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“Vida de Anaquel y Características Organolépticas de Huevos Obtenidos de Gallinas Alimentadas con Dietas Enriquecidas con Aceite de Pescado y Algas Marinas” TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE : QUÍMICO DE ALIMENTOS PRESENTA : Ríos Baza Víctor Hugo MÉXICO, D.F. AÑO 2006 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO : Presidenta : Gil Vieyra Leticia Vocal : Sandoval Guillén Bertha Julieta Secretaria : Carrillo Domínguez Silvia 1er. Suplente : Argote Espinosa Rosa María 2do. Suplente : Plata Jiménez María Teresa Lugar de Trabajo : Departamento de Nutrición Animal del INCMNSZ Asesora : M. en C. Carrillo Domínguez Silvia ____________________ Supervisora Técnica : M. en C. Castillo Domínguez Rosa María ____________________ Sustentante : Ríos Baza Víctor Hugo ____________________ AGRADECIMIENTOS : A la vida; por darme la oportunidad de vivir siempre un nuevo día. A mis padres, que gracias a su amor me dieron la vida. A mis hermanas, que a pesar de su carácter son siempre motivo de alegría. A mis abuelos, tíos, primos y sobrinos, y a toda mi gran familia, que en algún momento me han dado la fuerza y el valor para levantarme de las caídas. A mis amigos, que no digo por nombre, por que no podría acabar... A toda la banda de la P2 (tanto de extensión, como de la prepa). A las Buenas Peras F.C. A la gen. 98 (especialmente Qas). A la perrera. A la oficina. A la comarca. A los guaches y guachas de Michoacán. Y a todos aquellos que aunque sea por un instante tuvieron que tolerarme. Y hablando de tolerancia, a toda la gente del INCMNSZ, que me aguanto por mucho tiempo, tanto con el servicio como con la tesis, particularmente a mis asesoras, que con sus consejos y comentarios lograron que esta investigación llegara a buen puerto. A mi adorada Elizabeth, luz de las noches sin luna, calor en los días nublados, aliento cuando desfallezco, nunca olvides que te amo. Y siempre en mi corazón eterno agradecimiento a mi universidad, que me ha dado todo sin pedir nada a cambio, A todos y cada uno de sus maestros, que sus enseñanzas (invaluables) siempre tendré en mi mente a buen recaudo. A Dios... A la virgen de San Lucas... A todos ustedes; GRACIAS ATTE: Víctor CONTENIDO Página Introducción Objetivos Objetivos generales Objetivos particulares 1. Antecedentes 1.1 Huevo 1.1.1 El huevo y su importancia en la nutrición humana 1.1.2 Criterios para medir la calidad del huevo 1.1.3 Vida de anaquel 1.2 Algas marinas 1.2.1 Generalidades 1.2.2 Morfología 1.2.3 Constituyentes químicos de las algas marinas 1.2.4 Usos y beneficios de las algas marinas para la salud humana 1.2.5 Usos de las algas marinas en la alimentación avícola 1.3 Aceite de pescado 1.4 Lípidos 1.4.1 Generalidades 1.4.2 Ácidos grasos 1.4.3 Ácidos grasos omega 3 y sus beneficios para la salud humana 1.4.4 Oxidación de los lípidos 1.4.5 Determinación del grado de oxidación Hipótesis 2. Metodología 2.1 Pruebas de calidad del huevo 2.2 Análisis químicos 1 3 3 3 4 4 7 9 12 14 14 15 18 21 23 23 25 25 26 31 33 35 37 38 39 41 Página 2.3 Evaluación sensorial 2.4 Análisis estadístico 3. Resultados y discusión 3.1 Calidad del huevo 3.2 Análisis químicos 3.3 Evaluación sensorial Conclusiones Literatura citada Apéndices 41 42 43 43 49 77 81 82 88 Introducción Con base en los estudios realizados por Bang y Dyerberg en poblaciones de esquimales de Groenlandia, se ha podido determinar que la disponibilidad de ácido eicosapentaenoico (EPA) y del ácido docosahexaenoico (DHA) en la dieta habitual, mejora el estado de salud de personas con problemas coronarios y artritis reumatoide, de tal forma que autoridades de países como Estados Unidos, Canadá, el Reino Unido y Australia han recomendado el aumento en el consumo de ácidos grasos omega 3, presentes en el pescado. Por otra parte, el empleo de algas marinas en la industria alimentaria se ha extendido recientemente a los países occidentales, ya que se ha observado que éstas pueden potenciar los efectos nutrimentales de los alimentos, debido a su alto contenido de fibra, a su actividad antioxidante, anticancerígena y antiaglutinante, por mencionar algunas de sus propiedades. Sin embargo, en México el consumo de productos marinos es bajo, no así el de productos avícolas como el huevo. El huevo es uno de los alimentos más consumidos en el país, de hecho a nivel internacional México ocupa el primer lugar como consumidor de huevo fresco, con un consumo per capita anual de 21.6 Kg, y el sexto lugar como país productor. El huevo es un alimento con un bajo contenido calórico y aporta solamente 75 kilocalorías (igual que una fruta), y se considera una buena fuente de proteína, por su alto aprovechamiento en el cuerpo humano; contiene el mejor perfil de aminoácidos, un excelente contenido de todas las vitaminas (excepto la vitamina C) y de minerales (excepto el calcio), así como de los carotenoides luteína y zeaxantina que reducen el riesgo de cataratas y de degeneración macular. Por tales razones se ha venido empleando al huevo como vehículo para hacer llegar a la población los beneficios a la salud inherentes a la ingesta de ácidos grasos omega 3, mediante la incorporación de diferentes ingredientes con elevadas concentraciones de éstos, como el aceite de pescado, en la dieta de aves destinadas a la producción de huevo. Sin embargo, en virtud de que los ácidos grasos omega 3 se oxidan rápidamente por las largas cadenas poliinsaturadas que los conforman, se hace necesario añadir antioxidantes. Las algas marinas constituyen una fuente natural de antioxidantes que pueden proteger a 5 7 7 7 8 8 8 9 10 12 13 15 19 19 20 22 23 23 25 26 los ácidos grasos omega 3, extendiendo la vida de anaquel, la cual debe ser entendida como el comportamiento que presentan las características físicas químicas y organolépticas del huevo al paso del tiempo y en diferentes condiciones de almacenamiento, sin que se afecteni la calidad de dicho producto, ni la salud de los consumidores durante dicho período de estudio. A la fecha no se han realizado estudios que comprueben lo anterior, y se espera que los resultados obtenidos en la presente investigación, sean un antecedente, que permita mejorar la nutrición de la población mexicana, sin que esto signifique gastos sustanciales en su economía, mediante el consumo de un alimento versátil, económico y con multiplicidad de presentaciones y formas de preparación como lo es el huevo aunado a eliminar el estigma que dicho producto ha cargado en décadas anteriores sobre su supuesta influencia nociva en la salud de sus consumidores. Objetivos Objetivo General 1. Evaluar el efecto que las algas marinas y el aceite de pescado ejercen sobre las características físicas, químicas y organolépticas de huevos enriquecidos con ácidos grasos omega 3 al ser adicionados en la dieta de gallinas ponedoras. Objetivos Particulares 1. Determinar si la adición en forma combinada del aceite de pescado y diferentes algas marinas en el pienso de gallinas ponedoras mantiene la calidad física, química y las características organolépticas del huevo enriquecido con ácidos grasos omega 3 conforme al paso del tiempo. 2. Inferir si la inclusión combinada de aceite de pescado y diferentes algas marinas en el pienso de gallinas ponedoras reduce el proceso de rancidez de los ácidos grasos presentes en los huevos enriquecidos con ácidos grasos omega 3. 3. Discernir sobre el efecto que la refrigeración ejerce sobre las características físicas, químicas y organolépticas de huevos enriquecidos con ácidos grasos omega 3 obtenidos de gallinas cuya ración incluyo aceite de pescado y 3 algas marinas 1. Antecedentes 1.1 Huevo Generalidades Sin duda desde el comienzo de la civilización misma, uno de los alimentos más antiguos consumidos por el ser humano es el huevo. Este puede ser aprovechado de muy diversas formas en la industria alimentaria. Los huevos se encuentran formados principalmente por la cáscara, la clara y la yema (Figura 1). Cascarón: El huevo está envuelto por una cáscara de carácter poroso, que en el huevo de gallina va del color blanco al amarillo, pasando por el marrón. Su interior se encuentra revestido por dos finas membranas, que se separan entre sí en el polo obtuso del huevo para formar la cámara de aire, la cual aumenta con el 1, disco germinativo con vesícula; 2, membrana de la yema; 3, látebra; 4, vitelo (yema) blanco; 5, vitelo amarillo; 6, chalaza; 7, clara fluida; 8, clara espesa; 9, poros; 10, cámara de aire; 11, membrana de la cáscara; 12, membrana envolvente del huevo; 13, membrana de revestimiento de la cáscara; 14, cutícula superficial; 15, cascarón. Figura 1. Diagrama del huevo Belitz y Grosch, 1999 envejecimiento. La cáscara se compone de carbonato de calcio y fibras proteínicas, pudiéndose encontrar además pequeñas cantidades de carbonato magnésico y fosfatos. Como cascarón propiamente dicho actúa una matriz esponjosa con prolongaciones verrugosas hacia el interior, dicha matriz contiene poros, los cuales están llenos de fibras proteínicas que dificultan la entrada de microorganismos (Belitz y Grosch, 1999). Clara: La clara del huevo, corresponde a la porción líquida (que contiene aproximadamente 10% de proteínas) es blanquecina, ligeramente amarillenta compuesta por tres capas de albumen de diferente viscosidad. Las proteínas de la clara se pueden precipitar con facilidad, y en ella se puede encontrar una gran variedad de proteínas, como las que se enumeran a continuación: -Ovoalbúmina: Es la principal proteína del huevo, es una glicofosfoproteína, que se activa con el paso del tiempo, debido al aumento de pH en el huevo. Es relativamente estable frente al calor, pero se precipita con facilidad mediante fuerzas de fricción. -Conoalbúmina: Esta proteína no se desnaturaliza al paso del tiempo, pero coagula a temperaturas más bajas que la ovoalbúmina y tiene la particularidad de fijar iones metálicos como el hierro y el magnesio a un pH mayor o igual a 6, por lo que coloraciones rojas en huevos procesados pueden deberse a la formación de complejos con el hierro. En presencia de bromoacetato, se pierde la facultad de fijar hierro, o bien por nitración y su principal función es inhibir microorganismos. -Ovomucoide: Es muy estable frente a la coagulación por calor e inhibe la tripsina de vacuno, pero no así la humana. -Ovoglubulinas (G1,G2,G3): Son lisozimas, que presentan como característica particular en el huevo, el ser agentes espumantes muy efectivos. -Ovomucina: Forma con facilidad estructuras fibrilares, con lo que se aumenta la viscosidad de la clara, encontrándose en la clara espesa en una proporción 4 veces mayor que en la fracción más fluída. Esta proteína también es termoestable y forma con la lisozima un complejo insoluble en agua, cuya disociación se encuentra en función del pH. -Flavoproteína: Se encarga de fijar la riboflavina y permite el transporte de la coenzima desde el suero sanguíneo al huevo. -Ovoinhibidor: Es un inhibidor de la proteinasa, tripsina, quimotripsina y otras enzimas microbianas. -Avidina: Es una glicoproteína básica, capaz de fijar o unirse a moléculas de biotina, se cree que puede ejecutar un papel antibacteriano. -Cisteína peptidasa: También conocida como inhibidor de la enzima ficina, presenta propiedades inmunológicas, al inhibir a la ficina, papaína y algunas catepsinas o la dipeptidilpeptidasa I, sin embargo no es activa frente a proteínas del suero. Los lípidos en la clara se encuentran en muy pequeñas cantidades, mientras que los hidratos de carbono se encuentran libres, o fijados a proteínas, constituyendo alrededor del 1% de la clara, de estos, el que se encuentra en mayor cantidad es la glucosa, sin encontrarse oligosacáridos ni polisacáridos libres. Los minerales forman alrededor del 0.6 % de la clara pudiéndose encontrar potasio, magnesio y calcio entre otros (Belitz y Grosch, 1999). Yema: Es de forma esferoidal y se encuentra fija por dos cordones entrelazados llamados “chalazas”, adheridas a la membrana envolvente de la yema, y que atraviesan la clara hasta ambos polos del huevo. Es una emulsión de grasa en agua, con una cifra de extracto seco cercana al 50%. Un tercio se compone de proteínas y dos tercios de lípidos. En ella se encuentran gotitas y gránulos. Las gotitas de yema asemejan glóbulos grasos y se trata esencialmente de lipoproteínas de baja densidad (LDL), mientras que los gránulos (más pequeños que las gotitas) se componen fundamentalmente de proteínas, y algunos lípidos y minerales. Las proteínas de los gránulos son: -Lipovitelinas: Son lipoproteínas de alta densidad (HDL), cuya fracción lipídica constituye el 22% del extracto seco. -Fosvitina: Es una glicofosfoproteína que fija con facilidad los iones metálicos formando complejos metálicos con ellos. En la yema, además, los lípidos forman el 32.6%, mientras que los hidratos de carbono equivalen al 1% total y se encuentran en forma similar que en la clara, lo mismo que los minerales y las vitaminas (Bowers, 1992). 1.1.1 El huevo y su importancia en la nutrición humana La industria avícola productora de huevo es una de las más importantes industrias pecuarias en el país. Esto ha convertido a México en el sexto país productor de huevo y el primer consumidor mundial de huevo fresco. Esta industria genera alrededor de 390 mil empleos, de los cuales 65 mil son directos y cerca de 325 mil indirectos. La avicultura aporta cerca del 8.3 % del productointerno bruto pecuario, con lo que se generan ganancias de 15 mil millones de pesos (UNA, 2005). Durante la infancia y el crecimiento, se requiere un buen aporte de proteínas de excelente calidad, para la formación de músculos, así como para fortalecer el sistema inmunológico y otras funciones vitales, para lo cual el consumo de huevo es una buena opción ya que solo aporta 75 kilocalorías. Es buena fuente de proteína animal, por su excelente contenido de proteínas, y perfil de aminoácidos (Cuadros 1 y 2). La yema posee de 4-4.5 g de grasas por huevo fresco, de las cuales 1.5 son grasas saturadas y el resto insaturadas (estas últimas son benéficas para la salud). Además el huevo cuenta con todas las vitaminas, excepto la vitamina C, y todos los minerales (con excepción del calcio el cual se encuentra en bajas concentraciones) (Cuadro 3). Es una excelente fuente del fosfolípido colina el cual favorece sin duda Cuadro 1. Composición media del huevo de gallina (%) Parte Proporción del peso total Extracto seco Proteínas Grasas Hidratos de carbono Sales minerales Cáscara 10.3 94.8 3.3 95.1 Clara 56.9 12.1 10.6 0.03 0.9 0.6 Yema 32.8 51.3 16.6 32.6 1 1.1 Belitz y Grosch, 1999 Clara (%) Yema (%) Azufre 0.195 0.016 Fósforo 0.018 0.543-0.980 Sodio 0.161-0.169 0.070-0.093 Potasio 0.145-0.167 0.112-0.360 Magnesio 0.009 0.032-0.128 Calcio 0.008-0.02 0.121-0.262 Hierro 0.0009 0.0053-0.011 Cuadro 3. Elementos minerales del huevo Belitz y Grosch, 1999 Aminoácido Huevo Entero Clara Yema Alanina 0.71 0.65 0.82 Arginina 0.84 0.63 1.13 Ac. Aspártico 1.2 0.85 1.37 Cisteína 0.30 0.26 0.27 Ac. Glutámico 1.58 1.52 1.95 Glicina 0.45 0.40 0.57 Histidina 0.31 0.23 0.37 Isoleucina 0.85 0.70 1 Leucina 1.13 0.95 1.37 Lisina 0.68 0.65 1.07 Metionina 0.40 0.42 0.42 Fenilalanina 0.74 0.69 0.72 Prolina 0.54 0.41 0.72 Serina 0.92 0.75 1.31 Treonina 0.51 0.48 0.83 Triptófano 0.21 0.16 0.24 Tirosina 0.55 0.45 0.76 Valina 0.95 0.84 1.12 Cuadro 2. Composición de aminoácidos del huevo entero, clara y yema (g/100 g de porción comestible) Belitz y Grosch, 1999 el desarrollo de la memoria durante el crecimiento y de los pigmentos luteína y zeaxantina (Belitz y Grosch, 1999). En el caso particular de la vitamina D esta se produce en forma natural por la exposición solar, sin embargo en casos donde esto no es posible, el huevo es una herramienta útil, ya que es la segunda fuente más importante después del pescado. Otro componente del huevo que reviste particular importancia, es el ácido fólico, el cual es de importancia en mujeres embarazadas, ya que es primordial para prevenir problemas durante el desarrollo del sistema nervioso del bebé, por lo que el huevo suministra un buen aporte de ácido fólico al contener el 11.5% de la recomendación diaria (UNA, 2005; Instituto del Huevo, 2004). Si bien el huevo tiene una alta concentración de colesterol (230 mg / 50 g), también es cierto que posee sustancias como la lecitina que contribuye a mantener el balance de colesterol en el cuerpo actuando como emulsificante y por lo tanto, contribuye a reducir la concentración de colesterol en la sangre. Es importante mencionar, que cerca del 80% de colesterol que circula por nuestras venas, se produce en el hígado, y el 20% restante se adquiere con la dieta. El colesterol en nuestro cuerpo mantiene un balance, ya que al consumir más del que se necesita se disminuye su absorción y producción. Para disminuir el colesterol se recomienda disminuir el consumo de grasas saturadas ya que estas favorecen la formación del mismo (el huevo solo contiene 1.5 g de grasa saturada). (McNamara y Nicolosi, 1999). 1.1.2 Criterios para medir la calidad del huevo Los huevos destinados al consumo, revisten particular importancia las siguientes pruebas de calidad: Unidades Haugh: Es una medida introducida por Haugh en el año de 1939, la cual esta relacionada con el logaritmo del espesor del gel de la albúmina densa y se corrige en función del peso del huevo, y se expresa en “Unidades Haugh” de acuerdo a la fórmula U.H.= 100log(H-1.7P0.37+7.57) donde H corresponde a la altura de la albúmina densa (mm) y P al peso de huevo (g). Para este tipo de determinación, es importante no emplear huevos cuya temperatura interna sea inferior a los 12 grados Celcius, cascar con cuidado el huevo, no romper el albumen denso con un borde de la cáscara y medir la altura del albumen lo más cerca posible de la superficie donde se va a efectuar la medición, y realizar esta de manera inmediata. En los Estados Unidos, esta prohibido poner a la venta huevos de la categoría C (Figura 2). Color de yema: Es una de las características que más interesan al consumidor. Sin embargo, la noción de color es compleja y debe ser subdividida en tres componentes: matiz, saturación y brillo, por lo que el método aplicado más habitualmente es la comparación directa de la yema con una serie de colores patrón, Sauveur, 1993 Figura 2. Unidades Haugh como lo es por ejemplo, la “escala Roche”, tratando de trabajar con luz natural y sin modificar el ángulo de iluminación en el curso de una serie de mediciones. La coloración de la yema debe ser uniforme, sin mancha visible alguna. En el caso de que aparezcan manchas claras debajo de la membrana vitelina, estas se estiman en una escala que va de 0-5, al igual que las manchas de sangre que pudieran presentarse, para lo cual es útil disponer de un espejo inclinado debajo de la placa de vidrio transparente donde se efectúa el análisis del huevo. Las manchas de sangre se deben a pequeñas hemorragias que tienen lugar antes de la ovulación y su aparición se relaciona con un aumento en el tiempo de coagulación, una fragilidad capilar o bien por un aumento de la presión arterial, pudiendo cambiar el color de dichas manchas al aumentar el pH del albumen hasta alcanzar un color marrón oscuro. A su vez, las manchas de carne pueden presentar un diámetro de diversos milímetros y pueden deberse a una modificación de las manchas de sangre o bien por descamación del oviducto. Índice de forma: Viene definido por un índice que relaciona su diámetro (medido en el ecuador) con su longitud, donde los valores normales oscilan entre 70 y 75, pudiendo presentar valores extremos de 65 para huevos muy alargados y 82 para huevos muy redondeados, la fórmula que se emplea para determinar dicho índice es IF = [(diámetro del huevo en cm) / (largo del huevo en cm)]100 Peso del cascarón: Para poder pesar el cascarón hay que romper el huevo, y el peso debe efectuarse con precisión e incluye generalmente el de las membranas coquiliarias. Para comparar huevos de distinto peso, se emplea el peso por unidad de superficie, para la cual es necesario definir un índice de cascarón, que expresa el peso del cascarón por 100 cm2 de superficie, teniendo que I = (C/S)100, donde C es el peso del cascarón en gramos y S es la superficie del cascarón en cm2, pudiendo ser calculada a partir del peso del huevo P expresado en gramos con la ecuación S = KP2/3, en donde el coeficiente K toma los valores 4.67 (peso menor a 60 g), 4.68 (peso entre 60 y 70 g), y 4.69 (peso mayor a 70 g). Espesor del cascarón: Se mide con un tornillo micrométrico, es importante mencionar que dicho espesor no es constante en toda la superficie del huevo, siendo mayor en el polo fino, mínimo en el ecuador e intermedio en el polo grueso, comprendiendo valores promedio de 0.35-0.40 mm. En la expresión C = Sed e representa el espesor del cascarón y d el peso específico del cascarón, mientras que C se refiereal peso y S a la superficie. De donde el índice de cascarón (I) será: I =100(C/S) ; = 100(e d). Si tomamos en cuenta que d´ tiene un valor constante (2.3-2.4 g /cm3) se puede aceptar que el índice de cascarón y su espesor medio están relacionados de la siguiente forma: I = 23.5e (en g /cm2). La medida del porcentaje de cascarón sin romper el huevo, es una medida indirecta que se basa en el peso específico del huevo, el cual es estable (1.035-1.040 g / cm3) y diferente del cascarón (2.35 g / cm3). Generalmente la medición se realiza colocando los huevos (alrededor de 30 simultáneamente) en cestas metálicas sumergidas en soluciones de peso específico creciente, los huevos se van retirando a medida que empiezan a flotar. Aspecto del cascarón: Entre los más importantes se cuentan la porosidad y la rugosidad, la cual refleja defectos de calcificación superficial y de secreción de la cutícula, así como la presencia de ventanas y grietas. Limpieza del cascarón: Se refiere a la no presencia de alimento, heces o sangre. La limpieza se encuentra directamente relacionada con el modo de colecta y manejo de los huevos (Sauveur, 1993). 1.1.3 Vida de anaquel Es el período de tiempo en que un producto puede ser puesto en venta o anaquel, a lo largo del cual sus características de calidad (física, químicas y sensoriales) son las deseables desde el punto de vista del consumidor, asegurando además la salud del mismo por ingesta de dicho producto (Fennema, 1993). En la mayoría de los productos las características que sufren una degradación más rápida son las sensoriales, mucho antes de que se presenten microorganismos, o modificaciones químicas que puedan generar problemas en el consumo de dichos alimentos siendo deseable determinar la vida de anaquel ya que el consumo de productos sensorialmente no aceptables puede generar aversión inconsciente por parte de los consumidores hacia el producto y la marca, mediante un mecanismo que a lo largo de la evolución del hombre le ha permitido discernir entre aquellos alimentos que le son benéficos y aquellos que no lo son (Man y Jones, 2000). Dichos periodos de vida de anaquel difieren enormemente en función del producto o alimento del cual se trate, ya que puede ir de algunas semanas en frutas frescas (que no son sometidas a ningún proceso de conservación), o hasta ocho meses o más (en algunos productos lácteos ultrapasteurizados), siempre en función del trato al que sean sometidos los alimentos. El tiempo de vida de anaquel varía en relación de las diferentes características de los productos, y el empleo de métodos de conservación (como la pasteurización, la formación de salmueras, el almacenamiento en refrigeración), que es el principal factor que alarga el periodo de vida útil de los diferentes productos, seguido por la disponibilidad de agua en los alimentos. De tal forma que aquellos alimentos que presentan menos agua disponible (como las nueces y los frutos frescos) presentan una vida de anaquel más extensa con respecto a otro tipo de alimentos con una mayor cantidad de agua en su matriz, como lo es el caso de las ya nombradas frutas frescas; sobre todo porque la disponibilidad de agua en los alimentos favorece la reproducción de microorganismos, patógenos o no, que pueden afectar las propiedades de calidad de los alimentos (Belitz y Grosch, 1999). Para determinar el período de la vida de anaquel adecuado, se estudia el comportamiento de las principales características del producto que se trate a lo largo del tiempo (Man y Jones, 2000). En el caso del huevo de gallina, las características que se miden a lo largo del paso del tiempo, son las de calidad de huevo (ya mencionadas), las sensoriales (de sabor y color de yema del huevo generalmente), así como las químicas. El huevo dentro de sus componentes principales tiene poco más de 10% de lípidos, por lo que en lo que respecta a las determinaciones químicas las que se realizan son aquellas relacionadas con los lípidos, ya que estos son muy susceptibles a una degradación o enranciamiento, lo cual genera un sabor desagradable en el producto, sobre todo en el caso de los huevos enriquecidos con algas marinas y aceite de pescado donde la vida de anaquel puede verse afectada (Wong, 1989). 1.2 Algas marinas 1.2.1 Generalidades Los primeros organismos vivos que avistó Cristóbal Colón en su llegada al nuevo mundo fueron algas del tipo Phaeophyta, de forma más precisa la Sargassum fluitans o sargazo, llamada de esta manera debido a la apariencia similar que presenta con las uvas, cuando la flota compuesta por las tres naves españolas cruzaba por el mar de los Sargazos (Ortega et al., 1993). Las algas marinas son fuente de ácidos grasos insaturados, y están comenzado a ser un boyante recurso en la alimentación y la industria de alimentos, sobre todo si se toma en cuenta que las algas cubren cerca del 71% de la superficie de nuestro planeta, aunado a que contiene compuestos que no han podido ser elaborados o fabricados de forma sintética. En México, sobre todo en el estado de Quintana Roo y parte de Yucatán, se han consumido desde tiempo atrás, sobre todo las algas rojas de las cuales se obtienen ciertas sustancias espesantes que dan la consistencia en la elaboración de una variante del atole. Sin embargo en las demás regiones del país su consumo no ha sido tan generalizado, y solo ha comenzado a despuntar como una extravagancia, sobre todo por el aumento de la población de origen oriental, y por ende de sus platillos, sobre todo la comida japonesa (Ortega et al., 1993). Las algas también cuentan con ciertos componentes importantes desde el punto de vista tecnológico, como son los polisacáridos, dentro de los cuales se pueden contar los ficoloides o hidrocoloides. Dichos hidrocoloides son polisacáridos complejos obtenidos principalmente de algas de las divisiones Phaeophyceae (feofitas) y Rhodophyceae (rodófitas), y se emplean de una forma muy extensa en la industria alimenticia, ya que tienen la particularidad de formar coloides cuando se dispersan en agua. Se pueden citar como algunos ejemplos los alginatos, la laminarina, los galactanos, el agar, la carragenina y la fucoidina (Chapman y Chapman, 1970). De una forma general se puede decir que las algas son un grupo de organismos de estructura simple que producen oxígeno al realizar el proceso de la fotosíntesis. La mayoría de ellas son unicelulares y microscópicas, y pueden vivir en simbiosis con hongos, formando líquenes. Las algas macroscópicas se fijan a una superficie firme y crecen en abundancia como algas marinas en las zonas intermareal y submareal en profundidades de hasta 268 m (Marshall, 1991). Las algas constituyen un grupo muy variado y complejo, por lo que es complicado definirlas, hasta hace poco se les definía como vegetales fotosintéticos cuyo aparato vegetativo se denomina con el nombre genérico de “talo”, por lo que se les situaba en el grupo de los talófilos, al lado de los hongos. Otro factor que dificulta su clasificación, es que pueden ocupar casi cualquier hábitat, siempre y cuando éste cuente con iluminación y humedad, por lo que se les encuentra en agua dulce o en el mar, en suelos húmedos y en la nieve (Ortega et al., 1993). 1.2.2 Morfología Las algas marinas constan de un estípite (órgano de fijación) y de un fronde, que juntos forman el talo, en algunos casos los frondes se rompen de su estípite, por lo que no necesariamente las algas marinas se encontrarán fijas, sino que pueden flotar en la superficie del mar. Las algas marinas tienen poca diferenciación en sus tejidos y solo algunas como las laminarias, tienen algo parecido a un sistema vascular, yaque la gran mayoría de las células de las algas son capaces de realizar numerosas funciones. Para clasificarlas, se utilizan las particularidades del fronde y estípite los cuales pueden ser radiciformes o como una maraña de radículas, mientras que el fronde puede ser redondeado (o cilíndrico) plano con o sin una costilla o costillas centrales, o bien intermedio, es decir, ni redondo ni plano. Además también es importante el tipo de ramificación, pudiendo ser pinnado, espiral, alternado o dicótomo (Ortega et al., 1993). El color suele emplearse como otra forma para clasificar a las algas marinas, sin embargo esta forma de clasificación es poco fiable, ya que dichos colores pueden variar dependiendo de diversos factores, y ciertas algas tienen colores muy parecidos entre si, sin embargo, se puede considerar que las algas marinas se dividen en varios subgrupos, de los cuales se pueden considerar tres grupos principales. Clorofitas y cianofitas (algas verdes o azul verdosas): Son similares a las plantas terrestres, tienen los pigmentos clorofila A y B y son fácilmente diferenciables por su coloración amarillo verdosa en presencia de luz o verde oscuro en ausencia de una fuente luminosa. Pueden ser unicelulares, colonias, coenociticos (células con muchos núcleos) o sifonos (una o más células con muchos núcleos), filamentosas, tubulares o parenquimatosas. Algunas especies están calcificadas (con carbonato de calcio) como las especies de Halimeda que se encuentran principalmente como sedimentos en el fondo del mar (Marshall, 1991). Algunos miembros de la familia Chlorophyta son usados como indicadores de contaminación, como lo es el caso de Enteromorpha (Figuras 3 y 4) y Ulva, que crecen en forma exponencial en medios con una alta concentración de nitrógeno, además de poder emplearse como alimento para pienso animal. Se consumen frescas o secas, siendo una buena fuente de vitaminas A, B1 y C, se emplean incluso en la elaboración de papel artesanal. Feofitas (algas pardas): Suelen llamarse algas de roca o “Kelps”. Son materia prima para la obtención de alginatos, empleadas en la industria alimenticia y farmacéutica. La forma más simple de las algas cafés son algas rectas, con extensiones Figura 4. Enteromorpha clathrata Paalang y Guingona, 1996 Paalang y Guingona, 1996 Figura 3. Enteromorpha intestinalis filamentosas o sin ellas, con origen en una próstata, o sistema filamentoso basal (organización heterotricosa). El tallo de algunas phaeophytas es similar a las plantas terrestres, lo que se deriva de la habilidad de las células de dividirse en varios planos formando tejidos verdaderos los cuales pueden ser filamentados en formas agudas, sin embargo otras especies han modificado su estructura para la flotación. Las algas cafés no son unicelulares y no forman colonias, su tamaño llega incluso a los 30 metros de largo y se emplean directamente como alimento (como Sargassum), o como sazonadores (usualmente para pescados), aunque también se emplean como fertilizantes y aditivos en la industria avícola al igual que Sargassum, Turbinaria, y Hormophysa (Paalang y Guingona, 1996). Las algas cafés son una importante fuente de ácido algínico, un polisacárido que absorbe grandes cantidades de agua, y que se emplea principalmente como emulsificante en alimentos, helados y mezclas o cosméticos. Además cuentan con c l o r o f i l a A y C , beta-carotenos, como material de reserva se puede encontrar laminarina y manitol, además de que la pared celular tiene buenas concentraciones de ácido algínico (Ortega et al., 1993). Por último podemos citar que los elementos cribosos de las algas más avanzadas (Macrocystis) son comparables a las plantas superiores y poseen numerosas mitocondrias siendo parte del tipo laminaria, mientras que Sargassum (Figura 5 y 6) se considera como parte del genero Fucus. Rodofitas (algas rojas): Se pueden encontrar en fondos ya sea arenosos o fangosos de aguas frías, se consumen como alimento, y se emplean para obtener agar y carrageno. Sin embargo, también pueden dividirse de acuerdo a su forma en algas vesiculosas (o filamentosas), de aspecto parcialmente filamentoso, huecas o Figura 5. Sargassum cristaefolium Paalang y Guingona, 1996 Figura 6. Sargassum polycistum Paalang y Guingona, 1996 mucilaginosas, comprimidas (o delgadas), gruesas no membranosas (formando cordones cilíndricos o cintas), incrustaciones no calcificadas y calcificadas (Marshall, 1991). 1.2.3 Constituyentes químicos de las algas marinas. La química de las algas marinas es un campo extenso y en amplio crecimiento, y el interés radica en que son fuente de nuevos antibióticos, agentes farmacéuticos y antitumorales, e incluso de metabolitos biosintéticos inusuales presentes en algunas algas cafés, rojas y verdes. En México, la mayor diversidad y biomasa de algas, se encuentra en las costas de Baja California Sur, cuyas algas presentan escasa presencia de factores antinutricionales (como los taninos), valores de proteína similares al maíz, trigo y avena (7-15%), con una digestibilidad mayor al 70%, la concentración de grasa es mínima y parecida a la que se encuentra en cereales y leguminosas (alrededor del 2%) (Carrillo et al, 2002). La cantidad de fibra varía del 3.9-13.5 %, y en cuanto a minerales, se reportaron valores altos, al igual que el extracto libre de nitrógeno que comprende carbohidratos, así como agar, carragenos y ácido algínico los cuales no pueden ser utilizados por los humanos debido a sus enlaces. El calcio resulta ser el elemento mayoritario en las algas, con valores alrededor del 6-7%, valor alto comparando por ejemplo, con la harina de alfalfa que tiene un valor de 1.8%, pero los demás minerales (fósforo, sodio, potasio, magnesio, zinc, cobre, hierro) también presentan valores altos comparando con otros productos alimenticios y una mayor biodisponibilidad. A su vez, su bajo contenido calórico, permite adicionarlas a diversas dietas, sin afectar considerablemente la ingesta de calorías (Carrillo et al., 2002). Toda esta gama de componentes le confieren a las algas ciertas particularidades funcionales que son benéficas para la salud y a continuación se mencionan de forma más específica otros componentes: Clorofila: La clorofila A es la más abundante, siendo sintetizada probablemente en las algas a partir del ácido 5-aminolevulinico. Las algas verde y cafés producen además la clorofila B, sintetizada a partir de la clorofila A, mientras que las algas rojas no producen clorofila (Pomeranz, 1991). Ficobiliproteinas: Son pigmentos de cadena abierta de tetrapirroles que se encuentran en Rhodophyceae, Cianobacteria y Criptophyceae, identificándose dos tipos de bilinas en las algas, ficocianobilina y ficoeritrobolina, que se encuentran unidas a polipéptidos de clase mayores, y generan colores como el azul en las Rhodophyceae (Ragan, 1981). Carotenoides: Son pigmentos presentes en todos los organismos fotosintéticos y son derivados del ácido mevalónico y del licopeno, pudiéndose obtener una enorme variedad de carotenoides y xantofilas, siendo los principales pigmentos el β-caroteno, alfa caroteno, la zeaxantina y la luteína en las algas rojas; el β-caroteno, zeaxantina y neoxantina en las algas cafés y verdes. Las condiciones del medio influyen significativamente en la composición de los carotenoides de las algas, como lo puede ser la exposición a la luz y la consiguiente oxidación de dichos pigmentos. Esteroides y triterpenoides: Los esteroides son sintetizados a partir del ácido mevalónico, vía elpirofosfato isopentil y escualeno, lo que produce cicloartenol, precursor de todos los esteroides en las algas. Se han encontrado esteroles (como el colesterol y ergocolesterol) en todas las algas rojas, y en las algas cafés el esterol predominante es el fucoesterol, mientras que en las algas verdes su presencia es muy variable y poco predictiva, pudiendo encontrarse colesterol o β-sitosterol en pequeñas cantidades (Ortega et al., 1993). Ácidos grasos y lípidos: Se acumulan en pequeñas cantidades, y salvo unas cuantas excepciones la composición es constante en las diferentes algas, presentando en las algas rojas una mayor cantidad de ácidos insaturados con cadena mayor a 20 carbonos, mientras que las algas verdes tienden a acumular ácidos grasos de cadenas menores a 20 carbonos como el cis-vacenico (Marshall, 1991). Carbohidratos: Los complejos se pueden encontrar en una gran cantidad y variedad (como la celulosa), mientras que algunos carbohidratos poco comunes se encuentran en cantidades pequeñas, generados principalmente por la decarboxilación de los ácidos grasos, encontrándose el cis-3,6,9,12,15,18-heneicosahexano en las algas verdes y el cis-1,6,9,12,15,18-heneicosahexano en las algas cafés (Marshall, 1991). Metabolitos lipofílicos de bajo peso molecular: En las algas rojas pueden encontrarse antibióticos, como el metil yoduro, y otros compuestos halogenados encontrado en el genero Asparogopsis, así como lactonal halogenadas que generan actividad antibiótica en Beckerella subcostatum (Ragan, 1981). Fenoles relacionados a la Tirosina: Se encuentran en los tres tipos principales de algas, encontrándose en pequeñas cantidades en muchas algas rojas y cafés, y en menor proporción en las algas verdes (Ragan, 1981) Fenoles relacionados a fluoroglucinol y resorcinol: Son las algas cafés las que acumulan en mayor cantidad estructuras de taninos basados en el esqueleto del fluoroglucinol. Es importante mencionar, que buena parte de los antioxidantes empleados en la industria alimenticia son derivados fenólicos como lo es el BHA y BHT, cuyo empleo en alimentos se da al adicionarlos en concentración del 0.2% (concentraciones más elevadas no mejoran el efecto antioxidante) con respecto al peso total, y que estos son más eficaces si se encuentran en formas menos polimerizadas. Estos compuestos son los que presentan la actividad antioxidante al formar radicales libres estables que detienen el proceso de deterioro, y su concentración en las algas es muy variable pudiendo encontrarse en concentraciones menores al 0.1% (Belitz y Grosch, 1999). Vitaminas: El ácido ascórbico, también conocido como vitamina C, se encuentra en todas las clases de algas marinas. La vitamina B12, se encuentra también en casi todas las algas, principalmente en las verdes y rojas, mientras en las cafés se encuentra la biotina, en ambos casos la cantidad depende directamente de la época del año, por ejemplo la niacina (aunque se observa en todas las algas marinas) que presenta su máximo en mayo y abril (Ragan, 1981). Los tocoferoles (vitamina E) presentan actividad antioxidante y se encuentran extensamente repartidos en las algas pardas con mayor concentración (2-40 mg / 100 g peso seco), así como en las verdes y rojas con valores más bajos (alrededor de 1 mg / 100 g peso seco) (Jiménez-Escrig y Goñi, 1999). Aminoácidos, péptidos y compuestos nitrogenados de bajo peso molecular: En cuanto a los aminoácidos, estos se derivan principalmente de la cantidad de proteína que contienen las algas (alrededor del 30%), así como del contenido intracelular, pueden observarse valores altos o bajos de los diferentes aminoácidos y la cantidad se encuentra relacionada a la estructura de las algas (pared celular), sin embargo, las algas rojas parecen no acumularlos. Por su parte los péptidos también son acumulados en las algas, incluyendo las rojas observándose residuos de glutamato y aspartato, debido probablemente a una forma de almacenamiento de nitrógeno, pudiéndose encontrar también taurina. Es importante resaltar, que los constituyentes químicos antes mencionados pueden variar de alga en alga, incluso entre grupos y géneros iguales, por condiciones como periodos de luz y oscuridad, estación del año, estrés osmótico e irradiación entre otros, con lo que se puede decir que las algas marinas se encuentran interrelacionadas directamente con el medio ambiente (Ragan, 1981). 1.2.4 Usos y beneficios de las algas marinas para la salud humana En la industria alimenticia, las algas marinas se han explotado desde hace más de medio siglo, principalmente las localizadas en el litoral del Pacífico mexicano, como el alga parda Macrocystis pyrifera que se cosecha y exporta en fresco hacia Estados Unidos de Norteamérica para extraer alginato; además de una buena cantidad de algas del género Sargassum (también algas pardas) que suelen llegar a las playas y de las cuales también se pueden extraer alginatos (Ortega et al., 1993). Actividad antioxidante: Las algas pardas contiene compuestos fenólicos constituidos por floroglucinol, cuya actividad antioxidante es similar a la del alfa-tocoferol, impidiendo la captación de oxígeno (Ragan, 1981). Actividad anticancerígena: De diferentes algas se han extraído polisacáridos, como fucoidanos y porfiranos entre otros, a los cuales se les ha relacionado con una actividad antitumoral (Jiménez-Escrig y Goñi, 1999). Actividad anticoagulante: Del alga parda Ecklonia kusome se han aislado fucanos sulfatados, los cuales presentan una fuerte actividad anticoagulante, lo cual parece deberse principalmente a la presencia del grupo sulfato (Stansby, 1990). Disminución de colesterol: Se ha observado, que ratas alimentadas con polisacáridos provenientes de algas como alginato sódico, carragenano, o furonano, presentan una disminución en los niveles de colesterol plasmático, correlacionado con la mayor excreción de esteroles en heces (Jiménez-Escrig y Goñi, 1999). De forma más particular, se sabe, que el colesterol puede reducirse, o bien disminuir su metabolismo con el consumo de productos naturales como la vitamina A, el ergoesterol, y el colestano, sin embargo los resultados obtenidos en diferentes estudios con dichas sustancias, es muy variado, y depende principalmente de la especie empleada en dichos estudios, ya que por ejemplo, en ratas de laboratorio no se observa un efecto de disminución por la adición de aceite de pescado en las dietas, caso contrario a lo que se observa en aves (Nishide y Uchida, 1998). Sin embargo la razón por la que el colesterol disminuye, no se encuentra esclarecida, ya que puede deberse a diversos factores, como una prevención endógena en la síntesis del colesterol (por deficiencia de la vitamina B), por el contenido de CoA, o por procesos que faciliten su deposición en el organismo entre otros, aunque el motivo principal probablemente se debe a que los esteroides inhiben la absorción del colesterol en un punto entre el lumen (intestino) y los sitios de esterificación. Pero entre los diferentes esteroles, la capacidad de decrecer la cantidad de colesterol también se encuentra regida por la estereoquímica que presenten, aparentando ser mayor, en aquellos esteroles de configuración beta, sobre la alfa. Es importante mencionar, que en el caso de los esteroles con configuración beta, todo parece indicar que estos son absorbidos en ratas y hombres, por lo que al competir en absorción con el colesterol, disminuye por ende la cantidad del mismo, aunque también se ha sugerido que esteroles como el β-sitosterol forman cristales complejos con el colesterol, presentando una baja solubilidad(Reiner et al., 1962). 1.2.5 Usos de las algas marinas en la alimentación avícola Las algas marinas, han sido empleadas desde tiempos remotos, no solo para la alimentación humana, sino también en el pienso animal debido a sus diferentes propiedades nutricionales y funcionales (Jensen, 1972; Manzano, 1989). En particular en la industria avícola, se han empleado como fuente de pigmentos naturales, para mejorar la calidad del huevo, para observar el efecto de éstas en la concentración sérica de colesterol en gallinas ponedoras, así como en la modificación del colesterol en el huevo por inclusión de Macrocystis pyrifera y Ulva spp. (Carrillo et al., 1992; Rodriguez, 1995; Ramos et al., 1997; Meza, 1998; Ramos et al., 1998). 1.3 Aceite de pescado El contenido de grasa en el aceite de pescado, es extremadamente fluctuante, debido a una gran variabilidad entre las especies, en función de las etapas fisiológicas en los mismos. En los pescados llamados grasos o azules (como el arenque o la caballa) los lípidos se depositan en el tejido muscular formándose una dispersión globular, mientras que en los pescados blancos o magros, los lípidos se acumulan principalmente en el hígado, y en menor porción debajo de la piel, de tal forma que sus músculos se encuentran prácticamente libres de grasa, como lo es el caso de algunos pescados como el bacalao (Astiasarán y Martínez, 2000). Fracción saponificable: Se caracteriza por presentar una elevada porción de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga. Especialmente la de la serie omega 3 como los ácidos eicosapentanoico (EPA, C20:5 ω-3) y docosahexaenoico (DHA, C22:6 ω-3) son característicos en la grasa de los pescados, y que al estar presentes en el plancton marino y alguna algas, se incorporan a los tejidos de los peces al ser ingeridos por estos. El perfil de ácidos grasos de los pescados es muy variable, incluso dentro de la misma especie. En muchos casos se encuentran ácidos grasos ramificados y de número impar de átomos de carbono, siendo los más abundantes el eicosapentaenoico (20:5), docosahexaenoico (22:6), mirístico (14:0), palmítico (16:0), esteárico (18:0), oleico (18:1), linoleico (18:2), y el araquidónico (20:4) (Cuadro 4). Los ácidos más insaturados suelen ocupar, en los triglicéridos, las posiciones 1 y 3 (Astiasarán y Martínez, 2000). Fracción insaponificable: Está constituida principalmente por esteroles, siendo el más importante el colesterol, seguido por vitaminas liposolubles como la A, D, y E. El contenido de colesterol de los pescados oscila entre 50-90 mg / 100 g de músculo. El aporte en colesterol tiende a aumentar con el contenido graso. Así, los pescados blancos magros aportan menos de 30 mg / 100 g, mientras que los pescados azules poseen hasta 100 mg / 100 g. El aceite de hígado de bacalao (por ejemplo) posee una importante cantidad de vitaminas A y D, no obstante el pescado no puede considerarse como una de las principales fuentes de estas vitaminas en la dieta humana, dado principalmente a la escasez de tocoferoles de acción antioxidante, lo que unido al alto grado de insaturación de la fracción lipídica, hace que la grasa de pescado sea difícil de conservar, debido a su susceptibilidad a la oxidación (Astiasarán y Martínez, 2000). Aspectos nutritivos: Los estudios llevados a cabo por Dyerberg y Bang, como ya se ha mencionado, pusieron de manifiesto la escasa de incidencia de afecciones cardiovasculares en poblaciones que consumían grandes cantidades de pescado. Esto se relacionó con la abundancia de ácidos grasos de la familia omega 3 en la grasa de Cuadro 4. Composición en ácidos grasos del pescado (%) 14:0 16:0 18:0 18:1 18:2 (ω-6) 20:4 (ω-6) 20:5 (ω-3) 22:6 (ω-3) Total (ω-6) n-3/n-6 Bacalao 0.5 22.1 4.8 9.5 1.2 1.5 16.3 36.1 53.1 15.2 Caballa 2.8 17.5 5.8 7.8 1.9 6.9 11.2 22.8 41.2 4.3 Salmón 3.3 13.0 3.0 14.0 2.0 2.8 11.0 20.0 39.9 5.9 Sardina 3.4 14.5 4.9 15.4 1.4 0.9 11.3 25.8 43.4 11.7 Trucha 4.7 11.4 7.3 17.4 12.3 1.4 5.1 16.8 30.1 2.2 Atún 3.1 9.5 7.9 17.5 1.8 4.1 7.5 26.4 37.6 4.7 Astiasarán y Martínez, 2000 pescado, en concreto de EPA y DHA. Investigaciones posteriores han revelado que estos ácidos grasos entran a formar parte de determinadas rutas metabólicas que dan lugar a prostaglandinas y leucotrienos que desempeñan diferentes funciones en el organismo. Los ácidos EPA y DHA cuando están presentes en la dieta de forma habitual, constituyen un elemento preventivo de la aterogénesis, porque permite la formación de prostaglandinas PGI3, de carácter vasodilatador y antiagregante plaquetario y del tromboxano TXA3, sin apenas efecto vasoconstrictor ni agregante plaquetario. (Voet, 1991). Asimismo, se ha observado que interfieren en el metabolismo de los ácidos grasos omega 6, inhibiendo la acción de las enzimas lipooxígenasa y cicloxigenasa, que conducen a la formación, a partir del ácido araquidónico, de prostaglandinas PGI2 (de efectos similares a la PGI3), y también del tromboxano TXA2, que si tiene capacidad vasoconstrictora y agregante plaquetario. Además los omega 3 compiten con los omega 6 por la acilación en los fosfolípidos de la membrana. De ahí que un nivel elevado de omega 3 u omega 6 en la dieta incremente su proporción en las membranas, lo que determina su permeabilidad y fluidez . Por todo lo anterior, los ácidos grasos característicos del aceite de pescado poseen un carácter antitrombótico y antiinflamatorio, lo que justifica una menor prevalencia de las enfermedades cardiovasculares (Astiasarán y Martínez, 2000). 1.4 Lípidos 1.4.1 Generalidades Al grupo de los lípidos pertenecen compuestos tanto sencillos como complejos, formados por diversos componentes que aparte de su notable hidrofobicidad, carecen de una unidad estructural. De forma general, se puede decir que los lípidos son solubles en disolventes orgánicos e insolubles en agua, por lo que pueden separarse de las proteínas e hidratos de carbono. Una serie de lípidos son tensoactivos, ya que tienen grupos hidrófilos. Estos compuestos se diferencian como sustancias polares (anfifílicas) de los lípidos neutros. En la mayoría de los lípidos, tanto la hidrofobicidad como la reactividad que presentan, se basa en que se derivan de ácidos grasos. En los denominados acil-lípidos, el ácido graso se halla formando parte de la molécula en forma de ester y en algún tipo de lípidos como amida (Wong, 1989). Ciertos lípidos participan en la formación de las membranas que constituyen la envoltura de las células y los elementos subcelulares, encontrándose por tanto en casi todos los alimentos, aunque en cantidades pequeñas, cercanas al 2%. En los tejidos animales y órganos de ciertos vegetales, se llegan a acumular sobre todo los triacilgliceroles, que cuando se encuentran en valores mayores al 20% son susceptibles a su extracción para emplearlos como grasas o aceites (Brody, 1994). La importancia de los lípidos para la fisiología de la nutrición radica en el elevado valor energético de los triacilgliceroles (39 KJ / g) y en la presencia de ácidos grasos esenciales y vitaminas (Fennema, 1993). 1.4.2 Ácidos grasos Los ácidos grasos pueden clasificarse, en saturados donde las cadenas carbonadas son de enlaces sencillos, e insaturados, donde las cadenas carbonadas pueden tener uno o más enlaces dobles a lo largo de ella (Belitz y Grosch, 1999). Los ácidos grasos se pueden nombrar de acuerdo con la longitud de la cadena carbonada, el número, posición y configuración de los dobles enlaces, así como por la presencia de grupos funcionales. Los ácidos grasos se indican por abreviaturas, por ejemplo, se puede citar al ácido linoleico como 18:2 (9.12), dondese expresa el número de átomos de carbono (18), así como el número de insaturación (2), posición (carbono 9 y 12) y configuración de los dobles enlaces, los cuales son cis a menos que se indique lo contrario (Cuadro 5) (McCance y Widdowson´s, 1998). Ácidos grasos saturados: En este grupo predominan los lípidos compuestos con esqueleto carbonado lineal y número par de átomos de carbono. Son de bajo peso molecular y cadenas carbonadas pequeñas (menos de 20 carbonos), suelen encontrarse en la grasa de leche, coco y de palma, así como en alimentos que se obtienen con la ayuda de microorganismos, donde actúan como sustancias aromáticas, como lo puede ser el ácido butírico (Belitz y Grosch, 1999). Ácidos grasos insaturados: Son aquellos que contienen cadenas carbonadas relativamente grandes (generalmente de más de 16 carbonos) con uno o más enlaces dobles. Se encuentran en forma esterificada. En las plantas y los animales Cuadro 5. Clasificación de los principales ácidos grasos Símbolo Nombre sistemático Nombre común Ácidos grasos saturados 4:0 Butanoico Butírico 6:0 Hexanoico Caproico 8:0 Octanoico Caprílico 10:0 Decanoico Cáprico 12:0 Dodecanoico Láurico 14:0 Tetradecanoico Mirístico 16:0 Hexadecanoico Palmítico 18:0 Octadecanoico Esteárico 20:0 Eicosanoico Araquídico 22:0 Docosanoico Behénico 24:0 Tetracosanoico Lignocérico Ácidos grasos monoinsaturados y poliinsaturados 14:1 9-Tetradecenoico Miristoleico 16:1 9-Hexadecenoico Palmitoleico 18:1 9-Octadecenoico Oleico 18:1 Trans-Octadecenoico Elaídico 18:2 9,12 Octadecadienoico Linoleico 18:3 6,9,12-Octadecatrienoico γ-Linolénico 18:3 9,12,15-Octadecatrienoico α-Linolénico 20:4 5,8,11,14-Eicosatetraenoico Araquidónico 20:5 5,8,11,14,17-Eicosapentaenoico EPA 22:1 13-Docosaenoico Erúcico 22:6 (n-3) 7,10,13,16,19-Docosahexaenoico DHA McCance y Widdowson´s, 1998 predominan aquellos con esqueletos de 16-18 carbonos, como el palmitoleico, oleico, linoleico y el esteárico, siendo menos comunes aquellos con más de 20 carbonos. El primer enlace doble de los insaturados se encuentra generalmente entre el átomo de carbono 9 y 10, y en los poliinsaturados, el doble enlace tiende a presentarse cada tercer átomo de carbono delante del metilo terminal de cada cadena carbonada (Wong, 1989). Los dobles enlaces son los más frecuentes, mientras que los triples enlaces son raros y difícilmente tienen un origen biológico, sin embargo es importante mencionar, que a pesar de los dobles enlaces que pueden presentar las moléculas de ácidos grasos, dichas moléculas no son rígidas, sino que presentan una buena flexibilidad, por una relativa libertad de rotación en los enlaces carbono-carbono (Fennema, 1993). Algunas particularidades que presentan los ácidos grasos insaturados, es que al aumentar el tamaño de la cadena aumenta también el punto de ebullición, o que la configuración mayoritaria que se observa es cis, lo que genera un enlace rígido de alrededor de 30o C lo que interfiere con la eficiencia en el acomodamiento de los mismos para llenar los espacios vacíos, generando una reducción en las interacciones de Van der Waals provocando que el punto de difusión disminuya con el aumento del grado de insaturación (Voet, 1991). Los ácidos grasos insaturados que predominan, contienen de una a tres cadenas carbonadas en el resto acilo, donde la posición aislada del doble enlace, siempre tiene la configuración cis. Las relaciones estructurales entre los ácidos grasos insaturados no conjugados, obtenidos por biosíntesis, se ponen de manifiesto claramente cuando se indica la posición del primer doble enlace a partir del metilo terminal (CH3) añadiendo el prefijo omega seguido del número de carbonos que se cuentan, teniéndose omegas 3, omegas 6 y omegas 9, cuyos componentes más frecuentes son ácidos grasos con cadenas de más 18 carbonos (Figura 7). El ácido linoleico no puede ser producido por el organismo humano, por lo que al igual que otros ácidos grasos de la familia omega 6 y omega 3 (la síntesis en los mamíferos de los ácidos grasos omega 3 es posible a partir del ácido linoléico) (Figura 8) (Belitz y Grosch, 1999) son ácidos grasos esenciales, fundamentales para la formación de membranas biológicamente activas. Belitz y Grosch, 1999 Figura 7.Familia omega 3 CH3 HOOC CH3 HOOC CH3 HOOC Alfa Linolénico [18:3 (9,12,15)] EPA [20:5 (5,8,11,14,17)] DHA [22:6 (4,7,10,13,16,19)] Figura 8. Síntesis del ácido graso esencial DHA Voet, 1991 Biosíntesis de los ácidos grasos: Esta se lleva a cabo mediante la condensación de dos unidades de carbono, y es el proceso inverso a la β-oxidación. Dicha síntesis se lleva a cabo en el citosol, con los ácidos grasos esterificados a partir de una proteína portadora de acilo, como se menciona a continuación: En la vía metabólica entra el acil graso-ACP(Cn), el cual recibe una unidad de C2, con lo que se genera un beta-cetoacil-ACP, además de obtener como subproductos la CoA y dióxido de carbono (Voet, 1991). En un segundo paso el β-cetoacilACP acepta los electrones que le cede el NADHP con lo que se genera el 3-D-hidriacil-ACP además del subproducto NADP+, mientras que el 3-D-hidriacil-ACP libera agua, con lo que se convierte en enoil-ACP, que vuelve a aceptar dos electrones del NADPH, con lo que se obtiene el acil graso-ACP(Cn+2). El proceso se repite hasta alcanzar la longitud de la cadena que requiera el organismo (Figura 9). La regulación de este proceso metabólico se puede llevar a cabo a corto plazo, debido a que la acetil-CoA, que cataliza la primera reacción, es inhibida por la presencia del palmitoil-CoA así como por la fosforilación dependiente del AMPc estimulada por el glucagón y activada por el citrato así como por la fosforilación de la insulina. Además, esta síntesis también puede ser regulada al alterar la cantidad de enzima presente mediante variaciones de la velocidad de síntesis o bien de Voet, 1991 Figura 9. Síntesis de ácidos grasos degradación de proteínas, aunque esta última opción requiere de horas o días, por lo que suele llamársele como regulación a largo plazo. La degradación o β-oxidación de los ácidos grasos se regula principalmente por la concentración de los mismos en la sangre, lo cual depende directamente de la velocidad de hidrólisis de los triglicéridos en el tejido adiposo por la lipasa del triacilglicérol sensible a hormonas (Voet, 1991). 1.4.3 Ácidos grasos Omega-3 y sus beneficios en la salud humana Se ha observado en varios estudios que la ingesta de ácidos grasos omega 3 disminuye la concentración de colesterol y de triacilgliceroles en sangre, reduciéndose el riesgo de arterosclerosis, que es una enfermedad que altera las membranas internas de las arterias, y que favorece una mayor acumulación del colesterol esterificado libre y fosfolípidos, generando ateromas en la pared de las arterias y entorpeciendo la circulación de la sangre, pudiendo llegar a interrumpirla (Serrano, 1994; Adler y Holub, 1997; Agren, 1998; Stak, 2000; Gylling y Miettinen, 2001; Puiggrós et al., 2002). El consumo de ácidos grasos omega 3 favorece a pacientes con altos niveles de colesterol causado por problemas metabólicos (Goodfellow et al, 2000) y se pueden obtener todos estos beneficios al ingerir dichos ácidos grasos en la dieta humana de forma directa, o indirecta, al adicionarse al pienso de gallinas destinas a la producción de huevo (Carrillo et al., 2001). La importancia de los ácidos grasos omega 3, se explica por la incapacidad de los tejidos animales de introducir dobles ligaduras en posiciones previas al carbono 9. El descubrimiento del rol de losácidos grasos de cadena larga en la formación de eicosanoides permitió redimensionarlos como reguladores de procesos biológicos y de causar algunas enfermedades (Fennema, 1993). Los lípidos componentes de las membranas pueden modificar su fluidez e interacciones con proteínas y otros lípidos con lo que se genera un cambio en la función celular general, modulando las actividades de diversas células receptoras o de transporte, así como procesos hormonales y de transducción, incluyendo la expresión genética. Los ácidos grasos como combustibles juegan un papel importante en modular su propio metabolismo, síntesis y oxidación, lo que se lleva a cabo por una regulación alostérica de la actividad enzimática (Voet, 1991). Se ha observado que los ácidos grasos omega 3 regulan las enzimas lipogénicas, las enzimas oxidativas mitocondriales así como las gluconeogénicas, reduciendo por lo general la lipogénesis hepática, con lo que desciende el contenido de enzimas en la síntesis lipídica, como lo pueden ser la sintetasa de ácidos grasos, la acetil-CoA carboxilasa, y la enzima málica entre otras, en donde esta disminución se explica por una regulación negativa de la transcripción genética, a nivel de los mRNAs. También se ha observado que los ácidos grasos omega 3 modulan la adipogénesis, que es el proceso de generación de tejido blanco adiposo que se inicia con la diferenciación de fibroblastos en los adipocitos, en cuyo proceso se involucra la inducción de proteínas específicas, la acil-CoA sintetasa y la lipoproteína lipasa. Los ácidos grasos inducen la expresión de estos productos específicos de los adipositos estimulando la diferenciación de los mismos, aunado a una reducción del tejido adiposo visceral ya que los ácidos grasos omega 3 actúan regulando negativamente la formación de dichos adipositos. De forma general, se ha observado que la reducción en la expresión hepática, es mediada por el PPARα (receptor alfa de peroxisomas), que se activa por los mencionados ácidos grasos omega 3 y 6. La familia de los receptores nucleares de peroxisomas (PPAR) ha recibido mucha atención recientemente, dado que tiene un rol principal en la regulación del metabolismo de los lípidos y la glucosa así como en la diferenciación de los adipositos(Uauy-Dagach, 2001). Existen isoformas α, β y γ, que pueden distinguirse en base a sus efectos metabólicos y expresión tisular diferencial específica, teniendo que la PPARα se involucra con el metabolismo de ácidos grasos del hígado y otros tejidos, como el riñon, corazón, músculo esqueletico y tejido adiposo, mientras que la expresión PPARγ se observa principalmente en el tejido adiposo suprimiendo la diferenciación de adipocitos. La producción de eicosanoides, es otro mecanismo por el cual los ácidos grasos omega 3 afectan diferentes funciones biológicas. Las fosfolipasas liberan ácido araquidónico y EPA de los lípidos de la mémbrana, y a través de la acción de la cicloxigenasa o lipoxigenasa se forman eicosanoides, aumentando el tiempo de sangrado, disminuyendo la agregación plaquetaria, la viscosidad de la sangre, además de promover la vasodilatación y la respuesta a la insulina, a la vez que se inhibe la formación de VLDL, la proliferación de células plaquetarias y la respuesta inflamatoria y alérgica (Uauy-Dagach, 2001). 1.4.4 Oxidación de los lípidos Los procesos de oxidación se llevan a cabo, ya sea en alimentos como en sistemas biológicos, En el caso de los primeros, constituye una de las principales vías de deterioro de los alimentos, ocasionada por el ataque del oxígeno sobre algunos de sus componentes, lo que lleva a un deterioro de la calidad comercial, organoléptica y sanitaria del alimento (Sanchez-Moreno y Larrauri, 1998). El proceso de oxidación consta de tres etapas básicas: Iniciación: La reacción en cadena se inicia por la formación de un radical carbono central, por la sustracción de un Hidrógeno del lípido, pudiendo existir diferentes procedimientos para generar la iniciación, como la fotólisis, la radiación gama u otras (Figura 10). Propagación. Los radicales producidos en el proceso anterior se re-arreglan del 1,4 pentadieno (metileno interrumpido) a 1,3 pentadieno (conjugado) que reacciona con el oxígeno atmosférico para producir radicales peróxido del lípido, los cuales pueden seguir sustrayendo hidrógenos a través de una cadena de propagación. Las cadenas de polialcanos con dobles enlaces separados por más de un grupo metileno C H 2 C H C H C H2 R R C H C H C H C H2 R R - -H -H Figura 10. Etapa de iniciación en la oxidación de los lípidos Wheatley, 2000 no se conjugan. Las lipoxigenasas son oxidoreductasas que catalizan la conversión de los ácidos grasos poliinsaturados a sus respectivos hidroxiperóxidos. En la oxidación enzimática de los lípidos, se lleva a cabo una sustracción de hidrógeno y una adición del dioxígeno en posiciones específicas, mientras que la oxidación no enzimática no tiene una región específica de adición, y ocurre generalmente en las posiciones exteriores, donde se encuentra el último carbono antes del primer doble enlace de cada extremo de la molécula (Cheftel y Cheftel, 1992). Las lipooxidasas también se mantienen funcionando a temperaturas bajas, pudiendo atacar y romper los pigmentos, en muchas plantas, incluso la oxidación es rápida cerca al punto de congelación, observándose en los ácidos grasos que a mayor número de enlaces dobles hay una mayor oxidación por las lipooxidasas, o bien por una vía alterna como puede ser una oxidación por acción de la enzima peroxidasa (Allen, 1992). Los metales de transición catalizan el rompimiento del hidroxiperóxido al radical alquilperoxi y alcoxi, que generan una cadena de propagación, pero que también generan alcoholes secundarios, cetonas y aldehídos, incluyendo cadenas cortas. Los productos aldehídicos pueden formar conglomerados con algunas proteínas, lo cual puede suceder por la oxidación de la proteína, o bien por una adición de Michael del grupo tiol (SH) de dicha proteína hacia el aldehído, dado que los grupos tioles son nucleófílos, que pueden formar enlaces covalentes con átomos de carbono, en donde el ataque al doble enlace alquenico genera una rápida conversión estructural al aldehído correspondiente. Esta reacción genera una inhibición enzimática responsable de los aldehídos insaturados citotóxicos (Figura 11). Terminación. Las reacciones en cadena se terminan por reacciones entre los CH R R O2 CH R R O O CH R R O OH- 3 - RH R- Figura 11. Etapa de propagación en la oxidación de los lípidos Wheatley, 2000 radicales produciendo dímeros y grandes polímeros. El proceso de oxidación lipídica genera un movimiento del doble enlace, de tal forma que los metilendienos interrumpidos se conjugan, pudiendo anexarse nuevos grupos (Wheatley, 2000) (Figura 12) . 1.4.5 Determinación del grado de oxidación De forma concluyente, una sola prueba no permite determinar el grado de oxidación de los lípidos. Las pruebas más comunes son el índice de peróxidos, el índice de Kreis y el índice de acidez, recomendándose por lo general realizar al menos dos diferentes metodologías para obtener valores de oxidación más ajustados a la realidad. Valor de peróxidos: Este valor determina la cantidad de peróxidos del aceite (mg de peróxidos / Kg. de muestra), que se forma durante el almacenamiento. La formación de peróxidos es lenta en el período de inducción, que varía desde algunas semanas hasta varios meses, según el aceite o grasa de que se trate, así como la temperatura y otros factores. El valor de peróxidos en general se determina mediante volumetría,utilizando los métodos empleados por Lea (Kirk et al., 1999). Estos dependen de la reacción de yoduro de potasio con el oxígeno enlazado, seguido por la titulación del yodo que se libera con tiosulfato de sodio, empleándose cloroformo como disolvente. C H R C H C H C H 2 R CH R C H C H C H 2 R C HC H C H R C H 2 R C H R C H C H C H 2O O R R C H C H C H C H 2 R O O C H C H 2 RC H C H R - - Figura 12. Etapa de terminación en la oxidación de los lípidos Wheatley, 2000 Índice de Kreis: La reacción de Kreis se basa en la producción del color rojo cuando el fluoroglucinol reacciona con la grasa oxidada en solución ácida. Aparentemente, el color que se forma se relaciona con un incremento de producción de aldehído de efidrina o de aldehído malónico. Los diversos métodos propuestos para llevar a cabo la reacción de Kreis fueron revisados por Mehlenbacher. Debido a su elevada sensibilidad, la prueba de Kreis suele dar resultados confusos cuando se trata de colores producidos por aceites relativamente frescos (Kirk et al., 1999). Índice de acidez: Se define como el número de mg de hidróxido de potasio requeridos para neutralizar la acidez libre de 1 g de muestra, que suele expresarse como porcentaje de ácidos grasos libres. Esta medición es una medida del grado de descomposición de los glicéridos del aceite por acción de las lipasas o alguna otra causa, ya que la rancidez se acompaña usualmente de la formación de ácidos grasos libres. En la mayor parte de los aceites la rancidez empieza a ser notable al paladar cuando los ácidos grasos libres, calculados como ácido oleico (al ser el componente mayoritario de la fracción lipídica del huevo) se encuentran en una concentración alrededor de 0.5-1.5% (Kirk et al., 1996). Hipótesis 1. “Si se adicionan en forma combinada aceite de pescado y algas marinas a la dieta de gallinas ponedoras entonces la calidad física, química y sensorial (color de yema y sabor) de los huevos enriquecidos con ácidos grasos omega 3 se mantendrá por más tiempo que un huevo obtenido con una dieta testigo” 2. “Si los huevos enriquecidos con ácidos grasos omega 3, obtenidos de gallinas en cuya dieta se incorporaron aceite de pescado y algas marinas, se mantienen en condiciones de refrigeración, entonces la calidad física, química y sensorial de los mismos se verá favorecida” 2. Metodología El presente trabajo fue realizado en el Departamento de Nutrición Animal del Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán y forma parte del proyecto de investigación “Aprovechamiento de recursos naturales vegetales y marinos para el desarrollo de productos avícolas funcionales”. El aceite de sardina empleado (AS) en las dietas fue proporcionado por una empresa pesquera del puerto de Guaymas, Sonora, mientras que las algas marinas fueron recolectadas por personal del Centro Interdisciplinario de Ciencias del Mar del Instituto Politécnico Nacional, localizado en la Paz, Baja California Sur. Los huevos empleados para el estudio, fueron obtenidos a partir de un ensayo experimental previo realizado con gallinas Leghorn que fueron separadas en 4 diferentes tratamientos que consistían en incluir en la dieta de las aves 2% de aceite de sardina (AS) y 10% de algas marinas (AM). Las algas marinas empleadas fueron las algas cafés Macrocystis pyrifera (Mp) y Sargassum sinicola (SS), y el alga verde Enteromorpha spp (Es) quedando los tratamientos de la siguiente manera: Tratamiento Clave Testigo T 2% AS + 10% Mp AS + Mp 2% AS + 10% Ss AS + Ss 2% AS + 10% Es AS + Es Vida de anaquel y características organolépticas. Se recolectaron 122 huevos de cada tratamiento, y se dividieron para almacenarlos a temperatura ambiente y refrigeración (61 huevos por tratamiento en cada caso). Las determinaciones se realizaron a los 0, 15, 30, y 45 días de almacenamiento y se evaluó la calidad física, y química (lípidos totales, ácidos grasos y su degradación) empleando 10 huevos para cada tratamiento y día de análisis, además de llevar a cabo una evaluación sensorial (de color de yema y sabor) hasta el día 30, para la cual el número de huevos empleados por tratamiento y día de análisis fue de 7 (Figura 13). 2.1 Pruebas de calidad del huevo Para evaluar la calidad del huevo se emplearon 40 huevos por tratamiento, en cada uno de los tiempos y condiciones de almacenamiento, mencionando en cada caso los siguientes aspectos. Limpieza del huevo: Se determinó visualmente la presencia de restos de alimento, heces o sangre en el cascarón, reportando el porcentaje de huevos limpios, con un defecto, con dos defectos y con 3 defectos de limpieza. Aspecto del huevo: Esta determinación también fue visual, y en ella se observó si el cascarón estaba rugoso, poroso, o si presentaba grietas externas e internas, y ventanas. Índice de forma: Con un Vernier se midió el largo y ancho (en el ecuador) de cada huevo y se empleó la siguiente fórmula: Figura 13. Diagrama de los aspectos a evaluar en el estudio 488 huevos Temp. Amb. 244 Huevos Refrigeración 244 Huevos 0 Días: 10 Huevos calidad y análisis Químicos 7 Huevos pruebas sensoriales 15 Días: 10 Huevos calidad y análisis Químicos 7 Huevos pruebas sensoriales 30 Días: 10 Huevos calidad y análisis Químicos 7 Huevos pruebas sensoriales 45 Días: 10 Huevos calidad y análisis Químicos 61 Huevos T 61 Huevos AS + Mp 61 Huevos AS + Ss 61 Huevos AS +Es 61 Huevos T 61 Huevos AS + Mp 61 Huevos AS + Ss 61 Huevos AS +Es IF = [(diámetro del huevo en cm) / (largo del huevo en cm)]100 Peso del huevo: Se pesó el huevo con el cascarón en una balanza analítica, reportándose los valores obtenidos en gramos. Altura de albumen: Se cascó cada huevo y la yema y clara se depositaron en una plataforma con mesa de vidrio (que permite determinar la presencia de manchas diversas en el producto) y mediante el empleo de un micrómetro se midió la altura de la albúmina (Figura 14). Unidades Haugh: Para llevar a cabo este cálculo, se correlaciona la altura de albúmina y el peso del huevo mediante la fórmula U.H. = 100log(H-1.7P0.37+7.57) donde H corresponde a la altura de la albúmina densa (mm) y P al peso del huevo (g). Se empleó un equipo automatizado (con software especial de Technical Service and Supplies inc.) que efectúa los cálculos en forma automática, observándose un total de puntos que van de 30 a más de 85. Los huevos se clasifican en excelentes (mayor o igual a 85 UH), buenos (mayor o igual a 75 UH), regulares (mayor o igual a 65 UH) y malos (menos de 65 UH). Color de yema (Escala Roche): Se empleó un detector óptico, integrado al equipo automatizado y que emplea la escala del abanico Roche para medir el color de la yema. La escala presenta valores del 1 (muy pálido) al 15 (muy naranja) (Figura 15 y 16). Peso del cascarón: Se elimino la clara y yema del cascarón y se dejó secar (aún con las membranas coloquilarias), se pesó en una balanza analítica, reportándose los valores en gramos. Figura 14. Medición de albumen Figura 15. Abanico de color de Yema (Escala Roche) Figura 16. Receptáculo para la determinación del color de yema (escala Roche) Grosor del cascarón: Se tomó una pequeña parte del cascarón de la región del ecuador, se le retiró la membrana interna y se midió su grosor con un micrómetro electrónico (Figura 17) (Sauveur, 1993). 2.2 Análisis
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