Seminario 6 Tecnicas II BC 2020 Fmed UBA

Vista previa del material en texto

SEMINARIO 6
BIOLOGIA CELULAR Y 
MOLECULAR 2020
Técnicas de amplificación y 
manipulación de los ácidos 
nucleicos.
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
Objetivo general:
-Explicar el fundamento y la utilidad (para la investigación científica y 
para el diagnóstico y el tratamiento de personas) de técnicas de 
amplificación y manipulación de los ácidos nucleicos.
Objetivos específicos: 
-Justificar por qué las metodologías de amplificación y manipulación 
de ácidos nucleicos son útiles para analizar el genoma y los productos 
de los distintos niveles de expresión génica (ARNs, proteínas).
-Justificar por qué la PCR tiene utilidades en la investigación 
científica, el diagnóstico médico y la medicina forense.
-Justificar por qué la tecnología de manipulación de los ácidos 
nucleicos tiene utilidad en el estudio de la localización y funciones de 
ARNs y proteínas.
-Justificar por qué la tecnología de manipulación de ácidos nucleicos 
tiene utilidad en el tratamiento médico.
TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN O 
CLONACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS IN VITRO 
Y
TÉCNICAS DE RECOMBINACION DEL ADN
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
6 A. TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN O 
CLONACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS IN VITRO
Aclaración: Las técnicas de amplificación o clonación del ADN 
pueden clasificarse en dos tipos
-Clonación in vitro: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 
Constituye el punto I de este seminario.
-Clonación in vivo: Utilizan técnicas de recombinación del ADN. 
Por tal motivo, se desarrollan en la segunda parte de este 
seminario bajo el título de ¨Técnicas de recombinación del ADN¨.
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
6 A. TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN O 
CLONACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS IN VITRO
Clonación in vitro: Reacción en cadena de la polimerasa ( PCR)
-PCR punto final o convencional.
-PCR cuantitativa, en tiempo real o real time
Ambos tipos pueden partir de ADN genómico (muestra original de 
ADN) o de ADN complementario (ADNc). El ADNc se obtiene mediante 
la síntesis de ADN a partir de un molde de ARN mensajero. Por lo 
tanto, en este último caso, se obtiene una muestra de ARN sobre la 
cual se realiza un paso de retrotranscripción para obtener el ADNc 
previo a la realización de la PCR propiamente dicha. 
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Ciclos del proceso 
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Lectura en gel de agarosa 
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Lectura en gel de agarosa 
La altura de la banda amplificada puede poner de manifiesto la adición o pérdida de
nucleótidos en la secuencia de ADN estudiada (diagnóstico de mutaciones).
La presencia o ausencia de una banda de amplificación puede poner de manifiesto la
presencia o ausencia de un genoma bacteriano o viral y por lo tanto diagnosticar la 
presencia o ausencia de una infección.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Amplificación de ADN genómico o de ADN complementario (ADNc) 
Primer paso: 
Purificación del
ARNm.
Segundo paso: 
Retrotranscripción
de ARN a ADN.
Tercer paso: síntesis 
de la segunda 
cadena
de ADN 
complementaria
y amplificación.
Primer paso: 
Purificación 
de ADN.
Segundo paso: 
Amplificación
del ADN.
Información acerca del genoma vs información sobre la expresión génica
PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR y RT qPCR). 
“q” significa quantitative (cuantitativa), RT significa que va precedida de retrotranscripción a 
partir de ARN.
Detección por método inespecífico 
SYBR Green es una molécula cargada negativamente que, mientras está en solución sin unirse al 
ADN de doble cadena, prácticamente no emite fluorescencia. Cuando se une al ADN de doble 
cadena (etapa de extensión de la PCR) incrementa notablemente la emisión de fluorescencia, 
poniendo de manifiesto la amplificación del ADN. 
PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR y RT qPCR)
Detección por método específico 
La sonda Taqman tiene dos porciones (r: reporter y q: quencher). La porción quencher inhibe la 
emisión fluorescente de la porción reportera. Cuando la Taq polimerasa polimeriza ADN en la etapa 
de extensión de la PCR, con su capacidad 3´exonucleasa corta a la sonda Taqman separando sus 
dos porciones. Esto permite que el reportero emita fluorescencia y así se detecta la amplificación 
de la porción de ADN limitada por los primers. 
PCR cuantitativa en tiempo real 
(qPCR y RT qPCR) 
La lectura en tiempo real de la emisión de fluorescencia que se produce durante la 
amplificación del ADN permite cuantificar el ADN (si se purificó ADN de la muestra) 
o el ARNm (si se purificó ARNm de la muestra y se formó ADNc por retrotranscripción). 
TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN O CLONACIÓN
DE ACIDOS NUCLEICO IN VITRO
Aplicaciones de la PCR:
Diagnóstico de:
-infecciones
-mutaciones
Medicina forense: 
La comparación de fragmentos de ADN amplificados permite
-identificar personas.
-determinar maternidad o paternidad.
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
Replicaciones repetidas de un segmento
de ADN (Amplificación o clonación in vitro) 
Purificación de ARN 
Transcripción reversa
Purificación de ADN
PCR
qPCR RT qPCR
Modelos de experimentación Pacientes
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
6.B. TÉCNICAS DE RECOMBINACIÓN DEL ADN
-Enzimas de restricción.
-Formación de moléculas híbridas (insertos y vectores).
-Amplificación o clonación in vivo.
Las técnicas basadas en la hibridación y en la secuenciación
de ácidos nucleicos se analizarán en la cursada de Genética.
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA..
Figure 8-31 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Son endonucleasas que cortan
el ADN en secuencias específicas.
Los fragmentos resultantes pueden
tener extremos romos o con 
segmentos de ADN monocatenarios.
Estos extremos monocatenarios 
pueden volver a unirse por 
complementariedad de bases. 
Por esto se llaman bordes pegajosos. 
Figure 8-32 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN y FORMACIÓN DE MOLÉCULAS
RECOMBINANTES O HIBRIDAS
La unión (por complementariedad de bases) de bordes pegajosos de dos moléculas
de ADN de distinto origen cortadas por la misma enzima de restricción y 
unidas en forma covalente por una ligasa, permite la obtención de moléculas de 
ADN recombinante o híbridas. 
Figure 8-39 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
MOLÉCULAS HÍBRIDAS O RECOMBINANTES
(vectores e insertos)
Un fragmento de ADN de interés puede insertarse (inserto) en un elemento de ADN
con capacidad autorreplicante (vector) formando una molécula de ADN recombinante
o híbrida.
Figure 8-40 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
AMPLIFICACIÓN O CLONACIÓN de MOLÉCULAS HIBRIDAS
o RECOMBINANTES (vectores e insertos)
La molécula hibrida se introduce en una bacteria (transformación). La proliferación
de las bacterias permite obtener millones de copias de la molécula de ADN 
recombinante (amplificación o clonación in vivo).
Figure 8-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
HAY DISTINTOS TIPOS DE VECTORES: plásmidos, virus, cromosomas 
artificiales de bacterias y de levaduras.
LOS CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LEVADURA SIRVEN DE VECTORESPARA GRANDES SEGMENTOS DE ADN.
Figure 8-48 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
II. VECTORES DE EXPRESIÓN: producción de proteínas
Poseen secuencias promotoras
que permiten la transcripción 
del inserto.
Permite producir proteínas con
Utilidad terapéutica. 
Ejemplos insulina, 
factor VIII de la coagulación,
Vacunas. 
Figure 8-15 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
II. VECTORES DE EXPRESIÓN: producción de una proteína híbrida. 
Se fusiona el gen codificante de una proteína de interés con el 
gen codificante de una proteína que se pueda identificar (tag).
Figure 8-63 (part 2 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
II. VECTORES DE EXPRESIÓN: producción de una mutación en el gen 
codificante de una proteína y expresión de una proteína con un aminoácido 
distinto. 
Figure 8-64 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
III. POSIBLES MODIFICACIONES DEL GENOMA 
La alteración de la secuencia de ADN en un gen específico, puede ocasionar que
su producto (ARN y/o proteína) no presente cambios funcionales o por el contrario, 
puede ocasionar una ganancia o una pérdida de función de su producto. El análisis
del resultado de estos cambios funcionales permite interpretar la o las funciones 
del producto de ese gen. 
Figure 8-65 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
III: CÉLULAS MADRE CON MODIFICACIONES GENÓMICAS pueden ser 
introducidas en embriones en etapas tempranas del desarrollo, dando 
origen a ANIMALES TRANSGENICOS (animales que presentan 
modificaciones genómicas que transmiten a su descendencia)
Figure 8-66 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
RATÓN WILD TYPE O TIPO SILVESTRE (A) VS RATÓN TRANSGÉNICO (B).
A modo de ejemplo se muestra un ratón wild type o silvestre (sin inducción de 
mutación) (A) y un ratón transgénico (B) que presenta una mutación con pérdida de
función del producto del gen Xpd que codifica para una helicasa. Esta enzima 
participa en procesos de transcripción y de reparación del ADN. La acumulación de
daños en el ADN lleva al envejecimiento precoz del ratón transgénico. 
Los animales transgénicos no necesariamente presentan cambios patológicos. 
IV: Metodologías para estudiar la función de los genes
Usualmente involucran estrategias para modificar el nivel de expresión de las proteínas 
1- Estrategias de aumento de la expresión
Pueden expresarse:
• Proteínas endógenas
• Proteínas que poseen cambios en su estructura primaria debido a mutaciones
• Proteínas de otros organismos (caso especial: proteínas fluorescentes, por ej. GFP)
Usualmente involucran estrategias para modificar el nivel de expresión de las proteínas 
2- Estrategias de disminución de la expresión
Los estudios de pérdida de función son los más informativos para determinar la función 
de una proteínas
¿Qué técnicas se utilizan para modificar el nivel de expresión de las proteínas?
IV. Metodologías para estudiar la función de los genes
Tecnología de ADN recombinante
Permite combinar secuencias de ADN que pueden ser transcriptas y traducidas por las células 
PROMOTOR GEN DE INTERÉS
SEÑAL DE 
POLIADENILACIÓN
PROMOTOR NIVEL DE EXPRESIÓN
CMV Alto
MCSV Alto
EF1 Medio
PGK Medio
UbC Bajo
Los promotores utilizados para expresar 
proteínas son reconocidos por la 
maquinaria de transcripción endógena 
dependiente de la ARN polimerasa II
Estrategias de aumento de la expresión
IV. Metodologías para estudiar la función de los genes
Tecnología de ADN recombinante
Permite combinar secuencias de ADN que pueden ser transcriptas y traducidas por las células 
PROMOTOR GEN DE INTERÉS
SEÑAL DE 
POLIADENILACIÓN
cADN (ADN COMPLEMENTARIO)
1 2 3 4
1 2 3 4
cADN (sin intrones)
Diferencias entre el ADN genómico y el cADN:
Se genera a partir de la transcripción 
reversa del mRNA maduro
Estrategias de aumento de la expresión
ADN genómico
IV. Metodologías para estudiar la función de los genes
Tecnología de ADN recombinante
Permite combinar secuencias de ADN que pueden ser transcriptas y traducidas por las células 
PROMOTOR ARN DE INTERFERENCIA
Estrategias de disminución de la expresión
Los ARN de interferencia utilizan la 
maquinaria proteica y un 
mecanismo análogo a los miARNs
para silenciar mARN endógenos
El producto funcional es un ARN
Metodologías para estudiar la función de los genes
microARNs: para comparar con la tecnología de ARNs de 
interferencia
Biogénesis: Transcripción y procesamiento de los miARNs
IV. Metodologías para estudiar la función de los genes
Tecnología de ADN recombinante
Permite combinar secuencias de ADN que pueden ser transcriptas y traducidas por las células 
PROMOTOR ARN DE INTERFERENCIA
Estrategias de disminución de la expresión
PROMOTOR GEN DE INTERÉS
Estrategias de aumento de la expresión
¿Cómo pueden introducirse esas secuencias de ADN recombinante en las células?
IV. Metodologías para estudiar la función de los genes
Vectores de expresión
Plásmidos
• Pueden introducirse en las células 
(transfección) mediante distintos métodos:gen 
de 
inter
és
• Moléculas de ADN circulares (tamaño:3-10Kb)
originalmente derivadas de bacterias
A- Combinación con lípidos catiónicos:
Metodologías para estudiar la función de los genes
Vectores de expresión
Plásmidos
• Pueden introducirse en las células 
(transfección) mediante distintos métodos:gen 
de 
inter
és
• Moléculas de ADN circulares (tamaño:3-10Kb)
originalmente derivadas de bacterias
B- Electroporación:
impulso eléctrico
Metodologías para estudiar la función de los genes
Vectores de expresión
Plásmidos
• Pueden introducirse en las células 
(transfección) mediante distintos métodos:gen 
de 
inter
és
• Moléculas de ADN circulares (tamaño:3-10Kb)
originalmente derivadas de bacterias
Expresión transitoria
Los plásmidos no se replican en células 
eucariotas, por lo que pueden ‘diluirse’ en 
células en activa proliferación
IV.Metodologías para estudiar la función de los genes
Vectores de expresión
Virus modificados
Requiere la eliminación de los genes que dotan al virus de su capacidad infecciosa y 
patógena, dejando únicamente aquellos que participan en la inserción del material 
genético, y su sustitución por el gen de interés.
V. El uso de proteínas fluorescentes
Ejemplo:
Vectores de expresión de GFP
GFP (Green Fluorescent Protein)
Proteína fluorescente verde
Es una proteína endógena de la medusa 
Aequorea victoria
GFP emite fluorescencia en el rango verde del 
espectro visible cuando es excitada por luz de 
longitudes de onda cercanas a los 395nm
V. El uso de proteínas fluorescentes
Otras proteínas fluorescentes que pueden expresarse en células eucariotas
Ejemplo:
Expresión de GFP en células en cultivo mediante transfección de plásmidos
V. El uso de proteínas fluorescentes
Línea celular HEK293 Cultivo primario de neuronas de rata
Artegiani, et al., 2013. Development 140
Detalle a mayor magnificación
Ejemplo:
Expresión de GFP en neuronas mediante inyecciones de lentivirus en 
un animal de experimentación in vivo
V. El uso de proteínas fluorescentes
Estudios de localización con proteínas de fusión
-El gen que codifica para una proteína (cuya localización celular quiere estudiarse) se fusiona con el gen
que codifica para una proteína fluorescente. 
-La localización de la proteína fluorescente muestra la ubicación de la proteína estudiada.
Ejemplo: GFP-Tubulina alfa
V. El uso de proteínas fluorescentes
Estudios de localización con proteínas de fusión 
V. El uso de proteínas fluorescentes
Ejemplo:
¿Cómo afectan las distintas mutaciones 
la localización de la proteína PLCδ?
Transfección de células en cultivo 
con PLCδ-GFP wild type y de sus 
mutantes S33T,K30L, K32L y R40L
Estudios de la dinámica temporal de las proteínas mediante el uso de proteínas de fusión 
V. El uso de proteínas fluorescentes
Geminina-GFP
(Geminina ies una proteína que 
se expresa en las fasesS/G2/M
del ciclo celular)
Histona H2-mCherry
VI. Animales genéticamente modificados
Modificación del genoma mediante la tecnología CRISPR/Cas
Modificación del genoma mediante la tecnología CRISPR/Cas: 
es la metodología más eficiente para mdificar el genoma y producir
animales transgénicos
1- ARNs pequeños (sgRNAs) 
dirigen a la endonucleasa Cas9 a 
un sitio del genoma
2- Se activan los mecanismos de 
reparación de la doble hebra de 
ADN
3- El mecanismo de reparación por 
unión de extremos no homólogos 
(NHEJ) introduce inserciones y/o 
deleciones (‘indels’) provocando 
frecuentes corrimientos del marco 
de lectura
4- La introducción de un 
fragmento de ADN que posea 
homología (pero posea una 
mutación, por ejemplo) favorece el 
mecanismo de reparación por 
recombinación homóloga, 
introduciendo la mutación en el 
genoma.
VI. Animales genéticamente modificados
Ratones genéticamente modificados mediante CRISPR/Cas
VI. Animales genéticamente modificados
VII. TERAPIA GÉNICA . Este tema se analizará más profundamente
en la cursada de Genética.
Vectores de expresión con un gen codificante de una proteína normal podría permitir
la expresión de una proteína cuya ausencia o mala función es causante de una 
enfermedad.
Vectores de expresión con un gen con la información para un ARN de 
interferencia podría disminuir la expresión de una proteína causante de una 
una enfermdad.
Los vectores pueden introducirse
directamente en la persona (terapia
in vivo).
O introducirse en células en cultivo
que luego de ser modificadas
genéticamente se introducen en la 
persona (terapia ex vivo). 
ADN
Corte con enzimas de restricción
y unión con ligasa
Moléculas de ADN recombinante
(vector e inserto)
ARN
Transcripción reversa
ADNc
Producción de proteinas
(insulina, vacunas)
Proteinas fluorescentes
-Inhibicion, disminucion
de la expresión génica
-Aumento de la expresión
génica.
-Expresión de genes con
mutaciones puntuales
Animales 
transgénicos
Introducción en células
-Transformación de células procariontes
-Transfección o infección de células eucariontes
Modelos experimentales
CRISPR/Cas9
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
Estudio de la función de productos génicos
Esquema conceptual de los seminarios 5 y 6
Biopsia , elementos formes
de la sangre o celulas en cultivo
(conservan la estructura) 
Plasma, tejido homogeneizado, 
fraccionamiento subcelular 
Purificacion de AD o ARN
(no conservan la estructura)
Técnica histológica de rutina
Inmunohistoquímica/fluorescencia
Visualizacion de proteinas fluorescentes
Técnicas de análisis
Estudios bioquímicos 
Westernblot
PCR qPCR RT qPCR
Produccion de moléculas
de ADN recombinante
Observación
con microscopios
Muestras
TRABAJO CIENTíFICO ------------------------CONSULTA MEDICA
(Modelos experimentales) (Paciente)
CRISPR-Cas9
Departamento de Histología, Biología 
Celular, Embriología y Genética. 
Primera Unidad Académica. 
Facultad de Medicina, UBA.
Preguntas de autoevaluación del seminario 6:
1.Justifique qué utilidades diagnósticas tienen la PCR punto final y la qPCR.
2. Explique en qué se basa la diferencia metodológica entre la PCR y la qPCR. 
Justifique qué implicancia tiene esta diferencia en la información que aportan
los resultados de cada una de ellas.
3. Describa qué son las enzimas de restricción y justifique qué utilidades tienen
en la investigación científica.
4. Describa qué son las bibliotecas genómicas y de ADNc. Explique qué utilidad 
pueden tener cada una de ellas. 
5. Describa qué son los vectores de expresión. Justifique qué utilidades médicas
presentan los mismos.
6. Explique cómo podría utilizar un animal transgénico para investigar la función de
una proteína.
7. Explique qué utilidades tiene el método de CRISPR/Cas.
Preguntas de autoevaluación 
de los seminarios 5 y 6:
1. Justifique qué técnicas podría utilizar para determinar la ubicación de una 
proteína en un tejido.
2. Justifique qué técnicas podría utilizar para diagnosticar si una persona está 
Infectada por HIV
3. Justifique qué técnicas podría utilizar para evaluar la expresión de un producto
génico en un cultivo celular. Explique qué ventajas y desventajas presenta cada
una de ellas.
4. Justifique qué diferencias tendrían la RT qPCR y el Western blot en la
información que podrían aportar acerca de la presencia o ausencia de infección
por COVID-19 en un grupo de personas.
5. Justifique qué utilidad tendría el empleo de las distintas formas de PCR y de 
Western blot para detectar en un paciente la presencia de una mutación y su 
consecuencia sobre la expresión génica.