobación de la presencia de los intrones 2 y 3 81 v DEDICATORIA A l a m e m o r i a d e M i t i t u A m i f a m i l i a A l o s t r e s a m o r e s d e m i v i d a vi A G R A D E C I M I E N T O S Agradezco al CONACYT el apoyo brindado para la realización de este trabajo y durante el transcurso del Doctorado. Agradezco a CONCYTEG el apoyo otorgado al final del doctorado. Agradezco infinitamente a la Dra. June Simpson su apoyo y paciencia, a todos los doctores integrantes del comité de sinodales, especialmente al Dr. Plinio Guzmán Villate. Agradezco a todo el personal del CINVESTAV por que sin su apoyo, los estudiantes no podríamos trabajar: intendencia, mantenimiento, centro de información, departamento de cómputo, almacén, cafetería, enfermería, invernaderos, transferencia, preparación de medios de cultivo, secuenciación. Agradezco el apoyo laboral y moral brindado por mis compañeros de laboratorio, todos los buenos momentos de chistes, albures, reuniones, pachangas, seminarios, en fin, todos esos bellos momentos que quedarán en mi mente y en mi corazón. De forma muy especial, agradezco a Katy, Emy, Cori y Jazmín por la ayuda en la última fase. También quiero agradecer el apoyo técnico brindado por Pedro Martínez, Jimena Carrillo, Diana Mendoza, Fernando Hernández y Rosy; pero mucho más agradezco que me permitan ser su amiga. Agradezco la amistad que encontré en todos mis compañeros de generación, seremos amigos por siempre. Agradezco a mi familia, incluyendo además de papá y hermana a suegros, cuñados y cuñadas. Agradezco de especial forma el apoyo y la amistad brindados por las autoridades y amigos de la Universidad Latina de México: Ing. Ramón Lemus, Lic. Carlos Lemus, Dr. Rafael Lemus, Dr. Salvador Oliveros, Dr. Juan Manuel López Escalante y Dr. Gerardo J. Melesio Macías. Necesitaría muchas páginas para poder plasmar el agradecimiento que le debo a mi más grande amor, Pilo, mil gracias por todo el amor, la paciencia, los buenos, mejores y excelentes momentos, gracias por toda la vida. 2 Resumen Colletotrichum lindemuthianum es un hongo patógeno del frijol común, Phaseolus vulgaris, que puede llegar a terminar con la cosecha si encuentra las condiciones adecuadas para su desarrollo. Se ha registrado que los aislados del hongo obtenidos de diversas localidades geográficas de México, presentan una alta variabilidad genética, a pesar de que no se ha reportado que C. lindemuthianum tenga reproducción sexual de forma natural. En el presente trabajo se estudiaron a nivel molecular los genes que controlan la reproducción sexual de los hongos filamentosos, denominados ideomorfos MAT en dos aislados del hongo que llevaron a cabo la reproducción sexual. Solamente se encontró la presencia del ideomorfo MAT1-2 en ambas cepas parentales. Al estudiar el DNA de las cepas parentales por técnicas basadas en PCR, se obtuvo una secuencia de 2 Kb que contenía el dominio HMG, característico en todos los ideomorfos MAT1-2 de los ascomicetos filamentosos. Se localizaron varios marcos de lectura abiertos, uno de los cuales presentó alta homología con el gen MAT1-2-1 de varias especies pertenecientes al género Glomerella (teleomorfo de Colletotrichum) y con el de otros ascomicetos filamentosos. En la secuencia obtenida se encontraron tres posiblesintrones. Mediante RT-PCR se determinó si estos posibles intrones eran procesados como tales, lo cual se confirmó además mediante técnicas de secuenciación. Debido a que la secuencia del dominio HMG es utilizada como herramienta filogenética, se utilizó la secuencia obtenida para las cepas parentales y las secuencias de este dominio reportadas para otros hongos pertenecientes al mismo género y a la misma clase; se obtuvo un dendrograma en el que se confirmó la relación filogenética de C. lindemuthianum dentro del género Glomerella y de este género con los demás ascomicetos filamentosos. Luego de realizar hibridaciones tipo Southern tanto en las cepas parentales como en las segregantes, se concluyó que el gen MAT1-2-1 se encuentra en ambas cepas parentales, que es de copia única en ambas y se confirmó mediante un marcador RFLP la segregación 1:1 del gen, esperada para la progenie de individuos haploides que llevaron a cabo una cruza sexual. Finalmente se realizaron ensayos preliminares para probar algunas condiciones que podrían 3 modificar la expresión del citado gen. Se observó que la expresión del gen se ve afectada por los componentes del medio de cultivo y por la presencia de la cepa complementaria. 4 Abstract Colletotrichum lindemuthianum is a fungal pathogen of common bean, Phaseolus vulgaris which is capable of destroying a complete harvest under adequate developmental conditions. Reports indicate that isolates of this fungus obtained from different geographical regions within Mexico show high levels of genetic variability, even though sexual reproduction under natural conditions has never been observed for C. lindemuthianum. In the present work, the MAT idiomorph which controls sexual reproduction in filamentous ascomycetes was studied at the molecular level. Only the idiomorph MAT 1-2 was found in both parental isolates. Analysis of the genome of both parental isolates using PCR based methods identified a 2Kb DNA sequence containing the HMG domain characteristic of the MAT1-2 idiomorph of filamentous ascomycetes. Several open reading frames were identified, one of which encoded a protein with strong homology to the MAT1-2-1 gene of fungi from the genus Glomerella (teleomorph of Colletotrichum) and to that of other filamentous ascomycetes. Three putative introns were determined within the sequence and these were confirmed by RT-PCR and sequencing analysis. Since the HMG domain has been used as a phylogenetic tool, this sequence was used to construct a dendrogram comparing the HMG sequences of members of the same genus and class. This analysis confirmed the phylogenetic relationship of C. lindemuthianum within Glomerella and of this genus within the filamentous ascomycetes. Analysis of the genomes of the parental isolates showed the presence of MAT1-2-1 in a single copy in both parents with a 1:1 segregation in the progeny based on RFLP analysis, confirming the expected Mendelian ratio for haploid individuals obtained from a sexual cross. Finally preliminary experiments were carried out to test certain conditions which could modify the expression of MAT1-2-1. It was found that different growth media and the presence of the complementary strain both affected expression. 5 1. Introducción 1.1 Genómica y proteómica aplicadas al estudio de hongos modelo El Phylum Ascomycota representa el más grande y diverso del reino Fungi, sus miembros ocupan diferentes nichos alrededor del globo terráqueo. Muchos ascomicetos tienen importancia económica, agrícola o médica y por ello han servido como modelos en las investigaciones científicas. Por otra parte, algunos basidiomicetos también se han tilizado por años como modelos para la investigación en biología celular, desarrollo, dimorfismo y patogénesis. Gracias al desarrollo de la genómica y proteómica en hongos modelo, ahora se conoce más sobre las funciones de los genes y sus productos y se pueden realizar estudios comparativos entre estos genomas. A continuación se resumirán los resultados de algunas publicaciones recientes realizadas en hongos utilizados como modelo de estudio, para apreciar los avances provocados por el desarrollo de la genómica y la proteómica. 1.2 Saccharomyces cerevisiae Uno de los hongos que más se ha estudiado desde hace muchos años es el hemiascomiceto Saccharomyces cerevisiae. La “simbiosis” entre este hongo y el hombre ha resultado muy valiosa, primero por su importancia a nivel de la industria de las bebidas y los alimentos, después por la facilidad de cultivarlo en el laboratorio, utilizando medios sencillos y obteniendo el crecimiento y la reproducción de las colonias en poco tiempo y también por la producción de proteínas y algunas pequeñas moléculas usadas como drogas. Así durante años se han obtenido mutantes, se describieron vías metabólicas, se mapearon genes, y se hicieron estudios de microscopía antes que en ningún otro microorganismo. Inicialmente se realizaron un gran número de estudios bioquímicos y bioenergéticos, pero a medida que éstos se desarrollaban, quedaban expuestas las bondades que este modelo ofrecía para realizar análisis de biología celular, división celular, genética y biología molecular. Una muestra del impacto que esta levadura ha causado dentro de la biología es la secuenciación completa de su genoma en 1996, siendo el primer eucariote con el genoma secuenciado (Goffeau y col., 1996) 6 S. cerevisiae posee un genoma pequeño, solamente una cuantas veces mayor que el de Escherichia coli y 200 veces menor que el de células de mamífero. Como resultado del análisis de la secuencia del genoma de S. cerevisiae, se localizaron un total de 6,183 marcos de lectura abiertos y se predijo que de éstos, 5,800 correspondían a genes que codifican para proteínas. A diferencia de los genomas de organismos multicelulares, el genoma de la levadura es muy compacto, dado que el 72% de la secuencia corresponde a secuencias codificantes. Aproximadamente el 30% de los genes se han caracterizado experimentalmente, mientras que del 70% restante, cuya función no se conoce, aproximadamente la mitad contiene al menos un motivo de algún tipo de proteínas ya caracterizadas, o corresponden a genes que codifican para proteínas estructuralmente relacionadas con productos génicos ya caracterizados en levadura o en otros organismos (Kolkman y col., 2005). La secuenciación del genoma de este hemiascomiceto ha constituido un recurso de gran valor para el análisis de la función y arquitectura genómica. Así mismo, esta experiencia facilitó y propició el desarrollo de proyectos involucrados en la secuenciación de genomas de una gran variedad de organismos eucariotes, incluyendo el proyecto del genoma humano. Actualmente existe un alelo mutado para cada gen que se ha caracterizado en S. cerevisiae y se han descrito cientos de bancos de datos y análisis computacionales. Sin embargo, existen un poco más de 1000 genes que aun no se han caracterizado en este hemiascomiceto (Peña-Castillo y Hughes; 2007). Hay una gran variedad de factores que contribuyen a que exista un número grande de genes de levadura no caracterizados, entre ellos la redundancia genética, la carencia de un fenotipo notable y la posibilidad de que no todos ellos sean reales. Muchos de estos genes aun no caracterizados pueden estar involucrados en la respuesta a las condiciones ambientales, a respuestas metabólicas, o a estilos de crecimiento que no son las que se utilizan de forma rutinaria en el laboratorio. La facilidad con la que se puede estudiar el genoma de la levadura, la cantidad de manipulaciones genéticas y la metodología disponible en este sistema han llevado al desarrollo de métodos para analizar DNA y proteínas no sólo de la levadura sino de otros organismos. En los 7 últimos años se han desarrolladodiferentes estrategias para analizar el proteoma, el transcriptoma y otros grupos de proteínas de Saccharomyces cerevisiae. Dos de las metodologías más usadas por los científicos en el análisis protéico global son la electroforesis en gel de dos dimensiones y la cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (Kolkman y col., 2005). También se han elaborado mapas subproteómicos, como los mapas de mitocondrias de levaduras los cuales son herramientas poderosas para los investigadores que trabajan con estos organismos, pues pueden comparar los geles de sus estudios con los que se han reportado. La expresión cuantitativa de proteínas es una parte crucial de la proteómica y requiere métodos que brinden agudeza y reproducibilidad en la expresión diferencial de las proteínas de dos o más muestras biológicas. Posiblemente la utilidad más preciada de haber desarrollado todas estas tecnologías para estudiar el genoma de S. cerevisiae es el poder analizar estudios comparativos, en virtud de su uso como modelo de estudio. El análisis de los genes de S. cerevisiae, sus productos y las funciones de éstos pueden ser un buen elemento de predicción sobre la función de los genes de otros eucariotes, pues por ejemplo, cerca del 50% de los genes humanos tienen homólogos en esta levadura (Bassett, 1996). Posteriormente se presentarán los resultados de algunos de estos estudios comparativos en los que el genoma de este hemiascomiceto ha jugado un importante papel. Como ya se mencionó, el desarrollo de la genómica en los hongos comenzó con la secuenciación del genoma completo de S. cerevisiae en 1996. Sin embargo, este genoma brindaba solamente información limitada con respecto a los miembros del reino Fungi. La subsiguiente secuenciación del genoma de S. pombe dejó en evidencia las limitaciones de las levaduras para realizar una aproximación a otros hongos. En el año 2000 diversos consorcios privados y públicos consolidaron la Iniciativa del Genoma de los Hongos, cuya meta principal fue la secuenciación de diferentes miembros del reino. Desde entonces los genomas de 23 hongos diferentes se han publicado a través de este consorcio. Además, otras instituciones han trabajado en la secuenciación del genoma de otros hongos, de tal manera que hasta 8 el 2006 había 42 genomas de hongos secuenciados con acceso público (Galagan y col., 2005; Arvas y col., 2007). Usando la metodología basada en arreglos genéticos, Tucker y Fields (2004), investigaron la sensibilidad de 4,800 cepas de levaduras haploides, cada una conteniendo una deleción en un gen diferente, usando el ibuprofeno y otras tres drogas como parte del medio en el que crecían las levaduras y encontraron que una concentración de 50 M de ibuprofeno inhibe el crecimiento de las cepas silvestres. Observaron que la mutación en uno de los 7 genes involucrados en la biosíntesis de triptofano confiere alta sensibilidad al ibuprofeno. Por otra parte, utilizando el método de arreglos genéticos Baetz y col. (2004) analizaron 5,000 mutantes de levadura heterocigotas para probar su sensibilidad a un compuesto utilizado como inhibidor de metástasis (dihidromotuporamina C) e identificaron 21 mutantes que presentan gran sensibilidad a la droga. Establecieron que estas mutantes son heterocigotas para dos pasos en el metabolismo de esfingolípidos directamente. 1.3 Candida albicans Candida albicans es el principal hongo patógeno en humanos, existe como comensal en muchos individuos sin producir patología alguna, pero puede causar infecciones en pacientes inmunocomprometidos. La invasión de este hongo a los tejidos humanos se correlaciona con cambios en la inmunidad del hospedero y con cambios en las características físicas de su nicho habitual (cirugías, por ejemplo). La clave para entender la patogenicidad de este hongo está en estudiar los procesos regulatorios que definen la transición de ser un comensal para ser un patógeno. El genoma de C. albicans tiene 8 cromosomas, el tamaño de su genoma haploide es de 14, 851 kilobases, contiene 6,419 marcos de lectura abiertos, 20% de los cuales no tienen homólogos en las secuencias reportadas para otros organismos (Odds y col., 2004). Presenta un gran repertorio de genes homólogos a los que se ha predicho que intervienen en los estados esenciales de la meiosis en S. cerevisiae (Tzung y col., 2001). El genoma de C. albicans tiene una gran similitud con el de S. 9 cerevisiae en el número de familias de genes y en el número de genes, pero C. albicans tiene más genes relacionados con su capacidad metabólica y tiene una cantidad significante de DNA repetido. Existen cepas que presentan cambios en su cariotipo y también en su fenotipo colonial (número de cromosomas, pérdida de heterocigocidad). La mayoría de los genes requeridos para llevar a cabo la meiosis por S. cerevisiae están presentes en C. albicans, (Magee y Magee 2005). Alrededor de la mitad de los genes predichos contienen diferencias alélicas y dos terceras partes de estas diferencias terminan alterando la secuencia de la proteina. El genoma de C. albicans tiene secuencias de trinucleótidos repetidas en tandem localizadas dentro de las regiones codificantes. Más de 1000 genes que no tienen una función tampoco tienen homólogos en S. cerevisiae o en S. pombe y esto puede ser por que estén involucrados en el proceso de infección, por lo que es muy posible que el genoma de C. albicans contenga la información que le ha permitido permanecer como patógeno en el humano y lidiar con la respuesta inmunológica y con otra microflora (Odds y col., 2004). Hablando de la infección localizada causada por C. albicans, se han publicado numerosos estudios en los que se analiza la expresión de los genes o las proteínas durante el proceso de infección, algunos de estos genes están asociados a cambios importantes a nivel celular como la morfogénesis. Estos estudios se han enfocado en predecir factores de virulencia y han utilizado para ello todas las técnicas basadas en la PCR y en Inmunohistoquímica y han permitido concluir que los genes que codifican los factores de virulencia son específicos en diferentes estadios y tipos de infección. Hube y col. (Tewes S y col., 2007) con la finalidad de definir genes que estuvieran específicamente asociados con la invasión del tejido del hospedero, compararon el genoma de una cepa no invasiva con el de una cepa invasiva de C. albicans y examinaron cambios temporales en el transcriptoma durante el proceso de invasión. Varios estudios han examinado el transcriptoma en C. albicans durante la fagocitosis por neutrófilos, por macrófagos, la exposición a sangre humana y a diferentes fracciones de ésta, la invasión del epitelio humano, la infección del riñón y del peritoneo en ratones. En todos estos estudios se ha mostrado que la células de 10 C. albicans alteran su metabolismo para poder asimilar nutrientes y protegerse de las defensas del hospedero. Dichos resultados se han confirmado con un reciente estudio de microarreglos (Zakikhany y col., 2007). Otros trabajos de microarreglos sugieren que el hongo tiene cambios significantes en el metabolismo del carbono luego de la exposición al hospedero, lo cual se ha confirmado al estudiar diferentes mutantes (Fradin C y col., 2005; Tewes S y col., 2007). Por otra parte, los genes involucrados en la asimilación de hierro y fosfato se encuentran sobre-expresados durante el desarrollo de la infección (Tewes S y col., 2007). El análisis de la expresión del genoma completo también ha reforzado la observación de que la adaptación al estrés es esencial para la virulencia de C. albicans. Todos los análisis genómicos realizados, concluyen que además de tener bien regulados los genes que intervienen en la virulencia, C. albicans tiene un control fino sobre los genes involucradosen el metabolismo y en la regulación de la respuesta al estrés en nichos biológicos de hospederos específicos (Brown y col.,2007). Por otra parte, la genómica funcional brinda una ayuda poderosa para definir el modo de acción de las drogas, pues ofrece un panorama del impacto de una droga sobre la célula del hongo. Algunos investigadores han desarrollado las técnicas de reemplazamiento de genes y expresión condicional en C. albicans y estas mismas tecnologías se han trasladado a otras especies de Candida con el mismo éxito. También se ha llevado a cabo el análisis del efecto global de una droga en la expresión génica tanto a nivel del transcriptoma como del proteoma. Analizando el transcriptoma se ha observado que el ketoconazol afecta la expresión de genes involucrados en el metabolismo de lípidos, ácidos grasos y esteroles así como un inhibidor de la 1-3 glucanosintasa que influye en la expresión de los genes involucrados en la síntesis de la pared celular. De esta forma se puede evaluar el mecanismo de acción de nuevos compuestos antifúngicos y qué genes son regulados en respuesta a la droga (Liu y col., 2005; Bruneau y col., 2003). Existe un trabajo reciente sobre la tipificación de secuencias multilocus en el que C. albicans es una de las cepas más importantes. Este trabajo se basa en el análisis de siete fragmentos de genes “Housekeeping” (Brougnoux y col., 2003); ha confirmado 11 que las cepas de este hongo sufren una microevolución mientras se desarrollan en el paciente (Odds y col., 2006). En el aspecto del diagnóstico clínico, Pitarch y col., (2006) han combinado las técnicas proteómicas y bioinformáticas para analizar el inmunoma de C. albicans (proteinas de la pared celular que pueden interactuar con el suero de pacientes con candidiasis sistémica) y han reportado una cantidad significantemente elevada de anticuerpos contra la 1-3 glucosidasa en estos pacientes. La detección de estos anticuerpos representa una forma eficiente de diagnóstico en pacientes con candidiasis sistémica (Pitarch y col., 2006). A pesar de que se han comenzado a desarrollar todas estas nuevas tecnologías en el estudio de Candida albicans, aun no se han creado drogas antifúngicas para uso clínico a través de la genómica, sin embargo esta ciencia brinda una base sólida tanto para estudiar los mecanismos de adaptación del hongo a los compuestos atifúngicos como para la creación de nuevas drogas y para tener nuevas herramientas para el diagnóstico y el pronóstico en las infecciones sistémicas causadas por especies de Candida. 1.4 Neurospora crassa Cuando se empezaron a obtener los primeros resultados de los estudios de genómica y proteómica de levaduras, se comprendió que existían genes, proteinas y procesos que presentan los ascomicetos filamentosos que no estaban presentes en las levaduras. Por otra parte, desde hace mucho tiempo se ha tenido como modelo de estudio al ascomiceto filamentoso Neurospora crassa, debido a la facilidad de estudiar los productos de la meiosis mediante el análisis de tétradas, por lo que realizar los estudios de genómica en este hongo presentaba una gran oportunidad para el estudio del resto de los ascomicetos filamentosos. El genoma de N. crassa fue el primero en ser secuenciado entre los ascomicetos filamentosos. Tiene una longitud total de 39.9 Mb, presenta 10,082 genes que codifican para proteínas, con 12 un promedio de 3.7 Kb por gen y un promedio de 1.7 intrones por gen y 134 pb por intrón en promedio. 1,421 genes coinciden con proteínas vegetales o animales (Galagan y col., 2003). Presenta el 46% de proteínas hipotéticas conservadas, el 41% de proteínas no presentan similitud y el 13% tienen semejanza con secuencias conocidas (Borkovich y col., 2004). 584 de las proteínas predichas no tienen homólogos en S. cerevisiae o S. pombe, se cree que estas proteínas deben estar relacionadas con el crecimiento de la hifa y con la formación de estructuras del desarrollo multicelular, pues estas características no se encuentran en las levaduras, lo que sugiere que puede ser un mejor modelo para el estudio de eucariotes superiores en muchos aspectos de biología celular. Se han identificado genes de diez distintos receptores transmembranales acoplados a proteinas G (Borkovich y col., 2004). Los genes que codifican para los elementos que constituyen el sistema de dos componentes de Histidin-cinasas son más abundantes que en S. cerevisiae. Se han encontrado dos sensores de luz roja cuya función aun se desconoce. Muchos genes de N. crassa sólo tienen homólogos en procariotes, posiblemente por que el hongo ha ocupado el mismo nicho ecológico y requiere estos genes para la degradación del sustrato y el metabolismo secundario. Esta también puede ser la razón principal para el relativamente grande número de genes involucrados en catabolismo, desintoxicación química y mecanismos de defensa ante el estrés. Al comparar el genoma de este hongo con el de A. nidulans se observa que el primero carece de genes importantes involucrados en el control de la producción de esporas asexuales, sin embargo posee el homólogo del gen que controla todo el proceso (velvet ó veA). A pesar de que N. crassa crece solamente en material vegetal decadente, posee proteínas que se han reportado en organismos fitopatógenos como la del citocromo P450. Otros dominios importantes son los que tienen semejanza con dedos de zinc, el dominio de hidrogenasa-reductasa, entre otros. El número de dominios involucrados en señalización aparece menos en comparación con otros hongos y con algunas plantas, junto con algunas helicasas y regiones de unión a RNA (Galagan y col., 2003). 13 En S. cerevisiae se han identificado siete componentes que intervienen en el punto de revisión o check point mitótico, los cuales están conservados en Neurospora. Todas las histonas excepto H4 están codificadas por genes únicos que tienen intrones, lo que es similar a otros ascomicetos filamentosos pero diferente en las plantas, que tienen muchos genes que codifican las histonas y en los de las levaduras que no tienen intrones. Al analizar las secuencias de los factores de transcripción, se encontró que el genoma de N. crassa contiene elementos de regulación similares tanto a organismos simples (eucariote unicelular) como elementos presentes en eucriotes más complejos (metazoarios), lo que indica que existen mecanismos de regulación que ya se han descrito pero también nuevos mecanismos de regulación. Se han identificado muchos genes involucrados en la meiosis y en el desarrollo del asca. De tres factores de transcripción conocidos que son específicos y están involucrados en la transcripción de genes meióticos en S. cerevisiae, sólo uno está conservado en N. crassa; sin embargo se han encontrado genes que regulan la meiosis los cuales presentan homología con genes de eucriotes superiores como ratón y C. elegans (proteinas necesarias para el control del paquiteno en la meiosis, proteinas involucradas en la adhesión, proteinas involucradas en la segregación y apareamiento de los cromosomas), por lo que se concluye que N. crassa es intermedio entre estos ecucariotes superiores y las levaduras en cuanto al control de la meiosis se refiere. Menos de la mitad de los productos génicos relacionados con la esporulación que se encuentran en S. cerevisiae están presentes en N. crasa, por lo que parece que los componentes de la señalización requerida para la esporulación están más conservados que las proteinas estructurales. Se han encontrado en el genoma de N. crassa genes que codifican para tres proteinas semejantes a las que produce C. neformans para formar su cápsula, producir patogenicidad y evadir la respuesta inmunológica mediada por macrófagos; sin embargo, no es capaz de producir cápsula debido a quecarece de otras dos proteínas necesarias para la formación de la cápsula presentes en C. neoformans (Hynes, 2003). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12801405?ordinalpos=46&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum 14 1.5 Aspergillus spp. El genoma de nueve especies de Aspergillus ha sido parcial o totalmente secuenciado. A. nidulans ha sido utilizado como modelo de estudio por muchos años. Su genoma es de 30 Mb, con 9,541 genes que codifican, con un promedio de 3, 151 pb por gen y de 3.6 exones por gen (Galagan y col., 2005). En el 2005 se publicó la secuencia del genoma completo de A. fumigatus (Nierman y col.,2005). El genoma de este importante patógeno humano consta de 8 cromosomas que van de 1.8 a 4.9 Mb. Cuenta con 9,926 genes que se predice codifican para proteínas, con una longitud promedio de 1,431 pb. Alrededor de 3,000 de los genes predichos tienen similitud con secuencias conocidas. Existen alrededor de 12 copias de genoma mitocondrial por cada genoma nuclear. Al comparar este genoma con el de A. nidulans y A. oryzae, A. fumigatus tiene alrededor de 500 genes únicos. Se han encontrado los genes involucrados en el desarrollo sexual heterotálico, los involucrados en el proceso de ensamble de la pared celular y al menos 28 grupos de genes que codifican para proteínas involucradas en el metabolismo secundario y en la producción de micotoxinas y alrededor de 128 grupos de genes involucrados en la expulsión de drogas, toxinas y macromoléculas. A. fumigatus codifica una gran cantidad de información para proteger su integridad: enzimas que responden al daño en el DNA (similares a la fotoliasa), para reparar el rompimiento de la doble hebra (también presente en S. cerevisiae y E. Coli) y contiene la mayoría de los genes involucrados en la reparación del DNA dañado que se presentan en humanos. La localización de grupos de genes involucrados en la síntesis de metabolitos secundarios en A. fumigatus está en los telómeros, en contraste con A. nidulans que se encuentra en las regiones subtelométicas (500 kb al final del cromosoma; Galagan y col., 2005). La mayoría de las regiones del genoma que agrupan genes regulatorios están asociados con la resistencia al metabolito, sin embargo, A. oryzae presenta un potencial de metabolitos secundarios mucho mayor. El análisis del genoma de A. fumigatus ha localizado grupos de genes relacionados a la síntesis de gliotoxina y a la síntesis del alcaloide ergot. Un acontecimiento sorpresivo al analizar el genoma de A. fumigatus es que parece contener todos los genes que se sabe son 15 requeridos para la reproducción sexual, sin embargo la presencia de ciclo sexual en el hongo nunca ha sido reportada. El hongo no patogénico A. nidulans es homotálico, mientras que A. fumigatus es conocido por reproducirse solamente a través de esporas mitóticas asexuales. Sin embargo, al analizar 61 genes implicados en el proceso de apareamiento o de respuesta a feromonas, se encontró que cada gen puede ser identificado en A. nidulans y en A. fumigatus. Se han reportado genes similares a precursores de feromonas y a su receptor. Curiosamente una cepa de A. fumigatus que se ha secuenciado contiene el ideomorfo MAT-2 y otra cepa que se secuenció por otro grupo de investigación contiene el ideomorfo MAT-1, lo que sugiere que pueden ser un par de cepas heterotálicas. Los estudios realizados indican que parece haber iguales cantidades de cepas con un ideomorfo y con otro, lo que deja en el aire la pregunta por qué A. fumigatus no lleva a cabo la reproducción sexual y bajo qué condiciones es posible que la realice. El genoma de A.fumigatus contiene 13 posibles genes de histidin-cinasas, comparado con 15 de A. nidulans y A. oryzae. Comparado con S. cerevisiae, S. pombe y N. crassa, posee un número mucho mayor de estos genes, lo que sugiere una gran importancia y diversidad en este sistema regulatorio en la transducción de señales en el género. Los genomas de A. fumigatus, A. nidulans y A. oryzae contien cuatro genes que codifican para MAP cinasas. Una aplicación de análisis proteómicos muestra que el crecimiento de A. fumigatus en diferentes fuentes de carbono cambia el proteoma (Kniemeyer y col., 2006). La diferencia entre las secuencias de dos cepas de A. fumigatus se encuentran localizadas en las regiones subteloméricas, en las que se han encontrado grupos de genes involucrados en la poducción de metabolitos secundarios, los cuales son de gran interés en diferentes especies de hongos (Ronning y col., 2005). Por otra parte, el genoma de A. oryzae consta de ocho cromosomas con un tamaño de genoma de 37.6 MB, mientras que el genoma mitocondrial es de 28.9 Kb. Este genoma está muy relacionado con el de A. niger y A. flavus y es 20-30% más grande que el de A. nidulans y A. fumigatus. El número total de genes codificadores para proteínas mayores a 100 aminoácidos es de 12,074. Tiene un promedio de 2.8 Kb por gen (Machida y col., 2005). Tiene una gran cantidad de genes involucrados en metbolismo y en metabolismo secundario y 16 un número significante de genes con función desconocida (8,533). El número de genes relacionados con el metabolismo es mayor que en N. crassa y que S. cerevisiae y este aumento está marcado en varias rutas metabólicas particulares: la que contiene más genes es la de degradación de fenilalanina-triptofano, la de degradación de tolueno y la síntesis y degradación de aminoácidos hidrofóbicos. El genoma de A. oryzae posee una estructura de mosaico con loci comunes a las tres especies de Aspergillus. Presenta una gran cantidad de genes relacionados al metabolismo secundario en bacterias y se sabe que la mayoría de estos genes no se expresan en condiciones normales de crecimiento (Kobayashi y col., 2007). 1.6 Magnaporthe grisea Este hongo filamentosos se ha utilizado como modelo de estudio para estudiar diversos aspectos de la patogénesis, pues es patógeno del arroz. La secuencia completa de este hongo ha sido generada recientemente, contiene 38.8 Mb, 12,841 genes (Dean y col, 2005). Este genoma codifica para un numeroso y diverso grupo de proteínas secretadas. Contiene un gran repertorio de posibles receptores acoplados a proteína G, incluyendo 61 que no se habían descrito antes. Un grupo de estos receptores posee un dominio membranal que se expande al espacio extracelular, lo que es inusual en hongos. Dos de estos genes son diferencialmente expresados durante el desarrollo del hongo en el proceso de infección, lo que coincide con el papel en la percepción antes del inicio de la infección. El genoma de M. grisea codifica para un grupo extenso de enzimas involucradas en el metabolismo secundario, lo que es consistente con la capacidad que tiene este hongo para producir metabolitos secundarios. La función precisa de estos metabolitos en la patogénesis no se ha establecido, pero interesantemente uno de los genes que codifica para una policétido-sintasa (PKS) se ha identificado como un gen de avirulencia. Se ha observado que los metabolitos secundarios producidos por el hongo juegan un papel importante en el establecimiento de la enfermedad (Caracuel- Rios y Talbot, 2007). Al analizar el transcriptoma de este hongo en dos estadios de desarrollo, el crecimiento vegetativo y la formación del apresorio, Gowda y col. 17 (2006) encontraron una gran cantidad de genes que se expresan diferencialmente en ambas condiciones. El mayor número de genes diferenciales lo encontraron durante la formación del apresorio; corresponden a genes involucrados en la modificación postranscripcional y las chaperonas. En cambio, los genes relacionados con la traducción, la estructura ribosomal y la biogénesis se expresan en mayor cantidad mientras el hongo se desarrolla como micelio. 1.7 Fusarium sppLa principal meta en la investigación de la biología molecular de los hongos de diferentes especies de Fusarium es reducir la presencia de micotoxinas en los granos de los cereales, es por eso que los esfuerzos se han enfocado a identificar aspectos de la biosíntesis de las micotoxinas y la regulación de esta biosíntesis. Con la secuenciación completa de los genomas de Fusarium graminearum, F. verticilloides y varios bancos de secuencias de expresión génica de diferentes especies de Fusarium, los investigadores de todo el mundo están trabajando para identificar genes involucrados en la biosíntesis de micotoxinas y sus genes regulatorios. Así, se han identificado siete grupos de genes involucrados en la síntesis de micotoxinas. Cuatro de estos siete grupos corresponden a policétido sintasas, lo que refleja la actividad de estos hongos en la síntesis de micotoxinas (Desjardins y Proctor, 2007). Existen otrosmuchos reportes en los que se analiza la expresión diferencial de diferentes especies de Fusarium que son fitopatógenas con un gran interés agrícola. 1.8 Ustilago maydis El uso de S. cerevisiae como modelo de estudio tiene sus limitaciones, debido a que existen ciertos procesos básicos que sólo realizan las células animales, vegetales o fúngicas, como son el transporte a larga distancia a través del citoesqueleto, la remoción de la membrana nuclear durante la mitosis, la fotosíntesis, etc. El basidiomiceto Ustilago maydis, un conocido patógeno de maíz, tiene una larga 18 historia como un organismo modelo en Biología Celular para la comprensión de conceptos básicos como los mecanismos moleculares de la recombinación. Recientemente la importancia de este hongo como sistema modelo ha incrementado, se ha estudiado y se sigue estudiando el sistema de microtúbulos del citoesqueleto durante el crecimiento polar y la mitosis, y se ha revelado que este proceso es conservado entre este hongo y los mamíferos, lo que no sucede en S. cerevisiae. Debido a su estado de vida patogénico, a los numerosos avances tecnológicos y la reciente publicación de la secuencia de su genoma (Kamper y col., 2006) y de la anotación de su proteoma, este hongo se ha establecido como un poderoso sistema modelo en la fitopatología molecular; se han descrito, clonado y secuenciado genes que codifican para enzimas involucradas en rutas de señalización relacionadas con la patogénesis, con el desarrollo sexual, el dimorfismo, etc. El genoma de U. maydis tiene 6,867 genes que codifican para proteínas, con 2.86 Kb/gen en promedio, con exones de 1,208 pb en promedio y 1.45 exones/gen. Un importante proceso biológico en el que se está utilizando U. maydis en los últimos años como modelo es la remoción de la membrana nuclear, que también sucede en los mamíferos y no en S. cerevisiae (Lippincott-Schwartz, 2002; Straube y col., 2005). Se ha observado una gran conservación en las proteínas que componen el poro nuclear tanto en U. maydis como en el humano (Munsterköter y Steinberg, 2007). Otro importante proceso biológico en el que U. maydis se utiliza como modelo de estudio es la acción de los microtúbuoos durante la mitosis (Steinberg, 2007). Analizando el proteoma de U. maydis, de S. cerevisiae y la información accesible de Homo sapiens, se ha encontrado que el proteoma de U. maydis está más relacionado al humano que al del hongo S. cerevisiae. Muchas proteinas conservadas en H. Sapiens y en U. maydis pueden asignarse a ciertos procesos celulares; sin embargo, muchas de estas proteínas tienen función desconocida, lo que indica que aun faltan procesos por descubrir que son comunes en ambos organismos (Munsterköter y Steinberg, 2007). 19 1.9 Estudios genómicos comparativos entre diferentes hongos Fitzpatrick y col. (2006), utilizaron dos tecnologías computacionales para inferir la relación existente entre 42 especies de hongos cuyo genoma se ha secuenciado y publicado. Usaron un banco de datos de 345,829 extraídos de las secuencias genómicas publicadas. Dentro del Phylum Ascomycota, los Subphylum Pezizomycota y Saccharomicota fueron resueltos. Con ambas metodologías se infierió que los Leotiomycetes son los más cercanos a los Sordariomicetes. Por otra parte, Arvas y col. (2007), realizaron la comparación computacional del genoma completo de los genes que codifican proteínas en los Subphylum Saccharomycotina y Pezizomycotina y encontraron que en éste último fila existen proteinas hay un subgrupo de familias protéicas relacionadas conla degradación de biomasa vegetal y relñacionados con elmetabolismo secundario que muestran haberse expandido recientemente. Además este Subphylum tiene un gran número de genes que están poco cracterizados con una variedad de funciones que se predicen. Estos genes están bien conservados en el Subphylum pero no muestran signos de expansión reciente. Los genes encontrados en todos los hongos excepto en el Subphylum Saccharomycotina están ligeramente mejor caracterizados y predichas las principales enzimas para las cuales codifican. Existe más cantidad de genes involucrados en la transcripción y en las funciones mitocondriales. En este análisis se puede predecir que todos los miembros del Subphylum Pezizomycota a diferencia de los del Saccharomycota pueden potencialmente producir una gran variedad de metabolitos secundarios. Un gran número de todas las enzimas que se predicen se encuentran en todos los hongos, excepto en Saccharomycotina. Hablando de diferencias entre organismos más cercanos genéticamente, Gash (2007) publicó un estudio de tres hongos modelo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Candida albicans en el que analizó las diferencias de expresión genómica de estos hongos en condiciones de estrés ambiental. Estos organismos responden con un alto grado de precisión en términos de los genes 20 afectados en cada condición y la magnitud y la cinética de la expresión cambian dependiendo de la condición a la que se someten. La respuesta al estrés ambiental se describió inicialmente en S. cerevisiae en la que alrededor de 300 genes inducían su expresión mientras que alrededor de 600 genes la reprimían en respuesta a diferentes tipos de estrés (calor, estrés oxidativo o reductivo, estrés osmótico, falta de nutrientes, daño al DNA, etc, Causton y col., 2001). Luego de haber identificado las respuestas de S. cerevisiae, Chen y col., (2003) demostraron que en S. pombe también se induce y reprime la expresión de genes en respuesta a diferentes tipos de estrés y que muchos de ellos de forma general eran los genes ortólogos a los que se presentaban en S. cerevisiae. Otras características también se conservaban como el tiempo de inicio de la respuesta. Muchos de estos genes incluyen aquellos involucrados en el metabolismo de carbohidratos, en la defensa contra las especies reactivas de oxígeno, en el metabolismo de proteínas, en la señalización intracelular y en la reparación del DNA dañado. Un número pequeño de genes se inducen en S. cerevisiae pero se reprimen en S. pombe en respuesta al estrés, como los involucrados en el metabolismo de los ácidos grasos. Al analizar lo que sucedía en el patógeno humano, Candida albicans, Enjalbert y col., (2003) publicaron que este hongo no inicia una respuesta común al estrés bajo condiciones de laboratorio; sin embargo en un estudio posterior identificaron un pequeño grupo de genes que se ven afectados durante un severo estrés, los cuales coinciden con los de S. cerevisiae (Smith y col., 2004) Aparentemente esta carencia de respuesta inicial tiene relación con el nicho específico de esta especie. En otro análisis combinatorio realizadopor Tuch y col., (2008) se estudió la proteina Mcm1, un regulador transcripcional que en combinación con cinco cofactores se une al 4% de los genes de S. cerevisiae y regulaprocesos que van del ciclo celular al apareamiento. Encontraron que en Kluyveromyces lactis y Candida albicans el circuito regulatorio es muy diferente, pues este factor de transcripción se une al 12% de los genes en K. lactis y C. albicans. Este análisis muestra que los genes regulados por Mcm1 han cambiado drásticamente a través de la evolución. Debido a las secuencias de DNA a las que se une preferencialmente, se encuentra en mayor proporción cerca de los genes que están relacionados con ella. El gen que codifica para esta proteina se encuentra 21 entre los genes que han variado considerablemente a través de las especies y se encuentra en mayor cantidad durante ciertas etapas del ciclo celular y durante el apareamiento. Sin embargo existen varias diferencias específicas de especie. Al realizar la comparación del genoma de C. albicans con el de C. dubliniensis, Morán y col. (2004), encontraron que alrededor del 4% del segundo hibrida con el primero y que los genes involucrados en la virulencia de C. albicans divergen mucho de los encontrados en C. dubliniensis, lo que explicaría la baja patogencidad de este último. De Backer y col. (2001) bservaron que más de 150 genes aumentan su expresión cuando C. albicans crece en medio con itraconazol y 100 genes la disminuyen. El cambio en el pH y la falta de hierro ocasionan un cambio drástico en la expresión genética en este hongo. Fraddin y col. (2003), también mostraron que la expresión genética también sufre un cambio cuando la cepa se incuba en sangre o plasma. En cuanto a los hongos filamentosos, a pesar de que Neurospora no se asocia íntimamente con plantas vivas, la secuencia de su genoma ha revelado la presencia de genes cuyos posibles productos son muy similares a las proteinas presentes en organismos que son fitopatógenos como Botrytis, Colletotrichum, Magnaporthe, Nectria y otros. Estos genes presentes en N. crassa tienen aparentes homólogos en M. grisea y F. graminearum, incluso se han encontrado estas proteinas en A. fumigatus. Muchas proteínas que se encuentran en otros hongos y que están relacionadas tanto con funciones de patogenicidad como de no patogenicidad también se han encontrado en N. crassa, como aquellas involucradas en la salida de compuestos tóxicos, la transducción de señales en el estrés y en la biosíntesis. Parece ser que Neurospora y Magnaporthe comparten solo el 60% de sus genes. Alrededor de 200 proteínas que se predicen para N. crassa tienen similitud significante con productos génicos humanos cuya alteración causa enfermedad. Muchas de ellas se encuentran presentes en el genoma de S. cerevisiae o de S. pombe, pero otras tantas no. Existen por lo menos dos proteínas similares a transportadores de cobre asociados con la enfermedad de Wilson en humanos. Además posee un amplio repertorio de enzimas modificadoras de histonas (Galagan y col, 2003). 22 1.10 Hongos fitopatógenos como modelo de estudio El estudio de la biología de los hongos fitopatógenos tiene una gran importancia a nivel mundial y nacional. Mientras más conocimiento se tiene de los diferentes procesos que realizan estos organismos tales como su desarrollo, la forma de reproducción, las fuentes de variabilidad, las herramientas moleculares utilizadas para causar enfermedad, entre otros; mejor pueden ser controladas las enfermedades causadas por ellos en los cultivos de importancia comercial, se reduce la utilización de productos químicos para erradicarlos y se beneficia a un gran número de países en vías de desarrollo. Como ya se revisó, existen algunos hongos filamentosos que se han utilizado por muchos años como modelo de estudio. A medida que las técnicas moleculares son accesibles a más investigadores, el número de investigaciones utilizando hongos fitopatógenos como modelo aumenta y se diversifica, pues existen procesos biológicos que no son comunes aun entre los mismos hongos fitopatógenos. Dentro de los hongos fitopatógenos, diferentes especies pertenecientes al género Colletotrichum ocupan un lugar importante a nivel mundial, pues son causantes de enfermedades en varios cultivos de importancia comercial, tales como el mango, el plátano, el aguacate, el maíz y el frijol, entre otros. Algunas de estas especies de Colletotrichum se han utilizado como modelo de estudio para conocer los mecanismos que utiliza el hongo en el proceso de infección, así como para conocer los mecanismos de defensa y reacciones que desarrolla la planta. Otras especies de este género se han utilizado como modelo de estudio en el análisis de los eventos de reproducción, mientras que otras se han utilizado para realizar estudios filogenéticos. Estas especies son entre otras C. gloesporioides, C. graminicola, C. magna, C. acutatum y C. fragarie, las cuales se utilizan en todo el mundo como modelos. Debido a que México es un productor y consumidor importante de frijol, resulta de especial interés el estudio de C. lindemuthianum, patógeno de este cultivo que puede llegar a causar pérdidas de hasta el 90% en la cosecha (Bayley, 1992; Melotto y col., 23 2000) y que además reúne las características necesarias para ser utilizado como un excelente modelo de estudio. Debido a que no se ha encontrado el estado sexual de C. lindemuthianum en la naturaleza, ha sido difícil estudiar los procesos de variabilidad y patogenicidad que se pueden realizar fácilmente en hongos que llevan a cabo reproducción sexual. 1.11 Colletotrichum lindemuthianum como modelo de estudio En el laboratorio de Genética Molecular del CINVESTAV-unidad Guanajuato, donde se realizó el presente trabajo, se ha tenido especial interés en estudiar al hongo Colletotrichum lindemuthianum, por la importancia nacional desde el punto de vista agrícola y económico, pero también por representar un candidato estupendo para estudiar los procesos de patogénesis, virulencia, avirulencia y, en el caso de este trabajo, de la reproducción sexual en ascomicetos fitopatógenos. Nuestro grupo de trabajo ha recolectado aislados de este hongo provenientes de diferentes estados del país, se han clasificado, se ha estudiado su variabilidad genética, su patogenia y la interacción que tiene con la planta. La realización del presente trabajo fue posible gracias al hallazgo reportado por nuestro grupo de dos cepas de C. lindemuthianum capaces de llevar a cabo un desarrollo sexual en condiciones de laboratorio (Rodríguez-Guerra y col., 2005). Este fenómeno ha sido reportado en contadas ocasiones y no se han realizado estudios más exhaustivos al respecto en esta especie. Una vez caracterizadas patogénicamente estas dos cepas y su progenie (Rodríguez-Guerra y col., 2005; Luna-Martínez y col, 2007), se planteó la posibilidad de analizar a nivel molecular los fenómenos que determinan el desarrollo sexual en ellas. Se pensó que la forma idónea para abordar este problema sería la que se ha utilizado en diferentes ascomicetos que llevan a cabo reproducción sexual. Como se analizará en detalle posteriormente, varias especies de ascomicetos filamentosos llevan a cabo reproducción sexual, la cual está controlada de forma general por un locus MAT con dos ideomorfos (secuencias distintas en el mismo locus). Se ha reportado que las 24 cepas sexualmente compatibles poseen cada una, uno de estos ideomorfos, los cuales pueden contener uno o más genes. En uno de estos ideomorfos invariablemente se encuentra un gen que tiene un dominio conservado denominado caja HMG (MAT2), mientras que el otro presenta por lo menos un gen con un dominio conservado denominado dominio alfa (MAT1). Diversos grupos han diseñado iniciadores específicos para amplificar por PCR estos dominios que son conservados aun entre géneros. Con base en este antecedente, se pensó utilizar los iniciadores reportados para otros ascomicetosfilamentosos, para amplificar por PCR los dominios conservados de cada uno de los ideomorfos en las cepas de C. lindemuthianum que presentan reproducción sexual. Una vez obtenida la secuencia de estos dominios, se utilizó la técnica de TAIL-PCR (Liu y col., 1995) para conocer las secuencias aledañas a ellas y de esta forma clonar y analizar el o los genes involucrados en el desarrollo sexual de este hongo. En el presente trabajo se muestran y discuten los resultados obtenidos luego del análisis de estas secuencias. Además se realizaron análisis preliminares de la expresión de estos genes y de la segregación de ellos en la progenie obtenida de la cruza mencionada. Con las secuencias obtenidas al amplificar la región conservada HMG se realizó un análisis filogenético, herramienta que se ha utilizado en diversos ascomicetos del género Colletotrichum como instrumento de clasificación (Vaillancourt y col., 2000). 25 2. Antecedentes 2.1 Reproducción asexual en hongos Los hongos son organismos que pueden reproducirse utilizando diferentes mecanismos. Uno de estos mecanismos es la reproducción vegetativa, en la que no se requiere del apareamiento de dos células sexualmente compatibles. Durante la reproducción vegetativa en los hemiascomicetos, el material genético se duplica, se lleva a cabo la mitosis y la célula hija emerge de la célula madre por gemación (Snustad y Simmons, 2006; Figura 1). Figura 1. Ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae. Sólo se muestra el desarrollo vegetativo del hogo: la célula madre produce una célula hija por gemación. (Lodish y col, 2006). En el caso de los ascomicetos filamentosos una hifa crece, replica su material genético y forma células nuevas mediante la mitosis. Bajo ciertas circunstancias, la hifa forma estructuras especializadas, denominadas conidióforos o acérvulos, produce conidias que al ser liberadas al medio darán lugar a nuevas hifas (Nauta y Hoekstra, 1992). 26 En los basidiomicetos se lleva a cabo la reproducción asexual por mitosis, lo que produce el aumento del número de células del micelio (Casselton y Olesnicky, 1998). En los casos citados, la recombinación de material genético está ausente y las células hijas tienen material genético idéntico al de la célula madre. 2.2 Reproducción sexual en Ascomicetos Otro mecanismo de reproducción de los hongos es la reproducción sexual, que tiene como requisito el encuentro entre dos células sexualmente compatibles y puede ser de dos tipos: la reproducción sexual heterotálica, en la que las cepas son autoestériles y sólo pueden aparearse con células sexualmente compatibles provenientes de otra cepa y la reproducción sexual homotálica, en la que las cepas son autofértiles, es decir, pueden completar el ciclo sexual apareándose con ellas mismas (Nauta y Hoekstra, 1992). Como ejemplos de hongos con reproducción sexual heterotálica se encuentran algunas cepas de N. crassa, C. heterostrophus, C. albicans, P. anserina y G. Fujikoroi; mientras que algunas cepas de G. zae, S. macrospora, N. crassa y C. heterostrophus llevan a cabo la reproducción sexual homotálica. En la reproducción sexual deben formarse dos estructuras especializadas: el ascogonio o estructura femenina y la microconidia o estructura masculina. Estas dos estructuras se acercan entre sí, fusionan sus membranas celulares y desarrollan los protoperitecios, dentro de los cuales se forman las ascas. En las ascas se lleva a cabo la fusión nuclear y la posterior meiosis para formar cuatro ascosporas, las cuales se dividen por mitosis para formar finalmente 8 ascosporas. Este proceso da lugar a la maduración del peritecio, el cual en ciertas condiciones, libera las ascosporas para iniciar el ciclo nuevamente (Kronstad, 1997; Figuras 2 y 3). 27 Figura 2. Reproducción sexual en ascomicetos filamentosos. Dos células con tipo de apareamiento complementario se unen (plasmogamia), forman la hifa ascógena, luego el asca inicial. Posteriormente ocurre la fusión entre los núcleos de estas célualas (cariogamia) para formar las ascas y postreriormente dar lugar al peritecio . Modificado de http://www.fgsc.net/Neurospora/. 1 2 3 4 5 Figura 3. Formación de ascosporas. Las células con Mating-type complementario se fusionan para formar un zigoto diploide (1). Después de la duplicación de cromosomas el núcleo diploide entra en la primera división meiótica (2). Cada núcleo hijo se divide por meiosis produciendo dos núcleos haploides (3). Cada núcleo haploide se divide mitóticamente para producir dos núcleos gemelos (4). Los ocho núcleos resultantes se distribuyen en células separadas, desarrollando ocho ascosporas maduras (5). Esquema modificado de Snustad y Simmons (2006). Para que se lleve a cabo el acercamiento y fusión de células sexualmente compatibles es necesario que una célula reconozca que está delante de otra célula con la que es sexualmente compatible. Este reconocimiento se logra gracias a que cada célula sexualmente compatible secreta un polipéptido denominado feromona. La síntesis y secreción de este polipéptido se encuentra regulada por el locus del Tipo de Apareamiento. Las células con un tipo de apareamiento determinado, secretan una feromona específica, la cual se acopla a un receptor de membrana http://www.fgsc.net/Neurospora/ 28 específico para ella presente en la cepa del tipo de apareamiento complementario. Esta unión de la feromona con el receptor desencadena el desarrollo del ascogonio y la microconidia y todos los pasos ya comentados (Watson y col., 2005). Los ascomicetos poseen en general un locus único que controla el desarrollo del ciclo sexual. Esta región se conoce como locus del tipo de apareamiento (MAT), el cual como ya se dijo está involucrado en el reconocimiento celular. En cada una de las cepas que se aparean existe un alelo de este locus. Sin embargo, cuando se analizó la secuencia del alelo de cada cepa, se encontró que diferían en su secuencia, por lo que se les denominó ideomorfos (Arie y col., 1997). Dentro de cada ideomorfo existen de uno a varios genes, dependiendo del género y del tipo de apareamiento del que se trate. De forma general estos genes codifican factores de transcripción involucrados en la activación o desactivación del desarrollo sexual. Este sistema de apareamiento se denomina sistema bipolar: un locus único que gobierna el desarrollo sexual, con dos formas alternativas o ideomorfos. Se han estudiado los ideomorfos MAT de algunos ascomicetos modelo. Como se describe a continuación, existen similitudes y diferencias entre éstos. a) Hemiascomicetos. Las células sexualmente compatibles se reconocen, unen sus membranas, luego unen sus núcleos y llevan a cabo la meiosis; lo que da lugar a dos células hijas con el mismo número de cromosomas que las células madre. En el caso de Saccharomyces cerevisiae, una de las cepas que se aparean presenta Tipo de apareamiento a y la otra, Tipo de apareamiento ; estas cepas al aparearse forman una célula diploide a/. Una característica importante en este sistema es que tiene la capacidad de “encender” o cambiar de Tipo de apareamiento, lo que lo hace un organismo homotálico (Herskowitz, 1988; Figura 4). 29 Figura 4. Esquema del ciclo de vida de Saccharomyces cerevisiae. Se muestran tanto la reproducción asexual como la reproducción sexual (Lodish y col, 2006). . El locus MAT se encuentra en el cromosoma III, que además de tener el locus MATa o MAT, contiene otras dos copias del casete del Tipo de apareamiento, situadas en cada una de las regionesteloméricas, denominadas HML y HMR. Estos alelos están transcripcionalmente reprimidos por silenciamiento. Cuando se encuentran creciendo dos cepas cercanas y ambas presentan el mismo tipo de apareamiento, cualquiera de ellas es capaz de cambiar su tipo de apareamiento activando la copia del tipo de apareamiento que inicialmente se encontraba silenciada. Esto se lleva a cabo gracias a un fenómeo de recombinación que produce la activación de una secuencia presente en la región HML o HMR que contiene el tipo de apareamiento contrario A este cambio en el tipo de apareamiento se denomina “switch”. (Cosma, 2004, Figura 5). 30 Figura 5. Locus MAT en S. cerevisiae, situado en el centro. En los extremos se muestran los casetes necesarios para realizar el “switch”. Tomado de Watson y col.,(2005). Dentro del locus MATa existen dos genes que son divergentes; a1, un regulador negativo de genes haploides, miembro de la familia de genes de homeodominios y a2, que no codifica para una proteína funcional (Haber, 1998). En el locus MAT hay dos genes; 1 que es un factor de transcripción, regulador positivo de los genes específicos y 2 que es un represor, actúa evitando la activación de los genes a específicos y también pertenece a la familia de genes de homeodominios (Haber, 1998; Figura 6). Las células a y codifican cada una, reguladores específicos del tipo celular. Las células tipo a elaboran la proteína reguladora a1, mientras que las células producen las proteínas reguladoras 1 y 2. Una cuarta proteína llamada Mcm1 (no codificada por estos genes) también participa en la regulación de los genes específicos del Tipo de apareamiento (entre muchos otros) y está en ambos tipos de células. En las células a los genes específicos se encuentran inactivos debido a que no tienen unido ningún activador. Los genes específicos del tipo a se encuentran activos debido a que la proteína Mcm1 y la proteína a están unidas a ellos. En las células los genes específicos están activados por que Mcm1 está unida río arriba y los activa siempre y cuando se una a ella la proteína 1. En estas células los genes específicos a se mantienen inactivos por la acción de la proteína 2, que forma un dímero y se une a estos genes junto con la proteína Mcm1. Cuando ocurre la 31 fusión de los dos tipos de células, se forman las células diploides, en las que tanto los genes específicos de a como los de están desactivados (Haber, 1998; Figura 6). Figura 6. Activación-desactivación de los genes involucrados en el desarrollo sexual en S. cerevisiae.Tomado de Watson y col., (2005). Cada tipo celular haploide secreta un factor de apareamiento diferente, una pequeña feromona polipeptídica. También expresa un receptor de superficie celular asociado con la proteína G que reconoce la feromona secretada por las células del otro Tipo de apareamiento. La unión de los factores de apareamiento a sus receptores induce la expresión de un grupo de genes que codifican proteínas que dirigen el arresto del ciclo celular en G1 y promueve la adhesión/fusión de las células haploides para formar células diploides. En presencia de nutrientes suficientes las células diploides continúan creciendo. La falta de nutrientes induce a las células diploides a entrar en meiosis, cada una producirá cuatro esporas haploides (Figura 7). 32 Figura 7. Acción de las feromonas en S. cerevisiae. Tomado de Lodish y col., (2005). Siguiendo con el análisis de la reproducción sexual en los hemiascomicetos, Candida albicans, un importante hongo diploide patógeno en humanos, posee varias características distintivas que no se observan en otros hongos. Una de estas características es la habilidad de hacer un “switch” o cambio entre dos diferentes tipos celulares: células que forman colonias blancas, en forma de domo sobre el agar y que al microscopio se observan casi esféricas, cambian repentinamente para formar colonias opacas, pegadas al agar y que al 33 microscopio se observan más alargadas (Soll, 1997). A esta habilidad se denomina cambio o switch blanco-opaco. El fenómeno antes descrito aunado al hecho de que hace algunos años Magee y Magee (2000) encontraron condiciones específicas para que cepas de C. albicans con Tipo de apareamiento complementario llevaran a cabo la reproducción sexual en el laboratorio, llevaron a Miller y Johnson a publicar la relación existente entre el switch descrito por Soll y el locus del Tipo de apareamiento (Miller y Johnson, 2002). Como antecedente a este trabajo se sabía que en el genoma de C. albicans existe un locus denominado MTL (Mating-type Like) que contiene secuencias que codifican para proteínas con más del 50% de similitud con las proteínas codificadas por los genes 1, 2 y a1 de Saccharomyces cerevisiae. Estas secuencias se encuentran en los loci denominados MTL y MTLa. Miller y Johnson (2002), demostraron que el switch que realiza una pequeña proporción de células de aislados clínicos de C. albicans es controlado por proteínas que regulan la transcripción, codificadas en el locus MTL, específicamente por los genes MTLa1 y MTL2, cuyos productos génicos contienen homeodominios y forman un dímero que actúa como represor del switch. Además, las células que cambiaban de fenotipo (de blancas a opacas) eran capaces de reproducirse sexualmente con una frecuencia extraordinariamente mayor (106 veces más) que las células blancas. Estos resultados se obtuvieron eliminando uno de los alelos de cada cepa (diploide) para tener sólo un alelo funcional. Posteriormente Lockhart y colaboradores (2002) demostraron que las células deben ser homocigotas para el respectivo alelo para que este switch pueda llevarse a cabo. b) Ascomicetos filamentosos heterotálicos. Un importante modelo de hongo filamentoso en el que se ha estudiado la reproducción sexual es Neurospora crassa, que es un hongo básicamente heterotálico (Figura 8). 34 Figura 8. Reproducción sexual en N. crassa. La microconidia de la cepa de un Tipo de apareamineto se une al ascogonio de la cepa con Mating-type complementario y se lleva a cabo la formación de peritecios maduros y la liberación de ascosporas. http://www.fgsc.net/Neurospora/ Se sabe que las cepas de N. crassa, tienen dos ideomorfos denominados MatA y Mata. Dentro del ideomorfo MatA se han encontrado tres genes: MatA-1, cuyo producto génico tiene similitud con el producto del gen 1 de S. cerevisiae, con un dominio ; MatA-2 cuyo producto génico no tiene homología con lo reportado para otros genes de apareamiento y MatA-3 que contiene un dominio HMG. El ideomorfo Mata contiene dos genes: Mata-1 que tiene un dominio HMG y Mata-2 cuyo producto génico no presenta similitud con lo reportado en los bancos de datos (Figura 9). Figura 9. El locus MAT en las cepas de N. crassa está constituido por dos genes en el caso de Mata y por tres en el caso de MatA. Los genes Mata-1 y MatA-3 contienen un dominio HMG; el gen MatA-1 contiene un dominio y el gen MatA-2 contiene un dominio característico. Mat a Mat A Mat a-1 Mat a-2 Mat A-3 Mat A-2 Mat A-1 http://www.fgsc.net/Neurospora/ 35 Los análisis de mutantes en los ideomorfos MAT de N. crassa han proporcionado información acerca de su función. Cuando se realizó la transformación ectópica con cualquiera de los ideomorfos, las transformantes fueron capaces de aparearse, pero no de producir ascosporas, lo que indica que las regiones aledañas a cada ideomorfo tienen un papel regulatorio en los pasos siguientes al apareamiento (Staben y Yanofsky, 1990; Chang y Staben, 1994; Randall y Metzenberg, 1995; Ferreira y col., 1996). Se ha comprobado que
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