18avo teo TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LAS CELULAS 1

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SI SE TIENE ADN BICATENARIO → se le aplica calor → a medida que aumente la energía 
calórica se irá desnaturalizando ya que se desestabilizan las uniones PdH que mantienen a 
las dos hebras complementarias unidas. En la medida que se van separando las dos 
cadenas que forman la molécula de ADN → se van exponiendo las bases, que absorben 
luz a 260nm. 
A medida que aumenta la temperatura → las moléculas de ADN 
se van separando, se van exponiendo las bases, comienzan a 
absorber a 260nm → y llega un momento, a temperaturas muy 
altos, donde las dos hebras se separan y la absorbancia 
aumenta rápidamente. Cuando se llega a los 85-90 grados → se 
tiene a las dos hebras completamente separadas y la máxima 
absorción. 
SI LUEGO SE DISMINUYE LA TEMPERATURA → las dos cadenas de ADN monocatenario pueden 
volver a interaccionar por complementariedad de bases → y formar el ADN 
renaturalizado. 
 
SI SE TIENE ADN BICATENARIO NATIVO Y SE LO DESNATURALIZA → y luego se pone en contacto 
con este ADN monocatenario desnaturalizado, pequeñas moléculas formadas por 
desoxirribonucleótidos con secuencias complementarias a secuencias presentes en el 
ADN → cuando se baje la temperatura, esas pequeñas secuencias de ADN 
complementarias podrían interaccionar por complementariedad con secuencias del ADN 
desnaturalizado → esta interacción se denomina HIBRIDACIÓN. Si a esa pequeña molécula 
de ADN se le hubiese agregado alguna molécula marcadora → podría ser una forma de 
detectar una secuencia en un ADN desconocido. 
 
18° T E O R I C O 
ADN RECOMBINANTE 
El ADN recombinante ES CUALQUIER MOLÉCULA DE ADN QUE FUE OBTENIDA IN VITRO POR LA 
COMBINACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN QUE TIENE DISTINTO ORIGEN → un ADN que proviene de 
un organismo y un ADN que proviene de otro organismo o de síntesis. 
Lo que permite unir el ADN de distintos orígenes serán los 
ENLACES COVALENTES. La molécula resultante de la unión de los 
dos ADN es lo que se llama ADN recombinante. 
Para obtener estos fragmentos de ADN de distintos orígenes 
→ se necesita extraer estos fragmentos de alguna fuente → 
generalmente es el genoma del algún organismo → a través 
de enzimas de restricción. 
 
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ENDONUCLEASAS) 
Las enzimas de restricción son enzimas capaces de cortar el ADN en el interior de la 
molécula → no comienzan cortando al ADN por sus extremos, sino que es escindido en el 
interior de la molécula → por eso se las denomina ENDONUCLEASAS. 
Las enzimas de restricción son de ORIGEN BACTERIANO → las bacterias poseen estas enzimas 
ya que permiten degradar el ADN de aquellos virus capaces de infectar a las bacterias 
(BACTERIÓFAGOS) → van a degradar el ADN viral que esté tratando de infectar a las 
bacterias. Debido a esto se las llama enzimas de restricción → restringen el ingreso del 
ADN viral al citosol de la bacteria. 
¿Cómo hace la bacteria para evitar que estas 
enzimas degraden su propio ADN? Esta enzima, 
además puede modificar el ADN introduciendo 
un metilo dentro de los propios sitios de corte en 
su ADN → al metilar los sitios de corte de la 
enzima en su propio ADN → evita que la enzima lo corte → ya que la enzima reconocerá 
la presencia del metilo y esto evitará que actúe. 
Estas enzimas se caracterizan por reconocer secuencias específicas que contienen entre 4 
y 8 pares de bases y se denominan SECUENCIAS PALINDRÓMICAS → quiere decir que las 
secuencias son idénticas cuando se as lee en dirección 5’ → 3’. 
SITIO DE RESTRICCIÓN → es una secuencia palindrómica a donde cortará la enzima de 
restricción → cada enzima de restricción reconoce un sitio de restricción específico. 
 
Estas enzimas van a cortar en sitios de restricción → los cuales son secuencias 
palindrómicas que se leen de misma manera si se las lee de 5’ → 3’. 
 
Por ejemplo → se le GGCC en 5’ → 3’ en la hebra superior; y también se lee GGCG en 
dirección 5’ → 3’ en la hebra inferior. 
CADA ENCIMA DE RESTRICCIÓN VA A RECONOCER UNA SECUENCIA ESPECÍFICA → esto es 
coincidente con la propiedad de especificidad que tienen las enzimas, en particular en 
base a la forma de su sitio activo → la primer secuencia palindrómica será reconocida por 
una enzima llamada HAE III → cortará las dos hebras de manera lineal entre las uniones 
que unen a G con C → este tipo de corte se denomina CORTE LINEAL y se generan dos 
extremos denominados ROMOS → que no tienen ningún tipo de saliencia. 
 
Pero puede ocurrir que la enzima no corte de forma lineal a la molécula de ADN → sino 
que realice un CORTE ESCALONADO. Como consecuencia de la acción de esta enzima que 
es la EcoRl en la molécula de arriba y la Hind III en la inferior → se obtienen fragmentos de 
ADN que tendrán extremos escalonados o extremos cohesivos (ya que si se los pusiera 
juntos interaccionarían por complementariedad de bases). 
 
Para obtener ADN recombinante → se necesita 
ADN de distintos orígenes → ADN 1 y ADN2 en el 
esquema. 
El ADN 1 fue obtenido con la enzima de 
restricción uno y el ADN2 mediante la E1, E2 y E3. 
La condición para unir el fragmento de ADN1 
con el ADN2 es que tengan los MISMOS EXTREMOS 
COHESIVOS → por lo tanto, si se quiere unir dos 
ADN de distintos organismos, se debe tratar de 
cortarlos con la misma enzima de restricción → 
en el ejemplo, se debe unir el ADN1 con el 
fragmento de ADN2 obtenido con la E1 que 
genera el mismo extremo cohesivo. 
Entonces → el ADN1 interaccionará con el ADN2 
(a) → las bases complementarias 
interaccionaran a través de los extremos cohesivos por complementariedad de bases; sin 
embargo → A PESAR DE QUE LAS BASES INTERACCIONEN, SI NO SE FORMA LA UNIÓN COVALENTE, 
NO SE TENDRÁ EL FRAGMENTO DE ADN RECOMBINANTE. Para que se forme la unión covalente 
entre el OH de una base y el fosfato de la otra → se necesita una enzima llamada ADN T4 
LIGASA → generará la condensación, la liberación de agua, y la unión covalente entre las 
bases que se forman después de la interacción de los extremos cohesivos. 
SI TENGO LA UNIÓN DENTRO DE UN TUBO DE ENSAYO → se 
tendrá el ADN1 y los distintos fragmentos del ADN2 (el 
ADN1 solo interaccionará con el fragmento a del ADN2) y 
el fragmento recombinado → todo mezclado. Pero 
únicamente se quiere obtener el ADN recombinante que 
contiene a los fragmentos unidos covalentemente → se lo 
debe separar del resto de las moléculas que se tiene en 
la fracción → SE REALIZA UNA ELECTROFORESIS EN GEL DE 
AGAROSA → la agarosa es un polímero que deja un 
determinado tamaño de poro → SE SIEMBRA EN UN 
POCILLO LA MEZCLA DEL TUBO Y SE APLICA UN CAMPO 
ELÉCTRICO → en este caso, no se necesita el agregado de 
SDS ya que las MOLÉCULAS ESTÁN CARGADAS 
NEGATIVAMENTE YA QUE PROVIENEN DE ÁCIDOS NUCLEICOS → 
se van a separar de acuerdo a su tamaño y al tamaño del poro → cuando se agrega el 
campo eléctrico, las moléculas más pequeñas van a correr más rápidamente hacia el 
polo positivo; mientras que las moléculas más grandes van a correr más lentamente y 
quedarán más cercanas del polo negativo. 
El ADN no tiene color → se debe realizar una técnica para visualizar las 
bandas en el gel de agarosa → se utiliza alguna sustancia capaz de 
intercalarse en las moléculas de ADN → una delas más conocidas es el 
BROMURO DE ETIDIO → ya que tiene la particularidad de que cuando se lo 
irradia con luz UV es fluorescente → en la parte del gel donde no hay 
ADN, y por lo tanto el bromuro de etidio no se intercaló → el gel no va a 
fluorescer; mientras que en la parte del gel donde hay ADN con bromuro 
de etidio intercalado → se observará fluorescencia. 
Sin embargo → simplemente visualizando las bandas no se puede saber cuáles 
corresponden al ADN1 y cuales al ADN2 → podría ser cualquiera de ellas → se debe tratar 
de identificar la secuencia de interés sobre el gel → para ello, hay dos posibilidades: 
 A TRAVÉS DE LA HIBRIDACIÓN 
 A TRAVÉS DE LA SECUENCIACIÓN 
 
HIBRIDACIÓN 
La hibridación significa que se tieneun fragmento pequeño de desoxirribonucleótidos (al 
cual se denomina SONDA o “PROBE”) → este pequeño fragmento debe tener una 
secuencia complementaria al ADN que se desea encontrar. 
Esta secuencia SONDA ES ALTAMENTE ESPECÍFICA → solamente interaccionará cuando todos 
sus nucleótidos reconozcan a sus nucleótidos complementarios en el ADN o ARN 
desnaturalizado. 
Entonces → se tiene el tubo que 
contiene el ADN1, los distintos 
fragmentos del ADN2 y el ADN 
recombinado → se desea separar al 
ADN recombinante e identificarlo. 
Se aplica el gel de agarosa, se aplica 
el campo eléctrico, se desarrolla la 
electroforesis → y luego, al gel se lo 
pone en contacto con una 
membrana para que los fragmentos 
de ADN pasen del gel a la membrana 
→ se debe poner un peso en medio 
alcalino → y el ADN es rápidamente transferido del gel de agarosa a la membrana. 
Una vez que se tiene la membrana → todas las bandas de ADN que se tenía en la 
electroforesis ahora están en la membrana → sobre la membrana se puede realizar una 
REACCIÓN DE DETERMINACIÓN ESPECÍFICA PARA EVALUAR LA PRESENCIA DEL ARN O DEL ADN EN 
ESTUDIO. 
SE PONE A LA MEMBRANA EN CONTACTO CON UNA SOLUCIÓN QUE CONTENGA LA SONDA O PROBE 
→ si en la membrana está presente el ADN que se busca, la sonda interaccionará con él y 
se podrá identificar la banda. Si en la membrana no está presente el ADN que se busca → 
la sonda o probe no reconocerá ni se unirá a nada y no se obtendrá ninguna banda. 
En el ejemplo → se tiene una membrana con 3 bandas → se pone una sonda de ADN que 
debería hibridar con la banda del medio → que es lo que se observa cuando se revela la 
interacción. 
PARA PODER VISUALIZAR LA BANDA SE DEBE INTRODUCIR A LA SONDA UN FOSFATO RADIOACTIVO, 
ALGUNO DE LOS NUCLEÓTIDOS CON UN FLUOROCROMO. 
POR ESTA METODOLOGÍA SE PUEDEN SEPARAR TANTO MEZCLAS DE ARN COMO DE ADN. 
 Cuando la mezcla de ADN es revelada con las sondas correspondientes → el resultado 
del ensayo se denomina SOUTHERN BLOT. 
 Cuando la mezcla de ARN es revelada con las sondas correspondientes → el resultado 
del ensayo se denomina NORTHERN BLOT. 
Así se observaría un Southern blot revelado con sondas que 
estaban marcadas con fosforo radioactivo. En esta corrida 
electroforética en gel de agarosa se separaron los genomas de 3 
parásitos; siendo este genoma cortado por 3 enzimas de 
restricción diferentes. 
En las perneras 3 calles tengo los 3 genomas cortados por la 
misma enzima y lo mismo en las calles siguientes → cortado con 
las diferentes enzimas. 
Se observan solo aquellas bandas que hibridan perfectamente 
con las sondas que se puso en el medio de reacción. 
El southern blot permite ver que los genomas pueden ser cortados de manera diferente 
con cada una de las enzimas de restricción → y generan fragmentos diferentes con cada 
una de ellas. 
OTRO EJEMPLO → la secuencia de ADN que se 
desea identificar no se encuentra en un tubo 
Ependdorf → se desea reconocer un ADN dentro 
de la célula → se desea reconocer una 
secuencia de un gen dentro del núcleo. 
Derecha → hay un portaobjetos y sobre él está 
fijado la muestra con el ÁCIDO NUCLEICO A 
ANALIZAR → el ADN dentro de la muestra estará 
en estado nativo → se somete a la muestra a 
calor para desnaturalizar el ADN y separar las 
hebras. 
Por otro lado se tiene a la SONDA (en rojo) → son 
pequeños fragmentos de ADN que pueden tener unidas un fluorocromo o una pequeña 
molécula que se pueda revelar posteriormente. Se debe desnaturalizar a la sonda para 
obtenerlas en forma monocatenaria y luego → se pone en contacto la sonda 
desnaturalizada con el ADN desnaturalizado → si el ADN que se busca y para el cual se 
diseñó la sonda, se encuentra presente en la muestra → SE OBTIENE A TRAVÉS DE HIBRIDACIÓN 
LA INTERACCIÓN DE LA SONDA CON EL ADN BUSCADO → Y SI LA SONDA TENIA UN FLUORESCENTE 
PODRÉ DETECTARLA CON EL MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA. Este tipo de ensayo muy utilizado 
en la clínica se denomina FISH → permite diagnosticar la presencia de estructuras 
anormales dentro de los genomas u obtener un cariotipo y ordenarlo de acuerdo a los 
colores de las sondas que se diseñó para cada par de cromosoma (se diseña una sonda 
específica para cada par de cromosomas, unidos a fluorocromos de distintos colores con 
el fin de luego poder separarlos y agruparlos). 
Por esta técnica también se puede detectar el ARN. Utilizando 
una sonda de ADN dirigida contra una determinada 
secuencia → se puede detectar si en un núcleo celular se 
transcribió un determinado gen → si un determinado gen se transcribió, se obtiene el 
producto de expresión inmaduro y maduro que será el ARN → molécula complementaria 
del ADN → se debe diseñar una sonda marcada que posea la secuencia complementaria 
a ese ARN. 
Entonces → en la hibridación se utiliza un probe o sonda de una corta secuencia de 
nucleótidos → nucleótidos que se sepa que están presentes en la secuencia a evidenciar 
para con esa sonda marcada poder detectar la secuencia de ADN o ARN buscada 
mediante fluorescencia o radioactividad → ya sea en una corrida electroforética o en un 
preparado sobre un portaobjetos. 
SECUENCIACIÓN 
Es la otra manera de realizar la identificación → se utiliza para corroborar, por ejemplo, 
una secuencia de 1000 pares de bases es la que se busca → ya que no serviría de nada 
utilizar una sonda, que posee como mucho 50 pares de bases → con ella solo podría 
identificar un pedazo de secuencia, y seria ineficiente para una cadena tan larga ya que 
podría contener anomalías o mutaciones en los nucleótidos no reconocidos por las sonda 
y por lo tanto, no las detectaría. 
En estos casos → SE DEBE TOMAR TODA LA SECUENCIA Y SECUENCIARLA → o sea, saber 
exactamente cuál es la secuencia de nucleótidos que hay en esa cadena de mil pares 
de bases. Existen varios métodos para obtener la secuencia de ADN: 
 Métodos básicos de secuenciación → métodos de Sanger. 
 Métodos avanzados de secuenciación. 
 NEXT generation sequencing (NGS) → illumina. 
MÉTODO DE SANGER 
Es también conocido como método de determinación de la cadena o método de la 
didesoxirribosa. 
Sanger diseñó un NUCLEÓTIDO CARACTERIZADO 
POR SER DIDESOXI → es decir, que no tenía un 
OH en la posición 3’ → sin el OH en esta 
posición, la cadena no podrá seguir 
sintetizándose → con lo cual, la SÍNTESIS SE 
CORTA EN DONDE ENTRA EL NUCLEÓTIDO 
DIDESOXI. 
Y si además → se puede visualizar al 
nucleótido defectuoso de alguna manera → se puede saber en esa posición de la 
cadena molde, que nucleótido entró y se podrá comenzar con la secuencia. 
 
Se tiene 4 TUBOS EPENDDORF → en los 4 tubos se 
pone la misma mezcla → ADN desnaturalizado, 
un cebador, la ADNpol y los 4 nucleótidos. Sin 
embargo → en un tubo pongo DIDESOXI ATP (el 
rojo); en el amarillo DIDESOXI TTP; en el violeta 
DIDESOXI CTP y en el verde DIDESOXI GTP. 
Cuando se comiencen a sintetizar las cadenas 
complementarias y a la síntesis entre cada uno 
de los nucleótidos defectuosos → se detendrá 
la síntesis. Como el nucleótido defectuoso 
podrá ser visualizado de alguna manera → 
luego de separar la mezcla de reacción en gel 
de agarosa se podrá identificar el tamaño de 
la cadena sintetizada en cada uno de los 
tubos → y en base al tamaño de la cadena 
sintetizada se podrá deducir la secuencia del fragmento de ADN que se tenía. 
En el tubo rojo → se tiene ddATP, si el ATP entra en la primera base que tiene que sintetizar 
se corta la síntesis → y cuando se intente separar esa mezcla de reacción en el gel de 
agarosa → ese fragmento con la primera adenina alterada correrá al frente del gel de 
agarosa, luego correrá el segundo fragmento y luego el tercero. Lo mismo ocurrirá con las 
mezclas que tienen CTP, TTP y GTP → Y SE PODRÁ IR DEDUCIENDO EN BASE A QUIEN CORRIÓ MÁS 
CERCA DEL FRENTE DE CORRIDA CUAL ES LA SECUENCIA DE LA MUESTRA. 
EL DIDESOXINUCLEÓTIDO TIENE UNIDO UN FLUOROCROMO → el cual será detectado porun 
detector y se podrá obtener una imagen donde la maquina indica la secuencia de la 
muestra que se introdujo. 
 
 
CLONACIÓN 
La clonación es obtener muchas COPIAS IDÉNTICAS DE SECUENCIAS DE ADN (por ejemplo) → 
se obtienen in vitro a través de ciertas técnicas. 
Se puede querer clonar ADN para obtener grandes cantidades de esa misma secuencia 
→ para, por ejemplo, hacer un análisis de secuencia para hacer un diagnóstico; o para 
estudiar la función de un gen; para obtener proteínas recombinantes o para obtener los 
organismos genéticamente modificados. 
CLONACIÓN DE ADN 
El ADN en general se puede clonar de dos maneras: 
 PCR → a partir de la reacción en cadena de la polimerasa. 
 A partir de la TECNOLOGÍA DE ADN RECOMBINANTE. 
PCR 
 DESNATURALIZACIÓN. Se tiene a la doble cadena de ADN → lo primero que se debe 
hacer es desnaturalizarlo. En esta técnica se desnaturaliza al ADN a altas temperaturas 
(mayores a 90°C). 
 HIBRIDACIÓN. Luego, se pone cebadores o primers que necesita la ADNpol para 
extender la cadena; pero para que los cebadores hibriden en el lugar correcto, se 
debe bajar la temperatura. 
 ELONGACIÓN. Cuando ya se tiene los primers ubicados en la posición correcta para 
que actúe la polimerasa → se agrega la ADNpol y la mezcla de desoxiribonucleótidos 
→ para que la ADN pol, a partir del primer adecuado, elonge la cadena → y obtenga 
la cadena hija. 
La ADN pol elonga a 72°C → como nuestra temperatura constante es de 37°C → por 
lo tanto la ADN pol obtenida de mamíferos no podría resistir estas temperaturas y no 
podría realizar la elongación → entonces, se utiliza la ADNpol de una bacteria 
denominada thermus aquiaticus → TAQ POLIMERASA. 
 
Estos 3 pasos constituyen un primer CICLO DE REACCIÓN → se lleva a cabo en un 
TERMOCICLADOR. Con un ciclo se logra, como mucho, que se copie una única vez cada 
una de las hebras → se debe repetir el ciclo → cada uno de los dúplex que se formaron se 
van a separar, se van a ubicar los cebadores y la ADNpol elongara cada molécula 
separada. Al final del segundo ciclo de reacción → obtengo 4 hebras hijas → sin embargo, 
2 ciclos tampoco es suficiente. Se suele programar al termociclador para más de 20 ciclos 
de reacción. 
 
EJEMPLO → se tiene al hígado y se logra extraer todo el 
ADN de él → y se desea clonar el GEN MAPK (proteína 
quinasa que participa en una vía de señalización que 
activa la división celular). 
Se debe diseñar los primers que flanqueen los extremos 
del gen → una vez diseñados, se debe obtener el ADN a 
partir del hígado → una vez obtenido el ADN, se lo pone 
en un tubo de ensayo, se pone la mezcla de nucleótidos y 
la Taq polimerasa y los cebadores o primers diseñados. 
Lo primero que debe ocurrir es la DESNATURALIZACIÓN del 
ADN → cuando el ADN se desnaturaliza se separan las dos 
hebras y en ese momento los primers interaccionarán con 
su secuencia complementaria en ese ADN 
desnaturalizado → cuando los primers hibridaron con su 
secuencia complementaria el ADN (gracias a que se 
disminuyó la temperatura) → comienza actuar la taq 
polimerasa (temperaturas elevadas) y permite la copia 
del gen que se busca. 
Esto se obtiene dentro del tubo de ensayo → si se desea separar el gen clonado de toda 
la mezcla de reacción → se realiza un GEL DE AGAROSA en donde se correrá la muestra → y 
luego si se desea identificar nucleótido a nucleótido se debe MANDAR A SECUENCIAR y si no 
se lo debe HIBRIDAR CON UNA SONDA ESPECÍFICA para la secuencia a través de un southern 
blot. 
Si de una muestra biológica no puedo obtener ADN, sino que obtengo ARN → ESTE NO 
PUEDE SER CLONADO. En estos casos se puede hacer una estrategia que permita transformar 
el ARN en su complementario ADN → y luego amplificar el ADN por PCR. Esto se conoce 
como . RT PCR
 
Se tiene la muestra de ARNm → para aislarlo se utiliza como estrategia → utilizar como 
primer cebador, un CEBADOR FORMADO SOLO POR TIMINAS (ya que el ARNm tiene la cola 
poliA) → se denomina a este CEBADOR POLI T. Esto se denomina oligodeoxitimidina. 
Se pone la muestra de ARNm purificado en presencia de los oligoDT → además, se pone 
en el tubo de ensayo, una enzima llamada TRANSCRIPTASA REVERSA → esta, a partir de la 
molécula de ARN copia la molécula de ADN complementaria (roja en imagen). 
RETROTRANSCRIPCIÓN → luego de que actúa la transcriptasa reversa se tiene un 
heterodúplex → una molécula bicatenaria formada por una molécula de ARN y una de 
ADN (cDNA). Luego → la molécula de ARN se degrada con la misma transcriptasa reversa, 
ya que posee actividad de nucleasa → y luego la misma enzima copia la molécula 
complementaria a la del ADN para obtener un ADN de doble cadena. AHORA PODRÍA 
REALIZARSE LA REACCIÓN DE PCR A PARTIR DEL CDNA → el cDNA representa el producto de 
expresión de un gen. 
A partir de órganos, células, una muestra de sangre o de un hisopado → se puede hacer 
una purificación de ADN o una purificación de ARN → a partir del ADN purificado y 
utilizando primers adecuados → se puede tener la amplificación de una secuencia de 
ADN y se obtienen clones de ADN genómicos. 
Si se purifica ARN (total o mensajero) → primero se hace una retrotranscripción para 
obtener el ADN complementario → a partir de este, se pueden obtener copias del ADN 
complementario → el cual representa al ARN. 
LA CLONACIÓN DE ADN TAMBIÉN ES MUY UTILIZADA PARA EL DIAGNÓSTICO. 
Es una técnica no cuantitativa → lo único que permite decir la técnica es si hay o no hay 
respecto de algo que tiene comparando ADN o ARN. 
PCR CUANTITATIVA (Q) RT-qPCR → se refiere a haber hecho primero una retrotranscripción y 
luego una PCR que permite cuantificar. 
 CRISPR-CAS
El sistema CRISPR-CAS → es un sistema detectado en bacterias → corresponde al sistema 
de defensa de las bacterias. No responde al sistema de defensa inmediato sino que habla 
de memoria genómica para el sistema de defensa de las bacterias. 
REPETICIONES PALINDRÓMICAS → palindrómicas son las secuencias que se leen de la misma 
manera en dirección 3’ → 5’ y 5’ → 3’. 
Se detectaron bacterias que tenían muchas 
repeticiones palindrómicas pero entre ellas se 
vieron secuencias de ADN a las cuales se llamó 
→ ESPACIADORES DE LAS SECUENCIAS 
PALINDRÓMICAS → estas secuencias que 
separan a las secuencias palindrómicas tienen 
secuencias parecidas a las secuencias de los 
virus de ADN. 
Se determinó que las secuencias palindrómicas 
se encuentran separadas por distintos 
espaciadores → y cada espaciador 
corresponde a secuencias de ADN de 
diferentes virus. 
Secuencias palindrómicas representadas en gris; en colores se representan diferentes 
espaciadores. 
Existe una secuencia “líder” que tiene todos los elementos de regulación para que se 
exprese esa secuencia espaciadora → corriente arriba de la secuencia líder estarán 
codificadas en el genoma de la bacteria, diferentes proteínas denominadas PROTEÍNAS 
ASOCIADAS A LAS SECUENCIAS CRISPR → son enzimas denominadas CASP. 
CRISPR → es la secuencia que corresponde a las secuencias espaciadoras que separan las 
secuencias palindrómicas en el genoma de la bacteria. 
CASP → proteínas asociadas a las secuencias CRISPR. 
EN UNA PRIMERA INSTANCIA → una bacteria es infectada por un virus. Las enzimas de 
restricción que posee la bacteria degradarán al genoma viral de ADN → el cual se inserta 
en el genoma bacteriano separando las secuencias palindrómicas repetidas. 
CUANDO EL GENOMA DE LA BACTERIA ES LUEGO TRANSCRIPTO → se transcriben las secuencias 
de las proteínas asociadas a la secuencia CRISPR y también se transcriben las secuencias 
que tienen secuencias palindrómicas y secuencias espaciadoras. 
CUANDO EL VIRUS VUELVE A INFECTAR A LA BACTERIA → el ADN viral será desnaturalizado, la 
secuencia espaciadora complementaria al ADN del genoma del virus → se unirá al ADN 
desnaturalizado del virus y una vez que la secuencia ARN espaciadora interacciona con el 
ADN del virusque está infectando nuevamente la célula → se activa la proteína CASP → 
la cual degrada el ARN → de esta manera, LA BACTERIA SE DESHACE DE TODO EL GENOMA DEL 
VIRUS. En una primera infección → la bacteria degradaba el genoma del virus y lo 
insertaba en su genoma → y al estar inserto en el genoma, genera un SISTEMA DE MEMORIA 
→ que cuando vuelva a ingresar el virus ya no tiene que insertarlo en el genoma, sino que 
debe degradarlo completamente. 
Este es el mecanismo por el cual, las proteínas CASP pueden específicamente unirse a un 
determinado genoma y cortarlo en una secuencia específica dirigida por la secuencia de 
ADN que se introduzca. 
En general → el sistema que permite la modificación o la edición del genoma → es el 
sistema CRISPR-CASP 9 → o sea, la enzima que se utiliza para cortar ADN y editarlo y 
modificarlo es la CASP 9. 
CASP13 → no solo es capaz de degradar ADN sino que también puede degradar ARN. Si se 
pone una muestra de ARN en presencia de CASP13 y de una secuencia que reconozca 
específicamente a ese ARN, y esta secuencia hibrida completamente con el ARN → la 
CASP 13 se activará y degradará todo el complejo ARN-secuencia específica.