22 y 23 - Técnicas de Biología Molecular y laboratorio clínico VIRTUAL

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Aplicación de técnicas de biología molecular al laboratorio clínico
Cátedra Virtual de Bioquímica Humana
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. INTRODUCCIÓN:
. La manipulación de una secuencia de ADN y la construcción de moléculas quiméricas (ingeniería genética) brindan los medios adecuados para estudiar cómo funciona un segmento específico de ADN.
Biología molecular y laboratorio clínico:
.La comprensión de esta tecnología es importante para:
1. Establecer las bases moleculares de enfermedades genéticas;
2. La producción de proteínas humanas en abundancia con fines terapéuticos (insulina, hormona de crecimiento, eritropoyetina); 
3. La obtención de proteínas para vacunas (hepatitis B) y para pruebas diagnósticas (HIV/SIDA); 
4. El diagnóstico de enfermedades existentes y predicción de riesgos para desarrollar otros padecimientos;
5. La medicina forense;
6. El desarrollo de terapias génicas para tratar enfermedades.
Biología molecular y laboratorio clínico:
¿CÓMO SE ESTUDIA EL ADN?:
. La tecnología del ADN recombinante comprende el aislamiento y manipulación del ADN para elaborar moléculas quiméricas o híbridas.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Enzimas de restricción cortan las cadenas de ADN en sitios específicos.
. Estas enzimas son endonucleasas que cortan el ADN en secuencias específicas dentro de la molécula, que generalmente corresponden a secuencias palindrómicas. 
. Ejemplo: CGATCG GCTAGC (se leen igual en ambas direcciones).
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Deben su nombre ya que en su presencia algunas bacterias restringen el crecimiento de ciertos virus bacterianos, llamados bacteriófagos. 
. Cada una de las enzimas corta una secuencia específica de doble cadena de ADN de 4 a 7 pares de bases.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Estas enzimas cortan el ADN de cualquier fuente en piezas cortas y en secuencias específicas, en contraste con muchos métodos que lo hacen al azar.
. Reciben su nombre a partir de la bacteria de la cual se aislan. 
. Ej.: Eco III, deriva de E. coli. 
. Hind II: Haemophillus influenzae
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Los cortes pueden ser ROMOS:
5´---G T T A A C---3´ ---G T T A A C-- 
3´---C A A T T G---5´ ---C A A T T G--
. O bien, pueden ser COHESIVOS:
5´---G G A T C C---3´ ---G G A T C C---
3´---C C T A G G---5´ ---C C T A G G---
E
+
Biología molecular y laboratorio clínico:
E
+
+
PLÁSMIDO CIRCULAR DE ADN
T
T
T
A
A
A
T
T
Plásmido con extremos cohesivos
Plásmido circular de ADN
Endonucleasa de restricción
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que a menudo se encuentra en bacterias y otras células. Los plásmidos son separados del cromosoma bacteriano y se replican independientemente de ella.
ADN HUMANO:
 A A T T
 T T A A
T
T
A
A
A
A
T
T
A
A
T
T
T
T
A
A
ADN recombinante
Endonucleasa de restricción
Pegado
ADN ligasa
Biología molecular y laboratorio clínico:
TRANSFERENCIAS DE BANDAS:
. La visualización de un fragmento específico de ADN o de ARN, de entre muchos miles de moléculas contaminantes requiere de la convergencia de varias técnicas, las cuales se conocen en su conjunto como transferencia de bandas. 
Biología molecular y laboratorio clínic:o
¿CUÁLES SON LAS TÉCNICAS DE TRANSFERENCIA DE BANDAS?:
. Southern-Blot (ADN);
. Northern Blot (ARN);
. Western Blot (proteínas)
Biología molecular y laboratorio clínico
. Estas técnicas son útiles en la determinación de cuántas copias de un gen se encuentran en un tejido determinado, o si existen grandes alteraciones en un gen.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. En una transferencia de bandas el ADN, aislado de una línea celular o de un tejido, es digerido con una o más enzimas de restricción.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Esta mezcla se coloca en un gel de agarosa o de poliacrilamida y se expone a una corriente eléctrica directa. El ADN, que tiene carga negativa, migra hacia el ánodo. Los fragmentos más pequeños se mueven más rápido. 
Southern blot 	 Northern blot		 Western blot
ADN
ARN
Proteínas
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Después de un tiempo apropiado, el ADN se desnaturaliza por la exposición a una solución alcalina ligera y es transferido a un papel de nitrocelulosa y nylon, en una réplica exacta del patrón sobre el gel, por la técnica de bandas diseñada por Southern.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. TRANSFERENCIA AL PAPEL : 
	 Southern Northern Western
 (ADN) (ARN) (Proteínas)
Biología molecular y laboratorio clínico:
. El ADN se une al papel por medio de calor y el papel después se expone a la sonda de ADN marcado, con lo cual se hibridan los fragmentos complementarios sobre el papel filtro;
. En el caso del Western, se adiciona un anticuerpo específico marcado.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Después del lavado, el papel se expone a una placa de rayos X, la cual se procesa para revelar las bandas específicas correspondientes a los fragmentos de ADN que reconocieron las secuencias en la sonda de ADN.
Autorradiografía
Biología molecular y laboratorio clínico:
. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
. Es un método enzimático para el copiado repetido y de esta manera, amplificado de las dos cadenas de ADN que forman una secuencia génica particular.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
. La especificidad del método se basa en el uso de dos oligonucléotidos iniciadores que se hibridan con secuencias complementarias en cadenas opuestas del ADN y flanquean la secuencia blanco.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Secuencias tan cortas de ADN como de 50 a 100 pb y tan largas como de 10 kb, se pueden amplificar;
. Veinte ciclos proporcionan una amplificación de 106 y 30 ciclos de 109.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. El método permite que el ADN de una sola célula, de un folículo piloso o de esperma, se amplifique y analice…
. De allí, su aplicación en medicina forense.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. LA PCR TAMBIÉN SE UTILIZA PARA:
1. Detectar agentes infecciosos, en especial, virus latentes;
2. Hacer diagnósticos genéticos prenatales;
3. Detectar polimorfismos alélicos;
4. Establecer el tipo específico de tejido para trasplante;
5. Estudiar la evolución biológica.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. TÉCNICA DE LA PCR:
. La muestra de ADN se calienta para separar las dos cadenas, permitiendo que los iniciadores se unan al ADN, y cada una de las cadenas se copia mediante la ADN polimerasa, comenzando en el sitio del iniciador.
Biología molecular y laboratorio clínico:
Biología molecular y laboratorio clínico:
1. Desnaturalización
2. Recocido o templado 
3. Extensión
30 a 40 ciclos de 3 pasos:
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Biología molecular y laboratorio clínico:
Amplificación exponencial:
35 ciclos
Gen deseado
ADN templado
Primer ciclo
68 billones de copias
. La tecnología del ADN recombinante se utiliza, además, en el análisis molecular de las enfermedades.
. Esto permite el estudio de:
Variaciones génicas normales;
Variaciones génicas que causan enfermedades;
Diagnóstico prenatal;
Animales transgénicos;
Terapia génica.
Biología molecular y laboratorio clínico:
A. VARIACIONES GÉNICAS NORMALES:
. Las variaciones normales y heredables en la secuencia del ADN en regiones no codificantes se denominan polimorfismos y sólo ocurren aproximadamente en 1 de cada 500 nucleótidos. 
. Su estudio es de interés en medicina forense o bien, para el estudio de genes específicos. 
Biologíamolecular y laboratorio clínico:
B. VARIACIONES GÉNICAS QUE CAUSAN ENFERMEDADES:
. Mutaciones puntuales pueden generar proteínas alteradas.
Ej.: Anemia de células falciformes.
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Una sustitución de T por A en el sexto codón del gen de la globina, se traduce en el cambio de A por U en el ARNm correspondiente;
. El codón alterado especifica valina por glutámico y esto causa una alteración estructural de la molécula. 
Biología molecular y laboratorio clínico:
02
02
O2
O2
4 O2
 Oxihb S
Desoxihb S
Mutación genética
Cadena beta hb S
Biología molecular y laboratorio clínico:
. La supresión de un fragmento crítico de ADN, el rearreglo del ADN dentro de un gen o la inserción de un fragmento de ADN en una región de codificación o reguladora pueden cambiar la expresión génica y producir enfermedad.
5´
3´
Cromosoma 11 – gen de la globina
b
d
g
e
Sitio de control
b talasemia
Biología molecular y laboratorio clínico:
C. DIAGNÓSTICO PRENATAL:
. Si se conoce la lesión genética y se dispone de una sonda específica, es posible el diagnóstico prenatal;
. El ADN de células obtenidas de 10 ml de líquido amniótico (o por biopsia de vellosidades coriónicas) puede analizarse por Southern Blot.
Biología molecular y laboratorio clínico:
D. ANIMALES TRANSGÉNICOS:
. Se basa en la introducción de un nuevo ADN en células germinales por su inyección en el núcleo del huevo.
. Un porcentaje de genes inyectados en un óvulo fertilizado de ratón se incorpora al genoma y se encontrará tanto en células somáticas como germinales; estas modificaciones pasarán a la descendencia.
Biología molecular y laboratorio clínico:
E. TERAPIA GÉNICA:
. Las enfermedades causadas por la deficiencia de un producto génico están sujetas a una terapia de reemplazo.
. La estrategia es clonar un gen en un vector que será fácilmente capturado e incorporado al genoma de una célula huésped. 
Biología molecular y laboratorio clínico:
. Las células precursoras de la médula ósea son ideales para este propósito ya que se supone que volverán a establecerse en la médula y allí, replicarán.
Ej: terapia génica de la b-talasemia
Biología molecular y laboratorio clínico:
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