Aislamiento y carecterización de vidrio cholerae

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AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DE 	VIBRIO CHOLERAE
Introducción
El Cólera es una enfermedad originaria del Asia, se considera su cuna la región del Delta del Ganges; desde esta zona se difundía por toda el Asia, África, atravesando toda Europa y hasta América Durante el Siglo XIX terribles pandemias azotaron todas las regiones de la tierra, principalmente Asia, África y Europa, causando gran mortalidad. En 1817 , se presenta la epidemia en la India que se extiende en Asia, hasta Pekín y Japón, y por el occidente hasta Astrakan y Costa Africana, epidemia que persistió durante seis años, produciendo grandes estragos sobre todo en la India. En enero de 1991 aparece en el Perú, afectando casi simultáneamente a zonas de Chancay, Chimbote, Piura y Callao, difundiéndose posteriormente en casi todos los departamentos del Perú. Las hipótesis de la aparición del Cólera en el Perú, son las descargas de los barcos que contaminaron el mar, peces, mariscos y a través de portadores sanos, lo cual se vió favorecido por el saneamiento inadecuado, el grado de desnutrición y pobreza de la población en el Perú.
Es conocido que el hombre es el único reservorio del Vibrio y el agua es el principal vehículo de transmisión, de tal manera que el riesgo de contraer la enfermedad es grande, lo que se ve favorecido con el saneamiento inadecuado, ya que las aguas residuales van al rió (para regar las verduras) y al mar.
Siendo el Cólera un problema de salud pública y el hecho de haberse propagado rápidamente no solo en el Perú sino en los países vecinos, es de suma importancia establecer programas de control y vigilancia ambiental.
Definición del Vibrio Cholerae
Se presenta en forma de un bastoncito de 1.5 Am a 2.5 Am de largo y 0.2 - 0.4 Am de ancho, ligeramente encorvado. En ocasiones este encorvamiento es mínimo apareciendo entonces como verdaderos bacilos. También se les denomina bacilos en coma.
El Vibrio cholerae es muy móvil, por un flagelo polar, y es considerado como el más móvil de todas las especies patógenas. Son aerobios o anaerobios facultativos, gram-negativos, fermentan carbohidratos sin producción de gas, no producen hidrógeno sulfurado y son oxidasa, manitol, indol, lisina-descarboxilasa positivos.
Propiedades biológicas
Es un germen relativamente poco resistente a los agentes exteriores, dependiendo su vida de los factores físicos y químicos que influyen sobre él y de los factores biológicos que presentan las otras especies microbianas 
En las heces con vibriones, después de 24 horas el número disminuye, sin embargo Greig en la India lo encuentra después de cuatro días en frascos que conserva en la oscuridad.
Pueden permanecer vivos en la tierra dependiendo del grado de humedad y del isolamiento directo que reciba del terreno. En el agua vive largo tiempo, y sólo la existencia de otros microorganismos puede alterar su supervivencia. Se ha comprobado su existencia en aguas de pozo, río y agua de mar.
T.C.B.S. Medio
Medio selectivo para el aislamiento y cultivo de Vibrio cholerae, Vibrio parahemolyticus y otras especies de Vibrio a partir de heces, agua y alimentos contaminados. 
Fundamento 
Es este el medio selectivo más adecuado para el aislamiento de las especies de Vibrio e inhibidor para la mayoría de las enterobacterias. Esta inhibición se basa en las altas concentraciones de tiosulfato y citrato, la presencia de las sales biliares y un pH fuertemente alcalino. La degradación de la sacarosa es variable entre las especies de Vibrio y las colonias son verdes para las cepas que no utilizan la sacarosa y amarillas para aquellas que producen ácido a partir de este azúcar. Sin embargo la proporción de la sacarosa en el medio está equilibrada en forma tal que no les inhiba el crecimiento por exceso de ácido. Aumentando la concentración de cloruro de sodio y disminuyendo la temperatura de incubación, pueden aislarse especies marinas sin importancia sanitaria. 
Fórmula (en gramos por litro)
	  Extracto de levadura
	5.0
	  Peptona de carne
	5.0
	  Tripteína
	5.0
	  Citrato de sodio
	10.0
	  Tiosulfato de sodio
	10.0
	  Bilis de buey
	8.0
	  Sacarosa
	20.0
	  Cloruro de sodio
	10.0
	  Citrato férrico
	1.0
	  Azul de bromotimol
	0.04
	  Azul de timol
	0.04
	  Agar
	14.0
  pH final: 8.6 ± 0.2
Instrucciones 
Suspender 89 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición y hervir de 1 a 2 minutos. NO AUTOCLAVAR. Distribuir en placas de Petri estériles. 
Tratamiento de las muestras 
Materiales clínicos: Incubar las heces en agua peptonada alcalina (Peptona 1%, NaCl 1% pH 8.6) de 6 a 8 h a 37°C. En el caso de materiales provenientes de infecciones extraintestinales, no hace falta enriquecimiento previo. Agua: Filtrar de 1 a 10 litros de agua con membrana de 0.22µ. Incubar la misma en agua peptonada alcalina por 6-8 h a 35-37°C. Alimentos: Licuar 25 g de la muestra con 225 ml de agua peptonada alcalina e incubar por 6-8 h a 35-37°C. En todos los casos sembrar una alícuota del caldo de enriquecimiento en la superficie de una placa de TCBS, por estriado, para el aislamiento de colonias. 
Incubación 
Incubar las placas entre 18-24 h a 37°C. V. cholerae y V. parahaemolyticus desarrollan a 40°C, mientras que la gran mayoría de las otras especies de Vibrio tienen mejor desarrollo entre los 22 y 30°C. 
Interpretación de resultados
	Microorganismos
	Aspecto de las colonias 
	Vibrio cholerae
	Amarillas de 2-3 mm diametro borde traslúcido 
	V. parahaemolyticus
	Centro verde, borde traslúcido
	V. alginolyticus
	Amarillas grandes
	Aeromonas spp.
	Inhibido
	E. coli
	Inhibido
	Enterococos
	Amarillas puntiformes, diminutas
	Proteus spp.
	Verdes con borde traslúcido 
Características del medio
Medio preparado: verde azulado.
Cary-Blair Medio de Transporte 
Medio recomendado para la recolección y transporte de muestras para estudios microbiológicos. 
Fundamento 
El primer medio utilizado para el transporte de muestras para estudios microbiológicos fue el medio de Stuart. En 1964 Cary y Blair describieron un nuevo medio para el transporte de muestras fecales. Tenía un bajo contenido de nutrientes, un bajo potencial de oxidoreducción y un alto pH. En los estudios de Cary y cols., Salmonella y Shigella fueron recuperadas luego de 45 días de inoculación. Otros autores han demostrado la eficacia de ese medio de transporte para estudios microbiológicos en gastroenteritis. El fundamento en que se basa el medio de Cary-Blair, es que es un medio con un mínimo aporte de nutrientes que permite la recuperación de los organismos sin que haya replicación. El tioglicolato de sodio se incluye para proveer un bajo potencial redox; un pH relativamente alto minimiza la destrucción bacteriana por acidificación.
Fórmula (en gramos por litro)
	  Tioglicolato de sodio
	1.5
	  Fosfato disódico
	1.1
	  Cloruro de sodio
	5.0
	  Agar
	5.0
  pH final: 8.4 ± 0.2
Instrucciones 
Suspender 12,6 g del polvo en 991 ml de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver. Enfriar a 50°C y agregar 9 ml de un sol. De CaCl2 al 1% preparada recientemente. Ajustar el pH si es necesario. Distribuir y esterilizar 15 minutos a vapor fluente. 
Procedimiento 
Los hisopos con heces u otros materiales clínicos se colocan en tubos que contienen el medio de transporte. Los tubos se mantienen a temperatura ambiente durante su envío al laboratorio. 
Resultados 
El crecimiento de los microorganismos se verá en los medios de subcultivos utilizados. 
Control de calidad 
Shigella flexneri: crece cuando se subcultiva a un medio nutriente luego de 18 h. Salmonella typhimurium: crece cuando se subcultiva a un medio nutriente luego de 18 h.
Prueba de String-Test
Solución de desoxicolato de sodio a 0.5%
Desoxicolato de sodio............................................0.5 gr
Agua destilada.......................................................100 ml
Pesar 0.5 fr de desoxicolato y disolver en 100 ml de agua destilada estéril, guardar en frascoclaro.
Procedimiento
En una placa de vidrio colocar una gota del desoxicolato y agregar una pequeña porción de la colonia. Se formará como un hilo.
BIBLIOGRAFIA
http://www.britanialab.com/espanol/k06_03.html
http://www.cepis.ops-oms.org/eswww/fulltext/repind41/Aisla/Aisla.html
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