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Diseño y optimización de un 
proceso de fermentación para la 
obtención de enzimas 
hemicelulolíticas y celulolíticas a 
partir de Trichoderma 
koningiopsis Th003 
 
 
María Alejandra Jaramillo Rodríguez 
 
 
 
 
 
 
Universidad Nacional de Colombia 
Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería química y ambiental 
Bogotá D.C, Colombia 
2020 
 
Diseño y optimización de un 
proceso de fermentación para la 
obtención de enzimas 
hemicelulolíticas y celulolíticas a 
partir de Trichoderma 
koningiopsis Th003 
 
 
 
María Alejandra Jaramillo Rodríguez 
 
 
 
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título 
de: 
Magister en Ingeniería Química 
 
 
Director: 
Dr. Ing. Juan Carlos Serrato Bermúdez 
Codirectora: 
Ph.D. Eddy Johana Bautista Bautista 
 
 
 
 
Línea de Investigación: 
Bioproductos 
 
 
Universidad Nacional de Colombia 
Facultad de Ingeniería, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental 
Bogotá, Colombia 
2020 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A la vida, mis padres, hermanos y Alaska. 
 
 
Agradecimientos 
 
A mis papas y hermanos, por apoyarme en esta locura. 
 
A AGROSAVIA por darme la oportunidad de desarrollar mi trabajo. 
 
A mis directores Eddy Johana Bautista y Juan Carlos Serrato: no he podido dar con 
mejores personas, los admiro como personas y como profesionales y no me alcanzaría la 
vida para agradecerles por todo lo que aprendí de ustedes y todo el apoyo que me dieron. 
 
Al grupo BAL, especialmente a Leyanis Mesa y Luis Fernando Rodríguez, por todo el 
aporte que dieron a este proyecto. 
 
A Carlos Rafael Castillo, por siempre tener la disposición de ayudarme, aún en la distancia. 
 
A mis amigos del laboratorio: Ana María Jiménez, Duván Millán, John Pablo Vargas, Oscar 
Monrroy, Stella Rincón … los llevo siempre en el corazón. 
 
A mis amigas de la vida: Melissa Sánchez, Angela Alvarado, Marcela Ramos, Carel 
Carvajal, por siempre estar ahí. 
 
A Luis Antonio Soto, por la ayuda en el laboratorio. 
 
A Freddy Escobar: Por salvarme de muchas (siempre). 
 
Finalmente, a ti (Mono), por darme paz y tranquilidad. 
 
Resumen y Abstract IX 
 
Resumen 
La biomasa lignocelulósica es muy abundante en la naturaleza, una parte se genera a 
partir de procesos agroindustriales especialmente del sector agrícola. Muchos de estos 
materiales no tienen una aplicación directa en la industria, por lo tanto, su acumulación en 
grandes cantidades puede generar problemas ambientales. Esto se puede contrarrestar 
mediante el uso de estos materiales de bajo costo para generar productos con valor 
agregado como enzimas, las cuales tienen una aplicación en diferentes industrias. Este 
trabajo tuvo como objetivo el diseño de un proceso de fermentación a partir de bagazo de 
caña y salvado de trigo para la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de 
Trichoderma koningiopsis Th003. Inicialmente se realizó la evaluación de tres métodos de 
pretratamiento químico sobre el bagazo de caña: básico con NaOH 5%, ácido H2SO4 2,5%, 
y mixto H2SO4 1% + NaOH 4%. Posteriormente, usando una estrategia de diseño 
experimental, se establecieron las condiciones físicas (temperatura de fermentación), 
biológicas (concentración del inóculo), nutricionales (selección y concentración de fuente 
de nitrógeno) del proceso de fermentacíón. Finalmente, a través de técnicas de 
optimización se definieron las mejores condiciones nutricionales (selección de la 
concentración de las fuentes de carbono y nitrógeno) y fisicoquímicas (pH, altura de lecho 
y tamaño de partícula) para la producción de enzimas en un sistema de fermentación en 
fase sólida. Las condiciones que favorecieron esta producción fueron: temperatura de 
28°C; concentración de inóculo de 1x106 conidios/mL, relación bagazo/salvado 1:0,8; 
extracto de levadura 3,2 g/L, pH 5,0; tamaño de partícula 5 cm, y altura de lecho 0,5 cm 
con cinco días de fermentación. Con ellas se obtuvieron las siguientes actividades 
enzimáticas FPasa 0,275 U/gss, CMCasa 1,834 U /gss, y xilanasa 1261,05 U/gss. 
 
 
Palabras clave: xilanasas, celulasas, bagazo de caña, fermentación en estado 
sólido. 
 
 
X Título de la tesis o trabajo de investigación 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abstract 
Lignocellulosic biomass is the most abundant raw material in nature, a part is generated 
from agro-industrial processes, especially in the agricultural sector. Many of these 
materials do not have a direct application in industry, therefore their accumulation in large 
quantities can generate environmental problems. This can be counteracted by using these 
low-cost materials to generate value-added products such as enzymes, which have an 
application in different industries. The objective of this work was to design a fermentation 
process from sugarcane bagasse and wheat bran for the production of hemicellulolytic and 
cellulolytic enzymes from Trichoderma koningiopsis Th003. Initially, the evaluation of three 
chemical pretreatment methods was carried out on sugarcane bagasse: basic with 5% 
NaOH, 2.5% H2SO4 acid, and mixed H2SO4 1% + NaOH 4%. Subsequently, using an 
experimental design strategy, the physical (fermentation temperature), biological (inoculum 
concentration), and nutritional (selection and concentration of nitrogen source) conditions 
were established. Finally, through optimization techniques, the best nutritional conditions 
(selection of the concentration of carbon and nitrogen sources) and physicochemical (pH, 
bed height and particle size) for the production of enzymes in a fermentation system were 
defined. in solid phase. The conditions that favored this production were: temperature of 
28 °C; inoculum concentration of 1x106 conidia / mL, bagasse / bran ratio 1: 0.8; yeast 
extract 3.2 g/L, pH 5.0; particle size 5 cm, and bed height 0.5 cm with five days of 
fermentation. With them the following enzymatic activities were obtained: FPase 0.275 
U/gss, CMCase 1.834 U/gss, and xylanase 1261.05 U/gss. 
 
Keywords: xylanases, cellulases, sugarcane bagasse, solid state fermentation. 
 
Contenido XI 
 
Contenido 
Contenido 
Introducción .................................................................................................................... 1 
Objetivos ....................................................................................................................... 6 
Objetivo general ......................................................................................................... 6 
Objetivos específicos ................................................................................................. 6 
1. Marco teórico ............................................................................................................ 7 
1.1 Biomasa lignocelulósica ..................................................................................... 7 
1.2 Composición química de la biomasa lignocelulósica .......................................... 7 
1.2.1 Celulosa .......................................................................................................... 8 
1.2.2 Hemicelulosa ................................................................................................... 8 
1.2.3 Lignina ............................................................................................................. 9 
1.3 Limitaciones de la conversión de la biomasa lignocelulósica .............................. 9 
1.4 Pretratamientos ................................................................................................ 10 
1.4.1 Pretratamientos físicos .................................................................................. 10 
1.4.2 Pretratamiento químico .................................................................................. 11 
1.4.3 Pretratamiento fisicoquímico ..........................................................................12 
1.4.4 Pretratamiento biológico ................................................................................ 13 
1.5 Hidrólisis de la biomasa lignocelulósica pretratada ........................................... 13 
1.5.1 Hemicelulasas ............................................................................................... 13 
1.5.2 Celulasas ....................................................................................................... 15 
1.6 Aplicaciones de la celulasas y hemicelulasas ................................................... 16 
1.7 Procesos de producción de enzimas ................................................................ 16 
1.7.1 FES ............................................................................................................... 17 
1.7.2 Trichoderma sp .............................................................................................. 18 
1.8 Tipos de biorreactores utilizados en FES ......................................................... 19 
1.8.1 Biorreactor en bandejas ................................................................................. 19 
1.8.2 Biorreactor de lecho empacado ..................................................................... 19 
1.8.3 Biorreactor de tambor rotatorio ...................................................................... 20 
1.9 Parámetros fisicoquímicos de la FES ............................................................... 20 
1.9.1 Temperatura .................................................................................................. 21 
1.9.2 Contenido de humedad en el sustrato ........................................................... 21 
1.9.3 Aireación........................................................................................................ 21 
1.9.4 pH .................................................................................................................. 22 
1.9.5 Tamaño de partícula ...................................................................................... 22 
1.10 Parámetros nutricionales de la FES ................................................................. 23 
1.10.1 Fuente de carbono ......................................................................................... 23 
1.10.2 Fuente de nitrógeno ....................................................................................... 24 
XII Título de la tesis o trabajo de investigación 
 
2. Evaluación de pretratamientos químicos para la producción de hemicelulasas 
y celulasas ..................................................................................................................... 25 
2.1 Introducción ........................................................................................................... 25 
2.2 Materiales y métodos............................................................................................. 26 
2.2.1 Microorganismo y producción del inóculo ........................................................ 26 
2.2.2 Sustrato de fermentación ................................................................................ 27 
2.2.3 Pretratamiento del sustrato ............................................................................. 27 
2.2.4 FES ................................................................................................................. 28 
2.2.5 Obtención del extracto enzimático .................................................................. 29 
2.2.6 Métodos analíticos .......................................................................................... 29 
2.2.7 Determinación de la composición química del bagazo de caña y su fracción 
celulósica ................................................................................................................. 31 
2.2.8 Diseño estadístico ........................................................................................... 31 
2.3 Resultados y discusión .......................................................................................... 32 
2.3.1 Producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas a partir de bagazo de 
caña pretratado con diferentes métodos de hidrólisis química. ................................ 32 
2.3.2. Determinación de la composición química de los residuos agroindustriales 
usados como medio de fermentación. ...................................................................... 37 
2.4. Conclusiones parciales ......................................................................................... 39 
3. Selección de parámetros físicos, biológicos y nutricionales para la producción 
de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas de T. koningiopsis Th003 .................... 41 
3.1 Introducción ........................................................................................................... 41 
3.2 Materiales y métodos............................................................................................. 43 
3.2.1 Microorganismo y producción del inóculo ........................................................ 43 
3.2.2 Efecto de la concentración de inóculo de T. koningiopsis Th003 y la 
temperatura sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas. ......... 43 
3.2.3 Selección de la fuente de nitrógeno y de la relación bagazo/salvado para la 
producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas. .............................................. 44 
3.2.4 Obtención del extracto enzimático .................................................................. 45 
3.2.5 Métodos analíticos .......................................................................................... 46 
3.2.6 Tratamiento estadístico ................................................................................. 46 
3.3 Resultados y discusión .......................................................................................... 47 
3.3.1 Influencia de la concentración de inóculo. ....................................................... 47 
3.3.2 Efecto de la temperatura de incubación .......................................................... 51 
3.3.3 Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado ........................ 52 
3.4 Conclusiones parciales .......................................................................................... 59 
4. Optimización de los parámetros fisicoquímicos y nutricionales y efecto de la 
aireación sobre la producción de hemicelulasas y celulasas ................................... 61 
4.1 Introducción ........................................................................................................... 61 
2.3. Materiales y métodos ........................................................................................ 63 
4.2.1 Microorganismo y producción del inóculo ........................................................ 63 
4.2.2 Optimización de la concentración del extracto de levadura y la relación 
bagazo/salvado ........................................................................................................ 63 
4.2.2.1 Validación del efecto de los parámetros nutricionales .................................. 64 
4.2.3 Efecto de las condiciones fisicoquímicas (pH, tamaño de partícula, altura de 
lecho) sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas. .................. 64 
4.2.3.1 Validación del efecto de los parámetros fisicoquímicos ................................ 65 
4.2.4 Efecto de la aireación sobre la producción de enzimas hemicelulolíticas y 
celulolíticas .............................................................................................................. 66 
Contenido XIII 
 
4.2.5 Obtención del extracto enzimático y métodos analíticos .................................. 69 
4.2.6 Diseño estadístico ........................................................................................... 69 
4.3 Resultados y discusión .........................................................................................70 
4.3.1 Optimización de la concentración de extracto de levadura y la relación 
bagazo/salvado ........................................................................................................ 70 
4.3.2 Optimización del pH, tamaño de partícula y altura de lecho ............................ 77 
4.3.3 Efecto de la aireación ...................................................................................... 87 
4.3.4 Actividad enzimática antes y después de la optimización ................................ 89 
4.4 Conclusiones parciales ......................................................................................... 90 
5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................ 93 
Conclusiones .............................................................................................................. 93 
Recomendaciones ...................................................................................................... 94 
 
 
 
 
 
 
Contenido XIV 
 
Lista de figuras 
Pág. 
 
Figura 1. Composición de la pared celular vegetal (A. Kumar et al., 2020) ....................... 8 
Figura 2. Actividad FPasa durante 9 días de fermentación bajo diferentes 
pretratamientos. .............................................................................................................. 32 
Figura 3. Actividad CMCasa durante 9 días de fermentación usando bagazo pretratado 
con diferentes tratamientos. ............................................................................................ 34 
Figura 4. Actividad xilanasa durante 9 días de fermentación bajo diferentes 
pretratamientos. .............................................................................................................. 35 
Figura 5. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de FPasa de T. 
koningiopsis Th003 ......................................................................................................... 48 
Figura 6. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de enzima CMCasa 
de T. koningiopsis Th003 ................................................................................................ 49 
Figura 7. Influencia de la concentración de inóculo en la producción de xilanasas de T. 
koningiopsis Th003 ......................................................................................................... 50 
Figura 8. Influencia de la temperatura de incubación sobre la producción de FPasa, 
CMCasa y xilanasa de T. koningiopsis Th003 ................................................................. 51 
Figura 9. Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la 
producción de enzimas FPasas. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio ............ 53 
Figura 10. Efecto de la fuente de nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la 
producción de CMCasa. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio ........................ 54 
Figura 11. Efecto de la fuente de Nitrógeno y la relación bagazo/salvado sobre la 
producción de enzimas Xilanasa. (a) extracto de levadura; (b) sulfato de amonio .......... 55 
Figura 12. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto 
de levadura sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto 
positivo (rojo), efecto negativo (gris). .............................................................................. 56 
Figura 13. Diagrama de contorno de interacción entre la relación bagazo/salvado y 
concentración del extracto de levadura (g/L) teniendo como respuesta la producción de 
enzimas xilanasas (U/gss) .............................................................................................. 57 
Figura 14. Esquema del fermentador de lecho fijo PROPHYTA® L05 (Cruz, 2014). ...... 66 
Figura 15. Efecto de la concentración de extracto de levadura y la relación 
bagazo/salvado sobre la producción de enzimas FPasa. ................................................ 70 
Figura 16. Efecto de la concentración del extracto de levadura y la relación 
bagazo/salvado sobre la producción de enzimas CMCasa. ............................................ 71 
Figura 17. Efecto de la concentración del extracto de levadura y la relación 
bagazo/salvado sobre la producción de enzimas xilanasa .............................................. 72 
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Contenido XV 
 
Figura 18. Diagrama de Pareto de los efectos de la relación bagazo/salvado y extracto 
de levadura sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto 
positivo (rojo), efecto negativo (gris). .............................................................................. 75 
Figura 19. Gráfico de superficie de respuesta 3D para la actividad xilanasa al día 5 de 
fermentación. ................................................................................................................. 76 
Figura 20. Efecto del pH, tamaño de partícula y altura de lecho sobre la producción de 
enzimas FPasa. .............................................................................................................. 78 
Figura 21. Efecto del pH, tamaño de partícula y altura de lecho sobre la producción de 
enzimas CMCasa. .......................................................................................................... 79 
Figura 22. Efecto del pH, tamaño de partícula y altura de lecho sobre la producción de 
enzimas xilanasa. ........................................................................................................... 80 
Figura 23. Diagrama de Pareto de los efectos del pH, tamaño de partícula y altura de 
lecho sobre la producción de enzimas xilanasas al día 5 de fermentación. Efecto positivo 
(rojo), efecto negativo (gris). ........................................................................................... 82 
Figura 24. Superficie de respuesta (3D) y gráfico de contorno que muestran los efectos 
de la interacción para la producción de xilanasas al día 5 de fermentación. (a,b) efectos 
del pH y tamaño de partícula; (c,d) efectos del pH y la altura de lecho; (d,e) efectos del 
tamaño de partícula y la altura de lecho. La variable de respuesta aumenta de negro a 
rojo ................................................................................................................................. 83 
Figura 25. Efecto de la aireación sobre la producción de enzimas FPasa, CMCasa y 
xilanasa al día 5 de fermentación. .................................................................................. 87 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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file:///D:/MARIA/4.%20UNAL%20-%20MAESTRIA/4.%20TESIS/5.%20DOCUMENTO/2.%20PROYECTO%20FINAL/Versión%20final.docx%23_Toc58432999
file:///D:/MARIA/4.%20UNAL%20-%20MAESTRIA/4.%20TESIS/5.%20DOCUMENTO/2.%20PROYECTO%20FINAL/Versión%20final.docx%23_Toc58432999
file:///D:/MARIA/4.%20UNAL%20-%20MAESTRIA/4.%20TESIS/5.%20DOCUMENTO/2.%20PROYECTO%20FINAL/Versión%20final.docx%23_Toc58433000
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XVI Título de la tesis o trabajo de investigación 
 
 
 
Contenido XVII 
 
Lista de tablas 
Pág. 
 
Tabla 1. Métodos de pretratamiento utilizados en la biomasa lignocelulósica ................ 10 
Tabla 2. Producción de xilanasas por diferentes hongos ............................................... 14 
Tabla 3. Hongos productores de enzimas generadas mediante procesos de FES ......... 17 
Tabla 4. Pretratamientos químicos empleados para el bagazo. ..................................... 28 
Tabla 5. Composicion del forraje de avena. ................................................................... 37 
Tabla 6. Composición química de la fracción celulósica del bagazo antes y después del 
tratamiento alcalino y del salvado de trigo ...................................................................... 37 
Tabla 7. Tratamientos para evaluar el efecto de la concentración de inóculo de T. 
koningiopsis Th003 ........................................................................................................ 44 
Tabla 8. Tratamientos para evaluar el efecto de temperatura de incubación de T. 
koningiopsis Th003 ........................................................................................................ 44 
Tabla 9. Factorial con fuente de nitrógeno orgánica ....................................................... 45 
Tabla 10. Factorial con fuente de nitrógeno inorgánica ................................................. 45 
Tabla 11. Diseño de tratamientos para la selección de la fuente de nitrógeno y la relación 
bagazo/salvado para cada uno de los diseños factoriales. ............................................. 45 
Tabla 12. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5. ................. 55 
Tabla 13. Factores y niveles empleados en la optimización relación bagazo/salvado y 
fuente de nitrógeno ........................................................................................................ 63 
Tabla 14. Diseño central compuesto para la optimización de la fuente de nitrógeno y la 
relación bagazo/salvado. ................................................................................................ 63 
Tabla 15. Box Behnken para la optimización parámetros fisicoquímicos........................ 64 
Tabla 16. Diseño de tratamiento para la optimización de parámetros fisicoquímicos. .... 65 
Tabla 17. Dimensiones de los parámetros para evaluar el efecto de la aireación .......... 68 
Tabla 18. Tratamientospara evaluar el efecto de la aireación ....................................... 69 
Tabla 19. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5 de 
fermentación. ................................................................................................................. 73 
Tabla 20. Datos experimentales y predicción del modelo para la obtención de enzimas 
xilanasas a partir de Trichoderma koningiopsis Th003 ................................................... 77 
Tabla 21. Coeficientes codificados para la producción de xilanasas al día 5 de 
fermentación .................................................................................................................. 81 
Tabla 22. Datos experimentales y predicción del modelo para la obtención de enzimas 
xilanasas a partir de Trichoderma koningiopsis Th003 ................................................... 84 
Tabla 23. Porcentaje de humedad del sustrato al final del proceso de FES. .................. 88 
XVIII Título de la tesis o trabajo de investigación 
 
Tabla 24. Actividades enzimáticas antes y después de la optimización. ......................... 90 
Tabla 25. Productividad y porcentaje de aumento de la actividad enzimática con la 
optimización .................................................................................................................... 90 
 
Contenido XIX 
 
 
Introducción 
La ganadería bovina en Colombia representa uno de los principales sectores 
económicos del país pues aporta el 48,7 % del PIB pecuario, el cual corresponde 
al 3,3% del PIB nacional (FEDEGAN, 2019). Los sistemas de producción ganadera 
en el país utilizan técnicas de pastoreo para la alimentación de los animales, pues 
esta práctica disminuye los costos de mano de obra, sin embargo, pueden tener un 
efecto negativo en la productividad, puesto que los efectos producidos por la 
estacionalidad y el cambio climático han afectado considerablemente la producción 
de leche y carne (FAO, 2020). Durante las épocas secas, hay una disminución en 
la disponibilidad de forraje que reduce los niveles productivos por no encontrar 
alimento de calidad, y en época de lluvia hay un exceso de forraje que se suministra 
al animal en avanzado estado de madurez, el cual no le brinda los nutrientes 
necesarios (FAO, 2020). Por tal motivo, el ensilaje se ha convertido en una 
alternativa viable y de bajo costo para enfrentar los cambios producidos por las 
variaciones climáticas. Sin embargo, Colombia aún no dispone de información 
consolidada que demuestre procesos de ensilaje eficientes y controlados 
(FENALCE, 2018). Por lo tanto, diversas investigaciones se han centrado en 
estandarizar y mejorar los procesos de ensilaje, siendo la inoculación de enzimas 
del complejo hemicelulolítico, uno de los factores claves para obtener silos que 
puedan satisfacer las necesidades alimentarias del ganado, principalmente en 
época de sequía. 
El ensilaje, es un proceso de fermentación anaerobia de forraje verde de pastos, 
gramíneas, leguminosas o cereales, mediada por la acción de las bacterias ácido-
lácticas (BAL) que transforman los carbohidratos simples en ácido láctico, 
provocando la disminución del pH del medio, lo que impide la colonización de 
2 Introducción 
 
microorganismos, principalmente patógenos, favoreciendo su conservación (Dogi 
et al., 2015). Este proceso proporciona alimento estable para los sistemas de 
producción ganadera; sin embargo, la baja concentración de azúcares simples que 
presentan algunos forrajes y las malas prácticas de ensilaje, conllevan a una 
desestabilización del sistema permitiendo la proliferación de microorganismos no 
deseables como Clostridium sp, afectando negativamente la calidad del proceso y 
por consiguiente del producto final (Dogi et al., 2015). Para contrarrestar estos 
efectos, y que el proceso sea más eficiente, se ha aplicado una mezcla de enzimas 
al forraje para aumentar la hidrólisis de polisacáridos complejos logrando la 
liberación de los carbohidratos simples, haciéndolos disponibles para las BAL, y 
con ello obteniendo mayor concentración de ácido láctico en menor tiempo (Muck 
et al., 2018). La adición de estas enzimas a los inoculantes bacterianos ha tenido 
un efecto positivo en la calidad del ensilaje, aumentando y mejorando la eficacia de 
la alimentación en el ganado de engorde y lechero (Muck et al., 2018). Silva et al, 
evaluaron la influencia de la alimentación con silo de maíz tratado con enzimas 
hemicelulolíticas y celulolíticas sobre el rendimiento en novillas lactantes, 
encontrando que el silo de maíz tratado con enzimas favoreció la ingesta de materia 
seca y la digestibilidad de la fibra detergente neutra (FDN), aumentando de esta 
manera el tiempo de rumia de las vacas, y la producción de cadenas cortas de 
ácidos grasos en el rumen, parámetros que estarían involucrados en el rendimiento 
de leche (T. A. L. Silva et al., 2018). Por otro lado, Gandra et al, demostraron que 
el uso de enzimas hemicelulolíticas y celulolíticas en el ensilaje de maíz, aumentó 
la FDN del ensilaje, la cual al ser suministrada a vacas lactantes mejoró la ingesta 
de nutrientes, la fermentación ruminal, la síntesis de proteínas microbianas y la 
producción de metabolitos sanguíneos teniendo como resultado mayores 
rendimientos en la producción de leche (Gandra et al., 2017). 
En AGROSAVIA (Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria) se han 
venido adelantando estudios para el mejoramiento de los ensilajes principalmente 
de avena forrajera (variedad Altoandina), en donde la producción de enzimas y de 
inoculantes microbianos a base de BAL han sido uno de sus objetivos (Agrosavia, 
2018). De acuerdo con análisis bromatológicos realizados por el Laboratorio de 
Introducción 3 
 
microbiología pecuaria de AGROSAVIA, el cultivo de avena forrajera arrojó como 
resultado una baja concentración de azúcares libres (0,76-1%), lo que llevaría a 
una baja producción de ácido láctico durante el proceso de ensilaje (sin adición de 
enzimas), y por consiguiente un proceso deficiente. Sin embargo, se observaron 
altos porcentajes de celulosa (22,09%) y hemicelulosa (36,91%) en el forraje, que 
con la inoculación de enzimas se podrían hidrolizar y de esta manera aumentar los 
azúcares libres, principalmente glucosa, xilosa, manosa, galactosa y arabinosa, 
favoreciendo la producción de ácido láctico por parte de las BAL. 
Adicionalmente, las esporas del hongo T. koningiopsis Th003 son el principio activo 
del bioplaguicida Tricotec y han sido objeto de varios estudios en AGROSAVIA por 
sus características para el control biológico de diferentes patógenos en cultivos de 
tomate, lechuga y arroz. Este bioplaguicida se produce en un proceso de 
fermentación en estado sólido usando granos de cereal como sustrato (Corpoica., 
2010). Se ha podido demostrar que este hongo además de su capacidad 
antagónica tiene un alto potencial para producir una amplia variedad de enzimas 
hidrolíticas, especialmente celulasas (11,149 ± 0,523 U/gss de FPasa, 10,94 ± 
0,276 U/gss de CMCasa) y xilanasas (115,8 ± 1,08); sin embargo, la concentración 
lograda es baja, en comparación con las actividades de otros microorganismos 
pertenecientes al mismo género, pues el sustrato de fermentación en el que se 
produce masivamente no está diseñado para este propósito (Bautista, Jiménez, 
Chavarro-anzola, & Gómez, 2018). 
 
Por tal motivo, es necesaria la búsqueda de sustratos que favorezcan la producción 
de enzimas hidrolíticas para poder ser adicionadas a los procesos de ensilaje. 
 
En ese sentido, la biomasa lignocelulósica es una de las materias primas más 
abundantes en la naturaleza, gran parte se genera a partir de procesos 
agroindustriales especialmente del sector agrícola (Bill & Ozkan, 2019). Se ha 
demostrado que estos materiales son una importante fuente de energía renovable, 
con potencial para la producciónde biocombustibles, generación de energía, 
compuestos químicos y orgánicos, entre otros (Chun, Zhenquan, & Yeong, 2019). 
4 Introducción 
 
Uno de los muchos ejemplos de esta biomasa es la producida por el sector 
industrial de la caña, del procesamiento de arroz y el café. De acuerdo con cifras 
de la Unidad de Planeación Minero-Energética de Colombia, para el año 2019 se 
produjeron alrededor de 9 millones de toneladas de biomasa residual procedentes 
de estas industrias, de las cuales 1.871.023 toneladas corresponden a desechos 
de bagazo de caña (Asocaña, 2019), 2.564.250 toneladas corresponden a tamo de 
arroz (Fedearroz, 2019) y 3.420.000 a pulpa de café (Asocafé, 2019). Por tal 
motivo, existe un alto potencial para el uso de la biomasa lignocelulósica que se 
genera a partir de los procesos productivos agrícolas (Y. P. Castro, 2014). En 
general, la biomasa lignocelulósica está compuesta por celulosa, hemicelulosa y 
lignina. La celulosa es el polímero orgánico en mayor proporción y está compuesto 
por monómeros de D-glucosa unidos entre sí por enlaces glucosídicos β-1,4. La 
hemicelulosa es un heteropolisacárido ramificado de hexosas (D- glucosa, D- 
galactosa y D- manosa) y pentosas (D- xilosa y L- arabinosa). La lignina es un 
biopolímero aromático y rígido con un alto peso molecular. La celulosa y la 
hemicelulosa están estrechamente vinculadas con la lignina mediante enlaces 
covalentes y puentes de hidrógeno, lo que hace que la estructura de la biomasa 
sea robusta con una alta resistencia a los ataques biológicos y físicos (Cheah et 
al., 2020). 
 
Como se mencionó anteriormente, entre los residuos lignocelulosicos 
agroindustriales de interés en Colombia estan el bagazo y el salvado de trigo, los 
cuales van a ser utilizados en esta investigación. A pesar del uso que se les da a 
esos residuos, grandes cantidades se acumulan en las plantas de procesamiento 
convirtiéndose en una fuente de contaminación. No obstante, esta biomasa es 
recalcitrante al ataque enzimático, ya que, la lignina actúa como una barrera que 
interfiere en la accesibilidad de las enzimas para hidrolizar la celulosa y la 
hemicelulosa y por tanto en su aprovechamiento (Philippini, Martiniano, Chandel, 
Carvalho, & Silvio, 2019). Para reducir dicha recalcitrancia, se aplican 
pretratamientos químicos, físicos, y termoquímicos, que afectan la composición y 
estructura del material vegetal. Particularmente, los métodos alcalinos, 
Introducción 5 
 
hidrotérmicos, y ácidos son los más comúnmente utilizados para mejorar la 
sacarificación enzimática (Savou et al., 2019). Los tres métodos de pretratamiento 
tienen diferentes ventajas y desventajas con respecto a los requerimientos 
energéticos y la facilidad del proceso, por tal motivo, se ha buscado el desarrollo 
de pretratamientos combinados que requieran bajos niveles energéticos, sean de 
fácil manejo y mejoren la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica (Philippini et al., 
2019). 
Posteriormente, se logra la hidrólisis de la biomasa lignocelulósica previamente 
tratada mediante la acción sinérgica de diferentes enzimas entre las que se 
encuentran las xilanasas y celulasas (Yang, Yang, Duan, Alexandra, & Wang, 
2019). Estas enzimas son producidas por una gran variedad de microorganismos, 
específicamente hongos del género Trichoderma. Se ha reportado que este hongo 
es capaz de producir 0,26 U/gss de FPasa, 64,54 U/gss de CMCasa, 1130,70 U/gss 
de xilanasas (Alves et al., 2013), las cuales son producidas para diferentes 
aplicaciones industriales como la producción de azúcares fermentables utilizados 
para biocombustibles, prebióticos, textiles y la industria de pulpa y papel. Sin 
embargo, como fue mencionado anteriormente, una de las aplicaciones que se ha 
venido desarrollando dada la necesidad de intensificar los sectores productivos, 
especialmente del sector ganadero, es el mejoramiento de las propiedades del 
ensilaje por acción enzimática para alimentación bovina (Muck et al., 2018). 
Por lo anterior, la producción de enzimas celulolíticas por T. koningiopsis Th003 
puede constituir un paso importante para el mejoramiento de los procesos de 
ensilaje que se están llevando a cabo en AGROSAVIA para la alimentación de 
ganado bovino a partir de avena Altoandina. La optimización del medio de cultivo y 
las condiciones de operación, principalmente la relación carbono: nitrógeno: 
fósforo, el pH del medio, temperatura y tiempo de incubación, humedad y el tamaño 
del inóculo son parámetros a tener en cuenta para la producción de celulasas y 
hemicelulasas (Taherzadeh-ghahfarokhi, Panahi, & Mokhtarani, 2019). 
6 Introducción 
 
Por lo anterior, surge la pregunta de investigación ¿cuáles son los parámetros 
fisicoquímicos y nutricionales para un proceso de fermentación en estado sólido 
que favorecen la producción de enzimas del complejo hemicelulolítico? 
Para dar respuesta a la pregunta de investigación, se presentarán cinco capitulos 
en los cuales, en el primer capítulo se mostrará una recopilación de investigaciones 
previas y consideraciones teóricas en las que se sustenta el proyecto de 
investigación, permitiendo la interpretación de los resultados y la formulación de las 
conclusiones. En el capítulo 2 se estudian los pretratamientos realizados al sustrato 
de fermentación para la producción enzimática. En el capitulo 3, se presentan los 
resultados de la selección de parámetros físicos como la temperatura de 
incubación, biológicos como la concentración de inóculo y nutricionales como la 
selección de la fuente de nitrógeno para la mayor producción de ezimas en un 
proceso de fermentación en fase solida. Posteriormente, en el capítulo 4 se 
muestran los resultados de las optimizaciones nutricionales, fisicoquímicas y el 
efecto de la aireación en el proceso de fermentación, y por último las conclusiones 
y recomendaciones. 
Objetivos 
Objetivo general 
Diseñar un proceso de fermentación a partir de bagazo de caña y salvado de trigo para la 
producción de enzimas degradadoras de celulosa y hemicelulosa de T. koningiopsis 
Th003. 
Objetivos específicos 
▪ Evaluar diferentes métodos de hidrólisis química sobre el bagazo de caña como 
pretratamiento para la producción de enzimas degradadoras de celulosa y hemicelulosa. 
 
▪ Establecer a escala laboratorio las condiciones fisicoquímicas y nutricionales del 
proceso de fermentación que favorezcan la producción de enzimas hemicelulolíticas y 
celulolíticas. 
 
 
 
1. Marco teórico 
1.1 Biomasa lignocelulósica 
 
La biomasa lignocelulósica es uno de los recursos renovables de carbono orgánico en la 
naturaleza (Liao, Latif, Trache, Brosse, & Hussin, 2020). Las diferentes fuentes de biomasa 
lignocelulósica son los residuos agrícolas (hojas,pajas), residuos pecuarios (estiércol), 
biomasa forestal (cedro, abeto, sauce), desechos forestales (aserrín, madera), desechos 
industriales (pulpas) y desechos municipales (desechos de alimentos) (Su, Zhao, 
Khodadadi, & Len, 2020). Es considerada como una de las materias primas más 
prometedoras para la producción de biocombustibles y otros productos químicos debido a 
que es renovable, no compite con la producción de alimentos, además ayuda en la 
reducción de emisión de gases de efecto invernadero (Alayoubi et al., 2020). 
Algunos de los residuos agroindustriales más utilizados a nivel mundial para la producción 
de diferentes productos son: bagazo de caña, residuos de yuca, bagazo de naranja, pulpa 
de café, salvado de trigo, entre otros (Ferreira, Mahboubi, Lennartsson, & Taherzadeh, 
2016). Los componentes básicos de estos materiales son principalmente: lignina, celulosa, 
hemicelulosa, almidón, pectina y fibras. 
1.2 Composición química de la biomasa lignocelulósica 
 
La pared celular de la biomasa lignocelulósica consiste en una mezcla compleja de 
polisacáridos y otros polímeros, organizados por medio de un conjunto de enlacescovalentes y no covalentes. Es una matriz amorfa que contiene pectina, proteínas, lignina, 
hemicelulosa y celulosa que es conocida como complejo lignocelulósico (Figura 1). 
8 Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la obtención de 
enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas a partir de Trichoderma koningiopsis 
Th003 
 
 
1.2.1 Celulosa 
La celulosa está constituida por una larga cadena de monómeros de glucosa que se unen 
entre sí mediante enlaces β-1,4, lo que le otorga la característica de ser insoluble en agua. 
Estos enlaces forman cadenas lineales de glucosa estables que son resistentes a los 
tratamientos físicos y químicos principalmente por la interacción de los puentes de 
hidrógeno (Laluce, Roldan, Pecoraro, Igbojionu, & Ribeiro, 2019). 
1.2.2 Hemicelulosa 
La hemicelulosa es la estructura que sirve de conexión entre la lignina y la celulosa. A 
diferencia de la celulosa, la hemicelulosa es un heteropolímero de cadena corta más 
amorfo, ramificado y aleatorio lo que facilita las reacciones de hidrólisis que dan lugar a 
azúcares fermentables (Laluce et al., 2019). Está compuesta principalmente por hexosas 
(glucosa, galactosa, manosa, ramnosa, fructosa) y pentosas (xilosa y arabinosa). 
Hemicelulosa Celulosa 
Biomasa 
lignocelulósica 
Lignina 
Pared 
celular 
Figura 1. Composición de la pared celular vegetal (A. Kumar et al., 2020) 
Capítulo 1 9 
 
Adicionalmente también se pueden encontrar ácidos como el ácido galacturónico, 
glucurónico, etc (Liao et al., 2020). 
1.2.3 Lignina 
La lignina después de la celulosa es el segundo biopolímero más abundante sobre la tierra. 
Su función es rodear y proteger las fibras de celulosa, otorgándole mayor rigidez y 
resistencia al ataque enzimático a la estructura vegetal. Es un heteropolisacárido fenólico 
altamente complejo que consta de tres monómeros diferentes: alcoholes cumarílico, 
coniferílico y sinapílico, los cuales están unidos entre sí por enlaces éter, y a su vez estan 
unidos a la celulosa y a la hemicelulosa (Jatuwong et al., 2020). La estructura de la lignina 
depende principalmente del tipo de material vegetal, por lo tanto no ha sido posible 
establecer una estructura definida (Laluce et al., 2019). 
 
1.3 Limitaciones de la conversión de la biomasa 
lignocelulósica 
 
Debido a las propiedades de los polímeros presentes en la estructura de la biomasa 
lignocelulósica y a la interacción entre ellos, la biomasa lignocelulósica exhibe una 
resistencia biológica, química y mecánica que dificulta la separación de sus tres 
componentes principales (lignina, hemicelulosa y celulosa), y que le da su conocida 
recalcitrancia (Lorenci Woiciechowski et al., 2020). Para reducir esta última y aprovechar 
la hemicelulosa y la celulosa, se pueden aplicar diferentes tratamientos físicos, químicos 
y/o biológicos, que afectan la composición y estructura del material vegetal con el fin de 
obtener diferentes productos de interés industrial (Cheah et al., 2020). 
Una variedad de pretratamientos han sido desarrollados con el objetivo de desintegrar la 
fracción reticulada de la biomasa lignocelulósica para mejorar la accesibilidad a la celulosa 
y la hemicelulosa por acción de enzimas celulasas y hemicelulasas respectivamente (de 
Oliveira Gorgulho Silva & Filho, 2017). A continuación, se presentarán algunos de estos 
métodos, sus ventajas y desventajas. 
 
10 Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la obtención de 
enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas a partir de Trichoderma koningiopsis 
Th003 
 
1.4 Pretratamientos 
 
Un pretratamiento efectivo debe ser capaz de: 1) mejorar los rendimientos del azúcar para 
su posterior procesamiento, 2) tratar todo tipo de biomasa lignocelulósica, 3) ayudar en la 
disminución en la formación de coproductos o inhibidores y 4) minimizar los costos de 
energía y operación (Cheah et al., 2020). Por tal motivo, se han evaluado una variedad de 
pretratamientos para determinar su efectividad hacia la biodegradación de la celulosa y la 
hemicelulosa (Tian, Zhao, & Chen, 2018). La elección de los métodos de pretratamiento 
depende del factor económico, el tipo de materia prima y sus impactos ambientales (R. 
Kumar, Singh, & Singh, 2008). La tabla 1 muestra un resumen de los métodos de 
pretratamiento más utilizados para la desintegración de la biomasa lignocelulósica. 
Tabla 1. Métodos de pretratamiento utilizados en la biomasa lignocelulósica 
Químicos Físicos Fisicoquímicos Biológicos 
- Acido 
- Alcalino 
- Organosolv 
- Oxidativo 
- Molienda 
- Extrusión 
- Congelación 
- Ultrasonido 
- Irradiación 
- Explosión de 
vapor 
- Explosión 
con 
amoniaco 
- Percolación 
- Agua 
caliente 
- Bacterias 
- Hongos 
 
1.4.1 Pretratamientos físicos 
Los pretratamientos físicos como la molienda, la extrusión, congelación, ultrasonido y la 
irradiación se aplican sobre la biomasa. La extrusión es un método reconocido utilizado 
para producir carbón y productos gaseosos, en donde la biomasa lignocelulósica se trata 
a temperaturas superiores a 300°C con una mezcla de cizallamiento para eliminar y acortar 
la fibras de la biomasa (Cheah et al., 2020). 
Capítulo 1 11 
 
La molienda es otro de los pretratamientos físicos utilizados, ya que aumenta el área de 
superficie específica y reduce la cristanilidad de la celulosa para la hidrólisis enzimática 
(Rezania et al., 2020). 
La biomasa lignocelulósica puede pretratarse usando el método de congelación; el 
volumen de agua cambia a medida que se transforma de líquido a sólido a bajas 
temperaturas. A medida que el agua se difunde en la biomasa, el volumen de agua 
aumenta durante la congelación, lo que resulta en la descomposición de las paredes 
celulares (Rooni, Raud, & Kikas, 2017). 
El pretratamiento con ultrasonido es otra alternativa, a través de la deslignificación y 
erosión de la superficie, ofrece un tiempo de corto de procesamiento, una temperatura de 
funcionamiento más baja y menos uso de productos químicos; la eficiencia de este 
pretratamiento varía dependiendo del solvente utilizado, la frecuencia ultrasónica y el 
diseño del reactor (Cheah et al., 2020). 
La irradiación con microondas proporciona una operación fácil. Sin embargo, la duración 
de la irradiación es un factor importante a tener en cuenta para un tratamiento efectivo. Un 
mayor tiempo de exposición puede conllevar a la producción de inhibidores y la 
degradación de los azúcares ya presentes (Soltanian et al., 2020). 
En general, los petratamiento físicos son difíciles de escalar ya que incurren en altos costos 
de operación y energía (Abraham et al., 2020). 
1.4.2 Pretratamiento químico 
Los pretratamientos químicos son los más aplicados a escala comercial. Los productos 
químicos aplicados pueden ser: ácidos (orgánicos e inorgánicos), álcalis, y líquidos iónicos 
(Liao et al., 2020). 
 
▪ Pretratamiento ácido 
Este pretratamiento es uno de los pretratamientos más utilizados. Consiste en exponer la 
biomasa a una solución ácida, donde el ácido sulfúrico, el ácido nítrico, el ácido fosfórico y 
el ácido clorhídrico se usan típicamente. El proceso se puede llevar a cabo a temperaturas 
mayores a 180°C durante uno a cinco min, o temperaturas bajas (<120 ° C) pero con 
12 Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la obtención de 
enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas a partir de Trichoderma koningiopsis 
Th003 
 
tiempos de contacto más largos (30-90 min); también se puede realizar a temperaturas 
menores a 100°C pero con concentraciones más altas de ácidos (30-70%) o viceversa: a 
temperaturas más altas (100-250 °C) con ácidos diluidos (<10%) (Baruah et al., 2018). Las 
desventajas de la utilización de este pretratamiento incluyen: 1) La producción de 
inhibidores como: furfural, hidroximetil furfural, ácido fórmico, entre otros; 2) la naturaleza 
corrosiva del ácido y 3) pérdida de azúcares fermentablesdebido a las reacciones de 
degradación mediadas por el ácido (M. F. Li, Yang, & Sun, 2016). 
▪ Pretratamiento alcalino 
Es caracterizado por su efectividad para remover la lignina de la biomasa, a través de la 
ruptura de los enlaces que la unen con la hemicelulosa y la celulosa. La hemicelulosa se 
solubiliza, sin embargo, lo hace en menor proporción que con los pretratamientos 
hidrotérmicos y ácidos. Los puentes de hidrógeno entre la cadena de glucanos se rompen 
parcialmente permitiendo que la celulosa esté más disponible, además se generan menos 
inhibidores. Soluciones básicas de hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de potasio (KOH), 
hidróxido de calcio (Ca(OH2)) son las más utilizadas (de Oliveira Gorgulho Silva & Filho, 
2017) 
▪ Pretratamiento organosolv 
Es una mezcla de solventes orgánicos capaces de extraer la lignina y solubilizar la 
hemicelulosa. Los solventes que se usan comúnmente para catalizar el proceso 
organosolv son: metanol, etanol, acetona, etilenglicol, ácido oxálico, ácido salicílico y ácido 
acetil salicílico. Está técnica conduce a la deslignificación e hidrólisis completa de la 
hemicelulosa (Cheah et al., 2020). 
1.4.3 Pretratamiento fisicoquímico 
La biomasa lignocelulósica también puede tratarse física y químicamente en combinación, 
como por ejemplo la molienda (pretratamiento físico) se puede realizar junto con el 
pretratamiento alcalino (pretratamiento químico) para mejorar la eficiencia del 
pretratamiento. En general esta combinación de métodos es efectiva para modificar la 
estructura lignocelulósica en tiempos reducidos y a bajo costo (de Oliveira Gorgulho Silva 
& Filho, 2017). 
Capítulo 1 13 
 
1.4.4 Pretratamiento biológico 
Algunas especies de hongos y las bacterias son capaces de tratar biológicamente la 
biomasa lignocelulósica, al modificar su estructura e hidrolizarla en sustratos mas simples. 
Este pretratamiento elimina la lignina mediante la utilización de hongos de podredumbre 
marrón o blanca, exponiendo la celulosa y la hemicelulosa al ataque enzimático 
microbiano. Los hongos de podredumbre blanca promueven la degradación de la lignina a 
través de una variedad de enzimas ligninolíticas oxidativas, como la lignina peroxidasa, 
manganeso peroxidasa y lacasas (B. Kumar, Bhardwaj, Agrawal, Chaturvedi, & Verma, 
2020). Este pretratamiento está influenciado por varios factores, incluidos factores físicos 
como la temperatura, la humedad, el tiempo de incubación, la aireación, el tamaño de 
partícula, el área superficial accesible, entre otros; factores químicos como pH y la 
composición del sustrato; y factores biológicos como los consorcios de microorganismos, 
su interacción y competencia, que requieren mucho tiempo y un estrecho seguimiento a 
estas condiciones (A. Kumar, Anushree, Kumar, & Bhaskar, 2020). Sin embargo, las 
ventajas que presenta es la baja utilización de energía y la no utilización de químicos 
(Rezania et al., 2020). 
1.5 Hidrólisis de la biomasa lignocelulósica pretratada 
 
Varios microorganismos son capaces de producir enzimas que degradan la celulosa y la 
hemicelulosa de la pared celular de las plantas para generar compuestos de alto valor 
industrial. Estas enzimas se conocen como celulasas y hemicelulasas, las cuales son 
secretadas como metabolitos extracelulares por hongos filamentosos, actinomicetos y 
algunas bacterias aerobias (Bajaj & Mahajan, 2019). 
1.5.1 Hemicelulasas 
Las hemicelulasas o xilanasas son enzimas glicosidasas que catalizan la hidrólisis de los 
enlaces 1,4-β-D xilosídicos del xilano presente en la hemicelulosa, lo que conlleva a la 
liberación de xilosa. La hidrólisis de la hemicelulosa requiere de varias enzimas que tienen 
diversos modos de acción: endoxilanasa y exoxilosidasa (β-xilosidasa) (Yang et al., 2019). 
▪ Las endoxilanasas (endo-1,4-β-xilanasa (EC 3.2.1.8) y endo-1,3-β-xilanasa (EC 
3.2.1.32)) catalizan la hidrólisis de los enlaces 1,4-β-D-xilosídicos y 1,3-β-D-xilosídicos 
14 Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la obtención de 
enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas a partir de Trichoderma koningiopsis 
Th003 
 
respectivamente, de la cadena principal del xilano de manera aleatoria liberando 
xilooligosacáridos, lo que reduce el grado de polimerización de la hemicelulosa. 
▪ Las exoxilanasas (exo-1,4-β-xilosidasa (EC 3.2.1.37) y exo-1,3-β-xilosidasa (EC 
3.2.1.72)), catalizan la hidrólisis de los enlaces 1,4-β-D y 1,3-β-D de los extremos no 
reductores de los xilooligosacáridos liberando xilobiosa y xilosa respectivamente. 
Cuando la hemicelulosa presenta ramificaciones, la hidrólisis se ve favorecida por la acción 
de enzimas como las glucuronidasas, arabinasas, acetil xilano esterasas, ácido ferúlico 
esterasas y ácido p-cumárico esterasas, que hidrolizan las cadenas laterales. Sin embargo, 
la determinación de la actividad hemicelulolítica, se hace a partir de las endoxilanasas, 
debido a la dificultad de purificar las otras enzimas del complejo hemicelulósico (V. Kumar, 
Dangi, & Shukla, 2018). 
▪ Microorganismos productores de hemicelulasas 
 
Estas enzimas son producidas por una gran variedad de microorganismos incluidos 
hongos filamentosos, levaduras y bacterias. 
Los hongos filamentosos han sido usados como productores potentes de enzimas a nivel 
industrial, especialmente de enzimas hidrolíticas como las xilanasas. Los genomas de 
hongos como Aspergillus fumigatus, Trichoderma reesei, Phialophora sp., Malbranchea 
pulchella y Myceliophthora thermophila codifican para una diversidad de enzimas que 
hidrolizan los componentes de la hemicelulosa (Basit, Liu, Rahim, Jiang, & Lou, 2018). Sin 
embargo, en estudios recientes se ha podido demostrar que los mejores microorganismos 
para la producción de xilanasas son: Aspergillus niger, Trichoderma harzianum, Penicillium 
sp., Fusarium oxysporum, y Humícola sp (Tabla 2) (Corrêa et al., 2014). 
Tabla 2. Producción de xilanasas por diferentes hongos 
Microorganismo 
Unidades de actividad 
xilanasa 
Referencia 
Aspergillus niger 42,5 U/g 
 
(Alokika & Singh, 2019) 
Trichoderma harzianum 288 U/mL 
Penicillium canescens 8932 U/g 
Capítulo 1 15 
 
Fusarium oxysporum 1840 U/g 
Humicola laniginose 7832 U/g 
1.5.2 Celulasas 
Las celulasas, son enzimas que hidrolizan los enlaces β-1,4 de la celulosa para liberar 
oligosacáridos, celobiosa y glucosa (Patel, Singhania, Sim, & Pandey, 2019). Según el 
modo de acción, existen tres tipos de celulasas: endoglucanasas, exoglucanasas, y β-
glucosidasa (EC 3.2.1.21) (Yang et al., 2019). 
▪ Endoglucanasa (β-1,4-endoglucanasa (EC3.2.1.4): hidroliza al azar los sitios amorfos 
de la celulosa, generando cadenas más cortas (oligosacáridos), y nuevos extremos en 
la cadena. 
▪ Exoglucanasa (celobiohidrolasa (EC3.2.1.91) y celodextrinasa (EC3.2.1.74)): 
Hidrolizan los extremos reductores y no reductores de la cadena de celulosa y de los 
oligosacáridos produciendo celobiosa. 
▪ β-glucosidasa: actúa sobre la celobiosa liberada por las exoglucanasas para liberar 
monómeros de glucosa. 
Estas celulasas pueden actuar en la cadena de celulosa solas o en combinación. Sin 
embargo, la acción de dos o más enzimas celulasas de manera sinérgica, facilita la 
degradación de la estructura celulósica (Shokrkar, Ebrahimi, & Zamani, 2018). 
▪ Microorganismos productores de celulasas 
 
Existe una gran variedad de microorganismos que realizan la hidrólisis de la celulosa. Se 
han aislado complejos enzimáticos de un sinnúmero de bacterias, particularmente 
bacterias anaerobias presentes en los sistemas digestivos de bovinos (Garvey, Klose, 
Fischer, Lambertz, & Commandeur, 2013). No obstante, los hongos son los 
microorganismos más estudiados para la producción de estas enzimas debido a la gran 
variedad de enzimas que pueden producir cuando se inducen adecuadamente, además 
que estas son producidas de manera extracelular lo que facilita su separación. 
Trichoderma reesei,es el hongo más extensamente estudiado. Otros de los géneros más 
estudiados son: Humicola sp, Penicillium sp y Aspergillus sp. (H. Wang, Zhai, & Geng, 
2020). 
16 Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la obtención de 
enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas a partir de Trichoderma koningiopsis 
Th003 
 
1.6 Aplicaciones de la celulasas y hemicelulasas 
 
Se han encontrado diversas aplicaciones de las celulasas y hemicelulasas en la industria. 
Estudios recientes han demostrado que la aplicación de xilanasas y celulasas tiene un 
papel importante en la industria de alimentos y concentrados (Alokika & Singh, 2019). 
Recientemente, las investigaciones se han centrado en el desarrollo de mejores alimentos 
para los animales con el fin de aumentar el rendimiento de productos como leche, carne y 
huevos (Thapa et al., 2019). 
Otra de las aplicaciones importantes actualmente es la utilización de enzimas en la 
industria de pulpa y papel. El proceso de blanqueamiento químico es el proceso 
convencional en la fabricación de papel, este proceso requiere altas temperaturas (de 
hasta 170°C) y productos químicos como el Cl2, ClO2 y NaClO para la eliminación de la 
lignina (Basit et al., 2018). Estos agentes, en altas concentraciones son cancerígenos, 
mutágenicos y causan contaminación ambiental. Por consiguiente, el uso de enzimas 
como las xilanasas, es una alternativa ecológica para reducir el tiempo de procesamiento, 
el consumo de energía y el uso de productos químicos tóxicos (Alokika & Singh, 2019). 
Las xilanasas y celulasas se usan para degradar los sustratos lignocelulósicos, en 
azúcares fermentables, que posteriormente se fermentan en bioetanol, biobutanol, 
acetoína y 2,3-butanodiol, entre otros (Bala & Singh, 2019). 
Las enzimas en los detergentes ayudan a mejorar la blancura de la tela, su color, suavizan 
el algodón y aumentan la eficiencia en la limpieza de manchas y la suciedad clásica como 
la hierba, la grasa animal, vegetal, entre otros. Además, las celulasas contribuyen a 
modificar la estructura de la fibra de celulosa para mejorar el brillo del color y el cuidado 
general del tejido (Basit et al., 2018). 
1.7 Procesos de producción de enzimas 
 
La producción de enzimas se puede llevar a cabo en procesos de fermentación en estado 
líquido (FEL) o procesos de fermentación en estado sólido (FES). La FEL implica el 
crecimiento de los microorganismos en un medio líquido el cual permite mantener las 
Capítulo 1 17 
 
condiciones del medio homogeneas, (Uday, Choudhury, Bandyopadhyay, & Bhunia, 2016), 
mientras que la FES es el proceso en el que los microorganismos crecen sobre materiales 
sólidos, sin la presencia de agua libre. La FES es utilizada principalmente para el cultivo 
de hongos filamentosos, permitiendo una mayor productividad enzimática en comparación 
con las FEL (Farinas, 2015). Adicionalmente, las enzimas producidas en FES son menos 
susceptibles a problemas de inhibición por sustrato, y son más estables a los cambios de 
temperatura, y pH (Farinas, 2015). 
1.7.1 FES 
La FES es un proceso de fermentación que emplea una matriz sólida ya sea natural o 
inerte, con la humedad necesaria para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos, 
es decir, ocurre en ausencia de agua libre (Farinas, 2015). La matriz sólida puede ser la 
fuente de nutrientes o un soporte saturado con los nutrientes adecuados que permitan el 
desarrollo de los microorganismos. 
Desde una perspectiva ambiental, la FES presenta una importante ventaja sobre la 
fermentación en estado líquido (FEL), la cual, es la posibilidad de utilizar residuos 
agroindustriales sólidos como sustrato que simulan al hábitat natural del microorganismo, 
además hay bajo riesgo de contaminación por parte de bacterias debido a la baja humedad 
que requiere el proceso y por consiguiente hay baja producción de efluentes al final del 
proceso, los cuales sirven como fuente de carbono y energía para la producción de 
productos de interés. En la Tabla 3., se presentan algunos ejemplos de producción de 
enzimas a partir de hongos utilizando residuos agroindustriales en FES. 
Tabla 3. Hongos productores de enzimas generadas mediante procesos de FES 
Hongos 
Residuo 
utilizado 
Enzimas que 
producen 
Referencia 
Aspergillus niger Pulpa cítrica Fitasas (Jatuwong et al., 2020) 
Pleurotus ostreatus 
Bagazo de 
caña 
Lacasas (F. Wang et al., 2019) 
Trichoderma 
harzianum 
Bagazo de 
caña 
pretratado 
Xilanasas (Alokika & Singh, 2019) 
18 Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la obtención de 
enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas a partir de Trichoderma koningiopsis 
Th003 
 
Penicillium 
canescens 
Paja de trigo Xilanasas (Alokika & Singh, 2019) 
Aspergillus oryzae Harina de trigo Proteasas 
(R. J. S. de Castro & Sato, 
2015) 
Penicillium 
verrucosum 
Pulpa de café 
pretratada 
Tanasas (Aharwar & Parihar, 2018) 
Aspergillus sp 
Cáscara de 
naranja 
Pectinasas 
(Patidar, Nighojkar, Kumar, & 
Nighojkar, 2018) 
Ganoderma 
lucidum 
Hoja de piña 
Manganeso 
peroxidasas 
(Lizardi-Jiménez & 
Hernández-Martínez, 2017) 
Fusarium 
oxysporum 
Paja de trigo y 
mazorca de 
maíz 
Celulasas (Ferreira et al., 2016) 
1.7.2 Trichoderma sp 
Trichoderma sp es un género perteneciente a la familia Hypocreaceae. Es un 
microorganismo de vida libre, aerobio y puede crecer y desarrollarse en suelos con pH 
neutro hasta ácido (Nathan, Esther Rani, Rathinasamy, Dhiraviam, & Jayavel, 2014). Son 
cosmopolitas en su distribución y podrían aislarse fácilmente de la madera en 
descomposición, de diferentes formas de materia orgánica y del suelo. Puede 
caracterizarse por la producción masiva de conidios de varios tonos de color verde y un 
rápido crecimiento sobre diferentes medios de cultivo (Adnan et al., 2019). Ha sido utilizado 
ampliamente como agente de control biológico ya que tiene la capacidad de producir un 
complejo de enzimas hidrolíticas y de metabolitos antimicrobianos, que tienen efecto 
antagónico sobre una amplia gama de fitopatógenos transmitidos por las semillas y el 
suelo. Además, por la gran diversidad de enzimas que es capaz de producir, está implicado 
en la transformación de compuestos lignocelulósicos para obtener productos de interés 
industrial (Fraceto et al., 2018). Debido a esto, varias especies de Trichoderma sp. han 
adquirido importancia industrial y sus formulaciones actualmente se comercializan en todo 
el mundo a escala industrial, utilizando diferentes sustratos principalmente residuos 
Capítulo 1 19 
 
agroindustriales. Hasta la fecha, las especies de Trichoderma más utilizadas para la 
producción de celulasas y xilanasas son T. viride, T. reesei, T. virens, T. asperellum, T. 
tubingensis. Siendo T. reesei el gran exponente en este género (Ezeilo, Lee, Huyop, 
Zakaria, & Wahab, 2019a), ya que ha sido ampliamente producido a escala industrial por 
su capacidad de producir celobiohidrolasas (CBHI y CBHII), endoglucanasas (GE1 y GE2), 
y xilanasas con diferentes fines industriales (Astolfi et al., 2019). 
1.8 Tipos de biorreactores utilizados en FES 
 
Diferentes tipos de biorreactores han sido utilizados para la producción de enzimas en 
sistemas FES, la mayoría de ellos a escala laboratorio. Sin embargo, otros biorreactores 
como: bandejas, tambor rotatorio, lecho empacado y lechos fluidizados también han sido 
empleados (Shokrkar et al., 2018) y serán descritos a continuación. 
1.8.1 Biorreactor en bandejas 
El biorreactor tipo bandeja utiliza bandejas planas, donde el sustrato se fija sobre la 
superficie, creando una capa de entre 1,5 cm y 2 cm. Las bandejas son colocadas en un 
cuarto con temperatura constante y con circulación de aire húmedo (Farinas, 2015). El uso 
de bandejas es uno de los métodos más simples para la FES. La aplicación de este tipo 
de biorreactor a escala industrial ofrece ciertas ventajas como por ejemplo la bajautilización de energía ya que no necesita agitación durante el proceso, adicionalmente 
ofrece un proceso de fácil operación y bajo costo (Thomas, Larroche, & Pandey, 2013). 
Sin embargo, el intercambio gaseoso es limitado creando dificultades en la transferencia 
de masa y energía (Shokrkar et al., 2018). Este tipo de reactores son ideales para la 
fabricación en volumenes relativamente pequeños, no obstante, puede no ser atractivo 
para procesos a gran escala ya que se requieren grandes espacios para la instalación de 
equipos y mucha mano de obra. 
1.8.2 Biorreactor de lecho empacado 
Es utilizado frecuentemente en FES por ser un proceso de bajo costo y ser espacialmente 
eficiente. Este sistema consiste en columnas en las cuales el sustrato sólido se sostiene 
sobre una base perforada desde la cual se inyecta aire a través del sustrato. Este tipo de 
20 Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la obtención de 
enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas a partir de Trichoderma koningiopsis 
Th003 
 
biorreactores es ideal para sustratos que no necesiten mezcla debido al efecto adverso 
que puede causar sobre el crecimiento o la estructura del producto final. Adicionalmente 
se pueden equipar con controles de temperatura durante el proceso de fermentación 
(Farinas, 2015). 
Los biorreactores de lecho empacado son comúnmente utilizados para la hidrólisis de 
biomasa lignocelulósica para la obtención de enzimas; sin embargo, a gran escala no es 
utilizado comúnmente debido a las dificultades relacionadas con la caída de presión y la 
canalización cuando al sistema se le inyecta un alto flujo de aire. Otros inconvenientes 
asociados con el uso de este biorreactor son el crecimiento no uniforme del 
microorganismo y la dificultad para la transferencia de calor dentro del sistema (Singhania, 
Patel, Soccol, & Pandey, 2009). 
1.8.3 Biorreactor de tambor rotatorio 
Este biorreactor consiste en un tambor con o sin paletas, que gira para mezclar el sustrato 
de fermentación. El tambor rotatorio con paletas fue diseñado para proveer una adecuada 
aireación y homogenización del sustrato por que proporciona una mejor transferencia de 
oxígeno dentro del sistema y reduce la aglomeración de partículas del sustrato durante el 
crecimiento microbiano (Shokrkar et al., 2018). 
1.9 Parámetros fisicoquímicos de la FES 
 
Hay varios factores importantes involucrados en el éxito de una FES. Estos factores 
incluyen: la selección del microorganismo, la selección del sustrato, y los parámetros 
óptimos del proceso. Los hongos y levaduras son los microorganismos más utilizados en 
este tipo de procesos por tener bajos requerimientos de humedad (Singhania et al., 2009). 
La eficiencia de los procesos de FES para obtener productos de interés depende 
principalmente de las condiciones fisicoquímicas, operativas y ambientales. La 
temperatura, el pH, la humedad, aireación, la porosidad, el tamaño de partícula y la 
capacidad de absorción del sustrato utilizado, son las variables clave que influyen en los 
procesos de FES (Farinas, 2015). 
Capítulo 1 21 
 
1.9.1 Temperatura 
La temperatura es uno de los parámetros que más afectan los procesos de FES. En niveles 
extremos de temperatura, puede tener efectos desfavorables en el crecimiento del 
microorganismo y la producción de metabolitos, especialmente se puede dar la 
desnaturalización de las enzimas producidas (Raghavarao, Ranganathan, & Karanth, 
2003). Por tal motivo, la caracterización del microorganismo de interés, particularmente la 
influencia de la temperatura sobre la cinética de crecimiento y de producción de enzimas, 
es esencial para el desarrollo de este tipo de bioprocesos. 
1.9.2 Contenido de humedad en el sustrato 
El agua tiene varias funciones en un bioproceso: ayuda en la difusión de los nutrientes 
dentro del sistema de fermentación para ser tomados por los microorganismos y en la 
estabilidad y mantenimiento de la función biológica de proteínas, carbohidratos, 
nucleótidos; entre otros (R. J. S. de Castro & Sato, 2015). 
Un bajo contenido de agua puede reducir las tasas de crecimiento microbiano, y puede 
reducir la formación de los productos de interés. Si el contenido de humedad es muy alto, 
los espacios vacíos entre el sustrato son llenados por el agua, lo que dificulta la difusión 
gaseosa, impidiendo la transferencia de oxígeno y el desplazamiento del CO2 (producto 
del metabolismo) fuera del sistema, por tanto se pueden crear microambientes anaeróbicos 
dentro del reactor que inhiben el crecimiento de los microorganismos aeróbicos (Farinas, 
2015). 
El contenido óptimo de humedad depende del microorganismo y del sustrato. Una 
consideración importante para tener en cuenta es que la humedad varía durante el tiempo 
en que se lleva a cabo la fermentación (Sharma, Kumar, Panwar, & Kumar, 2017). 
1.9.3 Aireación 
Las principales funciones del aire en la FES son mantener condiciones aeróbicas, remover 
el CO2 producido y regular la temperatura y el contenido de humedad del sustrato. La baja 
producción de metabolitos, principalmente de enzimas en FES, puede estar relacionada 
con la limitación de oxígeno durante el crecimiento microbiano puesto que la transferencia 
de O2 se da principalmente por difusión (Hölker, Höfer, & Lenz, 2004). Además, la 
transferencia de calor y la dispersión del CO2 se ven favorecidas por inyección de aire. La 
22 Diseño y optimización de un proceso de fermentación para la obtención de 
enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas a partir de Trichoderma koningiopsis 
Th003 
 
velocidad de aireación debe evaluarse cuidadosamente, ya que la pérdida de humedad a 
altas velocidades de flujo puede afectar negativamente el crecimiento del microorganismo 
limitando la producción de enzimas (Thomas et al., 2013). 
1.9.4 pH 
Así como los otros parámetros mencionados anteriormente, el pH juega un papel 
importante en los procesos de FES, principalmente debido a que este puede cambiar en 
respuesta a las actividades metabólicas entre el sustrato y el microorganismo. 
La producción de enzimas está fuertemente influenciada por el pH, ya que en ciertas 
ocasiones, los sitios activos de las enzimas dependen de la presencia de iones para 
mantener una unión eficiente con el sustrato (Brijwani, Oberoi, & Vadlani, 2010). El 
monitoreo y control del pH durante la FES no es fácil, por tal motivo solo se ha descrito la 
influencia del pH inicial del sustrato de fermentación. 
1.9.5 Tamaño de partícula 
El tamaño de partícula del sustrato es un parámetro importante a tener en cuenta, ya que 
está relacionado con la caracterización del sustrato y la transferencia de calor y masa 
durante el proceso de FES (Krishna, 2005). Adicionalmente afecta la relación 
superficie/volumen de la partícula, que determina la porosidad del sustrato y la fracción de 
este que es accesible para el microorganismo. Dado que la velocidad de transferencia de 
oxígeno afecta el crecimiento microbiano, el sustrato debe contener partículas de tamaño 
adecuado para mejorar la transferencia de masa (Krishna, 2005). Generalmente las 
partículas más pequeñas proporcionan un área superficial más grande para la acción 
microbiana, por eso, los sustratos generalmente son pretratados con mecanismos físicos, 
como la molienda para disminuir su tamaño y aumentar el área superficial, sin embargo, 
las partículas muy pequeñas pueden provocar aglomeración en el sustrato interfiriendo con 
la transferencia de oxígeno provocando una inhibición en el crecimiento (Raghavarao et 
al., 2003). Por otro lado, las partículas más grandes, proporcionan una mejor relación 
respiración/aireación, pero proporcionan una superficie limitada para la colonización por 
parte de los microorganismos (Lizardi-Jiménez & Hernández-Martínez, 2017). Es 
importante recalcar que el tamaño de partícula puede variar durante la fermentación, 
Capítulo 1 23 
 
debido a la actividad metabólica