2. Método químico. Un segundo método para la secuenciación de fragmentos de ADN rápidamente fue desarrollado en 1977 por AM Maxam y W, Gilbert (Fig...

2. Método químico. Un segundo método para la secuenciación de fragmentos de ADN rápidamente fue desarrollado en 1977 por AM Maxam y W, Gilbert (Fig. 13-15). La secuencia se puede determinar por separado en ambas hebras de un fragmento de interés para el propósito de verificar la precisión de los datos (de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases) o para extender la longitud de la secuencia capaz de ser analizado. 1I) En el primer paso importante, el grupo 5'-fosfato se retira de ambos extremos de una doble hebra Fragmento de ADN mediante tratamiento con fosfatasa alcalina y se sustituye con un fosfato radiactivo a partir de ATP radiactivo usando la enzima polinucleótido quinasa. (2) Los dos extremos 5 'marcados se separan después por uno de dos métodos. El fragmento de ADN puede ser desnaturalizado en álcali y las dos hebras aislaron por electroforesis. Alternativamente, el fragmento de ADN puede se escindió con una enzima de restricción diferente (RE) que los utilizados para generar el fragmento. Este segundo RE debe cortar en una posición, la producción de dos fragmentos, cada una etiquetada solamente en un extremo; estos doble fragmentos de cadena se separan luego mediante electroforesis en gel. (3) Los dos conjuntos de productos de 5 'marcados con (ya sea de una sola hebra o de doble hebra) son entonces independientemente sometido al ataque por reactivos químicos que causan la modificación y eliminación de uno o dos bases específicas a partir del ADN. Uno escinde tratamiento con G bases solo; Otro tratamiento escinde tanto G y bases A; tercera elimina T y C bases; cuarto elimina sólo las bases C. Las condiciones de reacción son elegidas de tal manera que la reacción específica-base por lo general sólo uno se produce al azar por cadena de ADN en la región para ser secuenciados, generando así una serie de fragmentos marcados de todas las longitudes posibles. Roturas similares pueden ocurrir tanto en las cadenas marcadas y no marcadas de fragmentos de doble hebra (si este modo de separación fue elegido), pero la cadena no marcada puede ser ignorada, ya que no será detectada por autorradiografía. Si los fragmentos de doble hebra 5 'marcados se separaron por escisión con un segundo RE, el marcado hebras se separan de las hebras no marcadas por calentamiento en formamida. (4) la electroforesis simultánea de todos los cuatro grupos de tratamiento se lleva a cabo en el mismo 20% aery-gel talamida contiene (condiciones de desnaturalización) 7 W urea. La autorradiografía se llevó a cabo a -20 ° C Tøj minimizar la difusión de productos muy pequeños.