accion amilasa sobre el almidon

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Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Facultad de Ciencias Biológicas
Licenciatura en Biotecnología
Laboratorio de Bioquímica II
Profesora: Julia Maria Alatorre Cruz
Práctica 2. Acción de la amilasa sobre el almidón (Durante la
germinación)
Equipo
Integrantes:
Evelin Vanesa Jimenez Quiroz
Iván Santiago Marcos
Cristian Ulises Diaz Tocuhua
Fabian Perez Mata
INTRODUCCIÓN
Todas las células vegetales sintetizan y degradan almidón en algún punto de su desarrollo; no obstante,
existen notables diferencias con relación al destino del almidón producido. La degradación del almidón es
un proceso que depende de la estructura del gránulo, de la participación de diversas enzimas y su
asociación con el gránulo. El almidón es una reserva energética de las plantas, fuente muy importante de
hidratos de carbono en la población humana. El almidón está compuesto por dos polímeros de glucosa
que constituyen el principal producto de almacenamiento en semillas y otros órganos.
1. La amilosa. Formada por cadenas largas sin ramificar
de residuos D-glucosa que están unidos por enlaces
glucosídicos α-(1-4).
2. La amilopectina. Polímero ramificado que tiene ambos
enlaces glucosídicos α-(1-4) y α-(1-6).
La α-amilasa se ubica en la clasificación de las
enzimas hidrolasas, actuando sobre el almidón
hidrolizando los enlaces glucosídicos α-(1-4) y α-(1-6).
Las α-amilosas son enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces
glicosídicos α-1,4, presentes en el almidón, glucógeno y otros
polisacáridos.
Prueba de yodo (lugol).
Es una reacción usada para determinar la presencia o alteración de almidón. Una
solución de yodo, reacciona con almidón produciendo un color púrpura profundo.
Esta reacción es el resultado de la formación de cadenas de poliyoduro a partir de la
reacción del almidón con el yodo presente en la solución de un reactivo llamado
Lugol.
● La amilosa, el componente del almidón de cadena lineal, forma hélices donde
se juntan las moléculas de yodo, formando un color azul oscuro a negro.
● La amilopectina, componente del almidón de cadena ramificada, forma
hélices mucho más cortar, y las moléculas de yodo son incapaces de juntarse,
obteniéndose un color entre naranja y amarillo.
Al romperse e hidrolizarse el almidón en unidades más pequeñas de carbohidrato, el
color azul-negro desaparece.
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METODOLOGÍA
Diagrama 1. Metodología para detectar experimentalmente la presencia de la enzima amilasa en semillas de frijol.
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INSTRUCCIONES
1. Germinar 6 semillas de frijol
1.1 En dos frascos de Gerber colocar algodón humedecido y ahí dentro poner 3 semillas de frijol
previamente humedecidas.
1.2 Cubrir cada frasco con hoja de papel para evitar el paso de luz
1.3 Llevar a incubar a 37 °C durante 8 días
2. Preparar caja Petri con Agar nutritivo y almidón, previo a la práctica
3. Marcar caja Petri con divisón de 4 partes
4. Quitar piel y embrión a las semillas con ayuda de navaja delgada
5. Cortar por la mitad de forma horizontal cada semilla para posteriormente obtener 4 cortes en
forma de rectángulo (A) de estas mitades y 4 cortes de la mitad de estas mitades con 3 orificios
hechos con un alfiler.
6. Inmediatamente después de cada corte colocar dos cortes por cada división de la caja, estos irán
con la parte plana dentro del agar.
7. Humedecer con una gota de agua los extremos de cada pedazo ya en el agar
8. Llevar a incubar por 45 minutos a una temperatura de 37°C
9. Cada 20 minutos humedecer con agua las extremidades
10. Sacar la caja Petri transcurrido el tiempo y agregar lugol sobre toda la superficie, dejando actuar
por 2 minutos.
11. Enjuagar el exceso de lugol con ayuda de una piseta y con sumo cuidado para evitar romper el
agar.
12. Distinguir zonas traslúcidas y medir con ayuda de una regla, para después promediar las medidas
y anotar resultados.
PROCEDIMIENTO
1. Colocamos algodón humedecido dentro de dos frascos de vidrio para después colocar 3 semillas
de frijol en cada frasco, cubrimos con hojas de papel para evitar el paso de la luz; Incubamos a
37 °C durante 8 días
Imagen 1.Semillas de frijol preparadas para la incubación (izquierda); Frascos de Gerber con las semillas dentro de la
estufa para ser incubadas (derecha).
2. Se sacan los frijoles germinados y se les retira la piel con ayuda de una navaja delgada
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Imagen 2. Semillas de frijol germinadas durante 8 días a una temperatura de 37°C, nótese que hubo un ligero crecimiento de
hongo sobre ellas.
3. Después de quitar piel y embrión a las semillas, cortamos las semillas conforme las
instrucciones para inmediatamente después colocar en el agar, de acuerdo a las secciones
establecidas.
Imagen 3. Cortes de la semillas en agar con almidón, parte superior corte A, zona inferior corte B; preparados para llevar a
incubación durante 45 minutos.
4. Las muestras fueron llevadas a incubación a 37 °C por 45 minutos, humedeciendo cada 20
minutos como fue indicado.
Imagen 4. Muestra de la humectación de los cortes con ayuda de una piseta, en el intervalo de tiempo establecido.
5. Transcurrido el tiempo, se procedió a hacer el revelado con lugol, dejándolo actuar por 2 minutos
para después enjuagar con agua.
Imagen 5. Placa Petri después del enjuague de lugol; nótese que se observan pequeñas zonas transparentes que es en donde se
detecta la presencia de la enzima amilasa por la ruptura del almidón evitando la tinción con el lugol en esa zona.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Sabiendo el efecto que tiene la amilasa sobre el almidón, entre más interactúe la amilasa con este, mayor
será su hidrólisis hasta que el almidón se agote y se transforme en unidades más pequeñas de
carbohidrato, haciendo que no haya interacción entre estas unidades y el yodo.
Por tanto, las placas que tuvieron un mayor tiempo de exposición muestran un mayor promedio de zona
traslúcida que las menos expuestas, esto puede ser observado en la tabla 1, donde se comparó el resultado
que fue obtenido en este experimento (tiempo 45 minutos) con los de otros equipos del laboratorio a
tiempos de 30 y 60 minutos.
El tiempo influye en los experimentos debido a que es el tiempo que la enzima, presente, estuvo en
contacto con el almidón del agar, hidrolizando en moléculas que no reaccionan con el lugol evitando así
que esas zonas sean teñidas, por lo que,la longitud que las zonas traslúcidas muestran varia.
Las zonas medidas tanto como para A y B, en el tiempo 45 min. fue de los bordes de los cortes hasta el
fin de la zona traslúcida, no incluyendo la medida del corte.
Tiempo de revelado Promedio de las zonas
A B
30 minutos 1 mm 1.5 mm
45 minutos 1 mm 2 mm
60 minutos 2 mm 3 mm
Tabla 1. Resultados de los promedios de zonas traslúcidas a distintos tiempos de exposición amilasa almidón. Se observa un
mayor promedio en 60 minutos, demostrando la presencia de la enzima evitando que el almidón reaccione con el yodo y así
generando una hélice de mayor rango de longitud.
En la imagen 6 se muestra las zonas traslúcidas obtenidas en el tiempo de 45 minutos de incubación,
después del lavado, el agar con almidón aún presente se pinta de color oscuro en comparación de las
zonas cerca de las semillas que liberan la enzima amilasa y permite hidrolizar el almidón a su alrededor.
Imagen 6. Zonas traslúcidas alrededor de los cortes de las semillas. Nótese que el agar no fue teñido del color oscuro esperado,
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un factor de ello pudo haber sido un exceso de agua a la hora de la humectación; sin embargo las zonas transparentes son
observadas ligeramente.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el fundamento de la presencia o ausencia de almidón al momento de revelar?
El reactivo de Lugol, que contiene una mezcla de yodo y yoduro, permite reconocer
polisacáridos, particularmente el almidón por la formación de una coloración azul-violeta intensa.
Esta reacción es el resultado de la formación de cadenas de poliyoduro a partir de la reacción del
almidón con el yodo presente en la solución de Lugol. La amilosa, el componente del almidón de
cadena lineal, forma hélices donde juntan las moléculas deyodo, formando un color azul oscuro a
negro, si no hay presencia de este el color será inexistente.
2. ¿Qué indican las zonas translúcidas?
Indican que el almidón fue hidrolizado por la amilasa a compuestos mucho más simples de
manera que éstos no reaccionan con el Lugol y se manifiesta en zonas traslúcidas.
3. ¿Por qué a mayor tiempo es mayor la zona translúcida?
La amilasa será liberada por las semillas presentes, al hidratar las semillas, estas siguen su
proceso de germinación liberando por más tiempo amilasa; en un mayor tiempo estás alcanzarán
un rango más amplio en contacto con el almidón externo presente en el agar, por lo que será
hidrolizado, dando como resultado mayor área de zonas traslúcidas.
4. ¿Hay almidón en la zona translúcida? No ¿Si no lo hay, en que se transformó?
Lo que se encuentra son los restos de la de degradación del almidón por la acción de las amilasa,
enzimas que catalizan la hidrólisis de los enlaces alfa-glucosídicos de almidón, liberando
moléculas de glucosa y maltosa.
CONCLUSIÓN
La actividad de la enzima amilasa en las semillas de frijol durante la germinación se demostró con la
ausencia de color en las zonas cercanas a los cortes de las semillas, indicando que estaba hidrolisando
almidón. La amilasa es activada en mayor cantidad durante la germinación, para obtener alimento
favoreciendo su desarrollo, para esto necesita hidrolizar el almidón que tiene como reserva y esto lo
realiza la amilasa. El presente experimento permitió la observación de este proceso con la revelación de
zonas traslúcidas en presencia de lugol.
BIBLIOGRAFÍA
● Curtis Barnes, H. Biología (6a Ed). Editorial México Panamericana. Página 730
● Mathews. C. K. Bioquímica (3a edición). Madrid Addison Wesley Logman 2002.
● Lehninger Nelson D. y Cox M. Principios de Bioquímica. (4a Edición). Editorial Omega (2005)
volumen 1.
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