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1 FACULTAD DE DERECHO DOBLE GRADO EN DERECHO Y CRIMINOLOGÍA TRABAJO FIN DE GRADO CURSO ACADÉMICO [2017-2022] TÍTULO: REVISIÓN DEL ESTADO ACTUAL DE LA EVOLUCIÓN TEMPORAL DE LAS LESIONES: HISTOPATOLOGÍA, INMUNOHISTOQUÍMICA, IMAGENOLOGÍA Y BIOLOGÍA MOLECULAR. AUTOR: MARÍA RUIZ HUERTAS TUTOR ACADÉMICO: DR. D. JOSÉ RAMÓN CASTRO PEREIRA 2 A mis padres, por ser camino. A mi hermana, por ser abrazo con olor a mar. A mi abuela, por ser luz. Gracias por ser. Gracias por estar. En definitiva, gracias a todos los que no habéis escrito este trabajo, pero que habéis hecho posible que yo lo acabase. “Cuanto más nos elevamos, más pequeños parecemos a quienes no saben volar”. Friedrich Nietzsche 3 ÍNDICE 1. RESUMEN .................................................................................................................. 5 2. METODOLOGÍA ....................................................................................................... 6 3. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 9 4. DESARROLLO ........................................................................................................ 11 4.1 Consideraciones histopatológicas generales en la determinación de la data de las lesiones ........................................................................................................................ 11 4.2 Autopsias o necropsias medicolegales e imagenología ........................................ 17 4.2.1 Autopsias o necropsias medicolegales ........................................................... 17 4.2.2 Imagenología: la Resonancia Magnética y la Tomografía Computarizada ... 18 4.3.1 Técnicas de tinción histológicas e histopatológicas: histoquímica e inmunohistoquímica ................................................................................................ 21 4.3.2 Metaloproteinasas de matriz y sus inhibidores .............................................. 23 4.3.3 MicroARN ...................................................................................................... 25 4.4 Visión prospectiva de la patología forense ........................................................... 27 5. CONCLUSIONES .................................................................................................... 28 6. BIBLIOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA ........................................................................ 29 6.1 Bibliografía ........................................................................................................... 29 6.2 Webgrafía .............................................................................................................. 29 7. ANEXOS ................................................................................................................... 39 7.1 Anexo I ................................................................................................................. 39 7.2 Anexo II ................................................................................................................ 42 7.3 Anexo III ............................................................................................................... 45 4 ABREVIATURAS ADN = Ácido desoxirribonucleico ARN = Ácido ribonucleico ARNm = Ácido ribonucleico mensajero ARNt = Ácido ribonucleico de transferencia FGF = Fibroblast Growth Factor LECrim = Ley de Enjuiciamiento Criminal MMPs = Matrix Metalloproteinases NGS = Next Generation Sequencing PCR = Polymerase Chain Reaction PDGF = Platelet-Derived Growth Factor PMI = Post Mortem Interval RAE = Real Academia Española RM = Resonancia Magnética RD = Real Decreto TC = Tomografía Computarizada TIMPs = Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 5 1. RESUMEN Una de las labores de la medicina legal o medicina forense consiste en el empleo de los conocimientos médicos como medida de asistencia para la aplicación de justicia. Es precisamente en el ámbito de la patología forense donde se encuentra uno de los mayores retos de dicha disciplina: determinar la vitalidad de una herida, es decir, resolver si una lesión ha sido producida antemortem o postmortem; una tarea que, en muchos casos, puede resultar decisiva en la reconstrucción de las escenas de crímenes y en la identificación y castigo de los presuntos acusados. Las técnicas que han permitido a los profesionales de la Medicina Legal estimar la vitalidad de la herida y fijar el tiempo transcurrido desde su producción han ido evolucionando a lo largo de la historia de la ciencia. En el presente trabajo se desarrollan, desde el estudio histopatológico, las alteraciones histológicas inherentes a la inflamación tras ocasionarse una lesión con el fin de posibilitar el registro en la fase en que se hallen; así como los métodos validados (tradicionales e innovadores) que permiten evaluar la edad de la herida. Finalmente, una vez fijada la situación actual, se plantea una visión de futuro, un “hacia dónde se dirige” la patología forense, que sirva como punto de inflexión para los avances venideros. Palabras clave Histopatología forense, vitalidad de las heridas, cicatrización, inmunohistoquímica, imagenología, tinciones. ABSTRACT One of the tasks of Legal Medicine or Forensic Medicine is the use of medical knowledge for assistance of Justice. It is precisely in the field of Forensic Pathology where one of the greatest challenges of this discipline is found: to establish the vitality of a wound, that is, to resolve whether an injury has been produced antemortem or postmortem; a task that, in many cases, can be decisive in the reconstruction of crime scenes and in the identification and punishment of alleged accused. The techniques that have allowed forensic scholars to estimate the vitality of the wound and fix the elapsed time span have evolved throughout the history of science. In the present work, from the histopathological study, the histological alterations inherent to the inflammation after 6 causing an injury are developed to enable the registration in the phase in which they are as well as validated methods (traditional and innovative) that allow to evaluate the age of the wound. Finally, once the current situation is fixed, a vision of future is proposed, a "where is headed" the forensic pathology, which will serve as a turning point for the coming advances. Key words Forensic histopathology, wound vitality, healing, immunohistochemistry, imaging, stains. 2. METODOLOGÍA Para la realización de este trabajo se ha llevado a cabo una búsqueda orientada al análisis del desarrollo de las técnicas validadas en el campo de la Patología Forense para el estudio de la evolución temporal de las lesiones. En dicha búsqueda se han tenido en cuenta publicaciones que abarcan desde los años 80 hasta la actualidad más reciente, siendo estos últimos los más fundamentales. Las bases de datos en las que se ha llevado a cabo la búsqueda han sido Dialnet, SciELO y Google Scholar. En ellas, se han definido una serie de criterios de inclusión y exclusión de los artículos encontrados, que se recogen en la siguiente tabla: TABLA 1: CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN CRITERIOS DE INCLUSIÓN CRITERIOS DE EXCLUSIÓN Idioma español o inglés. Imposibilidad de acceso al texto completo. Rigurosidad científica. Información de páginas web no confiables. Artículos científicos de actualidad. Fuentes sin relevancia en el tema propuesto en el presente trabajo. Estudios con información referida al ámbito forense. Artículoscon autores indeterminados. 7 Para la búsqueda se han empleado las palabras y combinaciones reflejadas en la tabla expuesta a continuación: TABLA 2: COMBINACIONES DE PALABRAS ADN y ARN en Patología Forense Reparación heridas cutáneas Vitalidad heridas Análisis inmunohistoquímico heridas Evolución temporal de las lesiones Marcadores vitalidad Tipos de tinciones en Patología Forense Imagenología post mortem Las metaloproteinasas en la cicatrización de las heridas Cicatrización heridas MicroARN en Patología Forense Artículos de histopatología forense Metaloproteinasas e inhibidores Tinciones histológicas Lesiones en diferido en Medicina Forense Legislación española diagnóstico muerte Tras hacer una selección exhaustiva, he utilizado un total de 53 artículos científicos para completar el trabajo. Por otra parte, también he seleccionado algunos manuales hallados en Internet, ajenos a las bases de datos anteriormente indicadas; así como manuales en formato físico. Todas las fuentes consultadas de las que me he valido se encuentran citadas a lo largo del trabajo y ordenadas alfabéticamente en el apartado de “Bibliografía” según el estilo APA. 8 DIAGRAMA DE FLUJO DE LA BÚSQUEDA BIBLIOGRÁFICA Análisis de la evolución temporal de las lesiones: histopatología, inmunohistoquímica e imagenología Consideraciones histopatológicas generales Autopsias e imagenología Técnicas histoquímicas e inmunohistoquímica MicroARN Tinciones MMPs + inhibidores Bases de datos científicas: Google Scholar, SciELO y Dialnet Revisadas: Google Scholar (173), SciELO (15) y Dialnet (10) Aplicar criterios de inclusión y exclusión para la selección de artículos y manuales Cumple con los criterios de inclusión: 81 No cumple con los criterios de inclusión: 117 Información seleccionada: 53 Google Scholar (49), SciELO (2), Dialnet (2) 9 3. INTRODUCCIÓN La patología forense es una rama o subconjunto dentro de las ciencias médicas -y una parte de la Tanatología forense- orientada a darle solución a los problemas que puedan plantearse en el ámbito del Derecho penal y civil, y que encuentren respuesta en los conocimientos médicos (Tortosa López, 2011, p.21). Es por ello por lo que, dentro de este campo, se le da vida a una especie de epistemología ad hoc. En el Derecho penal y ante determinados crímenes, adquiere gran importancia el hecho de poder y saber fijar el momento de la muerte absoluta de una persona. En muchos casos de ello dependerá la aplicación de uno u otro tipo penal. En el campo del Derecho civil, precisar la data de la muerte es relevante en relación con los problemas de la conmoriencia. La conmoriencia se da en aquellos casos en los que fallecen, a la vez, dos personas llamadas a sucederse, resultando imposible demostrar quién murió antes. De ahí que el artículo 765 del Código Civil (1889) establezca que: “el heredero voluntario que muere antes que el testador no transmite ningún derecho a sus propios herederos”. Asimismo, el artículo 33 de este Código (1889), recoge que “si se duda entre dos o más personas llamadas a sucederse quien de ellas ha muerto primero, el que sostenga la muerte anterior de una o de otra debe probarlo; a falta de prueba se presumen muertos al mismo tiempo (conmoriencia) y no tiene lugar la transmisión de derechos de unos a otros”. De su relación con la Tanatología forense aflora su interés por estudiar, no solamente la morfología de las lesiones, sino todos aquellos aspectos concurrentes a las mismas: su etiología, su evolución temporal, el proceso de inflamación y cicatrización/reparación, la estimación de la edad de la herida, etc.; los cuales varían según la gravedad de la lesión (Li, Du, Bai y Sun, 2020). En el momento en el que una herida es producida en un cuerpo con vida, en los tejidos se da paso a una concatenación de reacciones vitales (moleculares y celulares), conocidas bajo la denominación de “vitalidad”, y orientadas a reparar el daño. Estas pueden mostrarse en forma de hemorragias, infiltración de células inflamatorias o formación de tejido de granulación (Oehmichen, 2004). Así pues, las reacciones vitales no solo activan la cicatrización de las heridas, sino que, además, posibilitan la probación de si la víctima se encontraba con vida en el momento en el que la herida fue infligida, 10 así como el conocimiento del período de tiempo transcurrido entre dicho momento y su muerte. Ello es viable gracias a que, durante la curación de una herida, se distinguen cuatro fases superpuestas (cada una con sus características morfológicas y/o bioquímicas específicas): hemostasia, fase inflamatoria, proliferativa y de remodelación (Sorg et al., 2017); que son identificables mediante técnicas morfológicas, citológicas y de biología molecular (Li, Du, Bai y Sun, 2020). No obstante, antes de seguir avanzando, es importante resaltar dos datos que favorecen el entendimiento de este tema (Cabrerizo et al., 2015, p.128): • “Todos los tejidos del organismo, exceptuando el sistema nervioso, se inflaman y reparan de la misma forma siguiendo las mismas pautas”. El progreso es parecido para todos los tejidos, aunque la duración de cada fase variará dependiendo de las características específicas de cada uno de ellos. • “Si un tejido no se inflama, no se repara, y son dos procesos que caminan juntos en el tiempo”. Lo destacable aquí es el hecho de que, en las reacciones vitales, como apuntan Cecchi (2010), Grellner y Madea (2007), se ven involucrados varios biomarcadores que acrecientan la precisión de la estimación de la edad de la herida. Los biomarcadores podrían definirse como “aquellas características biológicas, bioquímicas, antropométricas, fisiológicas, etc., objetivamente mensurables, capaces de identificar procesos fisiológicos o patológicos, o bien una respuesta farmacológica a una intervención terapéutica” (Torres y Pérez, 2016, p.5). El uso de los biomarcadores en el plano práctico de la Patología Forense, en un primer y básico planteamiento, presupone una excelente, sencilla y rápida oportunidad para una estimación más precisa de la vitalidad y la edad de las heridas. Sin embargo, siguiendo lo declarado por Li et al. (2020) y Casse et al. (2015), aunque durante los últimos años se ha evolucionado en el estudio de los marcadores inmunohistoquímicos, moléculas de adhesión, citocinas y quimiocinas, etc., todavía no se ha registrado un marcador o conjunto de marcadores que sean completamente fiables. La dificultad se encuentra en la accesibilidad y número de muestras de tejido humano con suficiente información sobre la herida la edad y la vitalidad de la herida, así como la reproducibilidad de los resultados, la experiencia del examinador y las limitaciones metodológicas (Casse et al., 2015 y Niedecker et al., 2021). Asimismo, son abundantes los factores a tener en cuenta para lograr unos resultados reproducibles y 11 adecuados, lo cual se convierte en una ardua tarea como consecuencia de la ausencia de grupos de control y cuantía de muestras que permitan la investigación (Casse et al., 2015). Por ello, la mayoría de las investigaciones en las que gravitan los conocimientos en esta materia se han realizado en animales (Cabrerizo, 2015). Los métodos que han venido utilizándose para fijar la iniciación de las reacciones vitales (antes de que aparezca el infiltrado inflamatorio) son, entre otras, técnicas bioquímicas, histoquímicas e inmunohistoquímicas (Cabrerizo et al., 2015). Empero, sus resultados no son concluyentes. En el plano del diagnóstico postmortem convergen, junto a las anteriores, un conjunto de técnicas tecnológicas bautizadas bajo el nombre de“imagenología” y entre las que se encuentran la resonancia magnética y la tomografía computarizada. 4. DESARROLLO 4.1 Consideraciones histopatológicas generales en la determinación de la data de las lesiones Como paso previo a adentrarnos en la cronología de una herida, es necesario clarificar ciertos conceptos. Todos sabemos lo que es una herida, así como somos capaces, igualmente, de identificarla a simple vista. Sin embargo, en Medicina Legal existe una disciplina denominada “Histopatología forense”, que podría definirse como la rama de la Patología Forense que se dedica al estudio de los tejidos y las células, con el objetivo de dar respuesta a cuestiones como: cuándo y cómo se produjo la muerte de un individuo, en qué momento se infligieron las lesiones en el cuerpo (si antemortem o postmortem), cuál ha sido la evolución de dichas lesiones, etc. De acuerdo con autores como Alaeddini et al. (2010) y Niedecker et al. (2021), es menester saber diferenciar entre heridas antemortem y postmortem, dada la existencia de la muerte biológica, es decir, la muerte de cada una de las células cierto tiempo después de la muerte del organismo; puesto que la actividad y supervivencia de las células de un individuo tras su muerte varía dependiendo de sus propios mecanismos de supervivencia. Y, es que, la muerte, en el plano científico, no ocurre en un momento exacto, pese a que esta sea identificada atendiendo a ciertos aspectos. En base a lo expuesto por Gisbert 12 Calabuig (1985), la muerte es un proceso en el que varias fases van sucediendo de manera evolutiva. Unas fases cuyo inicio y fin son imposibles de determinar, y que pueden clasificarse de la siguiente forma: 1. Muerte aparente. Estado en el que las funciones vitales del cuerpo humano muestran signos tan débiles que parece que ha fallecido. Un ejemplo conocido de muerte aparente es la catalepsia. 2. Muerte relativa. Se caracteriza por ser una dilatación de la agonía en el tiempo. Es decir, las funciones biológicas del cuerpo han quedado suspendidas, pero todavía es posible reanimar al sujeto. 3. Muerte intermedia. Fase en la que las actividades vitales cesan plenamente y, en ningún caso, va a poder recuperarse la vida del individuo. 4. Muerte absoluta. Corresponde a la extinción de toda actividad biológica del organismo. Las funciones vitales comprenden las funciones respiratoria, cardiocirculatoria y del sistema nerviosa. Empero, dado a que las dos primeras pueden ser mantenidas artificialmente, para fijar la muerte absoluta del individuo se atenderá a la muerte cerebral. En una publicación del Canadian Neurocritical Care Group (1999) se establecen una serie de signos que pueden coadyuvar a determinar la muerte cerebral de una persona si esta los presenta. Signos como, entre otros: el cese de todas las funciones cerebrales; la falta de funciones cerebrales, como la ausencia de respuesta a estímulos o la desaparición de ciertas funciones del tronco del encéfalo como el reflejo pupilar a la luz. Por lo que nuestro a país respecta, el Real Decreto 2070/1999, de 30 de diciembre, por el que se regulaban las actividades de obtención y utilización clínica de órganos humanos y la coordinación territorial en materia de donación y trasplante de órganos y tejidos, fue derogado por la disposición derogatoria única del Real Decreto 1723/2012, de 28 de diciembre, que regula las actividades de obtención, utilización clínica y coordinación territorial de los órganos humanos destinados al trasplante y establece requisitos de calidad y seguridad. En su artículo 9 senta los requisitos para la obtención de órganos de donante fallecido. Dice así: • Artículo 9.2 RD 1723/2012: “La obtención de órganos de fallecidos sólo podrá hacerse previo diagnóstico y certificación de la muerte realizados con arreglo a lo establecido en este real decreto y en particular en el anexo I, las exigencias 13 éticas, los avances científicos en la materia y la práctica médica generalmente aceptada. Los profesionales que diagnostiquen y certifiquen la muerte deberán ser médicos con la cualificación adecuada para esta finalidad, distintos de aquéllos que hayan de intervenir en la extracción o el trasplante y no estarán sujetos a las instrucciones de estos últimos. La muerte del individuo podrá certificarse tras la confirmación del cese irreversible de las funciones circulatoria y respiratoria o del cese irreversible de las funciones encefálicas. Será registrada como hora de fallecimiento del paciente la hora en que se completó el diagnóstico de la muerte.” • Artículo 9.3 RD 1723/2012: “El cese irreversible de las funciones circulatoria y respiratoria se reconocerá mediante un examen clínico adecuado tras un período apropiado de observación. Los criterios diagnósticos clínicos, los períodos de observación, así como las pruebas confirmatorias que se requieran según las circunstancias médicas, se ajustarán a los protocolos incluidos en el anexo I”. • Artículo 9.4 RD 1723/2012: “El cese irreversible de las funciones encefálicas, esto es, la constatación de coma arreactivo de etiología estructural conocida y carácter irreversible, se reconocerá mediante un examen clínico adecuado tras un período apropiado de observación. Los criterios diagnósticos clínicos, los períodos de observación, así como las pruebas confirmatorias que se requieran según las circunstancias médicas, se ajustarán a los protocolos incluidos en el anexo I”. El anexo I se divide, a su vez, en tres apartados, que ayudarán a diagnosticar y certificar la muerte de una persona mediante “la confirmación del cese irreversible de las funciones circulatoria y respiratoria o de las funciones encefálicas (muerte encefálica), conforme establece el artículo 9 del presente real decreto”. En el apartado para el diagnóstico de muerte por criterios neurológicos (muerte encefálica) se fijan las condiciones diagnósticas para tener en cuenta, la exploración clínica neurológica a llevar a cabo, el período de observación que ha de cumplirse, las pruebas instrumentales de soporte diagnóstico, así como toda una serie de supuestos especiales con pautas específicas (Anexo I, RD 1723/2012, pp. 89341 a 89343). Igualmente, para el diagnóstico de muerte por criterios circulatorios y respiratorios se explicita en qué se basa este tipo de diagnóstico y las condiciones que han de presentarse, además de las maniobras de 14 mantenimiento de viabilidad y preservación de los órganos (Anexo I, RD 1723/2012, p. 89344). Por otra parte, una herida o lesión tisular es “una pérdida de continuidad de la piel o mucosa producida por algún agente físico o químico, que cursa con una serie de signos y síntomas, tales como separación de bordes de la piel, dolor, inflamación y/o hemorragia” (Lucha et al., 2008, p.8). Esa inflamación es el paso siguiente a que se produzca una lesión y la que afecta al tejido dañado como reacción defensiva (Rubin et al., 2008). Cabe recordar que, todos los tejidos del organismo se inflaman, exceptuando el tejido del sistema nervioso central (encéfalo y médula). Por ello, desde aproximadamente la época de los años 60, se ha evolucionado considerablemente en la búsqueda de marcadores de vitalidad que permitan estudiar con mayor precisión el proceso inflamatorio. Y, es que, al fin y al cabo, la inflamación de una herida supone una reacción vital, que puede definirse como aquella reacción que experimentan tejidos y órganos mientras las células mantienen su integridad vital (Clínica Universidad de Navarra, 2022). De esta forma, se producirá la reacción vital en lesiones causadas en una persona viva, no ocurriendo así en el caso de que la lesión haya sido provocada tras la muerte. No obstante, si la herida tiene lugar en momentos próximos a la muerte (ya sea antes o después), el análisis de vitalidadse tornará más complicado e inconcreto (Calabuig, 1985). Cuando una herida es originada, se da comienzo al proceso de cicatrización, a través del cual se repara la herida, al margen de cuál sea su naturaleza o clase. No obstante, lo anterior no excluye que el tiempo que curación de la lesión se vea afectado por diversos factores, como son (Lucha et al., 2008): • Perjuicio vascular ocasionado en la herida. • El espacio dañado. • El lugar anatómico afligido. • La presencia de infección. • La ingestión de según qué fármacos. 15 En el transcurso de la cicatrización se pueden identificar tres o cuatro fases superpuestas, dependiendo del autor, a saber: la fase hemostática e inflamatoria, la proliferativa y de remodelación (Sorg et al., 2017). Cuando se ocasiona una lesión tisular, se producen dos eventos vasculares contrapuestos, inicialmente una reducción del calibre vascular (vasoconstricción) transitoria, seguida de una vasodilatación de pequeños vasos en la zona de la lesión con aumento de la permeabilidad de la microvasculatura, que origina un aumento de la viscosidad sanguínea que enlentece el flujo sanguíneo local. Esta vasodilatación local constituye el inicio de la inflamación, mediante la cual determinados glóbulos blancos (específicamente los neutrófilos y monocitos) se trasladan a la herida. Según Lucha et al. (2008), los neutrófilos se encargan de evitar que la herida se infecte destruyendo, a través de la fagocitosis, aquellas bacterias y virus que se ubiquen en la lesión. Por su parte, los monocitos circulantes se transforman en macrófagos tisulares, pudiendo, según los mismos autores, efectuar una doble función: a) La eliminación o remoción del tejido perjudicado. b) Otros macrófagos reparadores experimentarán una variación a nivel genético en su ARN mensajero con el propósito de segregar proteínas que orientan las fases de cicatrización y fijan el inicio de una fase u otra. Esta primera fase abarca varias etapas con la participación de múltiples moléculas de señalización celular (Zavala et al., 2009). Inicialmente, se produce una liberación y agregación de plaquetas que van a fomentar la curación a través de la liberación de factores de crecimiento como el PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas). En un momento posterior, le sucederá el proceso de coagulación e inflamación y el reclutamiento de leucocitos, donde se liberan factores de crecimiento como el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) o el transformador β (TGF-β) A los cuatro días, aproximadamente, posteriores a la producción de la herida arranca la fase proliferativa, en la cual los fibroblastos, el colágeno y la elastina tisular se acumulan dando lugar al tejido de granulación, que va a sustituir a la capa provisional de células situadas en la lesión. Es decir, la herida pasa aquí a ser hipóxica, pues los vasos sanguíneos han sufrido una ruptura y los fibroblastos y las células endoteliales, como lo son los queratinocitos, migran a la herida coadyuvando a la neovascularización de la misma. 16 Y, finalmente, la fase de remodelación corona el proceso de cicatrización, extendiéndose durante varios meses. En ella intervienen hasta 24 metaloproteinasas de matriz (MMP) (Nagase y Woessner, 1999), además de los fibroblastos de la etapa anterior, que producen fibronectina con el fin de que esta sea posteriormente reemplazada por “colágeno tipo III y luego colágeno tipo I” (Zavala et al., 2009, p.11). Así, la cicatriz resultante se caracteriza por ser un tejido estable prácticamente igual al presente con anterioridad a la herida1. Sin embargo, el proceso de cicatrización puede verse afectado por varios factores como, por ejemplo, la “insuficiencia venosa, el hábito de fumar o la desnutrición” (Senet, 2008, p.6). Por otro lado, hay que ser conscientes de que, con carácter general, la piel, el músculo esquelético y el tejido cerebral alrededor de las heridas infligidas (Li et al., 2020) son los tejidos más analizados para fijar la fecha de una lesión, tanto en estudios experimentales como de investigación. La diferencia entre ambos tipos de estudios radica, siguiendo de nuevo a Li et al. (2020), en el hecho de que, mientras en los primeros, las muestras de tejidos se toman en un tiempo preestablecido; los segundos extraen muestras en varias ocasiones posteriormente a la herida. La mayoría de los experimentos y estudios de investigación son practicados en animales y en personas. Los ensayos con animales cuentan con sus ventajas y, obviamente, también con inconvenientes. Y, es que, dichos experimentos son manejables, lo cual facilita no solamente que en un futuro puedan volver a repetirse, sino también que los datos obtenidos sean fidedignos. No obstante, pese a que, en muchos casos, la respuesta fisiológica básica al producirse una herida es parecida en humanos y animales, sería erróneo afirmar que los resultados puedan extrapolarse en su totalidad al ámbito de lo humano (Grellner y Madea, 2007; Gauchotte et al., 2013 Por su parte, las muestras extraídas de autopsias permiten un acceso a muestras tisulares humanas, si bien pueden presentar una dificultad interpretativa de los resultados, debido a las alteraciones que tienen lugar tras la muerte del cuerpo (como, por ejemplo, la putrefacción y las consideraciones acerca de los años de vida del sujeto, el lugar donde radica la lesión o los antecedentes médicos (documentados y no documentados). 1 Para más información, consultar el Anexo I. 17 Asimismo, también son factibles las muestras de seres humanos vivos, las cuales se consiguen de individuos con patologías de la piel, de pacientes que se someten a una cirugía para extirpar una parte de tejido o de aquellos son derivados a un médico forense. No obstante, esta práctica, aun cuando es de gran provecho científico, en cuanto a la tasación de la vitalidad de las heridas y, evidentemente, por su procedencia humana; en la realidad tropieza directamente con el marco de ciertos valores relevantes para la ética (Fronczek et al., 2015). 4.2 Autopsias o necropsias medicolegales e imagenología 4.2.1 Autopsias o necropsias medicolegales Cuando la muerte de una persona es considerada como violenta o sospechosa de criminalidad (art. 340 LECrim), se torna muy relevante en el ámbito judicial el determinar en qué momento se produjeron las lesiones. Para ello, en la práctica forense se encuentran las autopsias y/o necropsias, términos sinónimos para unos autores y divergentes para otros. Ambas, al fin y al cabo, van orientadas al estudio del cuerpo humano (cadáver) tras su fallecimiento. El forense que observe heridas en el cadáver se verá obligado a señalar si estas fueron producidas antes o después de la muerte. A tal efecto, podrán acudir al análisis histopatológico, esto es, al estudio de tales heridas o excoriaciones y su evolución a través del microscopio (Cabrerizo et al., 2015). El estudio histopatológico, permite que el patólogo forense pueda apoyar su diagnóstico en las técnicas de histoquímica e inmunohistoquímica (como, por ejemplo, las tinciones), favoreciendo la obtención de una data de las lesiones más categórica, más cercana a la realidad. Sin embargo, el forense puede encontrarse, de facto, con un gran número de heridas o lesiones infligidas en diversas ocasiones que van a presentar disimilitudes histológicas con respecto a los componentes (Cayax, 2020). Es por ello por lo que será necesario, en un primer momento, detectar las variaciones histológicas características de la inflamación, para lo cual se tiene que asegurar que el tejido estará bien preservado. Si esto último no se lleva a cabo con todas las cautelas posibles, pueden gestarse deducciones erróneas (Cabrerizo et al., 2015; y Betz et al., 1993). 18 En España se cuenta, entre otras, conlas autopsias/necropsias medicolegales o judiciales, que son ordenadas por el Juez. Lo que se pretende es que se fije la causa o causas que llevaron al sujeto a la muerte, la etiología medicolegal de la misma, así como aclarar las circunstancias en las que tuvo lugar. Además, este tipo de autopsias no requieren la aprobación de la familia. (Espinosa, 2008). El encargado de practicarla será el médico forense, aunque, la legislación europea aconseja que, en la medida de lo posible, sean dos médicos los que la lleven a cabo, de los cuales uno ha de contar con la cualificación en patología forense (Principio II, Recomendación N.º (99)3). Asimismo, la Recomendación N.º (99)3 de la Unión Europea dictamina que las autopsias medicolegales deberán realizarse cuando se esté ante una evidente muerte no natural o se dude acerca de ello, cuando haya un lapso de tiempo entre el acontecimiento causante y el fallecimiento, así como en supuestos determinados estrictamente (por ejemplo, homicidio o suicidio). 4.2.2 Imagenología: la Resonancia Magnética y la Tomografía Computarizada La imagenología es el “estudio y utilización clínica de las imágenes producidas por los rayos X, el ultrasonido, la resonancia magnética, etc.” (RAE, 23º ed.). Las herramientas empleadas por la imagenología han ido evolucionando y adaptándose a las exigencias del nuevo siglo, conformando un campo científico-técnico muy dinámico e innovador. Hoy en día, dentro de la ciencia forense, han adquirido relevancia la Resonancia Magnética y de la Tomografía Computarizada. Son dos medios que ofrecen una gran cantidad de ventajas en diversas direcciones: por un lado, permiten evitar la práctica de la autopsia sobre un cadáver y, por ende, la invasión o destrucción del cuerpo, lo cual es la opción a elegir por aquellas personas que profesan según qué creencia religiosa o poseen ciertos valores personales o culturales; y, por el otro, se caracterizan por ser métodos sencillos de emplear de los que emanan imágenes con una calidad visual magnífica y cuyos resultados se obtienen a través de lo que se conoce como imágenes 3D (Céspedes y Martínez, 2017). 19 Todo ello faculta a la Medicina Legal no solamente a respetar en su integridad la estructura corporal de los individuos fallecidos, sino también a extraer datos fehacientes y almacenables para posteriores estudios o reevaluaciones (Thayyil et al., 2010). El uso de la resonancia magnética (de aquí en adelante RM) es considerado muy provechoso para investigar, con carácter posterior a la muerte, tejidos blandos y averiguar si presentan lesiones o algún tipo de anomalía (Espinosa, 2008; Céspedes y Martínez, 2017). No obstante, eso no excluye que también pueda emplearse en aquellos supuestos de víctimas con vida que han padecido un acto violento (Tejaswi y Periya, 2013). Algunos casos en los que se puede acudir a la ayuda de la RM son los que señalan Céspedes y Martínez (2017): a) Fractura de la bóveda craneal: la RM permite observar con gran resolución el sistema nervioso central y toda la fisiología cerebral, así como los daños sufridos en el sistema ventricular. Por ello sirve como instrumento ideal para identificar efluvios y sangrados en áreas localizadas que hayan podido ser causados en sujetos fallecidos por politraumatismos en accidentes de tráfico, por objetos contundentes o caídas desde alturas muy elevadas. No obstante, lo anterior no significa que la RM sustituya a la autopsia convencional, sino que la complementa. b) Herida por arma cortopunzante en región torácica: dentro de esta categoría se incardinan tanto las heridas por arma de fuego y cortopunzante, como los traumas por accidentes. La dificultad del tipo de heridas que producen dichas armas radica en el hecho de que afectan a diversos tejidos y órganos al mismo tiempo. Con la RM es posible obtener imágenes que delimiten el recorrido de las lesiones y los daños anejos a su trayectoria. c) Traumas provocados por accidentes de tráfico: los huesos, los tendones y el tejido muscular constituyen el sistema osteomuscular. Cualquier lesión que sea originada en este sistema es fácilmente identificable por la RM. En palabras de los citados autores: “Su importancia es tal que, la mera observación de las articulaciones proporciona información relevante sobre el tiempo de vida de los cuerpos en estudio, así como de las patologías y medicaciones conexas que pudiesen llegar a producir deformaciones o cambios articulares” (p. 195). 20 d) Ahogamiento: el sistema gastrointestinal está cercado por órganos sólidos, hígado y páncreas, y huecos como el estómago y los intestinos; inundados por vasos como la arteria aorta. Aquí, particularmente, se emplean potenciadores que dejan entrever a la hora de la autopsia, la cantidad de líquido paralelamente a las partes sólidas en el estómago. e) Gas intrahepático: el gas intrahepático se halla con frecuencia en la RM postmortem en supuestos de muerte no traumática. f) Muerte por patología preexistente: Céspedes y Martínez (2017) exponen el caso de una mujer de 77 años que falleció de manera repentina tras una operación de aneurisma cerebral. La RM postmortem de cráneo únicamente evidenció que la hemorragia propia de la cirugía se había disipado. Sin embargo, la tomografía de tórax reveló “múltiples tumores pulmonares metafísicos con masas anormales en los bronquios y derrame pleural” (p. 196) que permitieron determinar la asfixia como causa de la muerte. g) Identificación de cadáveres: la RM también se ha empleado para identificar los cuerpos de individuos a partir de las características específicas de los mismos, tales como implantes, cirugías o fracturas vetustas. La desventaja con la que aquí nos topamos viene de la mano de la insuficiencia de inversión económica para con esta técnica, ya que, para que la RM pueda ser implementada y situarse al alcance de todos, se requieren escáneres con costes elevados. Empero, además, es necesario contar con un sistema de seguridad lo bastante blindado para que las imágenes obtenidas durante su uso no acaben en manos indeseadas; y actuar con la mayor diligencia posible para evitar accidentes imprevistos (Flach et al., 2014; Thayyil et al., 2010; y Céspedes y Martínez, 2017). Por su parte, la tomografía computarizada (de aquí en adelante TC) tradicional, ha sido eficaz en el descubrimiento de daños óseos (a nivel vertebral, costal y craneal) y en la ubicación de proyectiles y de metralla (Espinosa, 2008). Si bien, en la actualidad la mejora de los algoritmos matemáticos para la reconstrucción de la imagen TC ha originado una revolución en las posibilidades de interpretación digital de las imágenes obtenidas y se ha ampliado notablemente la cantidad de información que ofrece la TC. Su funcionamiento se basa en el uso de Rayos X que, junto a programas informáticos, permiten analizar la anatomía del cuerpo en 3D (Céspedes y Martínez, 21 2017). Gracias a los avances en el procesamiento digital de la imagen tomográfica, como, por ejemplo, la reconstrucción volumétrica tridimensional, es posible realizar valoraciones que mediante una autopsia tradicional no serían posibles de identificar (Espinosa, 2008), como, por ejemplo, roturas o taponamientos de vasos sanguíneos de minúsculo tamaño (Busardò et al., 2015). Igualmente, la TC trabaja de manera muy rápida, lo cual facilita el estudio de más cadáveres en menos tiempo (Brough et al., 2015). No obstante, Céspedes y Martínez (2017) apuntan que la TC se encuentra limitada en relación con la investigación de tejidos blandos y órganos internos, puesto que estos, tras sufrir una lesión, pueden experimentar transformaciones tan ínfimas que se convierten en indetectables para la técnica en cuestión. 4.3 Técnicas histopatológicas y moleculares 4.3.1 Técnicas de tinción histológicase histopatológicas: histoquímica e inmunohistoquímica “Tinción” es el término que, desde la medicina, se le acuña a la acción de “teñir”. Así, las tinciones constituyen el procedimiento y la consecuencia de teñir una cosa, es decir, de darle color a algo. En el campo de la Patología Forense, las tinciones tienen su utilidad en todo aquello relacionado con la vitalidad de las lesiones y su estudio tras la muerte de un sujeto. Esto es así dado que, lo que se pretende analizar son las células adheridas al tejido herido. Las tinciones permiten subdividir el campo de visionado de tal modo que, lo que marcan, son compartimentos diferentes y, gracias a eso, es más fácil discriminar la muestra. Dicho tinte favorece la calidad de la imagen que se ha obtenido, en la cual se observan células o porciones de tejido (entre otras alternativas), así como, en algunos casos, sirve para calibrar la existencia de determinados componentes en un agregado. En resumen, una tinción es una técnica que simplifica el examen de ciertos tejidos mediante el uso de diferentes tinturas y colorantes, los cuales coadyuvan a que tales tejidos o conjunto de células destaquen cuando sean observados a través del microscopio. Al tratarse de una técnica orientada a la evaluación de la data de las lesiones, debemos diferenciar dos planos de aplicación: la histoquímica y la inmunohistoquímica. 22 Dentro de la histoquímica2, la tinción más ensayada es la que se conoce como “H- E”, es decir, aquella cuya coloración cuenta con dos tintes: la hematoxilina (colorante de origen natural que se emplea en varios procedimientos, como en el método de Mayer y el de Harris) y la eosina (Cediel et al., 2009). Con este tipo de tinción se lograrán núcleos de tonos azules y violetas, al igual que se obtendrá la tinción de determinados componentes aniónicos citoplasmáticos como el ARN, ciertas proteínas extracelulares y otros como los glucosaminoglicanos. No obstante, la eosina teñirá la gran parte de los elementos citoplasmáticos membranosos y no membranosos, así como a la generalidad de moléculas extracelulares (Cediel et al., 2009). Una investigación llevada a cabo en China en el año 2020 por Yao et. al, estudió 20 muestras orales con tejidos duros que precisaban descalcificación. El contratiempo en dicho estudio radica en que los resultados que se obtenían variaban en función de si la tinción hematoxilina-eosina se realizaba sobre tejidos no sometidos a descalcificación y aquellos que sí. La solución la hallaron bañando las muestras en carbonato de litio, logrando que la tinción hematoxilina-eosina tiñera el tejido de forma mucho más excelente. Así, en el ámbito de la histopatología forense, este procedimiento puede ser aplicado para la observación a través del microscopio de tejidos óseos que han de ser descalcificados. Existen también otros tipos de tinciones, como la de Van Gieson para las fibras elásticas, las coloraciones tricrómicas de Masson para desvelar el colágeno (Cabrerizo et al., 2015) o las que van orientadas a la exploración de estructuras concretas (como la coloración con ácido periódico de Shiff) o al reconocimiento de microorganismos (por ejemplo, la coloración de Gram) (Cediel et al., 2009). Por otro lado, el procedimiento inmunohistoquímico emplea anticuerpos o inmunoglobulinas, orientados contra la proteína específica que se quiere revelar. Tales anticuerpos, para poder ser observados “tienen asociada una sustancia cromógena visible al microscopio de luz o una sustancia fluorescente, fluorocromo, visible por microscopía de fluorescencia” (Cediel et al., 2009, p. 42). Es decir, en la inmunohistoquímica se utilizan anticuerpos a los que se le une un componente fluorescente que coadyuva a que la proteína a investigar sea visualizable de una manera mucho más asequible. 2 Para más información, consultar el Anexo II. 23 En los estudios de datación de las lesiones, son especialmente útiles, los anticuerpos relacionados con los componentes moleculares de la inflamación, de la reparación tisular, con las proteínas de adhesión y los componentes de la matriz extracelular. A modo de ejemplo cabe destacar que, autores como Vergel y Zuluaga (2014), han descubierto que los marcadores inmunohistoquímicos desmina y C9 son eficaces en el diagnóstico postmortem de la isquemia cardiaca y, por ende, resultan muy útiles para la medicina forense. Asimismo, estudios internacionales realizados con anterioridad apoyan dichas conclusiones. Estudios como el llevado a cabo en Reino Unido por Doran, Howie, Townend y Bonser (1996), donde se analizó la conveniencia del C9 para diagnosticar la isquemia cardiaca temprana al cotejarlo con las tinciones histoquímicas y las tinciones de hematoxilina y eosina. En este estudio, mientras con hematoxilina y eosina se halló solamente en un 50% de los casos isquemia cardiaca, con el marcador C9 fueron positivos para necrosis la totalidad de los supuestos. Sin embargo, según autores como Cabrerizo et al. (2015), en la inmunohistoquímica, los métodos que se han ido practicando, pese a ser más recientes en el tiempo, no han sido plenamente verificados en patología forense, debido a, entre otros motivos, la mutabilidad de las particularidades del fallecimiento de un sujeto, el origen de las heridas y el lapso de tiempo transcurrido entre la muerte y el momento en el que se recolectan las muestras. 4.3.2 Metaloproteinasas de matriz y sus inhibidores Las metaloproteinasas son componentes de una clase de enzimas, las del grupo de las endopeptidasas zinc-dependientes (Chang, 2016). Una enzima es una proteína que favorece específicamente una reacción bioquímica del metabolismo en los seres vivos (RAE, 23º. Ed.). Pues bien, las enzimas a las que pertenecen las metaloproteinasas son capaces de separar las proteínas, las cuales se hallan, con carácter general, en los huecos existentes entre las células de los tejidos. Intervienen en la cicatrización de las heridas. Y, es que, en la piel tienen lugar un conjunto de eventualidades (tanto fisiológicas como patológicas) en las que se constata un incremento de creación de metaloproteinasas (Vaalamo et al., 1997). Como ya se explicó, la cicatrización es un proceso fisiológico cuyo objetivo es reparar una herida mediante la sustitución de los tejidos dañados por tejido nuevo, y 24 regenerarla a través del reemplazo de los tejidos perjudicados por otros histológicamente parecidos (Ferranti-Ramos et al., 2017). Es por ello por lo que, siguiendo a los mismos autores, las Metaloproteinasas de la Matriz Extracelular (de aquí en adelante MMPs) son manifestadas por distintos grupos de células durante el tiempo de cicatrización (como, por ejemplo, en los fibroblastos), aunque, fundamentalmente, gran parte se ubica en la Matriz Extracelular. Es decir, las MMPs están involucradas en aquellos momentos donde hay daño epitelial, endotelial y sea indispensable un proceso de curación de una lesión (Gibson y Schultz, 2013). Lo anterior se demuestra en el hecho de que, a lo largo de los primeros días tras producirse una herida, las células inflamatorias liberan MMPs para agilizar el crecimiento de tejido cicatrizal nuevo (Ferranti-Ramos et al., 2017). Por consiguiente, las funciones de las MMPs varían según la fase de cicatrización en la que se encuentren3. No obstante, mientras que en las primeras fases las MMPs son reguladas por células del tejido de la herida (células epiteliales, endoteliales y fibroblastos), en la última fase, la de regeneración, son los propios inhibidores de las MMPs quienes se encargan de regularlas. Dichos inhibidores son específicos de las metaloproteinasas y se conocen bajo el nombre de “inhibidores tisulares de metaloproteinasas” (TIMPs). Si los TIMPs realizan su función regulatoria de manera correcta, el proceso de cicatrizaciónserá el idóneo, pero si esto no sucede, el resultado será una herida crónica. El sino de la calidad de cicatrización se puede pronosticar mediante la medición de los niveles de las MMPs: si la actividad de las MMPs regulada por los TIMPs en una herida experimenta un aumento, el desarrollo de la cicatrización será el apropiado; en cambio, si los TIMPs no son los suficientes, serán demasiadas las MMPs que actúen en el proceso (Ferranti-Ramos et al., 2017). 3 Para conocer los tipos de Metaloproteinasas que pueden identificarse durante el proceso de cicatrización de las heridas, consultar el Anexo III. 25 4.3.3 MicroARN El ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico) son dos biomoléculas que constituyen los cimientos de nuestra información genética y, por ende, definen lo que somos como seres humanos y como personas individualmente consideradas. La diferencia entre ADN y ARN se halla en el hecho de que el ADN posee una información que, no solamente ha de llegar a las células de nuestro organismo, sino que también ha de ser comprendida por estas. Esa, precisamente, es la tarea del ARN: transferir los datos procedentes del ADN facilitando la síntesis de proteínas. Existen diferentes clases de ARN. Entre otros, se pueden destacar: el ARNm o ARN mensajero, que transfiere los datos contenidos en el ADN; el ARNt o ARN de transferencia, que traslada aminoácidos para la síntesis de proteínas; y los microARN, que son ARN de reducidas dimensiones, “no codificantes, cortos (18 a 24 nucleótidos) y de una única hebra, que se encuentran bien conservados en los organismos eucarióticos” (Rocchi et al., 2020, p.1). Son los microARN los que, desde 1993 hasta hoy, han ido ganando una importancia significativa en el mundo de la ciencia forense y, más específicamente, en la identificación de la edad de la herida y tasación del período de tiempo desde que se produjo la muerte (Silva et al., 2015; Poór et al., 2016; y Luan et al., 2018). Es más, el primer microARN fue descrito por Lee et al. (2001) en el helminto (gusano) Caenorahabditis elegans. En dicha especia se identificó una rol molecular relevante del microARN en la regulación del desarrollo larvario del helminto. Debido a su diminuta envergadura y a su intervención en las fases de cicatrización de las heridas, han sido ampliamente empleados como biomarcadores en el estudio de la vitalidad de las lesiones y en el cálculo de la muerte de un sujeto. No obstante, en el supuesto de la estimación del intervalo postmortem, influyen diferentes factores (Rocchi et al., 2020), como los ambientales (temperatura, luz solar, humedad), la causa y circunstancias de la muerte (Li et al., 2016) o, incluso, el tipo de tejido a analizar (Bauer, 2007), que han de tenerse en cuenta y ante los cuales, pese a ubicarse en etapas avanzadas, los microARN se suelen mostrar estables. 26 Los microARNs (de aquí en adelante ARNmi), presentan una serie de características que son expuestas por Rocchi et al. (2020) de la siguiente manera: • Regulan la expresión de varios tipos de genes mediante la prevención de la síntesis proteica o favoreciendo la degradación postranscripcional del ARNm por clivaje. • Dado que la interacción entre el ARNm y el ARNmi solo requiere unas cuantas bases, los ARNmi suelen tener varias dianas biológicas. • Existe una base de datos bioinformáticos de ARNmi (1917 ARNmi codificadas por el genoma humano). • La mayor parte de los ARNmi son intracelulares pero algunas han sido identificadas en distintos fluidos (sangre, saliva, lágrimas, líquido cefalorraquídeo, etc.). Éstos son estables a distintas temperaturas, pH o, incluso, a tratamientos químicos o a la actividad de las enzimas ARNasas endógenas, dado que circulan en vesículas extracelulares, unidas a complejos lipoproteicos y proteínas de unión a ARNs. • Su estudio se puede efectuar de un modo rápido y múltiple mediante microarrays o técnicas nuevas de secuenciación (NGS: next generation sequencing) y de un modo cuantitativo en tiempo real mediante la PCR a tiempo real (qRT-PCR). En el plano de la Patología Forense, los ARNmi adquieren interés en relación con los siguientes aspectos (Rocchi et al., 2020): 1. Respecto a la vitalidad de las heridas, ayudan a distinguir reacciones vitales de cambios postmortem, así como a establecer la edad de la herida. 2. En casos de premoriencia o postmoriencia en un incendio, se han identificado ARNmi que no semejan afectarse por el calor o las quemaduras postmortem. 3. Por lo que concierne a la determinación de la cronotanatología, hay que tener en cuenta que el intervalo postmortem (en adelante PMI) constituye un importante desafío en el ámbito forense. Es por ello por lo que los ARNmi son interesantes candidatos por su resistencia a la degradación, a la temperatura y a las condiciones de putrefacción corporal. Es cierto que varios estudios no han logrado demostrar una correlación entre los niveles de ARNmi y la etapa temprana de PMI (primeras 24 horas). Sin embargo, Lv et al. (2016) identificaron que miR-1-2 y 18S rNA eran grandes aspirantes a biomarcadores del PMI entre las 90-120 horas. 27 Por otra parte, Wang et al. (2013), en modelos animales, registraron miR- 206 y miR-133 como posibles marcadores del PMI entre las 24 y 48 horas. Finalmente, un estudio reciente de Na et al. en el año 2020, sugiere que let-7e y miR-16 pueden también ser candidatos para estimar el PMI de varios meses en tejido óseo. En consecuencia, si bien en la actualidad parámetros como la valoración del algor mortis, livor mortis, rigor mortis, cambios bioquímicos en el humor vítreo y la entomología, constituyen métodos de uso común para la determinación del PMI, los perfiles de ARNmi podrían representar una herramienta suplementaria a las técnicas bioquímicas y moleculares clásicas. Por consiguiente, se puede concluir mediante la afirmación de que los microARN, por sus propias particularidades, como su precisión, su idoneidad para ser examinados de forma equidistante con el ADN, su consistencia y su poca sensibilidad a la descomposición, son el instrumento perfecto para la praxis forense (Rocchi et al., 2020). 4.4 Visión prospectiva de la patología forense Durante los últimos años, la labor del médico y el patólogo forense de determinar la edad de las heridas ha ido adquiriendo cada vez mayor fuerza. Una labor que en la actualidad ha incorporado nuevas técnicas complejas, haciendo muy necesario la incorporación y cooperación múltiples disciplinas para una correcta interpretación de la datación de las heridas. Pese a los avances en las técnicas y la obtención de nueva información multidisciplinar relacionada con la datación de las lesiones, sigue siendo necesario la obtención de más datos, bien mediante estudios con animales cuyos resultados fueran extrapolables al ámbito humano, o bien, mediante de muestras de autopsias. El problema radica en que, las investigaciones con animales no son ni concluyentes ni totalmente fiables, y que las muestras de autopsias son inexistentes o reducidas (Li et al., 2020). Por otra parte, el desarrollo de técnicas histoquímicas e inmunohistoquímicas y el empleo de diversos marcadores han permitido estudiar múltiples moléculas y proteínas al mismo tiempo. Esto, obviamente, ha agilizado el proceso de resolución de la edad de una 28 herida, además de recabar una información más concreta y fidedigna. Aunque, es necesario mejorar las tácticas de elección de los marcadores idóneos (Li et al., 2020). Finalmente, sería conveniente no dejar a un lado la imagenología postmortem y atender a las ventajas que tanto la resonancia magnética como la tomografía computarizada ofrecen al marco de las ciencias forenses y, por ende, al Derecho Penal. Tal vez lo aconsejable es destinar una cantidadeconómica más que aceptable a la creación de “unidades de imágenes diagnósticas forenses” (Céspedes y Martínez, 2017, p.198). 5. CONCLUSIONES 1. Pese a que, en las últimas décadas, se ha progresado en la evaluación de la data de las heridas, es imprescindible no olvidar que la tasación es una estimación. Es decir, el avance en el plano tecnológico es indudable, lo cual le ha permitido a la Medicina Legal ensayar en la práctica, entre otras cosas, la combinación de varios marcadores. 2. La incorporación de las técnicas de laboratorio histoquímicas, inmunohistoquímicas y de biología molecular ha contribuido a la expansión en la obtención datos cronológicos de datación de las heridas. No obstante, por el momento, estas técnicas no permiten una datación exacta y precisa, contribuyendo fundamentalmente a complementar y acotar los intervalos de tiempo postmortem establecidos por observaciones y recolecta de información obtenida en el lugar del levantamiento y en durante la realización de la autopsia. 3. Las modificaciones cadavéricas por transformación y descomposición cadavérica en función de factores externos (temperatura y humedad ambiental, sumersión, etc.) y factores internos (patología endocrina, infección, etc.) introduce una mayor variabilidad en la mayor parte de los elementos y fenómenos empleados para la datación de la lesión antemortem o postmortem, dificultando la interpretación correcta, a pesar de la mejoría que suponen las técnicas de datación forense más modernas. 4. Fechar una lesión consiste en indicar un intervalo de tiempo, lo cual supone que no hay que interpretarla de manera rotunda, puesto que, actualmente, no se cuentan con parámetros, sistemas o técnicas cuyos resultados sean totalmente fiables de forma individual. 29 6. BIBLIOGRAFÍA Y WEBGRAFÍA 6.1 Bibliografía Gisbert Calabuig, J. A. Medicina Legal y Toxicología. 3ª Ed. Valencia: Saber, 1985. Young, B., Woodford, P., & O’Dowd, G. (2014). Wheater. Histología funcional: Texto y Atlas en color (6.a ed.). 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