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FACULTAD DE TECNOLOGIA MEDICA ESCUELA DE LABORATORIO Y ANATOMIA PATOLOGICA CULTIVO DE LINFOCITOS Tecnica de cultivo de linfocitos 1) Toma de muestra 2) Siembra 3) Cosecha 4) Preparacion de laminas 5) Coloracion y observacion ( tecnica de bandeo cromosomico) Procedimiento Presentar condiciones de asepsia en lugar de toma de muestra Para la toma de muestra utilizaremos anticoagulante de heparina sódica ya que actúa sobre los factores de coagulación en lugar de los iones divalentes a diferencia de otros tipos de anticoagulante, además este tipo de anticoagulante no interfiere en la metafase de los linfocitos. Con la ayuda de una jeringa se toma la heparina sódica (0.1ml) Introducimos la jeringa con heparina al paciente y obtenemos un volumen de sangre de 3ml a 5ml. NOTA La cantidad de volumen de sangre puede variar según el grupo etario del paciente, por tanto lo mínimo de volumen en pacientes especiales como por ejemplo un recién nacido es de 0.5ml. La toma de muestra en un recién nacido es realizada con una jeringa de tuberculina debido a venas delgadas que presenta. 1 Luego de la toma de muestra, se coloca la jeringa en posicon vertical colocado con su capuchón hacia abajo, para que se separe las fases. plasma Capa de mononucleares (Glob. Blancos) Globulos rojos Desechamos la capa de glóbulos rojos a un tubo donde las condiciones sean estériles. La muestra que se requiere es la capa media y el plasma ya que este ultimo enriquece el cultivo con sus componentes. 2 NOTA El tiempo dejado para que se separen las fases en la jeringa es variable, pero en caso no llegue a separarse en un tiempo pronosticado, pues lo única opción a tomar es sembrar la sangre total con una cantidad de 0.5ml o 30 gotas. Esta baja cantidad es debido a que los glóbulos rojos pueden interferir con la fitohematoglutinina (estimulante mitogenico), además forma muchos coágulos a una cantidad mayor de este tipo de muestra. Comenzamos desechando la capa de globulos rojos a un tubo en condiciones esteriles.El medio en condiciones esteriles puede ser una cabina de flujo laminar o cerca de un mechero de bunsen encendido, como tambien cerca de un mechero de alcohol. Se elimina la capa de globulos rojos dejando la capa de interfase(media) y el plasma. Entonces ocurre un proceso de mezcla de interfase: leucocitos + plasma. Continuamos con colocar el medio de cultivo alrededor de 5-10ml. en un frasco de cultivo y luego colocamos la muestra .(mezcla de interfase).Tener la mayor esterilidad posible Utilizamos frascos de cultivo (Falcon flask , vidrio) Colocamos el medio de cultivo(5-10ml.) , posteriormente la muestra(1.0-1.5ml). Lo mezclamos suavemente e incubar el frasco de cultivo. NOTA El medio de cultivo (+) utilizado es RPMI-1640. Este medio contiene una gran cantidad de fosfato y está formulado para su uso en una atmósfera de dióxido de carbono 5% Incubación Siguiendo el procedimiento, se incuba el frasco de cultivo a una temperatura de 37°C por 70 a 72 horas en la estufa. El tiempo establecido se debe a que en 72 horas la incubación se encuentra en un pico alto de índice mitótico de linfocitos. El frasco de cultivo se coloca dentro de la estufa en una temperatura de 37°C por 72h. Fase en la que el índice de div. Mitótica se encuentra alta Luego de la incubación retiramos el frasco de cultivo para iniciar el cultivo NOTA En la incubación solo hay producción de linfocitos (proliferación). Debido a que la fitohematoglutinina se une al receptor de los linfocitos el cual es compatible con este. Mientras que los otros tipos de leucocitos no presentan este tipo de receptor. Proceso de colchinizacion Tener en cuenta que la colchicina detiene la división o mitosis produce una despolimerización de microtubulos.Para este proceso no hay necesidad de trabajar en condiciones de esterilidad. La cantidad de colchicina a utilizar depende de la concentración y la estandarización por el laboratorio. Se agrega colchicina al frasco de cultivo (0.1µg/ml) Posteriormente,mezclamos suavemente 1 Entonces incubamos el frascoo a una temperatura de 37°C por 50 a 60 min 2 3 4 5 6 7 Retiramos el tubo de la centrifuga. NOTA Cuando se retira el sobrenadante se deja un poco de este para proteger el sedimento. Dato: sedimento o Pellet Hipotonizacion Agregamos al tubo con el sedimento cloruro de potasio 0.075M alrededor de 5 o 6 ml. De este sol. hipotónica Luego de añadir el ClK, se agita con vortex alrededor de unos 10 segundos. En caso de no poseer un vortex se puede remplazar con una pipeta pasteur para realizar la mezcla por 2 minutos. NOTA En esta parte de hipotonizacion, luego de añadir el ClK y realizar una agitación, el liquido empezara a entrar dentro de la celula para que esta se hinche hasta romper la membrana celular y los cromosomas comenzaran a expandirse. Prefijacion Luego del proceso agitación al tubo, se da la incubación a una temperatura de 37°C por 10 min. NOTA A más tiempo con la sol. Hipotónica, los cromosomas empiezan a dañarse, desnaturalizarse y dañar la estructura afectando la lectura del bandeo cromosómico. Entonces, un tiempo max. es de 15 minutos con la solución. Luego de la ultima incubación se saca el tubo y se añade el fijador (mezcla de metanol + acido acético) alrededor de 10 a 12 gotas aproximadamente. 1 2 Colocamos al tubo luego de la incubación , unas 10 a 12 gotas de fijador Mezclamos la nueva sustancia con el sedimento en un vortex por 10 segundos. Fijacion 3 Por ultimo, centrifugamos el tubo a 1000 RPM por 10 minutos. NOTA Las gotas añadidas del fijador bloquean la acción de la solucion hipotonica. Luego de la centrifugación tendremos un sedimento y un sobrenadante.Entonces se elimina el sobrenadante para quedarnos con el sedimento para realizar el prox. Procedimiento. Añadimos el fijador al sedimento, una cantidad de 5 ml. Mezclamos el fijador y sedimento con vortex por 10 segundos. Luego de la mezcla se deja a temperatura ambiente por 20 minutos para luego continuar con el preparado cromosómico. 3 1 2 NOTA En caso se desea parar el proceso se puede dejar en refrigeración a +4°C por días o semanas. Para ser utilizado nuevamente otro día y continuar con el proceso. Proceso cromosomico 4 Posteriormente, luego que el tubo haya sido expuesto por minutos a temperatura ambiente, continuamos con la centrifugación del mismo. Para este proceso se centrifuga la muestra (sedimento fijado) y luego se bota el sobrenadante 1 1 lavado esta compuesto de: Adicionar 5 ml de fijador Agitar con vortex por 10 segundos Centrifugar la muestra Eliminar el sobrenadante NOTA La cantidad de lavados depende de la cantidad de sedimento. Realizamos el proceso de lavado Anadimos 5ml del fijador al sedimento Agitamos la mezcla con un vortex por 10 segundos Centrifugamosla muestra por 1000RPM por 10 minutos. Luego eliminar el sobrenadante para comenzar nuevamente el proceso A B C En el tercer lavado, el ultimo sedimento se va a resuspender. Se añade una pequeña cantidad de fijador, dependiendo de la cantidad de sedimento. Añadir el fijador al ultimo tubo con sedimento que paso por el ultimo lavado. Entonces de los tubos que se resuspenden se tomara alrededor de 3 o 4 gotas de esta muestra resuspendida sobre 3 o 4 gotas sobre una lamina portaobjeto helada 2 NOTA Las láminas heladas son utilizadas debido a que asi evita la evaporación del fijador y evita vapores toxicos. Posteriormente, coloreamos las laminas directamente con el colorante de Giemsa Se sumerge la lamina portaobjeto con el colorante alrededor de 6 -7 minutos y luego enjuagar en agua destilada, se deja secar al calor de un mechero, posterior se observa en el microscopio los cromosomas. Obtención de los cromosomas finalmente que son observadas mediante el microscopio.
