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LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA LICENCIATURA DE BIOLOGÍA EXPERIMENTAL Practica No.11 Análisis Bioquímico del metabolismo bacteriano Objetivo: El alumno realizará las pruebas bioquímicas para analizar, identificar y entender el metabolismo de algunos microorganismos. INTRODUCCION La identificación de microorganismos en base a su estructura colonial y microscópica no es concluyente por lo cual se recurre a la identificación fisiológica, para lo existen un gran número de pruebas metabólicas. Al conjunto de reacciones bioquímicas que tienen lugar en la célula se le llama metabolismo. Dentro del metabolismo ocurren dos tipos de reacciones: las anabólicas, que son las que suceden en la célula para formar macromoléculas; y las catabólicas, que convierten sustratos a formas más simples o más oxidadas para obtener la energía requerida por las reacciones anabólicas. Los principales procesos por los cuales se obtiene la energía y su conversión en ATP, son: 1) Fermentación: Se obtiene ATP por fosforilación a nivel sustrato. 2) Respiración: El ATP se obtiene por fosforilación oxidativa. 3) Fotosíntesis: la obtención de ATP se lleva a cabo por fotofosforilación. La fermentación es un proceso anaeróbico en el cuál tanto los donadores como los aceptores de electrones son compuestos orgánicos, aminoácidos y otros más. Existen varios tipos de fermentaciones llevadas a cabo por microorganismos y los productos de éstas, son principalmente ácidos orgánicos, alcoholes, cetonas y CO2. Tipo de fermentación Productos principales Microorganismos que la producen Alcohólica Etanol y CO2 Algunas levaduras y Zymomonas Homoláctica Ácido láctico Lactobacillus y Streptococcus Heteroláctica Acido láctico, etano y CO2 Lactobacillus, Leuconostoc Acido mixta 2,3-butanodiol, butanol, succinato, lactato, acetato, H2 y CO2 Shigella, Salmonella, Klebsiella, Eschericchia coli Butírica Butirato, acetato, H2 y CO2 Clostridium butyricum Propiónica Propionato, acetato y CO2 Propionibacterium, Clostridium propionicum Acética Acetato Clostridium acéticum, Acetobacterium *Manual de prácticas. Laboratorio de Bacteriología y Micología Generales. Georgina Reyna López (2012). METABOLISMO DE AMONIÁCIDOS. Los microorganismos además de requerir una fuente de carbono y una de energía, necesitan una fuente de nitrógeno para construir su propio material celular. Esta fuente de nitrógeno puede ser de moléculas orgánicas como las proteínas, aminoácidos, bases nitrogenadas; o bien inorgánica a partir de nitrógeno molecular, amonio, nitritos o nitratos. Dentro del metabolismo de los aminoácidos existen algunas enzimas capaces de llevar a cabo reacciones de desaminación, descarboxilación y desulfuración de aminoácidos o degradarlos completamente. La desaminación de moléculas como la arginina, produce citrulina y amonio. Las reacciones de descarboxilación la sufren aminoácidos básicos como la lisina, ornitina, arginina y las enzimas que las llevan a cabo se llaman descarboxilasas; el proceso es anaeróbico irreversible y requiere de un cofactor denominado piridoxal. La degradación de aminoácidos como cisteína o metionina lleva a la producción de ácido sulfhídrico; la enzima que lleva a cabo esta reacción se llama cisteinasa y metionina-redustasa respectivamente. RESPIRACIÓN. La respiración es un proceso de fosforilación oxidativa, asociada a una cadena de electrones que genera un gradiente electroquímico, el cual es utilizado por la ATP sintetasa para acoplar ATP. La capacidad respiratoria se encuentra ampliamente distribuida entre los microorganismos. Todos los eucariotes (con excepción del grupo de los microesporidios que no poseen mitocondrias), tienen capacidad de respirar usando oxígeno como aceptor final de electrones. Como donadores de electrones se usan compuesto orgánicos como succinato, NADH y FADH que provienen del metabolismo de azúcares o aminoácidos. Los procariotes, además de contar con respiración aeróbica, algunos grupos poseen también la capacidad de respirar anaeróbicamente y pueden usar NO3-, NO2-, (SO4)2-, CO2, S°, Fe3+ o fumarato como aceptor final de electrones. Entre los procariotes litotróficos, los donadores de electrones pueden ser moléculas orgánicas o inorgánicas entre las entre las que se encuentran H2, H2S y NH3. MATERIALES Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo glucosado. Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo malonato. Tubos de 13x100 mm con campana de Durham con 3 mL de caldo base, rojo de fenol y glucosa, sacarosa y manitol respectivamente. Tubos de 13x100 mm con 3 mL con medio inclinado de Kliger. Tubos de 13x100 mm con 3 mL con medio inclinado de citrato de Simmons. Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo triptona. Tubos de 13x100 mm con 3 mL con medio SIM (Sulfide Indole Motility). Tubos de 13x100 mm con 3 mL con medio inclinado de LIA (Lysine Iron Agar). Tubos de 13x100 mm con 3 mL con medio de caldo nitrato Placas de agar nutritivo Reactivos: Solución de KOH-creatina Solución de α-naftol Reactivo de Kovac’s o Ehrlich Papel tornasol rosa Reactivo de α-naftil amina Solución de ácido sulfanílico Reactivo de oxidasa/papel filtro ó discos de reactivo Solución de peróxido de hidrógeno al 10%. PROCEDIMIENTO I) FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS: GLUCOSA, SACAROSA Y MANITOL. 1) Inocular con una asada de cada microorganismo los tubos con caldo base, campanas de Durham y rojo de fenol con glucosa, sacarosa y manitol respectivamente. NO AGITAR LOS TUBOS. 2) Incubar a 37°C por 24 horas. 3) Observar los resultados. Tomando en cuenta que el rojo de metilo en condiciones acidas toma un color amarillo; ligeramente alcalino (pH 7.4) color naranja y alcalinas se torna rojo. -Producción de ácido: la coloración del medio se torna amarilla. -Producción de gas: es positiva si se forma una burbuja dentro de la campana de Durham. II) FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN MEDIO KLIGER. 1) Inocular por picadura cada una de los microorganismos, en la superficie de los tubos con medio Kligler. 2) Incubar los tubos a 37°C por 24 horas. 3) Observar si hay: Fermentación de glucosa: coloración amarilla en la superficie del tubo Producción de gas: aparición de burbujas en el medio de cultivo. Producción de H2S: formación de un precipitado negro en el medio. Alcalinización: el medio se torna de rojizo a violeta. III) FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS. PRUEBAS DE ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER (MR Y VP). 1) Inocular dos tubos de caldo glucosado para cada cepa. Uno marcado como MR y el otro como VP. 2) Incubar los tubos a 37°C durante 24 horas. 3) A los tubos marcados como MR, adicionar 5 gotas de reactivo de rojo de metilo, sin agitar. La prueba es positiva por la formación de un anillo rojo en la parte superior del tubo. 4) A los tubos marcados como VP, adicionarles 6 gotas de reactivo de α-naftol y 2 gotas de solución de KOH-creatina. Agitar suavemente. Dejar reposar de 20 a 30 minutos. La prueba de Voges-Proskauer es positiva por la aparición de un color rojo en el tubo debido a la formación de acetil-metilcarbinol). IV) UTILIZACION DE ÁCIDOS ÓRGANICOS: 1) Inocular por estría abierta, la superficie un tubo con agar citrato de Simmons para cada cepa. 2) Inocular con una asada, un tubo con caldo malonato, para cada cepa. 3) Incubar a 37°C por 24 horas. 4) La prueba es positiva cuando hay crecimiento y la solución vira a azul. V) METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS: PRODUCCION DE ÁCIDO SULFHÍDRICO E INDOL. 1) Inocular por picadura cada una de las cepas en cada tubo de medio SIM. 2) Incubar los tubos a 28°C por 24 horas. Observar e interpretar: • Producción de H2S: formación de precipitado negro. • Movilidad: Se observa turbidez en regiones alejadas de la picadura de inoculación. • Producción de Indol: añadir 4 gotas del reactivo de Kovac’s o Ehrlich; la prueba es positiva por la aparición del color rojo. VI) METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS : PRODUCCIÓN DE AMONIACOE INDOL. 1) Inocular con una asada de cada cepa en los tubos de caldo triptona respectivamente. 2) Colocar una tira de papel tornasol en la tapadera del tubo sin tocar el medio de cultivo. 3) Incubar a 37°C durante 24 horas. 4) Observar el cambio de color de rosa a azul del papel tornasol por la liberación de amoniaco. 5) Añadir 4 gotas del reactivo de Kovac’s o Ehrlich como en la sección anterior, la prueba es positiva con la aparición del color rojo en la superficie. VII) METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS : PRODUCCION DE LISINA- DESCARBOXILASA: 1) Inocular por picadura y estría un tubo con medio LIA con cada una de las cepas. 2) Incubar los tubos a 37°C por 24 horas. 3) Observar los Resultados: - Descarboxilación positiva: color púrpura en el fondo del tubo. - Descarboxilación negativa: color amarillo en el fondo del tubo. - Desaminación positiva: color naranja en la superficie del tubo. - Desaminación negativa: no hay cambio de color. - Producción de H2S: formación de un precipitado negro. VIII) RESPIRACIÓN: REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS. 1) Inocular cada cepa en los tubos de caldo nitrato respectivamente. 2) Incubar a 37°C por 24 horas. 3) Añadir 3 gotas de α-naftil amina y 3 gotas de solución de ácido sulfanílico. 4) Observar y registrar: -Una coloración rojo ladrillo indica la presencia de nitritos por la formación de un compuesto diazoico. IX) RESPIRACIÓN: PRUEBAS DE CITOCROMO OXIDASA Y CATALASA. 1) Sembrar por estría abierta cada placa con agar nutritivo con cada cepa respectivamente. 2) Incubar todos los tubos por 24 horas. 3) Para la prueba de oxidasa: tomar una asada a un trozo de papel filtro y agregar el reactivo de oxidasa ó bien colocar un disco sobre una porción del crecimiento en la caja. La prueba es positiva por la aparición de una coloración color púrpura en el disco o papel filtro. -El sistema citocromo oxidasa se encuentra por lo general en organismos aerobios y por lo que utilizan el oxígeno como aceptor final de electrones y producir H2O2. 4) Una vez hecha la prueba anterior, en otra porción del crecimiento en la placa, añadir unas gotas de la solución de peróxido de hidrógeno al 10%. La prueba es positiva por la aparición de burbujas. -La mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos poseen la enzima catalasa, la cual descompone el peróxido de hidrógeno evitando su acumulación en la célula. RESULTADOS Prueba de fermentación de carbohidratos E. coli B. subtilis Cepa aislada Glucosa Ácido Gas Durham Sacarosa Ácido Gas Manitol Ácido Gas Kligler Glucosa Gas H2S Alcalinización MR (Rojo de Metilo) VP (Voges Proskauer) Prueba de utilización de ácidos orgánicos Citrato de Simmons Malonato Prueba metabolismo de aminoácidos SIM H2S Indol movilidad Caldo triptona Amoniaco Indol LIA Descarboxilación Desaminación H2S Respiración Reducción de nitratos a nitritos Oxidasa Catalasa *Prueba positiva +, negativa - CUESTIONARIO 1) Indicar el fundamento de cada prueba bioquímica realizada. 2) Hacer una investigación bibliográfica con los resultados de las pruebas bioquímicas y reportar la identificación del posible microorganismo de la cepa problema; sustentando sus argumentos. BIBLIOGRAFIA: -Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología y Micología Básicas. Aut: López Reyna Georgina. (2003) Ed. Stock. -Conceptos y práctica de Microbiología General. Rojas Triviño Alberto. Universidad Nacional de Colombia (2011). - Introducción a la Microbiología. Ingraham J.L., Ingraham C.A., Ed. 2004. Reverté. España.
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