18 y 19 Tecnicas para el Estudio de las Celulas Acidos Nucleicos y DNA Recombinante

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Están relacionados por el ADN recombinante 
Si a un ADN desnaturalizado (monocatenario) lo expongo a pequeñas moléculas de 
desoxirribonucleótidos con secuencias complementarias a mi ADN, estas se van a unir por 
complementariedad de bases y puedo usarlas para detectar una secuencia en un ADN 
desconocido si las marco con una partícula marcadora. A esto se lo conoce como HIBRIDACIÓN 
DNA RECOMBINANTE: molécula de ADN circular o lineal obtenida in vitro por combinación de 
fragmentos (enlaces covalentes) de ADN de distintos orígenes 
Para obtener los fragmentos necesito un ADN fuente (genoma) y Enzimas de restricción 
(tijeras) 
CORTE 
ENZIMAS DE RESTRICCION/ENDONUCLEASAS: enzimas que cortan ADN en el interior de la 
molécula. 
Tienen origen bacteriano: las bacterias tienen estas enzimas para protegerse de virus 
(bacteriófagos), evitando el ingreso del ARN viral al citosol 
Para evitar de la autodegradación, la enzima metila el ADN de los propios sitios de corte (el 
metil produce un cambio en el sitio de unión de la enzima por lo que no puede unirse y de esta 
forma no se degrada) 
Cada enzima Reconoce 1 secuencia PALINDROMICAS/SITIOS DE RESTRICCIÓN: secuencias de 4-
8 pares de bases idénticas cuando se leen en sentido 5´→3´ donde la enzima va realizar el 
corte de forma lineal (extremos romos) o no (extremos escalonados) 
 
 
 
 
UNION 
Para poder unir los fragmentos necesito cortarlos con una enzima que genere los mismos 
extremos cohesivos, ya que si los extremos son distintos no se van a unir. 
DNA T4 Ligasa: forma la unión covalente entre los extremos cohesivos 
SEPARACIÓN 
Separación del DNA Recombinante: uso una electroforesis en gel de agarosa (separación por 
tamaño) para separar el ADN recombinante del resto de fragmentos/moléculas. Se siembra la 
muestra en el gel de agarosa, se aplica un campo eléctrico y luego un colorante. 
En este caso no hace falta agregar SDS porque las moléculas tienen carga negativa (provienen 
de ac nucleicos), pero si tengo que agregar Bromuro de Etidio para poder verlas 
 
Bromuro de Etidio: se intercala entre las moléculas de ADN y fluoresce (naranja) cuando se le 
irradia con luz UV. 
NORTHERN BLOT (ARN) o SOUTHERN BLOT (ADN): Una vez separado por electroforesis se 
traspasan los fragmentos de ADN/ARN desde el gel a un papel de filtro/membrana aplicando 
peso en un medio alcalino (ADN desnaturalizado) y se procede a la identificación y revelado. 
FISH: (dentro del núcleo) permite ver estructuras anómalas dentro de los cromosomas 
mediante el agregado de moléculas fluorescentes o moléculas que puedo identificar 
fácilmente, a la sonda. Puedo detectar si en un núcleo se transcribió un gen por ej. 
 
IDENTIFICACIÓN 
(hibridación o secuenciación) 
Hibridación: uso una sonda marcada de 18-50 nucleótidos complementarios al ADN/ARN que 
quiero encontrar. Altamente específica, solo interacciona cuando todos los nucleótidos se 
unen al ADN o ARN. Si mi ADN/ARN de interés está presente voy a ver una banda, sino no. 
Secuenciación: para corroborar que una secuencia de 1000 pares de bases es la secuencia que 
estoy buscando. Para eso tengo que secuenciar mi ADN: 
• Métodos Básicos de Secuenciación Sanger- Sanger automatizado: para secuenciar el 
ADN sintetizo la molécula complementaria (sabiendo los nucleótidos 
que entran en la síntesis puedo identificar mi cadena de ADN) 
Nucleótido di desoxi (defectuoso): permite saber que nucleótido entra en cada 
momento de la síntesis. No tiene OH, frena la síntesis y si está marcado me 
permite conocer el nucleótido que entró en ese momento. 
Necesito: ADN molde desnaturalizado, cebador, ADN polimerasa, los 4 
nucleótidos y el nucleótido didesoxi. 
La síntesis de la cadena complementaria se frena cuando llega al nucleótido defectuoso, me 
permite identificar el tamaño de la cadena sintetizada (luego del revelado) y deducir la 
secuencia del fragmento de ADN que tenía. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Método Avanzado de Secuenciación 
• NEXT generation sequencing: Illumina 
REVELADO: a la sonda le agrego fluorocromos (quimioluminiscencia), fosfatos radioactivos 
(radioactividad) o moléculas orgánicas pequeñas que interaccionen con fluorocromos 
 
 
CLONACIÓN 
Muchas copias idénticas de algo: células, microorganismos, genes, fragmentos de ADN 
generado y obtenido por técnicas de DNA cloning, etc 
PORQUE CLONAR DNA? Para tener grandes cantidades de una misma secuencia para hacer un 
análisis de secuencia para diagnóstico de mutaciones (por ej), estudiar la función de esos 
genes, obtener proteínas recombinantes u organismos genéticamente modificados. 
¿Como clonar? A partir de Tecnologías de DNA recombinante o PCR (Rxn en Cadena de la 
Polimerasa) 
PCR: replico muchas veces ese DNA, para eso al fragmento de DNA lo desnaturalizo a altas 
temperaturas (T°C>90°) y le agrego dNTP (tiene las 4 bases CTGA), cebadores, DNA polimerasa. 
 
1° desnaturalizo a T°C>90° para asegurarme de tener las 2 hebras separadas 
2° Hibridación: bajo la temperatura (60°C) para que los primers hibriden donde corresponde y 
luego agrego la DNA polimerasa con los dNTP para la elongación 
3° Aumento la temperatura hasta 72°C para que la ADN Pol elongue la cadena. La ADN pol de 
mamíferos no aguantan estas temperaturas, entonces se usa la Taq polimerasa (Thermus 
aquaticus: adn pol de una bacteria de geisers) 
Estos 3 pasos suceden en un termociclador y se repite unas 30 veces aprox 
 
Los métodos de obtención de ADN sirven para sangre, tejidos solidos o cultivos celulares. 
Ej: quiero clonar el gen de la MAC-Quinasa (proteína quinasa activada por mitógenos y actúa 
en la división celular) 
1° diseño los primers que flanqueen los extremos del gen 
2° Obtengo el DNA 
3° DNA + dNTP + Taq + Primers en un tubo = desnaturalización, unión complementaria de los 
primers con el ADN desnaturalizado (hibridación), copia del gen (Taq Pol) 
Obtengo clones del gen completo o la parte del gen que le corresponda a los cebadores que 
elegí 
SEPARACION DEL GEN CLONADO: corrida en Gel de agarrosa y luego secuenciación o southern 
blot (si quiero identificar) 
De una muestra biológica obtengo ARN, ¿Puedo clonar ARN? NO. Para eso tengo que 
transformar el ARN en ADN y amplificarlo por PCR. Esto es una RTPCR (retro transcripción pcr) 
Ej: para el ARNm uso como primer cebador un POLI T/ Oligodt(cebador formado solo por 
timina, el ARNm tiene una cola POLI A), luego agrego la Enzima Transcriptasa Inversa (obtenida 
de un microrganismo) que copia la molécula de DNA complementaria (cDNA) al ARN. 
Luego de la copia tengo un heteroduplex (doble cadena), la enzima degrada al ARN, se 
sintetiza la molécula complementaria al cDNA (polimerasa/transcriptasa) y obtengo un cDNA 
de doble cadena a partir del cual hago la PCR 
 
 
cDNA= producto de expresión del gen= ARN 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Muestras biológicas: CLONES GENOMICOS= CLONES DE DNA 
 CLONES DE cDNA = CLONES DE ARN 
DIAGNOSTICO: puedo clonar DNA o hacer una RT PCR para comparar los valores que obtengo 
con los valores normales y asi diagnosticar enfermedades 
La PCR me dice si HAY O NO HAY pero NO CUANTIFICA 
¿Como identificar la carga viral? PCR cuantitativa (qPCR o RT-qPCR) 
EJ: A partir del hisopado puedo aislar el RNA y obtener 
el ADN monocatenario por retro transcripción. Al DNA 
se le agrega la TACpolimerasa, primer y una sonda 
especifica con un marcador fluorescente que solo 
emite fluorescencia cuando se libera de la sonda. 
Cuando la DNA Pol elonga la cadena une el cebador 
con la sonda y corta el marcador fluorescente (emite 
fluorescencia). La fluorescencia se puede detectar con 
un fluorometro, iluminómetro, etc 
A medida que obtengo más moléculas de ADN por 
medio de la PCR más fluorescencia voy a detectar. Con 
estos datos se confecciona una curva y me permite 
obtener datos cuantitativos. 
ALTAMENTESENSIBLE→a partir de 1 molécula obtengo millones, ESPECIFICA→ el primer y la 
sonda están diseñadas específicamente para unirse por complementariedad molecular con el 
fragmento de DNA que quiero 
Otra aplicación de la PCR: diagnóstico de filiación: se utiliza para diferenciar individuos o para 
exámenes de paternidad. 
 
La PCR se la aplica a los DNA microsatélites: secuencias chicas de ADN altamente repetitivas (2-
6 pares de bases) y se revela en un southern blot. 
Cada persona va a tener una huella genética característica debido a que las 
repeticiones de ADN satélite son característico y distinto para cada 
individuo. 
En caso de tratarse de un examen de paternidad se compara el patrón de 
bandas del hijo con el de la madre y del padre, si es hijo de esas personas 
las bandas del hijo coinciden con la de los padres. 
 
CRISPR-CAS: proteínas CAS asociadas a Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y 
Regularmente Interespaciada 
Sistema detectado en el sistema de defensa de las bacterias (simil enzimas de restricción) que 
no responde al sistema de defensa inmediato sino a la Memoria Genómica 
 
Repeticiones Palindrómicas: el genoma de 
muchas bacterias tiene muchas secuencias 
de este tipo separadas por distintas 
secuencias de DNA (DNA espaciadores de 
secuencias palindrómicas) del genoma de 
distintos virus 
 Secuencia Líder: separa las secuencias 
palindrómicas y tiene la maquinaria para 
que se expresen las repeticiones 
palindrómicas con sus respectivos DNA 
espaciadores 
Codificadas en el genoma bacteriano hay 
Proteínas asociadas a las secuencias crispr: 
enzimas CAS 
 
Crispr: secuencia que corresponde a las secuencias espaciadoras 
Función: 
1) bacteria infectada por un virus 
2) degradación del genoma viral de ADN por medio de las enzimas de restricción de la bacteria 
3) el genoma viral de ADN se inserta en el genoma bacteriano y separa las secuencias 
palindrómicas repetidas 
4) Transcripción de secuencias palindrómicas y secuencias espaciadoras (genoma bacteriano y 
viral). Obtengo una secuencia corta de RNA complementaria al genoma del virus que se une a 
las proteínas cas. 
PADRE MADRE HIJO 
 
Cuando el virus re infecte la bacteria el ADN va a ser desnaturalizado y el ARN complementario 
a ese ADN se le une y la interacción DNA espaciador del crisper-dna desnaturaliza el virus y 
activa la proteína cas que degrada el ARN. De esta forma la bacteria se deshace de todo el 
genoma del virus 
En el Primer contagio, la 
bacteria incorpora el ARN 
viral y en el segundo activa un 
mecanismo de memoria que 
cuando vuelve a ingresar el 
virus lo degrada 
completamente 
Proteínas cas reconocen 
específicamente 1 genoma y 
lo cortan en la secuencia 
especifica dirigida por la 
secuencia de ARN que 
introduje 
 
Cas 13: degrada ADN y ARN: si coloco cas 13 + ARN viral + secuencia ARN complementaria al 
ARN viral (ARN guía) y que lo hibridase + secuencia/arn prob= activación de cas 13 y 
degradación de todo arn que encuentre y en consecuencia emisión de fluorescencia 
(diagnostico +) 
Secuencia Prob: sonda con un fluorescente en un extremo y una no fluorescente que anula la 
fluorescencia mientras este en la misma molec que la molec fluorescente. Fluoresce cuando se 
lo separa 
 Metodo muy, muy, muy sensible y bastante rápido 
SHERLOCK One Pot Testing: procedimiento para detectar covid que tiene 1 paso previo a todo 
lo anterior (crispercas) donde concentran el rna con dynabeds. Esto le da mucha mas 
sensibilidad. 
 
 
 
 
 
 
 
DNA recombinante: fragmentos de DNA de distintos orígenes, a saber: DNA que 
proviene de un organismo, DNA genómico (PCR), cDNA (RT-PCR) 
Vector de clonación: molécula de DNA de doble cadena que puede incorporar un 
fragmento de DNA de otro origen mediante la DNAT4 ligasa 
Tipos de vectores: 
 
Estructura del vector de clonación: 3 secuencias principales: 
• ORI: permite la replicación independientemente del DNA cromosómico 
• POLILIGADOR: tiene muchos sitios de restricción que me permite seleccionar 
la enzima que quiero para cortar el vector y el DNA. 
• AMPR: codifica una enzima que degrada el antibiótico del medio de incubación. 
Me permite seleccionar las bacterias transformadas 
 
¿Como clonar DNA? 
 
 
 
 
Necesito obtener el DNA a clonar, Vector plasmídico y Enzimas de corte 
https://youtu.be/mQtc4i_V6z8
https://youtu.be/mQtc4i_V6z8
 
2. Corto el vector y el fragmento de DNA que quiero clonar con las enzimas de corte 
para formar extremos cohesivos que se van a unir mediante complementariedad 
molecular gracias a la DNA T4 ligasa y formar el PLASMIDO RECOMBINANTE 
(DNA recombinante a clonar) 
 3 y 4. Transformación bacteriana y Amplificación: incorporo el plásmido 
recombinante en mi célula bacteriana. 
 Se incuba la bacteria con el plásmido recombinante y con un agente competente 
(pueden captar el plásmido) en un Medio de cultivo bacteriano (sales, AA, co-factores 
enzimáticos y ampicilina) 
Una vez transformada mi bacteria, en el medio de cultivo voy a tener muchas copias de 
la misma con por lo menos 1 plásmido cada una (el plásmido se replica a otro ritmo) 
La ampicilina me sirve para que solo crezcan las bacterias transformadas (incorporaron 
el plásmido). Las bacterias transformadas expresan la enzima que degrada el antibiótico 
mientras que las no transformadas no sobreviven 
Para saber si todas las transformadas incorporaron el plásmido se hace una extracción 
del plásmido recombinante y así poder usar el DNA clonado. 
 
 
Puedo guardar bacterias que contengan todas las secuencias del DNA en estudio (todo 
el genoma)→ BIBLIOTECA DE DNA GENÓMICO; o la información de toda la 
expresión del genoma de un organismo→ BIBLIOTECA DE cDNA 
 
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS 
Necesito la secuencia de la proteína que quiero producir, un VECTOR de EXPRESION 
(tiene la secuencia que me interesa) y un Sistema de Expresión 
Secuencia a producir = cDNA 
✓ Vector de Expresión: ORI, AMPR, Poliligador y PROMOTOR: en 
posición 5´-3´para favorecer la interacción de la RNA polimerasa con 
el DNA 
 
✓ Sistema de Expresión: sistema celular procarionte (bacterias) o 
eucarionte (cel de levaduras, mamíferos, insectos, gusanos, etc) 
El fragmento se incorpora en sentido 5´->3´en el vector y luego de la 
ligación, la RNA pol activa la transcripción y obtengo una gran 
cantidad de proteína que me interesa. 
 BACTERIAS COMO SISTEMA DE EXPRESION: favorezco la expresión de la 
proteína usando el promotor LAC-Z (estrategia) del operón lactosa (ver 16 y 17) 
Se usa el promotor del operón LAC al que se reemplazan los genes de la LAC-Z por el 
DNA de la proteína que quiero expresar 
Con este plásmido se transforman las bacterias las cuales se incuban en presencia 
lactosa o IPTG (no se degrada como la lactosa) 
Esto me permite copiar con alta eficiencia el cDNA, puedo obtener grandes cantidades 
de mi proteína. No producir glicoproteínas por ej 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 EUCARIONTES COMO SISTEMA DE EXPRESIÓN: 
 
• Transfección Transitoria o transiente: proceso por el cual introduzco un vector 
recombinante en una célula eucarionte que no se incorpora al genoma de la célula 
y se pierde luego de un tiempo 
Se usa para glucoproteínas por ej 
Sistema similar al de bacterias. 
El vector recombinante se introduce en células de mamíferos en cultivo (ver cultivo 
celular) mediante perturbaciones transitorias en la membrana plasmática. Una vez 
dentro de la célula el vector ingresa al núcleo donde es reconocido por la ARN pol, la 
cual lo transcribe y en el citoplasma lo traduce a la proteína que me interesa 
El PLASMIDO NO SE INCORPORA AL GENOMA: después de un tiempo se 
degrada el plásmido y tengo que volver a transfectar la célula (mucha fiaca) 
No todas las células incorporan al plásmido→Baja eficiencia 
 Para que sea más eficiente se cambia la ampicilina por Neomicina: antibiótico toxico,solo las que incorporen el vector en el genoma sobreviven (expresan la enzima que 
degrada el antibiótico) 
• Este método se conoce como Transfección estable/ transformación celular: la 
célula incorpora al genoma un nuevo gen que es heredable y permanente 
 
 VECTOR LANZADERA o SHUTTLE: se usa cuando quiero clonar 
y expresar un DNA usando solo 1 vector 
Gen de selección para transformación bacteriana 
 ORI + Poliligador 
 + 
clonación 
promotor fuerte y marcador de selección→ expresión 
 
ESTUDIO DE CELULAS 
GNES REPORTEROS: gen que da un producto detectable o medible que puede usarse 
indicador de funciones de proteínas (actividad o localización) o para saber si una 
transfección fue exitosa o no 
• Proteína Fluorescente (GFP*): puedo ver la localización de una proteína o 
procesos en CELEULAS VIVAS 
Se usa una proteína de fusión: se fusiona el ADN codificante de 2 proteínas para que se 
transcriban y traduzcan juntas dando 1 solo polipéptido con 2 dominios (el de mi 
proteína de interés y el de la proteína fluorescente) 
El cDNA lo inserto en un vector de expresión y tranfecto las células mediante 
transfección estable para que exprese mi proteína de fusión 
*Aplica a cualquier proteína fluorescente 
 
 
 
 
 
 
 
 
• Actividad de Luciferasa: Luciferasa= enzima 
Si se expresa puede convertir un sustrato incoloro en un sustrato fluorescente 
ER: (elemento de respuesta): Secuencia reguladora donde se unen factores de 
transcripción 
Se utiliza para estudiar la actividad de factores de transcripción. Si el factor se une al 
ER (activo) induce a que la ARN pol se una al promotor y transcríbala Luciferasa 
 
 
 
 
 
 
 
 
• GFP + actividad de Luciferasa: permite ver que célula se transfecto y si el 
factor de transcripción está activo o no. 
Cuando la Luciferasa se transcribe se ve fluorescencia porque está unida a la 
proteína fluorescente. Veo células fluorescentes y actividad o no de la Luciferasa 
(gráfico) 
Estudio de CÉLULAS VIVAS: donde se localizan y cómo actúan las proteínas las 
distintas moléculas que componen a la célula 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GMO 
(ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS) 
Pueden ser pluricelulares o unicelulares mediante la ADICION DE UN GEN o 
SILENCIANDO/DELECTANDO UN GEN 
ORGANISMO TRANGÉNICO: célula, planta o animal que incorporó de forma estarle 
(transfección estable) 1 o más genes de otro organismo y puede ser heredarlo. 
TANSGEN: DNA extraño que se agrega cuando creo un organismo transgénico (DNA 
que agrego al cultivo para que produzca la proteína que quiero) 
¿COMO ADICIONO UN GEN EN EL GENOMA? 
• Homologa: el gen debe recombinarse en el locus de un gen preexistente. 
Reemplazo 1 gen por otro 
 
• No homologa: el gen que quiero agregar se inserta en una región donde no 
moleste al resto, por ej en una región no codificante. 
 
El gen que quiero incorporar está dentro de un vector que se introduce en la célula y se 
incorpora al genoma por recombinación no homologa 
Junto con el gen agrego un primer regulable que me permite activarlo cuando quiera a 
través de drogas, estímulos, etc ya que no sé en que parte del ADN se va a unir mi gen 
 
❖ ANIMALES TRANSGENICOS: se microinyecta un plásmido de expresión en el 
núcleo de un ovocito fecundado. Algunos descendientes son transgénicos (10-30%) y 
otros no. 
Los animales transgénicos se usan para investigación nada más. 
❖ PLANTAS TRANSGENICAS: 
La adición de los genes le da ventajas (para el productor jaja): aumento de tamaño, 
resistencia a sequias o plagas, etc 
Obtención: 
Ej: uso un gen de una bacteria 
resistente a los insectos. Clono el 
gen (PCR o DNA 
recombinante), recubro 
partículas de oro o tungsteno con 
este vector y las coloco en balas 
de teflón dentro de una pistola 
que uso para dispararle a las 
células embrionarias de la 
planta. 
Las plantas son fácilmente 
transfectales y transformables. 
Una vez dentro del genoma, la 
planta se la hace crecer en un 
medio de selección y luego se 
plantan en la tierra. 
 
❖ TERAPIA GENICA: combatir tumores (leucemias, linfomas o mielomas) 
https://genotipia.com/genetica_medica_news/terapia-car-t/ 
 
❖ PRODUCCION FARMACEUTICA: Cultivos celulares en animales transgénicos 
y clonados como el tambo farmacéutico en el cual se buscaba obtener insulina 
humana a partir de la leche bovina. 
 
OBTENCION DE UN OGM MEDIANTE DELECCION O SILENCIAMIENTO DE 
UN GEN: 
Estudio la función del gen silenciado. 
Para esto puedo noquear el DNA de un OGM interrumpiendo la expresión de un gen; 
noquear el RNAm induciendo su degradación para evitar la expresión de la proteína o 
bien inhibiendo la función de la proteína con inhibidores farmacológicos. 
 
https://genotipia.com/genetica_medica_news/terapia-car-t/
 
Por recombinación homologa reemplazo el gen que quiero silenciar por una 
construcción interruptora que no tenga el gen. 
CONSTRUCCION INTERRUPTORA: cDNA que 
codifique una enzima que degrade antibiótico 
(neomicina) flanqueada por secuencias que se 
encuentran en los extremos del gen que quiero 
reemplazar + una secuencia de tirosina quinasa del 
virus de estomatitius humano 
Tirosina quinasa del virus de estomatitius humano 
(timidina cinasa/quinasa): añade un fosfato a un ganciclovir (estructura similar a la 
timidina) y produce su análogo de base (ganciclovir-P-P-P) que bloquea la síntesis de 
ADN. 
Introduzco la construcción en el vector de 
expresión para transformar células madres 
embrionarias de ratón mediante recombinación 
homologa (viven)→ degradan a la neomicina; o 
no homologa (mueren)→ degradan la neomicina 
pero proliferan ya que expresan la enzima que 
transforma el aciclovir. 
Con neomicina y aciclovir puedo seleccionar las 
células que fueron transformadas por 
recombinación homologa e inocularlas en un 
embrión temprano (blastocisto). Los hijos 
resultantes van a ser ENDIVIDUOS 
QUIMERA/MOSAICO (tienen células de 2 
orígenes distintos) que tienen genes mutados y 
genes que le cambia el color del pelaje (me 
permite saber cuales tienen las células que 
incorpore y cuales no) 
Ratón knock out; expresan el gen mutado en ambos alelos 
SILENCIAMIENTO DE UN GEN: una hebra de un microRNA separado por el RISC 
(Complejo Silenciador Inducido por RNA) se aparea con un RNA citoplasmático, lo 
degrada y ese producto no puede ser traducido o formar parte de un ribosoma 
Estos RNA se los conoce como RNA DE INTERFERENCIA y se pueden diseñar para 
degradar algún RNA específico del citoplasma celular. 
Saber el proceso fisiológico (ver teórica 16 y 17) 
MODIFICACION/EDICION DEL GENOMA: 
CAS 9: enzima que reconoce y degrada secuencias específicas de DNA 
Con la CAS9 saco el gen defectuoso y mediante técnicas incorporo el gen correcto. Esto 
se debe hacer en la etapa embrionaria temprana (cuando hay más replicación) usando 
CRISPR-CAS