DNA recombinante resumen

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Técnicas para el estudio de las células: ácidos nucleicos y DNA 
recombinante 
Si al DNA desnaturalizado se le agregan pequeñas moléculas complementarias de 
desoxirribonucleótidos, estas podrán interaccionar con las hebras monocatenarias de DNA por 
complementariedad de bases, esta interacción se llama hibridación. 
Cualquier molécula de DNA obtenida “in vitro” por combinación de fragmentos de DNA de 
distinto origen se denomina DNA recombinante. 
Para extraer los fragmentos de DNA a utilizar debo utilizar como “tijeras” a enzimas de 
restricción que son endonucleasas ya que cortan el DNA en su interior. Estas enzimas son de 
origen bacteriano, las bacterias las utilizan por ejemplo para degradar DNA viral, y para que no 
degrade su propio DNA, se metilan los sitios de corte propios para inhibir la acción de las 
enzimas. 
Las enzimas de restricción reconocen secuencias palindrómicas, es decir, aquellas que son 
identicas al leerlas en dirección 5’ a 3’, y se denominan sitios de restricción por ser de donde las 
enzimas cortan. 
Cada enzima reconoce un sitio de restricción específico: 
 
 
HaeIII hace un corte lineal 
generando extremos romos (sin 
ningún tipo de saliencia) 
EcoRI y HindIII hacen cortes 
en forma escalonada, 
generando extremos 
escalonados, cohesivos, 
pegajosos ó “sticky ends” 
que se podrían unir por 
complementariedad de bases 
Entonces, el DNA recombinante se obtiene a partir de ADN de distintos orígenes y para unir 
estos extremos, deben ser cohesivos complementarios. Para ello, deben ser cortados con la 
misma enzima de restricción. Además, si no se forma la unión covalente, por mas que tenga las 
bases complementarias no se puede formar el DNA recombinante, de esto se encarga la ligasa, 
que facilita el enlace covalente entre el grupo fosfato de una base y el OH de otra, y 
generalmente se la denomina DNA T4 ligasa. Ejemplo de todo este proceso: 
 
Elijo el DNA2 digerido con E1 (a) ya que es el que 
tiene extremos cohesivos complementarios con el 
DNA1. 
 
 
 
 
 
 
El ensayo de DNA recombinante se realiza por ejemplo, en un tubo Eppendorf, en este obtendré 
tanto DNA1, como DNA2 y DNA recombinante, para obtener solo el DNA recombinante, debo 
separarlo del resto con una electroforesis en gel de agarosa. 
En la electroforesis en gel de agarosa, los 
ácidos nucleicos ya tienen carga negativa, por 
lo que no hará falta cargarlos para que se 
separen según su tamaño (pares de bases), las 
mas livianas, mas cercanas al polo positivo, y 
las mas pesadas mas alejadas. Para visualizar 
las bandas se utiliza bromuro de etidio, que se 
intercala en las moléculas de DNA y fluórese 
cuando se lo irradia con rayos UV en los sitios 
donde haya DNA. 
 
¿Cómo distingo cual es cada banda? (dos formas posibles) 
• Hibridación: una sonda (o probe) pequeña con su secuencia complementaria al gen que 
quiero encontrar, se pone en contacto con el DNA desnaturalizado interactuando con 
una secuencia complementaria. 
Luego de la electroforesis, el gel se pone en contacto con un papel de filtro, por ejemplo, 
nitrocelulosa, para pasar los fragmentos del gel a la membrana. Luego, se la pone en 
contacto con la sonda, si esta presente el DNA que busco, obtendré una banda. Para 
revelar la banda se debe marcar la sonda con un fosfato radiactivo ó introducir alguno 
de los nucleótidos unido a un fluorocromo. Con este método, separo el DNA por 
Southern Blot ó el RNA por Northern Blot. 
Para reconocer una secuencia de gen dentro de una célula ó preparado puedo usar la 
técnica de FISH: Fluorescence in situ hybridization. 
 
a. Sondas (rojo), muestra en el portaobjetos (azul). 
 
b. La sonda puede tener una pequeña molécula 
receptora de fluorocromo (cuadro verde) ó estar 
directamente marcada con fluorocromo (cuadro 
amarillo). 
c. Hebras desnaturalizadas (por calor). 
 
d. Se juntan las sondas con la muestra y se 
desnaturaliza, hibridándose sondas con el DNA. La 
sonda marcada con fluorocromo fluórese. 
e. La sonda que tiene una molécula receptora se 
une al fluorocromo y fluórese. 
La fluorescencia se detecta con microscopía de fluorescencia. Esta técnica también se 
puede utilizar para obtener un cariotipo ordenado por los colores de las sondas. 
Para el RNA se podría usar sondas de DNA para detectar si una secuencia se transcribió: 
el RNA transcripto será complementario a la sonda marcada y entonces podré observar 
la presencia y cantidad de RNA por FISH. 
• Secuenciación: este proceso permite corroborar toda la secuencia de nucleótidos 
(larga). Se puede hacer por 3 métodos: Método de Sanger/Sanger automatizado, 
métodos avanzados de secuenciación y NEXT generation sequencing (NGS). 
El método de Sanger, método de terminación de la cadena ó método desoxirribosa se 
basa en la síntesis de la cadena complementaria, y en base a los nucleótidos que van 
entrando, determinar la secuencia. Para esto Sanger diseñó un nucleótido didesoxi: le 
falta un OH en el carbono 3, lo que evita la elongación de la cadena al no poder 
producirse el enlace fosfodiéster. Así la síntesis se corta en el nucleótido defectuoso, 
que si lo puedo visualizar, sabré en que posición entra. 
Así la experiencia de Sanger fue: Elementos colocados en cada 
tubo Eppendorf: DNA molde, 
cebador, DNA polimerasa, 
nucleótidos y un tipo de 
didesoxirribonucleótido para cada 
tubo 
La síntesis se detendrá cuando se 
agregue un nucleótido defectuoso 
En una electroforesis en gel de 
agarosa, separo la mezcla de 
reacción y puedo ver de abajo 
hacia arriba el orden de los 
nucleótidos. 
La clonación 
Clonar una molécula de DNA sirve para obtener grandes cantidades de la misma secuencia y así 
poder analizarla (para un posterior diagnóstico), para estudiar los genes, obtener proteínas 
recombinantes u organismos genéticamente modificados. 
El DNA se puede clonar por dos métodos: reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ó por 
tecnología de DNA recombinante. 
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
Se basa en la desnaturalización de la doble cadena en dos simples cadenas a 95 °C, luego en un 
segundo paso la hibridación de cebadores (o primers) a 60 °C (ya que a menos de 60 °C se 
podrían hibridar otras cosas además de los primers) y una vez ubicados los primers en la cadena, 
la elongación de la cadena a partir de una DNA polimerasa particular: la Taq polimerasa, 
obtenida de bacterias extremófilas que soportaran el calor que la DNA polimerasa corriente de 
los mamíferos no podría por las condiciones homeostáticas. Este último paso se realiza a 72 °C. 
 
 
Estos tres pasos constituyen un ciclo, para obtener una 
buena cantidad de DNA clonado se necesitan entre 20 a 30 
ciclos. 
 
 
Para clonar a partir de una muestra (higado… cultivos… sangre… etc…) se debe extraer el DNA, 
diseñar primers que flanqueen la región codificante, colocar en el tubo todos los reactivos 
necesarios (DNA, nucleótidos, Taq polimerasa, primers, buffer con Mg++) e introducirlo en el 
termociclador, donde se realizará la amplificación por PCR de la que luego podremos separar las 
cadenas de interes con una separación por geles de agarosa y opcionalmente tambien 
identificarlas por secuenciación o Southern Blot. 
PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa (audio latino) https://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU 
Cantidad de DNA a los 30 ciclos 
https://www.youtube.com/watch?v=Kuy4PDb6bdU
Electroforesis de ADN en gel de agarosa (IQOG-CSIC) https://www.youtube.com/watch?v=NL1usCc0n38&feature=youtu.be 
Purifying DNA from an Agarose Gel https://www.youtube.com/watch?v=YC-75aUSf2M&feature=youtu.be 
NO se puede clonar RNA, para obtener gran cantidad, debo transformar RNA en su DNA 
complementario (no posee los intrones, es solo el producto de expresión de un gen) y luego 
podré amplificar ese DNA. Este proceso es la RT-PCR, en el que antecediendo la PCR, sucede una 
retrotranscripción. 
La retrotranscripción tambiéncomienza 
con la síntesis de primers de acuerdo al 
RNA a utilizar, si es mRNA y teniendo en 
cuenta que tienen una cola de poli-A en el 
extremo 3’, se puede utilizar un cebador 
poli-T, llamado habitualmente Oligodt. 
Luego, la enzima transcriptasa inversa 
copia una cadena complementaria de 
cDNA (DNA complementario) y se 
degrada el RNA con RNasa H, aunque 
dejando un fragmento de RNA que 
actuará como cebador para realizar ahora 
si la PCR con la que obtendré clones de 
cDNA que luego por transcripción se 
pueden convertir en RNA. 
 
El diagnóstico por PCR se realiza viendo el producto de expresión de un gen y comparándolo con 
un control. La PCR es una técnica NO cuantitativa, solo permite saber si hay o no determinado 
DNA ó RNA. Para cuantificar se debe realizar una PCR cuantitativa, (qPCR ó RT-qPCR, si primero 
se realiza una retrotranscripción) en la que se agrega a todos los elementos en el termociclador 
una sonda con marcador fluorescente, que se va a unir a la molécula a amplificar y va a fluorescer 
cuando el marcador sea liberado al pasar la Taq polimerasa durante la síntesis, y la fluorescencia 
se medirá en una curva para cuantificarse. 
 
Coronavirus Test: Real time RT-PCR - Animation video https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4&feature=emb_logo 
https://www.youtube.com/watch?v=NL1usCc0n38&feature=youtu.be
https://www.youtube.com/watch?v=YC-75aUSf2M&feature=youtu.be
https://www.youtube.com/watch?v=ThG_02miq-4&feature=emb_logo
La PCR se pude utilizar para diagnóstico de filiación, teniendo en cuenta que cada individuo tiene 
DNA microsatélite que está compuesto por repeticiones de secuencias cortas y que es 
característico de cada uno. Entonces un hijo tiene un alelo con el número de repeticiones del 
padre y uno con el número de repeticiones de la madre, que luego de una PCR podré ver por 
electroforesis en gel de agarosa en bandas. 
Tecnología de DNA recombinante 
Un vector es una molécula de DNA de doble cadena con capacidad de albergar un fragmento de 
DNA exógeno (de otro origen). Un vector de clonación es una molécula de DNA capaz de 
albergar al DNA a clonar, unido al mismo por la DNA T4 ligasa. 
Hay diferentes tipos de vectores de clonación, los plasmídicos (con su estructura que deriva de 
plásmidos bacterianos, que tienen DNA circular y de doble cadena, extracromosómicos, que 
replican en forma independiente al cromosoma, y pueden ser transferidos de una célula a otra 
y permiten clonar fragmentos de DNA hasta 30.000 pb), los YAC (que son cromosomas 
artificiales de levadura, que permiten clonar fragmentos de DNA entre 100 a 400.000 pb) y los 
BAC (cromosomas artificiales bacterianos, que derivan del plásmido F bacteriano y permiten 
clonar fragmentos de DNA entre 100 a 400.000 pb). Nos concentraremos en los vectores de 
clonación plasmídicos. 
Un vector plasmídico consta de 3 secuencias principales: 
➢ ORI: origen de replicación. 
➢ Secuencia poliligador, policonector ó polylinker: Sucesión de sitios de restricción para 
diferentes tipos de enzima, que permiten seleccionar con que enzima voy a cortar el 
vector y el DNA a clonar para generar en ambos extremos cohesivos. 
➢ Secuencia de selección: Codifica la expresión de una enzima capaz de degradar el 
antibiótico que se va a encontrar en el medio de incubación. 
Clonar DNA a través de tecnología de DNA recombinante: 
1- Obtención del DNA a clonar (por cortes de genoma, PCR, ó cDNA por RT-PCR) y el vector 
plasmídico de clonación, también obtener enzimas que permitan cortar las cadenas para 
generar extremos cohesivos. Luego se incuba la mezcla con DNA T4 ligasa para generar las 
uniones covalentes entre los extremos que serán apareados por complementariedad de 
bases. 
2- Transformación bacteriana: se introduce el plásmido recombinante dentro de bacterias para 
que estas cuando se dupliquen, dupliquen el plásmido introducido. Generalmente se utilizan 
cultivos de Escherichia coli. 
Se incuban las bacterias con un agente que induzca competencia (significa que las bacterias 
están en condiciones de captar el plásmido con el que se incuba) y en presencia de los 
plásmidos recombinantes. Una vez que las bacterias captan a los plásmidos recombinantes, 
tengo que incubar a las bacterias transformadas en un medio de cultivo adecuado: con sales, 
aminoácidos, cofactores enzimáticos y un antibiótico: generalmente ampicilina. 
Una vez que la bacteria se divide, se divirá el plásmido que contiene, aunque los plásmidos 
también pueden dividirse independientemente de la división del cromosoma bacteriano. 
Con la presencia de ampicilina solo crecerán las bacterias que hayan incorporado el 
plásmido. 
Una vez que termina la incubación, se toma una alícuota y se siembra en una placa con 
agar+ampicilina para obtener colonias de bacterias transformadas, que se podrán conservar 
por mucho tiempo. 
A partir de las bacterias transformadas, se extrae el plásmido recombinante para obtener el 
DNA clonado. 
 
Puedo obtener DNA genómico y cortarlo con enzimas de restricción e incorporar los 
fragmentos en vectores plasmídicos para obtener plásmidos recombinantes. Si los 
plásmidos se incuban con todo el genoma del organismo, los plasmidos tendrán toda esta 
información. Al transformar las bacterias y obtener las placas de colonias, obtendremos 
plasmidos recombinantes con todo el genoma del organismo, que denominaremos 
biblioteca de DNA genómico. 
Puedo obtener todo el RNA contenido en una muestra y por retrotranscripción obtener 
cDNA e incorporar los fragmentos en vectores plasmídicos para obtener plásmidos 
recombinantes. Los plásmidos tendrán toda la información que se expresaba en la muestra 
al momento de extraer en el RNA. Al transformar las bacterias y obtener las placas de 
colonias, obtendremos plasmidos recombinantes con todo el cDNA de el RNA expresado, 
que denominaremos biblioteca de cDNA. 
 
Producción de proteínas 
Para producir proteínas necesito: 
1- La secuencia de DNA de la proteína que quiero expresar. 
2- Un vector de expresión que tendrá los mismo de elementos que el vector de clonación, 
además de un promotor que favorecerá la interacción con el DNA de la RNA polimerasa, y 
estará ubicado corriente arriba de la secuencia de la proteína a expresar. 
3- Sistema de expresión: un sistema celular procarionte ó eucarionte 
El fragmento de DNA que contiene la secuencia de la proteína va a ser incorporado dentro del 
vector en la dirección correcta (5’ a 3’) y una vez que se ligue, la RNA polimerasa interaccionará 
con el promotor para activar la transcripción del DNA que introduje en el vector de expresión. 
Así, si tengo una transcripción contínua obtendré RNA correspondiente a la proteína, ese RNA 
sobreexpresado que antes en el sistema no se expresaba es traducido a proteína y obtendré una 
gran cantidad de la proteína. 
Utilizando como sistemas de expresión células procariontes, podemos favorecer la producción 
de la proteína utilizando como estrategia el promotor del operón lactosa. Se realiza una 
construcción que tiene el promotor del operón lactosa y se reemplaza la zona de los genes lac Z 
(los genes a transcribir) por el DNA de la proteína que quiero expresar. Una vez realizada la 
construcción, el plásmido recombinante tendrá el DNA bajo el control del promotor lac Z, y se 
incubarán a las bacterias transformadas en presencia de lactosa o IPTG (que inducen la 
liberación de la zona operador-promotor para poder promover la transcripción). Así se pueden 
obtener grandes cantidades de proteínas a expresar que deseo. 
Las glucoproteínas son mas complejas, y no se podrán producir dentro de una bacteria ya que 
no poseen las endomembranas para su glucosilación, secreción y síntesis. 
Utilizando como sistemas de expresión células eucariontes, el vector será introducido en células 
eucariontes en cultivo mediante generación de perturbaciones transitorias en la membrana 
plasmática (electroporación,transfección viral, mezclas lipídicas o microinyección nuclear). Una 
vez ingresado en la célula, el plásmido debe ingresar en el núcleo celular y una vez allí el 
plásmido recombinante será suceptible de que el promotor sea reconocido por una RNA 
polimerasa que va a transcribir y luego ese RNA va a ser transportado al citoplasma y se traducirá 
la proteína de interés. 
El vector de expresión alcanza el compartimiento nuclear pero no se incorpora en el genoma. 
No todas las células incorporan el plásmido recombinante, después de un tiempo la célula se 
deshace del plásmido degradándolo, y si quiero expresar la proteína, debo transfectar de nuevo 
la célula (transfección= es transitoria, el DNA no se incorpora al genoma). 
Por esto, se desarrolló un sistema mas eficiente: utilizando neomicina (ó G418) como 
antibiótico, que es mas fuerte. Así se logra una transfección estable o transformación celular: el 
genoma de la célula ha sido transformado y es heredable, por lo que voy a poder expresar la 
proteína de manera constante. 
Vector lanzadera o shuttle 
Este vector permite clonar y expresar mediante un solo vector, al tener los elementos necesarios 
para la clonación y los necesarios para la expresión. 
Sistemas de genes reporteros 
Un gen reportero es un gen cuyo producto es facilmente detectable o medible y por lo tanto 
puede utilizarse como indicador de alguna función (actividad o localización) de una proteína 
celular o como indicador de si una transfección fue exitosa. 
Una proteína de fusión ó proteína quimérica implica que dos proteínas se transcriban y 
traduzcan unidas, para ello debo fusionar el DNA codificante de cada una de las proteínas. 
1- Proteínas fluorescentes verde, roja, etc: serán proteínas de fusión que permiten estudiar la 
localizacion o actividad de una proteína celular (a la que están unidas) sin fijación. 
2- Actividad de luciferasa: enzima que reporta alguna actividad de la proteína. Cuando se 
transfecta con la construcción si la luciferasa se expresa, es capaz de convertir un sustrato 
incoloro en uno fluorescente. 
La construcción esta compuesta por una enzima luciferasa, un promotor y un elemento de 
respuesta, al que se le unirán los factores de transcripción. Por esto servirá la luciferasa, 
para estudiar la actividad de factores de transcripción. 
Cuando estos factores se unan al elemento de respuesta, se induce a que la RNA polimerasa 
se una al promotor y se transcriba la luciferasa convirtiendo al sustrato en luminiscente. 
Entonces la luminiscencia quiere decir que se transcribió porque el factor de transcipción se 
unió al elemento de respuesta. 
Las proteínas fluorescentes y la luciferasa pueden estar presentes en la misma construcción 
permitiendo ver que célula se transfectó (de color de la proteína fluorescente) y medir la 
actividad de luciferasa para ver si el factor de transcripción está activo.