Técnicas de Microscopia e Coloração

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2022
· ALARCON TUESTA, KATHERINE LILIANA
· BENITES ALATRISTA, YRMA DALINDA
· CUBAS LLANOS, BRIGGITH MILAGROS
· CRUZ CASTILLO, MARYLIZA KELLY
· HUAMAN MOLINA, ELENA MEDALIT
· MORAN CABRERA, JOHNNY LUIS
INTEGRANTES:
DOCENTE: MG. VANIA MALLQUI BRITO
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
TEMA: COLORACIÓN
GRUPO: 4
		Coloración
Coloración
1. ¿Qué es un frotis? Describe brevemente como se realiza.
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con el objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida (1). 
Realización del frotis:
· Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. 
· Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una colonia del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. 
· Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. 
· Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos (2). 
Fijación de las bacterias al portaobjetos: 
· Fijación de las bacterias al portaobjetos 
· Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases. 
· Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido). Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión completamente seca. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente. 
· Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción (2).
2. ¿Qué son las preparaciones en fresco? Describe brevemente como se realizan. 
La forma más simple de preparar un espécimen para su examen microscópico es hacer una preparación en fresco. Existen dos técnicas, una preparación en fresco simple ("entre porta y cubre") consiste en colocar una gota de líquido con los microorganismos sobre un portaobjetos y a continuación cubrirla con un cubreobjetos. Una preparación en gota pendiente se realiza colocando una gota del material en un cubreobjetos y cubriéndolo con un portaobjetos (invertido) con una excavación central (portaobjetos excavado). Hay que sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación. La ventaja de esta última técnica, es que la preparación no se seca y puede ser observada durante un tiempo más largo (3). 
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos. Por ejemplo, para la búsqueda de Trichomonas vaginalis en secreciones vaginales (3). 
3. ¿Qué es una tinción simple y para que se emplea? 
La tinción simple es un procedimiento de tinción rápido y sencillo en el cual se emplea un solo colorante, por eso se denomina simple. Se utiliza principalmente para determinar la morfología y la organización de las células presentes en una muestra.
Colorantes empleados en la tinción simple
Existen varios colorantes básicos que se pueden usar en el laboratorio de microbiología. Los más empleados son:
· Azul de metileno.
· Violeta de cristal.
· Verde malaquita. 
· Fucsina básica.
Todos estos colorantes funcionan bien en las bacterias porque tienen iones de color (cromóforos) con carga positiva (catiónicos) (3).
4. ¿A qué se le llama tinción diferencial? 
Las tinciones diferenciales son de las más utilizadas en el área de Microbiología por las amplias aplicaciones que posee para la salud. Este tipo de tinción es cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante y sirven para poner de manifestó las características de afinidad por ciertos colorantes de microorganismos. Se basan en el hecho de que disantos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción (3).
5. Fundamente la coloración de Gram. 
La coloración de Gram cuenta con 4 pasos fundamentales: tinción, fijación, decoloración y contratinción.
· Cristal violeta (tinción): de naturaleza básica con afinidad a sustancias cargadas negativamente como las paredes celulares bacterianas, así se tiñen de morado las bacterias Gram positivas y Gram negativas inicialmente. Enjuague con agua.
· Lugol (mordiente): aumenta la fijación del cristal violeta sobre la pared celular, creando un complejo insoluble en agua (no se pierde durante el enjuague con agua). Las bacterias Gram positivas tienen gran cantidad de ácidos teicoicos tienen gran afinidad por agentes oxidantes como el Lugol. Enjuague
· Alcohol acetona (disolvente orgánico): este decolora la pared bacteriana al disolver el complejo cristal violeta-lugol, afectando a las bacterias Gram negativas, pero no a las Gram positivas (debido a la estructura de la pared de las Gram positivas que es más gruesa propiciando una barrera a la salida del colorante cristal violeta).Enjuague
· Safranina (contratinción): Al ser catiónico tiñe las paredes bacterianas ya que estas tienen cargas negativas, donde las Gram negativas se tiñen de color rosa, pero las bacterias Gram positivas no se tiñen porque su pared celular está saturada de cristal violeta impidiendo la entrada de la safranina (4).
6. Fundamente la coloración de Ziehl Nielsen. 
Las micobacterias están cubiertas por un material grueso, ceroso, que resiste la tinción. No obstante, una vez que se tiñen las paredes celulares bacterianas resisten la decoloración por disolventes orgánicos fuertes, como el alcohol ácido, debido al ácido micólico que se encuentra presente. Además, se caracterizan por su posesión única de ciertos tipos de ácidos grasos, alcoholes y carbohidratos (2).
7. ¿Qué son los colorantes vitales? Da 5 ejemplos e indica el uso que tienen
Las tinciones vitales son aquellas que se efectúan sobre células que están vivas, mediante la introducción de un colorante en la circulación de un organismo vivo. 
· Rojo neutro:
Es una sustancia soluble en agua. Puede ser administrada a los animales superiores por vía endovenosa o digestiva, en la proporción del 1%; se aplica diariamente varios centímetros cúbicos de la solución. Por la vía digestiva se usa cuando se trata de estudiar la mucosa digestiva.
· Azul de metileno:
Como colorante vital, el azul de metileno se emplea principalmente en las coloraciones postvitales o supravitales, utilizadas para el estudio del tejido nervioso, ya que introduciendo en un animal el azul de metileno en inyección endovenosa, este se fija en las células nerviosas. La solución se prepara en suero fisiológico al 0,5% o al 1%.
· Verde Jano:
Es también un colorante supravital, utilizado para el estudio de mitocondrios. Se aplica por inmersión o inyección. Los mejores resultados se obtienen con sangre. En este caso se usa en una solución al 1 x 10 000 en suero fisiológico al 0,85%. Se aplica una gota en el portaobjeto con sangre fresca, y después, se coloca un cubreobjeto. 
· Alizarina roja S:
Se ha usado como colorante vital para el tejido nervioso en pequeños invertebrados.
· Púrpura brillante R:
Usado como colorante vital para la levadura (5).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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1.	MedlinePlus. Frotis de Sangre. [Online].; 2020 [cited 2022 Febrero 12. Available from: https://medlineplus.gov/spanish/pruebas-de-laboratorio/frotis-de-sangre/.
2.	Gutierrez A, Arellano B, Gutierrez C, Escalera E, Romero G, Saucedo J, et al. Manual de Laboratorio Microbiología General I. [Online].; 2017 [cited 2022 Febrero 12. Available from: https://www.zaragoza.unam.mx/wp-content/Portal2015/Licenciaturas/qfb/manuales/10_MANUAL_MICROBIOLOGIA_GENERAL_I_2020.pdf.
3.	Gónzales R, CuevasB, Cortés M, Orduña M. Las Tinciones Básicas en el Laboratorio de Microbiología; Un enfoque gráfico. Primera ed. Luna AG, editor. UNAM, FES Zaragoza; 2020.
4.	Fernando J. MDM Científica; Coloración de Gram. [Online].; 2020 [cited 2022 Febrero 12. Available from: https://mdmcientifica.com/nunca-olvidemos-el-fundamento-de-la-coloracion-de-gram/.
5.	López-Jácome LE, Hernández-Durán M, Adriana C, Colín-Castro. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en discapacidad. 2014 Enero; 3(1).
6.	LE L, M H, CA C, S O, G C, R. F. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. [Online].; 2014 [cited 2022 Febrero 12. Available from: http://www.mediagraphic.com/pdfs/invdis/ir-141b.pdf.
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