SAìNTESIS-CONCEPTUAL-7---BiologAa-Celular

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SINTESIS CONCEPTUAL 7 de 2022
BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
TÉCNICAS II:
A- Vectores de expresión para estudios de
ganancia y pérdida de función
B- El uso de proteínas fluorescentes
C- Animales genéticamente modificados
Metodologías para estudiar la función de los genes
Usualmente involucran estrategias para modificar el nivel de expresión de las proteínas 
1- Estrategias de aumento de la expresión
Pueden expresarse:
• Proteínas endógenas
• Proteínas que poseen cambios en su estructura primaria debido a mutaciones
• Proteínas de otros organismos (caso especial: proteínas fluorescentes, por ejm. GFP)
Metodologías para estudiar la función de los genes
Usualmente involucran estrategias para modificar el nivel de expresión de las proteínas 
2- Estrategias de disminución de la expresión
Los estudios de pérdida de función son los más informativos para determinar la función 
de una proteínas
¿Qué técnicas se utilizan para modificar el nivel de expresión de las proteínas?
Metodologías para estudiar la función de los genes
Tecnología de ADN recombinante
Permite combinar secuencias de ADN que pueden ser transcriptas y traducidas por las células 
PROMOTOR GEN DE INTERÉS
SEÑAL DE 
POLIADENILACIÓN
PROMOTOR NIVEL DE EXPRESIÓN
CMV Alto
MCSV Alto
EF1 Medio
PGK Medio
UbC Bajo
Los promotores utilizados para expresar 
proteínas son reconocidos por la 
maquinaria de transcripción endógena 
dependiente de la ARN polimerasa II
Estrategias de aumento de la expresión
Metodologías para estudiar la función de los genes
Tecnología de ADN recombinante
Permite combinar secuencias de ADN que pueden ser transcriptas y traducidas por las células 
PROMOTOR GEN DE INTERÉS
SEÑAL DE 
POLIADENILACIÓN
cADN (ADN COMPLEMENTARIO)
1 2 3 4
1 2 3 4
cADN (sin intrones)
Diferencias entre el ADN genómico y el cADN:
Se genera a partir de la transcripción 
reversa del mRNA maduro
Estrategias de aumento de la expresión
ADN genómico
Metodologías para estudiar la función de los genes
Tecnología de ADN recombinante
Permite combinar secuencias de ADN que pueden ser transcriptas y traducidas por las células 
PROMOTOR ARN DE INTERFERENCIA
Estrategias de disminución de la expresión
Los ARN de interferencia utilizan la 
maquinaria proteica y un 
mecanismo análogo a los miARNs
para silenciar mARN endógenos
El producto funcional es un ARN
Metodologías para estudiar la función de los genes
Tecnología de ADN recombinante
Permite combinar secuencias de ADN que pueden ser transcriptas y traducidas por las células 
PROMOTOR ARN DE INTERFERENCIA
Estrategias de disminución de la expresión
PROMOTOR GEN DE INTERÉS
Estrategias de aumento de la expresión
¿Cómo pueden introducirse esas secuencias de ADN recombinante en las células?
Metodologías para estudiar la función de los genes
Vectores de expresión
Plásmidos
• Pueden introducirse en las células 
(transfección) mediante distintos métodos:gen 
de 
interé
s
• Moléculas de ADN circulares (tamaño:3-10Kb)
originalmente derivadas de bacterias
A- Combinación con lípidos catiónicos:
Metodologías para estudiar la función de los genes
Vectores de expresión
Plásmidos
• Pueden introducirse en las células 
(transfección) mediante distintos métodos:gen 
de 
interé
s
• Moléculas de ADN circulares (tamaño:3-10Kb)
originalmente derivadas de bacterias
B- Electroporación:
impulso eléctrico
Metodologías para estudiar la función de los genes
Vectores de expresión
Plásmidos
• Pueden introducirse en las células 
(transfección) mediante distintos métodos:gen de interés
• Moléculas de ADN circulares (tamaño:3-10Kb)
originalmente derivadas de bacterias
Expresión transitoria
Los plásmidos no se replican en células 
eucariotas, por lo que pueden ‘diluirse’ en 
células en activa proliferación
Metodologías para estudiar la función de los genes
Vectores de expresión
Virus modificados
Requiere la eliminación de los genes que dotan al virus de su capacidad infecciosa y 
patógena, dejando únicamente aquellos que participan en la inserción del material 
genético, y su sustitución por el gen de interés.
Metodologías para estudiar la función de los genes
Vectores de expresión
Virus modificados
Requiere la eliminación de los genes que dotan al virus de su capacidad infecciosa y 
patógena, dejando únicamente aquellos que participan en la inserción del material 
genético, y su sustitución por el gen de interés.
El uso de proteínas fluorescentes
Ejemplo:
Vectores de expresión de GFP
GFP (Green Fluorescent Protein)
Proteína fluorescente verde
Es una proteína endógena de la medusa 
Aequorea victoria
GFP emite fluorescencia en el rango verde del 
espectro visible cuando es excitada por luz de 
longitudes de onda cercanas a los 395nm
El uso de proteínas fluorescentes
Otras proteínas fluorescentes que pueden expresarse en células eucariotas
Ejemplo:
Expresión de GFP en células en cultivo mediante transfección de plásmidos
El uso de proteínas fluorescentes
Línea celular HEK293 Cultivo primario de neuronas de rata
Artegiani, et al., 2013. Development 140
Detalle a mayor magnificación
Ejemplo:
Expresión de GFP en neuronas mediante inyecciones de lentivirus en 
un animal de experimentación in vivo
El uso de proteínas fluorescentes
Estudios de localización con proteínas de fusión 
Ejemplo: GFP-Tubulina alfa
El uso de proteínas fluorescentes
Estudios de localización con proteínas de fusión 
El uso de proteínas fluorescentes
Ejemplo:
¿Cómo afectan las distintas mutaciones 
la localización de la proteína PLCδ?
Transfección de células en cultivo 
con PLCδ-GFP wild type y de sus 
mutantes S33T,K30L, K32L y R40L
Estudios de la dinámica temporal de las proteínas mediante el uso de proteínas de fusión 
El uso de proteínas fluorescentes
Animales genéticamente modificados
Modificación del genoma mediante la tecnología CRISPR/Cas
Modificación del genoma mediante la tecnología CRISPR/Cas
1- ARNs pequeños (sgRNAs) 
dirigen a la endonucleasa Cas9 a 
un sitio del genoma
2- Se activan los mecanismos de 
reparación de la doble hebra de 
ADN
3- El mecanismo de reparación por 
unión de extremos no homólogos 
(NHEJ) introduce inserciones y/o 
deleciones (‘indels’) provocando 
frecuentes corrimientos del marco 
de lectura
4- La introducción de un 
fragmento de ADN que posea 
homología (pero posea una 
mutación, por ejemplo) favorece el 
mecanismo de reparación por 
recombinación homóloga, 
introduciendo la mutación en el 
genoma.
Animales genéticamente modificados
Ratones genéticamente modificados mediante CRISPR/Cas
Animales genéticamente modificados
FIN
TÉCNICAS 
BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR AÑO 2022
	Número de diapositiva 1
	Número de diapositiva 2
	Número de diapositiva 3
	Número de diapositiva 4
	Número de diapositiva 5
	Número de diapositiva 6
	Número de diapositiva 7
	Número de diapositiva 8
	Número de diapositiva 9
	Número de diapositiva 10
	Número de diapositiva 11
	Número de diapositiva 12
	Número de diapositiva 13
	Número de diapositiva 14
	Número de diapositiva 15
	Número de diapositiva 16
	Número de diapositiva 17
	Número de diapositiva 18
	Número de diapositiva 19
	Número de diapositiva 20
	Número de diapositiva 21
	Número de diapositiva 22
	Número de diapositiva 23
	Número de diapositiva 24
	Número de diapositiva 25
	Número de diapositiva 26
	TÉCNICAS II:��A- Vectores de expresión para estudios de� ganancia y pérdida de función�B- El uso de proteínas fluorescentes�C- Animales genéticamente modificados
	Número de diapositiva 28
	Número de diapositiva 29
	Número de diapositiva 30
	Número de diapositiva 31
	Número de diapositiva 32
	Número de diapositiva 33
	Número de diapositiva 34
	Número de diapositiva 35
	Número de diapositiva 36
	Número de diapositiva 37
	Número de diapositiva 38
	Número de diapositiva 39
	Número de diapositiva 40
	Número de diapositiva 41
	Número de diapositiva 42
	Número de diapositiva 43
	Número de diapositiva 44
	Número de diapositiva45
	Número de diapositiva 46
	Número de diapositiva 47
	Número de diapositiva 48
	Número de diapositiva 49