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.1 Biorremediación en suelos contaminados por hidrocarburos de petróleo: Retos y oportunidades para Colombia en el marco de los .2 Biorremediación en suelos contaminados por hidrocarburos de petróleo: Retos y oportunidades para el Colombia en el marco de los Objetivos de Desarrollo Sostenible José Manuel Niño Zárate Trabajo de Grado para optar por el título de Microbiólogo Director de Monografía Martha Vives Flórez PhD en Ciencias Biológicas Universidad de los Andes Facultad de Ciencias Dpto. de Ciencias Biológicas Junio de 2023 .3 INDICE Resumen ................................................................................................................................................ 6 Introducción .......................................................................................................................................... 7 Objetivos ............................................................................................................................................... 9 Objetivo General ....................................................................................................................................... 9 Objetivos Específicos ................................................................................................................................. 9 Método ................................................................................................................................................. 10 Petróleo ............................................................................................................................................... 12 Formación del Petróleo ........................................................................................................................... 12 Definición: Petróleo ................................................................................................................................. 13 Clasificación Hidrocarburos ..................................................................................................................... 14 Hidrocarburos totales de Petróleo TPH .................................................................................................. 16 Petróleo y Medio Ambiente ............................................................................................................... 17 Definición suelo contaminado ................................................................................................................. 17 Interacción con el suelo........................................................................................................................... 17 Afectación del suelo y la biota ................................................................................................................ 19 Flora ......................................................................................................................................................... 20 Fauna ....................................................................................................................................................... 20 Seres Humanos ........................................................................................................................................ 20 Cuerpos de agua dulce y comunidades ictiológicas ................................................................................ 21 Biorremediación ................................................................................................................................. 22 Definición de Biorremediación ................................................................................................................ 22 Fundamentos de la biodegradación ........................................................................................................ 24 Factores que supeditan la biorremediación en el suelo ......................................................................... 28 Temperatura ........................................................................................................................................ 28 pH ......................................................................................................................................................... 29 Nutrientes ............................................................................................................................................ 29 Humedad ............................................................................................................................................. 30 Oxígeno ................................................................................................................................................ 30 Microorganismos ................................................................................................................................. 30 Contaminante ...................................................................................................................................... 31 Estructura del Suelo ............................................................................................................................. 31 Organismos degradadores de hidrocarburos en suelos .......................................................................... 32 .4 Técnicas de biorremediación en suelos .................................................................................................. 39 Bioaumentación .................................................................................................................................. 40 Bioestimulación ................................................................................................................................... 41 Atenuación Natural ............................................................................................................................. 42 Biospargin ............................................................................................................................................ 42 Bioventing ............................................................................................................................................ 43 Bioslurping ........................................................................................................................................... 43 Landfarming ........................................................................................................................................ 44 Compostaje .......................................................................................................................................... 44 Compostaje por hileras ........................................................................................................................ 44 Biopilas ................................................................................................................................................ 45 Bioreactor ............................................................................................................................................ 45 Estado Contaminación por Hidrocarburos de Petróleo en Colombia ........................................... 46 Fuentes de Contaminación por Hidrocarburos de Petróleo ................................................................... 48 Histórico Contaminación por Hidrocarburos de Petróleo (1986-2015) .................................................. 50 Radiografía Contaminación por Hidrocarburos entre periodo 2015-2022 ............................................. 60 Pasivos Ambientales ................................................................................................................................ 68 Disposición finalde Residuos Peligrosos RESPEL de la Industria Petrolera ............................................ 71 Legislación Ambiental en Colombia ................................................................................................. 73 Normativa Nacional ................................................................................................................................. 73 Convenios Internacionales Suscritos ....................................................................................................... 78 Organización Institucional Ambiental ............................................................................................. 81 Organización Institucional a nivel Ambiental y Desarrollo Sostenible .................................................... 81 Panorama de la Biorremediación en Latinoamérica ...................................................................... 85 Resultados: Estado de la Biorremediación en Colombia ................................................................ 90 Manejo de Residuos: Lodos y Suelos Contaminados .............................................................................. 90 Protocolo Operativo de implementación de Biorremediación ............................................................... 93 Empresas Colombianas de Biorremediación ........................................................................................... 98 Mapa de la Biorremediación en Colombia ............................................................................................ 101 Panorama General de Biorremediación de la Industria Petrolera en los últimos años ........................ 107 Biorremediación en Ecopetrol ............................................................................................................... 111 Biorremediación de Residuos Peligrosos ........................................................................................... 113 Reclamaciones sobre Impactos socio-ambientales ........................................................................... 116 .5 Biorrremediación en Campo :Período Actual .................................................................................... 118 Desarrollo Tecnológico de Biorremedación por parte del ICP ........................................................... 119 Patentes productos de Biorrremediación ............................................................................................. 122 Estudios de Biorremedación en Colombia ............................................................................................ 127 Cepas Autóctonas aisladas con capacidad de Degradar Hidrocarburos en suelos o sedimentos ..................................................................................................................................... 128 Técnicas estudiadas en Colombia ...................................................................................................... 132 Discusión ........................................................................................................................................... 136 Metodología de Análisis ........................................................................................................................ 136 Biorremediación y la Economía Circular: Oportunidades para el país hacia un modelo sustentable .. 139 Biorremediación y Bioeconomía: Hacia un camino de competitividad económica y un enfoque de valorización de los sitios contaminados ................................................................................................ 147 Matriz DOFA .......................................................................................................................................... 156 Técnico ............................................................................................................................................... 156 Institucional ....................................................................................................................................... 160 Marco Legislativo: El que Contamina Remedia ..................................................................................... 163 Política para la Gestión Sostenible del Suelo ........................................................................................ 167 Estudios Nacionales de Técnicas de Biorremediación: Porcentajes de Eficiencia ................................ 172 Impacto en los Objetivos del Desarrollo Sostenible ODS ...................................................................... 175 Impactos Directos .............................................................................................................................. 176 Impactos Indirectos ........................................................................................................................... 180 Conclusiones ..................................................................................................................................... 184 Retos y Oportunidades para el Éxito ..................................................................................................... 184 .6 Resumen Esta investigación recopila información sobre el estado de la contaminación en Colombia por derrames de petróleo, desde el año 1986 hasta la actualidad y su afectación en suelos. Así mismo se resumen leyes y convenios internacionales suscritos más relevantes en cuanto a hidrocarburos, medio ambiente y residuos peligros RESPEL , además de citar las instituciones cuyo trabajo está estrechamente relacionado con la actividad de hidrocarburos. En los resultados se establece cuál es el panorama de la biorremediación a nivel nacional, que tan extendido está y como ha sido utilizado para reducir el impacto ambiental. En la discusión se plantea un método de análisis para establecer los retos y oportunidades que enfrenta el país mediante varios ejes: bioeconomía, economía circular, matriz DOFA a nivel técnico e institucional, cambio en el enfoque legal, su incorporación en la Política Sostenible del Suelo y como están alineados con los Objetivos del Desarrollo Sostenible (ODS). Finalmente se indagan los objetivos y metas de las ODS que se impactan, encontrándose 6 objetivos de forma directa y 6 de forma indirecta que pueden desarrollarse como consecuencia de una mayor aplicación de la biorremediación. Se concluye que la masificación de la biorremediación en el país aún es insuficiente, pero tiene espacio para el crecimiento si se implementa una política sinérgica más efectiva entre entes del estado, sector privado, universidades y emprendedores y se destina una mayor inversión que según el diagnóstico, aún es insuficiente. Palabras clave: biorremediación, hidrocarburos, petróleo, bioeconomía, objetivos del desarrollo sostenible .7 Introducción La industria extractiva del petróleo es el motor de la economía del país, no obstante también ha representado una causa de contaminación debido a los derrames que se han producido tanto por acciones dentro del conflicto armado como por las mismas actividades inherentes a los procesos operativos de la industria, viéndose afectados una gran cantidad de extensiones de terrenos con el consecuente daño a la flora y fauna que perdurarán por años y que incidirán en cambios graves en las relaciones bióticas y en las estructuras mismas del suelo (Calderón Gómez, 2006; Departamento Nacional de Planeación, 2016b) Pese este panorama pesimista, el país ha empezado a abordar el camino del desarrollo sustentable, que busca un balance óptimo entre economía, protección al medio ambiente y bienestar social, trabajando en las primeras pautas a nivel de institucionalidad, marco legal y fomentos económicos (Muñoz Gaviria, 2011; Universidad EAFIT et al., 2018b) Para 2030 la nación tendrá que presentarsu primer balance de los avances que ha logrado en cuanto a los Objetivos del Desarrollo Sostenible (ODS) , un acuerdo que fue suscrito por miembros de la O.N.U y que está basado en 17 objetivos y 169 metas, no obstante a pesar de no ser de obligatorio cumplimiento, si se convierte en una necesidad apremiante debido a la conciencia que se ha adquirido de proteger el planeta frente un futuro previsible donde la supervivencia de la misma sociedad se ve entredicha (Organización de las Naciones Unidas, 2022) Por ello en este contexto se propone hacer un estudio crítico de la biorremediación como herramienta para cumplir con los ODS y que permita a Colombia la recuperación de sus suelos degradados por los hidrocarburos, mirando las oportunidades y retos que se presentan en entes del estado, .8 compañías petroleras, centros de investigación ,empresas de biorremediación y la sinergia efectiva que debe haber entre todas ellas para que se produzca una ejecución de forma amplia en el territorio y al mismo tiempo se fomente la innovación, la tecnología, el emprendimiento y el desarrollo que conlleve al país a tener una economía sofisticada que contribuya a una mejor calidad de vida, una sociedad más educada y responsable con su medio ambiente y que se aprovechen las ventajas que ofrece la biorremediación para el desarrollo sustentable y la mitigación de los daños generados por la extracción de crudo. .9 Objetivos Objetivo General Hacer un estudio critico de la biorremediación en suelos contaminados por hidrocarburos de petróleo, analizando los retos y oportunidades que se encuentran en el país para lograr su implementación de forma más amplia y comprender los beneficios que esto conllevaría en el desarrollo de una economía sostenible, un mayor progreso en innovación y una mejor conciencia en la protección del medio ambiente. Objetivos Específicos 1. Compilar información sobre el estado de la contaminación por hidrocarburos de petróleo en el país desde 1986 hasta la fecha actual. 2. Determinar la normativa existente que aplica para la protección del medio ambiente, la industria del petróleo y manejo de residuos peligrosos RESPEL, así mismos tratados internacionales suscritos. 3. Establecer el panorama de la biorremediación en Colombia, determinando la magnitud de su aplicación en empresas privadas y los mecanismos de actuación de Ecopetrol S.A.S que es la mayor petrolera del país y principal causante de reportes de contaminación 4. Proponer un modelo de investigación que posibilite diagnosticar los retos y oportunidades de la biorremediación en el país y establecer los beneficios que esto proporcionaría para el desarrollo de una economía sostenible mediante un modelo de análisis 5. Precisar que objetivos y metas de las ODS se estarían impactando con la biorremediación. .10 Método La metodología para esta monografía consistió en 3 fases: una primera de investigación minuciosa de la información, una segunda de obtención de resultados que permitió conocer el panorama de la biorremediación para recuperar suelos afectados por hidrocarburos en Colombia y una tercera de discusión que incluyó la proposición de un método de análisis que brindó las herramientas para discutir los retos y oportunidades. Para ello se consultó información del repositorio Uniandes, Google Académico , la Revista Colombiana de Biotecnología de la Universidad Nacional, bases de datos de la Superintendencia de Industria y Comercio, reportes de sostenibilidad de varias petroleras del país, documentos de la empresa ambiental Innova sobre pasivos ambientales, informes de varias entidades del estado como el Departamento Nacional de Planeación DNP, Contraloría General de la Nación, Comisión de la Verdad sobre afectación al ambiente en medio del conflicto, la Car Cundinamarca, el IDEAM, Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible y CONPES en temas de desarrollo sostenible, economía verde y biotecnología , además de estudios de investigación de economía circular de la ANDI, ensayos de bioeconomía del Instituto Humboldt, la CEPAL y el portal sobre desarrollo sostenible de la ONU, así mismo se complementó con derechos de petición a las empresas Ecopetrol y la ANLA. Se establecieron varios criterios: palabras clave ( biorremediación, Colombia, hidrocarburos, petróleo, suelos, lodos, desarrollo sostenible, fitorremediación, biorremediación in situ y ex situ, técnicas biorremediación, biodegradación, bioaumentación, bioestimulación, ladfarming, biopilas), tipos de estudio (tesis de pregrado y maestría, reportes institucionales, informes de empresas privadas), objeto .11 de estudio (Colombia, petróleo y suelos) , fecha de publicación (desde el año 2000 en adelante) e idioma (inglés y español) . Los resultados fue la información obtenida sobre el estado de aplicación de la biorremediación en el país, lo que arrojó un primer análisis sobre el panorama nacional. La discusión se basó en la proposición de una metodología de análisis de varios pasos abarcando los siguientes ejes: economía circular, bioeconomía, matriz DOFA a nivel institucional y técnico, fortalecimiento de la biorremediación con el cambio de enfoque legal “el que contamina remedia” , su incorporación a la Política Sostenible del Suelo, la indagación sobre los estudios hechos a nivel nacional en cuanto a técnicas y cepas aisladas con capacidad degradadora y los objetivos del desarrollo sostenible que se estarían impactando con una política eficiente. Finalmente, el propósito es responder una sola pregunta: ¿ qué tan preparado está el país para masificar la biorremediación y como su uso amplio y efectivo jugará un papel vital en el avance de los objetivos del desarrollo sostenible? .12 Petróleo Formación del Petróleo Los hidrocarburos empezaron a formarse hace 250 millones de años cuando los desechos orgánicos de animales y vegetales empezaron a acumularse en el fondo de los mares y lagos junto con otros agregados minerales. Con el paso del tiempo, los cambios biológicos y geotectónicos que sucedieron causaron que los lechos empezarán a quedar sepultados por otras capas de tierra que se iban acumulando encima, generando un mayor peso sobre estos y aumentando la temperatura y la presión donde estaban situados, esto provocó que millones de años después estos residuos orgánicos se transformarán en gas y petróleo, facilitado además porque las moléculas de hidrocarburos quedaban atrapadas en roca impermeable. Producto de movimiento de las capas tectónicas, se generaron fracturas por donde estas moléculas empezaron a filtrarse a capas superiores más porosas, sin embargo, en la mayoría de los casos, estas encontraron una barrera impermeable que evitó que se siguieran movilizando hacia la parte más superficial, quedando finalmente atrapadas. Actualmente los procesos tradicionales de extracción involucran extraer crudo de esa primera capa permeable, mientras que en el fracking busca la salida de esa capa más profunda e impermeable (Castro Cabello, 2015; Instituto Argentino del Petróleo y del Gas, 2015). En la cadena productiva del petróleo, el crudo es aquel que está presente de manera natural y sin procesar, pero luego de ser refinado queda convertido en gasolina que es la composición más ligera (Castro Cabello, 2015; Ponce Contreras, 2014). .13 Definición: Petróleo El petróleo es un líquido espeso, negro y con derivados de alquitrán, constituido por más de 200 moléculas de hidrocarburos que conforman desde un 50% hasta un 98% de su concentración, destacando las parafinas como su principal elemento. A nivel de átomos está formado de Hidrógeno (10-14%), Carbono (76-86%), además de Azufre (0.8%), Oxígeno (0.4%), Nitrógeno (0.4 %), Cloro, Bromo, Flúor y Fósforo (Loya del Ángel, 2013; OlayaRojas & Triviño Cortes, 2019; Rodríguez Calvo, 2017; Viñas Canals, 2005).La composición del crudo depende del sitio donde se formó y la transformación minero- geológica que haya experimentado (Loya del Ángel, 2013; Ponce Contreras, 2014) . Sus propiedades son la solubilidad y volatilidad y se clasifica como amargo, semiamargo o dulce dependiendo de la concentración de azufre (Castro Cabello, 2015; Ponce Contreras, 2014). Los hidrocarburos que componen el petróleo suelen ser entre un 70 a un 97% degradables bien sea por procesos químicos o biológicos, el resto son elementos estables como las parafinas. Se encuentran en los estados líquido, gaseoso y sólido (Ponce Contreras, 2014), su importancia en contaminación se debe a varias propiedades como es su dificultad de biodegradación , el volumen de bioacumulación en las estructuras de suelos y aguas y el nivel de toxicidad en especies vegetales y animales (Rodríguez Calvo, 2017). Según su origen se clasifican en dos clases: biogénicos y antrópicos (Castro Cabello, 2015; Rodríguez Calvo, 2017) el primero es el que se presenta de forma natural en el ambiente y se denomina crudo, mientras que el segundo es resultado de las actividades económicas del ser humano que conlleva la transformación del petróleo y su proceso de refinamiento generando productos más ligeros como el diésel (Castro Cabello, 2015; Loya del Ángel, 2013). .14 Clasificación Hidrocarburos Los hidrocarburos se clasifican en dos grupos: alifáticos de cadena abierta y alifáticos de cadena cerrada denominados alicíclicos. Los de cadena abierta se dividen en saturados e insaturados, ambos se subdividen en lineales y ramificados. Los de cadena cerrada en saturados, insaturados y aromáticos (Castro Cabello, 2015; Malaver Flor & Muñoz Sánchez, 2018; Rodríguez Calvo, 2017). Los alifáticos de cadena abierta saturados son aquellos que poseen enlaces sencillos y se catalogan como alcanos. Su fórmula es CnH2n+2. En los alcanos lineales se encuentran el metano (CH4), etano (CH3CH3) , el propano (CH3CH2CH3) entre otros. Dependiendo del número de carbonos se denominan gaseosos si poseen un numero de átomos inferior a 8 y se catalogan como de bajo, medio o alto peso molecular si su número está entre 8-16, 17-28 y más de 28 respectivamente. En los ramificados un hidrógeno es remplazado por un grupo alquilo (CH3) como el metilpropeno (CH3- CH-(CH3)2). Los insaturados son los que poseen enlaces dobles y se llaman alquenos, su fórmula es CnH2N y si poseen enlaces triples se catalogan como alquinos CnH2n-2, los cuales también pueden ser lineales o ramificados como el Buteno y el Butino (Castro Cabello, 2015; Rodríguez Calvo, 2017) El segundo grupo son los Alifáticos cíclicos o de cadena cerrada conocidos como Alicíclicos. Estos son saturados si son formados por átomos de Carbono en una estructura cerrada unidos mediante enlaces simples. Son los Cicloalcanos y su fórmula es CnH2n. Los insaturados son los que tienen al menos un enlace doble como los cicloalquenos CnH2n-2 o cicloalquinos si tienen un triple enlace CnH2n- 4. Los aromáticos son los que están formados por un anillo de 6 carbonos unidos con enlaces sencillos y dobles intercambiados entre si creando una estructura llamada anillo. Los aromáticos policíclicos tienen dos o más anillos aromáticos enlazados entre sí y se conocen como PAH (hidrocarburos .15 policíclicos aromáticos) (Castro Cabello, 2015; M. L. Gómez et al., 2006; Rodríguez Calvo, 2017). La Figura 1 muestra la forma como están distribuidos los Hidrocarburos. Figura 1 Clasificación moléculas de Hidrocarburos. Nota: Elaborado con información de “Biorremediación de agua contaminada por diésel y petróleo empleando un microbioma y sustancias húmicas” (p.31), por D.C. Castro ,2015, Instituto Politécnico Nacional, “Biorremediación de aguas contaminadas con hidrocarburos mediante sistemas bio-adsorbentes” (p.11), por A. Rodríguez, 2017,Universidad de Granada: Instituto de Investigación del Agua y “Tecnologías para la restauración de suelos contaminados por hidrocarburos”. (pp.7-8), por D.I. Loya del Ángel,2013,Universidad Veracruzana. .16 Hidrocarburos totales de Petróleo TPH TPH es la agrupación de todas las diferentes clases de hidrocarburos presentes en el crudo, debido a que la cantidad es tan grande es más práctico tratarlos como una agrupación que de forma individual. Estos han sido divididos en base a la forma similar como se disuelven y reaccionan en suelos o aguas. Dependiendo de su peso y enlaces tendrán a flotar en el agua o a hundirse y acumularse en el fondo, lo mismo sucede con el suelo, manteniéndose en la parte superior de la tierra o movilizándose a través de la porosidad de este. Su toxicidad radica cuando su cantidad es superior a la capacidad de los microorganismos de poder degradarlos, acumulándose en las partículas del suelo en magnitudes que provocan cambios en las relaciones bióticas (Castro Cabello, 2015; Malaver Flor & Muñoz Sánchez, 2018) .17 Petróleo y Medio Ambiente Definición suelo contaminado Un suelo contaminado es aquel que ha experimentado daño en sus propiedades fisicoquímicas debido a la acumulación de sustancias de carácter toxico provenientes de actividades industriales, generando un riesgo para los seres vivos y redes tróficas (Olaya Rojas & Triviño Cortes, 2019; Ponce Contreras, 2014). Interacción con el suelo Los hidrocarburos presentes en el crudo ocasionan un desbalance en el número de átomos, alterando el equilibrio entre carbono, nitrógeno y fósforo, con el carbono acumulándose de forma excesiva dentro de las partículas de la tierra , desencadenando un cambio en las sustancias orgánicas (que son aquellas que se forman por la absorción de carbono proveniente de restos de animales y vegetales. El aumento de carbono proveniente del petróleo altera las sustancias orgánicas con impactos negativos en el suelo y sedimentos ,modificando varios de sus procesos naturales y afectando las relaciones bióticas entre las diferentes especies que interaccionan dentro de este (Olaya Rojas & Triviño Cortes, 2019;Vera Solano, 2021), además restringe en gran medida el flujo de elementos gaseosos, entre ellos el oxígeno, elevando el nivel de estrés ambiental que se verá condicionado por la humedad presente, textura y temperatura del suelo afectado y volumen de contaminante absorbido (Benavides López De Mesa et al., 2006). Así mismo la disponibilidad de nutrientes para microrganismos y plantas se verá reducido por la restricción en la accesibilidad de estos (Ponce Contreras, 2014). Una vez en contacto con la tierra, los hidrocarburos más pesados se acumulan en .18 los niveles más superficiales y los más livianos se absorben, distribuyéndose en forma vertical hacia las capas inferiores debido a su mayor nivel de solubilidad (Flores Ganem, 2010; Ponce Contreras, 2014) ,llegando alcanzar las aguas subterráneas o por procesos de escorrentía se desplazarán hasta llegar a los lechos de los ríos depositándose en los sedimentos (Vera Solano, 2021). La porosidad en suelos ve reducida, modificando la estabilidad de los canales de migración químico y biótico (Ponce Contreras, 2014). Diferentes alteraciones fisicoquímicas experimentan los hidrocarburos en su interacción con el suelo, prolongándose en el tiempo y pasando por procesos diferentes. El primero es la vaporización, ocurre cuando ciertas moléculas por sus propiedades particulares se evaporan más fácil a la atmósfera, haciendo que el crudo residual se vuelva más viscoso y menos tóxico debido a su densidad no se movilizara tan fácil entre los poros del suelo y se depositara en áreas más específicas. La oxidación ocurrida por radiación con UV descompone las estructuras de los hidrocarburos, aunque es poco lo que llega a reaccionar con el oxígeno debido a sudificultad de entrar en las manchas de crudo . Por último, la biodegradación es cuando el petróleo es aprovechado por ciertas bacterias y plantas utilizando las fuentes de carbono para sus procesos metabólicos (Loya del Ángel, 2013). En otros casos el petróleo llega hasta las fuentes de agua, flotando en sus superficies o precipitándose en sus sedimentaciones, siendo los de tipo arcilloso los que absorben hidrocarburos con más facilidad (Olaya Rojas & Triviño Cortes, 2019). La sedimentación del petróleo en las profundidades de cuerpos de agua se presenta bien sea porque al ser muy viscoso y pesado tiene mayor peso que al agua circundante y se hunde o porque logra ser absorbido por las partículas que hay en el agua y luego tienden por procesos naturales acumularse en el fondo (Loya del Ángel, 2013). .19 Afectación del suelo y la biota El efecto nocivo en el suelo y sus consecuencias en los ciclos ecológicos e interrelaciones con las cadenas biológicas se evidencia entre otros , por la perturbación de comunidades microbianas, reducción en el crecimiento de flora y capa vegetal, el traspaso de elementos dañinos en la cadena trófica, acumulación excesiva que sobrepasan las capacidades de descomposición de bacterias que se alimentan de hidrocarburos, disminución de oxígeno en las diferentes capas, polución de la atmósfera por combustión , contaminación de aguas subterráneas y mantos acuíferos , cambios en el pH y salinidad de los suelos, desencadenando reducción de la calidad de los cultivos , acumulación en los sedimentos de ríos y lagos y reducción de procesos de fotosintéticos por taponamiento de la luz con consecuente muerte de microalgas y plantas acuáticas (Ponce Contreras, 2014; Vera Solano, 2021). El impacto general en la alteración de las redes ecológicas no es solo por la transmisión de compuestos tóxicos y mortales en la cadena alimenticia sino por el desbarajuste del equilibrio ambiental, como la muerte de pequeños invertebrados de la microbiota y mesobiota que no logran huir fácilmente de los derrames y que tienen el papel sustancial en la formación de suelo , adicional la intoxicación directa de reptiles y mamíferos al consumir compuestos cancerígenos o la inmovilidad de la aves por la adherencia del crudo en sus plumas (Miranda & Restrepo, 2005). El volumen de petróleo vertido, el tiempo que haya estado presente en el medio y los tipos de moléculas químicas son factores que inciden en el nivel de daño que se pueda ocasionar (Ponce Contreras, 2014). .20 Flora En las plantas se producen necrosis en sus tejidos, clorosis por falta de nutrientes o raíces dañadas, deterioro en las semillas que interrumpen la germinación y reproducción, quema de tejido vegetal por contacto directo y asimilación de componentes tóxicos que inducen la muerte (Vera Solano, 2021). Fauna En las aves el crudo se pega a sus alas, quitándoles su capacidad de aislamiento térmico y causándoles hipotermia, además al tratar de limpiarse ingieren el contaminante. En los anfibios al adherirse a su piel actúa como barrera impidiéndoles sus procesos de transpiración (Vera Solano, 2021). Se ha observado anemia en patos y aparición de cáncer en pequeños mamíferos (Ponce Contreras, 2014), en reptiles los hidrocarburos entran por vías respiratorias cuando están semisumergidos en el agua y el consumo de peces contaminados afecta a todos que de estos se alimentan (Miranda & Restrepo, 2005). Seres Humanos Existen 3 rutas de entrada del crudo al cuerpo: de forma directa al consumir agua o peces, por contacto directo con la piel o por inhalación en vías respiratorias. Entre las diversas enfermades están alteraciones al sistema neuronal, modificación de células rojas en la sangre, cáncer, daño en órganos, inflamación y quemaduras en la piel, migrañas, vómitos mareos y picazón en las extremidades (Ponce Contreras, 2014). .21 Cuerpos de agua dulce y comunidades ictiológicas Suelos y aguas están interconectados por procesos químicos, biológicos y geológicos, lo que sucede en uno irremediablemente se ve reflejado en el otro. En el caso de derrames de petróleo su circulación se ve favorecido por la gravedad natural y por procesos de escorrentía en el que los hidrocarburos que hayan logrado penetrar en el suelo se movilizarán a través de la porosidad favorecido por la humedad y la fuerza motriz que provoca el agua al desplazarse también por las capas superficiales y medias (Flores Ganem, 2010). La fotosíntesis es el mecanismo más afectado en los ríos, quebradas, lagos y lagunas por la ausencia de captación de luz por parte de flora acuática debido a la barrera que genera la acumulación de hidrocarburos en la superficie. En estudios hechos por Ecopetrol S.A se ha observado que la inhibición de la fotosíntesis decrece el fitoplancton nativo por falta de oxígeno disuelto y promueve la proliferación de microbiota oportunista como las cianobacterias que al no ser parte de la cadena trófica afectan sustancialmente la supervivencia de especies superiores limitando la recuperación del ecosistema o generando uno nuevo. En el caso de regiones aledañas por donde pasa el oleoducto Caño Limón-Coveñas, investigaciones han resaltado el papel de las macrófitas. Estas plantas acuáticas retienen los hidrocarburos en sus raíces y tejidos, lo que favorece la limpieza de forma natural, no obstante, cuando están totalmente impregnadas lo mejor es removerlas ya que se puede producir un rápido recambio poblacional. Estas cualidades fueron notadas cuando en áreas impactadas por derrames, el medio ambiente mejoraba sustancialmente después de que eran trasplantadas o regresaban al medio contaminado. En el caso de los peces estos fallecen por asfixia debido al taponamiento de sus branquias, otro efectos desencadenados son la pérdida de equilibrio, la inhibición a la sensibilidad superficial y la perturbación de sus procesos enzimáticos digestivos lo que les puede cambiar su conducta, producirles la muerte además de deformidades en sus embriones, .22 sin embargo cuando se hace una rápida depuración del crudo en las aguas, la fauna íctica es capaz de recuperarse pudiendo eliminar los tóxicos de sus tejidos en cuestión de meses mientras el contacto no haya sido muy prolongado (Miranda & Restrepo, 2005) . Biorremediación Definición de Biorremediación La Biorremediación es un mecanismo biotecnológico en el cual se aprovechan las capacidades de organismos como bacterias, hongos y plantas organizándose de forma individual, en consorcio o por acumulación en biopelículas para remover contaminantes presentes en el medio ecológico como aguas dulces, marinas, suelos ,lodos y aire, aprovechando sus procesos metabólicos que permiten transformar esas moléculas toxicas en sustancias menos peligrosas que luego se incorporan a los ciclos biológicos y químicos de la biota. Es una combinación de la biología y la ingeniería, de manera que se crea una tecnología que puede ejecutarse de manera sostenible teniendo en cuenta las diferentes variables y dar seguimiento con el fin de obtener los resultados esperados en una tasa de eficiencia deseable (Chiriví et al., 2019; M. L. Gómez et al., 2006; Rodríguez Calvo, 2017; Trujillo Toro & Ramírez Quirama, 2012). En este contexto hay que diferenciar varios conceptos para tener una idea clara de este proceso: el de biodegradación que son las vías metabólicas naturales que tienen los microrganismos para procesar sustancias toxicas que encuentra en el medio, mientras que biorremediación es la utilización y .23 mejoramiento de estas capacidades para generar la limpieza de los nichos afectados, así mismo aquellos que tienen estas propiedades de biodegradación pueden catalogarse como resistentes si tienen mecanismos específicos que les permite sobrevivir frente a estos compuestos tóxicosy tolerantes si estos son no específicos .En cuanto a biorremediación, la técnica de fertilización o bioestimulación es la agregación de ciertos nutrientes como fósforo y nitrógeno para promover el desarrollo de microrganismos que se presentan naturalmente en la zona de interés y la inoculación o bioaumentación es la agregación de comunidades microbianas para incrementar las posibilidades de transformación y puede ir acompañado de nutrientes (Chiriví et al., 2019; Trujillo Toro & Ramírez Quirama, 2012). Las rutas de degradación permiten transformar los compuestos contaminantes en moléculas de dióxido de carbono, agua y estructuras atómicas inorgánicas o a través de procesos de oxido- reducción para convertir agentes inorgánicos tóxicos en sustancias más beneficiosas (Castro Cabello, 2015; M. L. Gómez et al., 2006; Ponce Contreras, 2014). Existen dos formas a nivel químico en procesos de remediación por hidrocarburos: una aeróbica y una anaeróbica. La primera es de mejor rendimiento y consiste en la degradación hacia moléculas más simples a partir de estructuras complejas de alifáticos de cadena abierta e hidrocarburos cíclicos entre ellos los aromáticos, mediante la acción de oxigenasas que permiten el traspaso de oxígenos y perdida de electrones. La segunda hay reacción en el sustrato, pero conlleva un traspaso de electrones hacia moléculas externas como nitritos, sulfatos y carbonatos (Castro Cabello, 2015). .24 Fundamentos de la biodegradación La primera limitante de los microorganismos para la captación de hidrocarburos es su naturaleza hidrofóbica, creando una barrera física entre la molécula y la célula que posee una membrana plasmática con superficie hidrofílica, desequilibrando así sus estructuras. No obstante, existen mecanismos que actúan para sobreponerse a esta restricción, esto mediante el proceso de emulsificación que consiste en la creación de biosurfactantes con estructura anfipática que permite englobar las moléculas de hidrocarburos a través de unas estructuras redondas con capacidad de atracción y retención llamadas micelios que cumplen su función en tres pasos: solubilizan y transportan el sustrato, entran en contacto con la célula y finalmente hacen la trasferencia, como se observa en la Figura 2. Los biosurfactantes son los más comunes en la biorremediación, no obstante, también se puede hacer la captación adhiriéndose directamente al compuesto toxico o mediante otro tipo de estructuras como disolventes o ácidos. Géneros y especies de Acinetobacter radioresistens KA- 53 , Acinetobacter calcoaceticus RAG-1, Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Rhodococcus erythropolis , Arthrobacter spp., Nocardia spp. , Corynebacterium spp. , Bacillus subtilis , Bacillus licheniformis , Torulopsis bombicola , Torulopsis petrophilum y Torulopsis apicola utilizan esta vía para solubilizar hidrocarburos (Chiriví et al., 2019; De la Rosa Cruz et al., 2014) . .25 Figura 2 Solubilización de moléculas por biosurfactantes Nota: Reproducido de “Biosurfactantes y su papel en la biorremediación de suelos contaminados por plaguicidas”.(p.58), por N.L. de la Rosa Cruz et al. 2014, Revista Latinoamericana de Biotecnología Ambiental y Algal, 4(1). En lo relativo a las reacciones químicas, se producen mayoritariamente en forma aerobia y en menor medida anaerobia, siendo los hidrocarburos lineales y de enlaces sencillos los más fácilmente degradados mientras que los de organización molecular más compleja como los aromáticos con múltiples anillos solo pudiendo ser metabolizados por unas pocas especies. La presencia de dobles o triple enlaces, el número de carbonos y la conformación de múltiples anillos unidos entre si incrementan la dificultad de ser biodegradados. En la aerobiosis enzimática de hidrocarburos alifáticos la oxidación mono-terminal es la más frecuente, en la cual el grupo metilo (CH3) se oxida por acción de la enzima alcano mono-oxigenasa generando un grupo alcohol que luego por otra oxidación mediante una deshidrogenasa se convierte en un aldehído y luego por actividad de un aldehído .26 deshidrogenasa se vuelve un ácido graso y por beta-oxidación se convierte en el metabolito acetil coenzima A que entra al ciclo de Krebs para ser aprovechado en forma de energía. Estas reacciones generalmente son similares para las moléculas saturadas (enlaces sencillos, incluyendo ramificados y cíclicos), mientras que para las saturadas la oxidación ocurre el doble o triple enlace produciendo un anillo epóxido (Chiriví et al., 2019; Rodríguez Calvo, 2017). Para los hidrocarburos aromáticos el anillo se disuelve y se rompen los enlaces por una oxidación mediada por la enzima di oxigenasa que permite la adición de 2 átomos de oxígeno formándose un cis-dishydrodiol , luego por una oxidación adicional se genera un catecol que por 2 rutas diferentes forma varias clases de ácidos como el succínico, fumárico, pirúvico y acético y también aldehídos y acetil coenzima A que sirven para los procesos esenciales de la célula (Rodríguez Calvo, 2017) . Según Chiriví et al., 2019 especies del género Pseudomonas spp y Rhodococcus spp tienen genes específicos para descomposición de PAH o aromáticos policíclicos, usando mono o di-oxigenasas para hidroxilar los anillos y facilitar posteriormente su rompimiento en moléculas que integrarán el metabolismo del ácido tricarboxilico. En el caso de los hongos usan mono-oxigenasas como la lignina peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa (MnP) y versátil peroxidasa (VP). El proceso general de una aerobiosis de hidrocarburos es la toma del sustrato, su oxidación para producir biomasa , dióxido de carbono y agua (Ponce Contreras, 2014), como se observa en la Figura 3: .27 Figura 3 Proceso bioquímico de la biodegradación por aerobiosis. Nota: Adaptado de “Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos” (p.19), por D.S. Ponce Contreras,2014,Universidad del Bio Bio. En la degradación anaeróbica de alifáticos el aceptor de electrones son átomos diferentes al oxigeno (como los nitratos, óxido de hierro, manganeso, dióxido de carbono, dióxido azufre entre otros) y se adiciona un fumarato al hidrocarburo produciendo un bencil succinato y por varios procesos de oxidaciones y reducciones se generan compuestos utilizables por la célula. En aromáticos el caso más emblemático es el del tolueno que tras la adición de un fumarato mediado por una bencil succinato sintetasa se crea un bencil succinato que luego por beta oxidaciones se produce un bencil coenzima A (Rodríguez Calvo, 2017). El procedimiento general se muestra en la Figura 4: .28 Figura 4 Proceso bioquímico de la biodegradación por anaerobiosis. Nota: . Reproducido de “Biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos” (p.19), por D.S. Ponce Contreras,2014,Universidad del Bio Bio. Factores que supeditan la biorremediación en el suelo El nivel de eficacia de la biodegradación en suelos contaminados dependerá de tres factores: la cantidad y tipo de estructura de los hidrocarburos presentes en el crudo, las concentraciones de especies de microrganismos con capacidad de beneficiarse metabólicamente al transformar el contaminante y propiedades fisicoquímicas del suelo que permiten las condiciones ideales para que el proceso ocurra a una tasa ideal (Ponce Contreras, 2014; Rodríguez Calvo, 2017). Temperatura El primer factor y uno de los más importantes es la temperatura ya que condiciona la actividad y tasa metabólica de los microorganismos,la mayoría de las bacterias degradadoras de hidrocarburos son mesófilas y crecen óptimamente en un rango de entre 20 y 30 0C , si el medio está sometido a rangos superiores de 40 0 C se desnaturalizan las enzimas y a temperaturas bajas los procesos catalizadores disminuyen inhibiéndose a partir de 00C, ocasionando también que los hidrocarburos se vuelvan más viscosos y se vaporicen menos a la atmósfera. No obstante, algunos procesos degradadores del .29 petróleo se han observado fuera de estas condiciones, como es el caso de Bacillus stearothermophilus que ha sido encontrada en ambientes termófilos de hasta 60 0C en suelos del desierto Kuwait. También la biodegradación ha sido encontrada en suelos árticos y subárticos de 5 y 10 0C de temperatura (Ponce Contreras, 2014; Rodríguez Calvo, 2017). pH El nivel óptimo de pH para la biorremediación es de 7.4-7.8, siendo el rango donde se da el mayor crecimiento de microorganismos, en valores extremos el resultado suele ser negativo o inferior, aunque los hongos pueden actuar en pH ácidos de 4-5 y algunas bacterias alcalófilas prosperan en pH de entre 6 y 8. El pH también tiene un efecto sobre un nutriente esencial como el fósforo, disminuyendo su disolución en las partículas del suelo y también limitando el transporte sustratos pesados (Ponce Contreras, 2014; Rodríguez Calvo, 2017). Nutrientes La presencia del tipo de nutrientes y su cantidad es esencial para la reproducción y supervivencia de comunidades microbianas dado por la necesidad de procesar fuentes de energía, con el carbono (C), nitrógeno (N), el fósforo (P) y potasio (K) siendo moléculas limitantes . En base al tipo de técnica que realizada , las proporciones de C:N:P ideales serían 100:10:1, aunque pueden variar en base al contexto que se haya dado la contaminación por petróleo. El equilibrio es importante en la bioestimulación, ya que un exceso de nutrientes también puede disminuir las tasas de biodegradación (Ponce Contreras, 2014; Rodríguez Calvo, 2017; Ruiz Olarte, 2019). Según Ruiz Olarte (2019) al tratar un suelo, para controlar esta concentración excesiva de sustancias asimilables y evitar su desplazamiento a niveles inferiores por acción de las lluvias, se ha utilizado un tipo de abono llamado “fertilizantes inorgánicos olefílicos de liberación lenta”, con resultados exitosos (p.36). .30 Humedad La humedad ideal dependerá de las características que cada suelo posea, el tipo de contaminante que se haya vertido y si la biorremediación ocurre en condiciones de presencia o ausencia de oxígeno, no obstante, los mejores procesos se dan en aerobiosis ya que un exceso de agua reduce la concentración de oxígeno. El agua forma parte del núcleo y citoplasma de las bacterias, siendo fundamental en el transporte de los elementos inorgánicos al interior de la célula para que sean sintetizados y aprovechados, pero una mayor persistencia de humedad en niveles superficiales limita los procesos de degradación por limitación de oxígeno disponible (Ponce Contreras, 2014) Oxígeno Como la biodegradación es mejor en aerobiosis debido a la oxidación de hidrocarburos por actividad catabólica de oxigenasas, el oxígeno es central para la optimización en la descomposición de moléculas presentes en el crudo, actuando como receptor de electrones en las primeras fases de las reacciones químicas, si bien en condiciones de anaerobiosis otros átomos también actúan como aceptores entre ellos los sulfatos y el hierro (Gaete Mora, 2019; Ponce Contreras, 2014; Rodríguez Calvo, 2017) . Según Gaete Mora (2019) , para crear las condiciones favorables de presencia de oxígeno, se implementan técnicas tales como la inyección de “aire, oxigeno puro, peróxido de hidrogeno u ozono a través de bombas, propulsores, agitadores y vaporizadores” (p.24). Microorganismos Las concentraciones de microbiota que degradan de hidrocarburos son el eje central en la biorremediación debido a sus capacidades de adaptación a los cambios generadas por derrames, su variabilidad catabólica al poseer diferentes enzimas que degradan las moléculas contaminantes y al enriquecimiento en sus poblaciones una vez entran en contacto con este. Cuando el suelo esta libre del sustrato toxico alrededor del 0.1% lo conforman estas comunidades degradadoras, pero al estar .31 expuestas se incrementan a un 85 % de todas especies presentes. Se ha estipulado que un número de 1x103 UFC/pgs es el aceptable para que se desarrolle la biodegradación con resultados eficientes. Por ello es importante hacer un recuento e identificar las especies en el área de estudio como paso previo a la utilización de un mecanismo de biorremediación (Gaete Mora, 2019) Contaminante La complejidad en las estructuras de los hidrocarburos agregan un grado de dificultad para ser metabolizados, aquellas moléculas con dobles o triple enlaces, con ramificaciones, con anillos o configuraciones aromáticas las hacen mas pesadas y dificiles en las rutas enzimáticas, asi mismo cualidades físicas como su viscosidad y baja solubilidad limitan su transporte en la porosidad del suelo o su disponibilidad por las bacterias. No obstante, concentraciones muy altas pueden llegar a ser demasiado tóxicas para los microorganimos, dañando potencialmente su células y membranas plasmáticas (Gaete Mora, 2019; Ponce Contreras, 2014; Rodríguez Calvo, 2017). Estructura del Suelo La distribución , tamaño y abundancia de los granos y la presencia del tipo del sedimento (arena, limo, arcilla) configuran la porosidad y solubilidad de las sustancias al movilizarse en el suelo, esto genera las condiciones en el que se da el intercambio con el aire, agua y distintos tipos de moléculas orgánicas e inorgánicas .Una baja porosidad impide la accesibilidad del residuo con el microorganismo y ademas permite la concentracion de agregados del petróleo restringiendo su disposicion de disolverse hacia las diferentes capas (Gaete Mora, 2019; Ponce Contreras, 2014). .32 Organismos degradadores de hidrocarburos en suelos En la biorremediación de hidrocarburos en suelos operan una gran diversidad de micro y macroorganismos capaces de sintetizar directamente el sustrato o una molécula parcialmente degrada producto de una digestión residual. Se ha comprobado la versatilidad catabólica de géneros y especies de bacterias, hongos, levaduras, actinomicetos y plantas, bien actuando de forma individual, en asociación o simbiosis con otros microrganismos o en la superficie de las micorrizas. Además, llevan a cabo procesos importantes en el suelo como la configuración de ciclos biogeoquímicos de diferentes minerales hasta procesos de formación y granulometría en las fases liquidas, acuosas y solidas de este. Se ha establecido que en cuanto a nivel de actividad y eficiencias metabólicas las bacterias son las más estudiadas y utilizadas, aunque están limitadas a metabolizar hidrocarburos de estructura sencilla como aromáticos simples y alcanos, los hongos en cambio pueden degradar fracciones más recalcitrantes y pesadas como los poli-aromáticos y las plantas con microbiomas en sus raíces presentan ventajas que las hacen ideales para su estudio e implementación en estas técnicas. Además, con el avance de la ciencia y los ensayos en laboratorio, la modificación genética ha permitido mejorar procesos naturales en las rutas enzimáticas, incrementado las tasas catabólicas con objetivos centrado en los hidrocarburos. Un grupo de interés son las bacterias filamentosas como los actinomicetos, caracterizados por ser ubicuos, con gran tolerancia a rangos amplios de temperatura, pH y resistentes a condiciones bajas de humedad y poca presencia de recursos. Así mismo las esporas juegan un papel de supervivencia en condiciones adversas y las bacterias formadoras de esporas suelen encontrarse en ambientes con condiciones de variabilidad (Petro Cardona& Mercado Montero, 2014) . .33 Según Trujillo Toro y Ramírez Quirama (2012) entre las bacterias degradadoras de petróleo se encuentran los géneros nombrados en la Tabla 1 : Tabla 1 Bacterias degradadoras de petróleo Achrornobacter spp. Leumthrix spp. Xanthomyces spp. Acinetobacter spp. Moraxella spp. Lactobacillus spp. Actinomyces spp. Nocardia spp. Erwinia spp. Aeromonas spp. Peptococcus spp. Flavobacterium spp. Alcaligenes spp. Pseudomonas spp. Klebsiella spp. Arthrobacter spp. Sarcina spp. Coryneforms spp. Bacillus spp. Spherotilus spp. Vibrio spp. Beneckea spp. Spirillum spp. Brevebacterium spp. Streptomyces spp. Nota: Reproducido de “Biorremediación en suelos contaminados por hidrocarburos de petróleo”(p.40), por M.A. Trujillo y J.F. Ramírez, 2012 , Revista de Investigación Agraria y Ambiental., 3(2). En el caso específico de Colombia, en un ensayo sobre suelos contaminados con diésel se lograron aislar cepas de bacterias autóctonas de los géneros Anthrobater spp, Bacillus spp., Enterobacter spp., Staphylococcus aureus y Flavobacterium spp. (Arrieta Ramírez, Rivera Rivera, Arias Marín, et al., 2012). Por otro lado, los hongos tienen un crecimiento mucho más lento, pero degradan compuesto más recalcitrantes , crecen en pH más ácidos, generalmente por debajo de 5 y suelen ser más sensibles a las oscilaciones en la humedad (Dussán Garzón et al., 2010; Viñas Canals, 2005). En la tabla 2 se nombran los géneros: Tabla 2 Hongos degradadores de petróleo Allescheria spp. Oidiodendrum spp. Gonytrichum spp. Aspergillus spp. Paecylomyses spp. Hansenula spp. Aureobasidium spp. Phialophora spp. .34 Helminthosporium spp. Botrytis spp. Penicillium spp. Torulopsis spp. Candida spp. Rhodosporidium spp. Trichoderma spp. Cephalosporium spp. Rhodotorula spp. Trichosporon spp. Cladosporium spp. Saccharomyces spp. Fusarium spp. Cunninghamella spp. Sporobolomyces spp. Debaromyces spp. Scopulariopsis spp. Nota: Reproducido de “Biorremediación en suelos contaminados por hidrocarburos de petróleo”(p.40), por M.A. Trujillo y J.F. Ramírez, 2012 , Revista de Investigación Agraria y Ambiental., 3(2). Ciertos tipos particulares de plantas han demostrado habilidades inherentes para limpiar ambientes contaminados, esto se debe a la relación estrecha entre la planta, microrganismos asentados en la rizosfera y el suelo, en el cual nutrientes y macromoléculas tóxicas son absorbidas por las raíces, transformadas y almacenadas en las partes superiores como hojas y tallos y liberados a la atmósfera como gases no dañinos. El procesamiento de los hidrocarburos por fitorremediación inicia con las raíces infiltrándose en el suelo, las células de la epidermis y sus pequeños vellos que secretan sustancias que crean las condiciones para que los hidrocarburos sean asimilados, unas vesículas luego los transportaran a unas vacuolas donde serán almacenadas (Velásquez Arias, 2016) . Existen varias formas en que las moléculas son procesadas: por absorción cuando la rizosfera atrae los componentes para luego ser descompuestos y almacenados dentro de la planta, si estos exceden la capacidad metabólica son acumulados en vacuolas subcelulares, por fijación cuando exudados varían el pH, humedad y otras condiciones del suelo para inmovilizar los hidrocarburos, por evaporación donde las moléculas son volatilizadas a la atmósfera en compuestos no perjudiciales través de las hojas, por degradación en el que los sustratos inorgánicos son usados como fuente de energía, procesados dentro tejidos de la plantas para sus procesos celulares , en este caso las raíces tienen secreciones que ayudan a degradar los elementos tóxicos y rizodegradación cuando la .35 rizósfera actúa sobre los contaminantes a través de excreciones, degradándolos para luego ser aprovechados como fuente de carbono por los microrganismos que viven en esta (Zhao et al., 2021) . De las especies de plantas usadas se mencionan “Zea mays L, Panicum máximum jacq, Paspalum xirgatum, Echinochloa polystachya H B K, Sorghum vulgare L, Phaseolus vulgaris L, Phaseolus coccineus L, Chamaecrista nictitens y Hordeum vulgare” (Velásquez Arias, 2016,p.31). Un elemento es la capacidad de degradación frente a configuraciones específicas de hidrocarburos presentes en el petróleo, en el caso de alcanos han mostrado actividad las bacterias Pseudomonas aeruginosa, Bacillus spp., Acitenoabcter spp., Serratia mercescens, Alcaligene sodorans y Rhodococcus spp., para aromáticos de un solo anillos Vibrio spp., Corynebacterium spp., Orchrobactrum spp. y Achromobacter spp. (Rodríguez Calvo, 2017) . Los aromáticos policíclicos (PAH) son los más complejos para degradar . Han mostrado capacidad lítica específica las bacterias Alcaligenes odorans, Sphingomonas paucimobilis, Mycobacterium flavescens, Burkholderia cepacia, Xanthomonas spp así mimos Pseudomas spp., Rhodococcus spp. y Archromobacter spp. En el caso de hongos se ha visto degradación mediante uso de enzimas ligninolíticas como Pleurotus ostreatus y Antrodia vaillantii y no ligninolíticas como Chrysosporium pannorum, Cunninghamella elegans y Aspergillus niger (Rodríguez Calvo, 2017) . Según Benavides López de Mesa et al. (2006) hay 2 géneros de bacterias efectivas en biodegradar compuestos hidrocarburos con alta capacidad de supervivencia y adaptación en suelos. Sus propiedades están resumidas en la Tabla 3: .36 Tabla 3 Características de dos géneros de bacterias con alta tasas de degradación y supervivencia. Rhodococcus spp. Posee versatilidad en rutas metabólicas para degradar compuestos aromáticos de múltiples anillos (PAH) por poseer las enzimas di oxigenasas y mono-oxigenasas que actúan rompiendo los anillos de carbono. También tiene actividad de ruptura del catecol que es un compuesto intermedio generado en la digestión de alifáticos. Son candidatos ideales para biorremediación porque proliferan en ambientes con recursos restringidos, tienen alto nivel de supervivencia y actividad catabólica amplia. También usan DBT presente en el diésel como fuente de azufre. Aquellas especies con mutaciones pueden degradar enlaces dobles de alquenos. Pseudomonas spp. Crecen con éxito en ambientes contaminados por petróleo. La especie Pseudomonas aeruginosa produce biosurfactantes permitiendo la solubilización y asimilación de HCs, además tiene enzimas específicas de degradación en su membrana. Los ramnolípidos (biosurfactante) que posee le permite catabolizar el n-hexadecano y algunos alifáticos en anaerobiosis. Pseudomonas putida vive de la materia orgánica en descomposición y es cosmopolita, habita en rizosfera de las .37 plantas y gracias a enzimas di oxigenasas convierte alcanos en aldehídos, además de degradar el naftaleno y fenantreno (compuestos aromáticos). Además, posee el tolueno di-oxigenasa metabolizando con facilidad el tolueno. Limitantes en el uso por ser patógenos oportunistas. Nota: Adaptado de “Biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos derivados del petróleo” (p. 87- 88) por J. Benavides López de Mesa et al.,2006,Nova Publicación Científica,4(5) El género Burkholderia spp. posee una alta tasa de biodegradación, pero por su habilidad mutagénica y resistencia a antibióticos transmisible no es seguro para implementar en agricultura o suelos, así mismo Acinetobacter spp son eficientes en consumir alcanos y Mycobacterium spp. degradan kerosene, biodiesel y gasolina (Benavides López De Mesa et al., 2006) . Triángulo de la Biorremediación Según Chiriví et al. (2019) para tomar la decisión más rápida y seleccionar la mejor técnica de biorremediación, se debe guiar por un triángulo cuyos ejes son el tipo de contaminante, el agente biodegradador y el medio donde se llevará a cabo, simulandoasí el conocido triangulo epidemiológico. En el caso del compuesto tóxico hay que tener en cuenta si es orgánico o inorgánico, su configuración química y la densidad presente. Para el agente biológico establecer si se usará uno nativo o externo, cuáles son sus rutas metabólicas, su habilidad para digerir el contaminante, su velocidad de crecimiento en las condiciones que presente el medio y capacidad de adaptabilidad. Con respecto al ambiente, se debe mirar que tipo es (líquido, sólido o atmosférico), sus propiedades como pH, .38 humedad, nutrientes, temperatura, si el catabolismo es con o sin de oxígeno y el tipo de ambiente. La clave parte del eje del cual se tenga información y centrarse en investigar en los que los datos son insuficientes. Por ejemplo, si el medio es suelo, seleccionar microrganismos cuyas capacidades biológicas sean más competentes en base a las condiciones que este brinda, su textura y compuestos (arcilloso, arenoso, limoso) y el tipo de sustancia química que se haya vertido (si es hidrocarburos, mirar si es de cadena sencilla, doble o triple, o aromático), así al aislar comunidad microbiana del suelo escoger solo aquellas con las mejores tasas de rendimiento, supervivencia y actividad especifica. La información del triángulo de la biorremediación se encuentra resumida en la Figura 5: Figura 5 Triángulo de la biorremediación Nota: Triángulo de la biorremediación con los 3 ejes que permiten escoger la menor técnica para hacer biodegradación. Adaptado de Revisión y Panorama Nacional de la Biorremediación Microbiana (p.23), por J.S Chirivi Salomón et al., 2019,Universidad Nacional y a Distancia: Sello Editorial. .39 Técnicas de biorremediación en suelos Los procedimientos en biorremediación se pueden clasificar en base a la clase de organismo utilizado, ubicación donde se implementa y metodología base para transformar el contaminante. En cuanto al primero se destacan la fitorremediación (plantas) realizada en consorcio entre plantas y bacterias u hongos en las micorrizas, micorremediación (hongos), ficorremediación (microalgas), la biorremediación bacteriana, la biorremediación enzimática y en algunos casos, aunque menos usada el lombrocultivo y compostaje. En el segundo los mecanismos se ejecutan bien sea in situ (mismo lugar) o ex situ (traslado de la muestra a tratar) y el método puede consistir en el monitoreo sin variar propiedades ambientales hasta certificar que el contaminante se haya reducido (atenuación natural), el mejoramiento de las condiciones agregando nutrientes para estimular la tasa de crecimiento (bioestimulación) o la inoculación de cepas endógenas con las mismas características de las presente en la matriz ,modificadas genéticamente o agregación de cepas exógenas (bioaumentación) (Chiriví et al., 2019). En la Figura 6 se resumen todas las clasificaciones: .40 Figura 6 Clasificación de técnicas de biorremediación Nota: Adaptado de Revisión y Panorama Nacional de la Biorremediación Microbiana (p.18-19), por J.S Chirivi Salomón et al., 2019,Universidad Nacional y a Distancia: Sello Editorial. Bioaumentación Radica en agregar comunidades nativas o exógenas al suelo cuando las concentraciones de los microorganismos son muy bajas o estén ausentes, esto mediante mecanismos de inyección en las capas donde estén infiltrados los hidrocarburos. Si el contaminante ha logrado distribuirse a zonas más profundas con presencia de acuíferos, para evitar o remediar el daño de estos se hace una introducción de los microrganismos debajo de su superficie. Se puede adicionar nutrientes y otros elementos como oxígeno para incrementar probabilidades de crecimiento y supervivencia, pero requiere de una extensa investigación previa sobre las condiciones ecológicas (M. L. Gómez et al., .41 2006; Petro Cardona & Mercado Montero, 2014) . Las muestras de suelo son aisladas y en laboratorio se cultivan para determinar aquellos con capacidades de metabolización de hidrocarburos para luego ser reintroducidas en el medio afectado en mayores concentraciones, también puede llevarse a cabo modificación genética de cepas para obtener mejores resultados o uso de cepas extrínsecas, pero en este caso es más difícil debido a procesos de adaptación que deben enfrentar y cuestiones de bioseguridad. Entre las desventajas estaría su uso en zonas muy amplias y subsecuentemente dificultad de inocular a gran escala (Petro Cardona & Mercado Montero, 2014). Dependiendo de las condiciones del suelo, el proceso de degradación puede darse en aerobiosis con hidrocarburo convertido en agua, dióxido de carbono y masa celular o en anaerobiosis donde se obtienen otros compuestos como ácido sulfúrico o amoniaco (Loya del Ángel, 2013) . Bioestimulación Se basa en agregar nutrientes como nitrógeno (N), fósforo (P), potasio (K), agua y oxígeno entre otros para mejorar el crecimiento de la microbiota y agilizar degradación de las moléculas. El nitrógeno es importante para la producción de enzimas y proteínas que catabolizan procesos, mientras que el fósforo participa como adyuvante en la formación de compuestos energéticos que son esenciales para división celular y biodegradación. Los fertilizantes usados pueden ser orgánicos con minerales obtenidos a través del estiércol o inorgánicos mediante preparados especiales. Su agregación aumenta la tasa degradación entre 3 y 5 veces . Para resultados óptimos, el suelo debe ser homogéneo en su estructura, con condiciones ideales de pH, humedad y temperatura, además de un equilibrio estable entre nitrógeno y fósforo en un radio de 10:1(Chiriví et al., 2019; M. L. Gómez et al., 2006; Petro Cardona & Mercado Montero, 2014) . .42 Atenuación Natural Es un método sencillo, de bajo costo, que no requiere la intervención humana y consiste en monitorear la transformación del contaminante en el suelo que se logra con los procesos naturales de las poblaciones de microorganismos presentes y las reacciones fisicoquímicas. Esta biotransformación ocurre por procesos de “dilución, dispersión, volatilización, adsorción y degradación” (M. L. Gómez et al., 2006, p.8). Varios aspectos condicionan el éxito de estas interacciones contaminante- microbioma-ambiente, entre ellos el número de la población y especies con actividades específicas de metabolización, la presencia de oxígeno diluido para procesos de aerobiosis, elementos como nitrógeno, fósforo o sulfato que actúen como aceptores de electrones en anaerobiosis y conformación de las estructuras del suelo que sean favorables para la adhesión del contaminante (Chiriví et al., 2019; M. L. Gómez et al., 2006; Petro Cardona & Mercado Montero, 2014). Biospargin Se aplica para descontaminar suelos y acuíferos. Radica en la irrigación de aire y nutrientes a la denominada zona vadosa que es un área ubicada entre la parte superficial y zonas más profunda donde se encuentran acuíferos o asentamientos de aguas. Los hidrocarburos se acumulan en una zona de saturación y el bombeo de oxígeno permite que estos compuestos se volatilicen o disipen en forma de gas y se distribuyan a zonas no saturadas para facilitar su dispersión y degradación por contacto con mayor número de microrganismos autóctonos. Esta inyección mecánica también estimula el crecimiento y actividades bacterianas (Chiriví et al., 2019; M. L. Gómez et al., 2006; Loya del Ángel, 2013). Hay varios puntos que condicionan la selección de este método, entre ellos que la concentración de elementos orgánicos sea de tamaño pequeño, preferiblemente cadenas de hidrocarburos con menos de 20 carbonos como los alcanos lineales y con alta capacidad de pasar a .43 fase de vapor (volátiles) , los tipos de suelo sean arcilla y con buena capacidad de filtración de oxígeno (Loya del Ángel, 2013). BioventingConsiste en la infiltración de oxígeno a zonas no saturadas dentro de suelo mediante pozos de inyección y máquinas de extracción al vacío. Esto permite que los hidrocarburos se condensen hacia su estado gaseoso facilitando su reducción en el ambiente, además de que el oxígeno actúa como activador en la biodegradación por parte de microorganismos. Es relevante saber la porosidad de las estructuras de la tierra contaminada de manera que se pueda determinar la posición y distancias entre los pozos de venteo a instalar y la dimensión en la profundidad a la cual se introducirá el aire. Su optimización se alcanza en zonas poco profundas, no tan extendidas y se recomienda la instalación de conductos para guiar el flujo de las corrientes, uso de revestimientos y un plan de muestreo extensivo para análisis de cualidades de biorremediación obtenidas. Este método es exitoso para tratamiento de hidrocarburos con peso molecular ligero (Chiriví et al., 2019; M. L. Gómez et al., 2006). Bioslurping Esta técnica se utiliza en suelos permebales , aguas subterráneas y combina tres métodos:el bioventeo mediante bombeo de aire, el uso de un conducto que se inserta en la tierra creando un pozo de tracción el cual genera una fuerza de sustración a travéz de un mecanismo de vacío por acción de la presión generada, permitiendo así recuperar la fase ligera no acuosa (LNAPL) que vendría ser el contaminante que no es soluble en agua y tiene una densidad más baja que esta y el cual se moviliza en la parte interna del tubo . Simultáneamente se hace la extracción de vapores del suelo que se transportan en los bordes externos del conducto.Una vez llega a la superficie, el hidorcaburo en su fase líquida y de vapor son separadas y biorremediadas en válvulas separadas. Sirve para tratar petroleos volátiles y semivolátiles en capas saturadas y no saturadas (Bala et al., 2022; Sharma, 2020). .44 Landfarming Procedimiento sencillo, económico y con instalación de estructuras no complejas. Se excava el terreno contaminado, se traslada y se extiende sobre una cama que puede ser un suelo con condiciones ideales, se labra constantemente para incorpoar aire y se adiciona agua y nutrientes (N,P,K) ayudando así a promover la actividad microbiana. Especial para lodos contaminados con hidorcarburos que no sean muy volátiles. Se deben adecuar condiciones para evitar lixiviados por aguas lluvias mediante incorporación de membranas impermeables de polietileno (Bala et al., 2022; Chiriví et al., 2019; M. L. Gómez et al., 2006; Petro Cardona & Mercado Montero, 2014; Sharma, 2020). Compostaje El compostaje permite controlar parámetros de temperatura, humedad y mezclas agrícolas residuales. El suelo afectado se mezcla con el compostaje y se vigila la humedad y aireación que recibe, ademas de generar las condiciones para que la temperatura sea mayor de 50 0C,creando condiciones favorables para bacterias termófilas.El fin es lograr reducir al maximo los hidorcarburos y generar un compost maduro que pueda ser utilizado en la reparación de tierras. Se lleva a cabo en sistemas cerrados de variable tamaño y tecnología como tambores, tanques y biopilas (Chiriví et al., 2019; M. L. Gómez et al., 2006; Petro Cardona & Mercado Montero, 2014). Compostaje por hileras Similar al anterior pero con una rotación periódica del suelo contaminado, lo cual incrementa la aireación sumado a la adicion de agua favorece no solo una distribución homogénea de los nutrientes y contaminantes, sino mejores tasas de biodegradacion, generando descomposción de cualquier material orgánico en formas inorgánicas aprovechables para las plantas en un proceso conocido como mineralización. Se puede combinar bioestimulación y bioaumentación para mejores resultados, no .45 obstante para hidorcarburos muy volátiles no es aconsejable por desencadenar polucion atmosférica (Chiriví et al., 2019; Sharma, 2020) . Biopilas Es una tecnología de remediación en el que suelos extraidos son apilados en un sistema cerrado conocido como pilas que posee tamaños variables y mezclados con compostaje para crear las condiciones favorables de degradación de contaminantes y actividad microbiana. Este sistema puede contar con tuberías que riegan oxígeno, nutrientes y agua o por el contrario la aireación se da en forma activa por remoción y movimiento del suelo. Geomembranas impermeables de PVC son dispuestas en la parte inferior para evitar pérdidas por lixiviados y se requieren areas relativamente amplias de trabajo. Es necesario que los hidracarburos estén en una concentración menor a 50.000 ppm, que densidad bacteriana sea 1000 UFC/ gr de suelo, haya una humedad relativa de 40-85%, temperatura de 10-45 0C, que la textura sea arcillosa y mantener un radio de carbono: nitrógeno y fósforo de 100:10:1 (Ponce Contreras, 2014; Sharma, 2020; Suárez Beltran, 2013) . Bioreactor El tratamiento de suelos contaminados se realiza en unos contenedores o bioreactores que proporcionan las condiciones óptimas para la remediación , ejerciendose así un control de parámetros como pH, la temperatura, agitación y la aireación. El control de las condiciones proporciona la maxima degradación posible. Existen varios modos operativos, los cuales pueden llevarse a cabo en múltiples etapas, en contenedores conectados para procesos continuos y con metolodgía estacionaria o parcialmente estacionaria (Bala et al., 2022; Chiriví et al., 2019; Sharma, 2020) . .46 Estado Contaminación por Hidrocarburos de Petróleo en Colombia La extracción del petróleo tiene una enorme relevancia en la economía nacional, estando presente en casi todas las regiones del país, no obstante debido a los problemas de orden público y conflicto armado, sumado al entorno de riqueza natural de ecosistemas y biodiversidad donde se desarrolla esta actividad ,ha desencadenado un enorme pasivo ambiental (Calderón Gómez, 2006) , propiciando la necesidad de llevar un control de esta afectación a través de un trabajo entre instituciones del estado, liderado por el Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible, la ANLA, La Agencia Nacional de Hidrocarburos ANH y Corporaciones Regionales Autónomas (Agencia Nacional de Hidrocarburos entre otros entes(Agencia Nacional de Hidrocarburos, 2022; Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible, 2023a).Los ataques a la infraestructura petrolera de Ecopetrol , la principal empresa extractora del país, en los últimos 35 años han desencadenado el vertimiento de más de 4,1 millones de barriles, superando la cantidad de otros accidentes históricos , como el del Golfo de México acontecido en 2010 o la catástrofe de Exxon Valdez en 1989. En los últimos 35 años se han totalizado alrededor de 2.600 derrames (Departamento Nacional de Planeación, 2016b) , sin contabilizar aquellos provocados por fallas en equipos, errores humanos o procesos de corrosión (Bayona Moreno, 2017). Esta contaminación ha desembocado en las fuentes de agua como ríos, quebradas, ciénagas y pantanos, además de suelos que tienen capacidad de producción agrícola y pecuaria (Benavides López De Mesa et al., 2006). Se estima que entre 1986 y 1998 más de 6000 hectáreas de tierra se han visto afectadas, 2600 kilómetros de ríos y 1600 hectáreas de pantanos y ciénagas (Rodríguez Zapata & Ruiz .47 Agudelo, 2021) , y en el consolidado de las ultimas 3 décadas alrededor del 60% de fuentes hídricas y suelos colindantes fueron contaminados como consecuencia de voladuras (Departamento Nacional de Planeación, 2016b). Esta afectación tan generalizada radica en el nivel de infraestructura, con más de 8.000 kilómetros de tuberías que recorren el país, pasando en su recorrido por zonas de bosques y quebradas. La toxicidad en los hábitats ha ocasionado a la mortandad de plantas, mamíferos, aves, reptiles y consecuencias negativas de salud en la población humana (Bayona Moreno, 2017).
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