Guía parcial 2 - Dariel Isai Soria Cordova

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ELECTROFORESIS 
GelesHORIZONTALES
VERTICALES 
Es hidratada y desnaturalizada con calor para que al reestructurarse la proteína forme una red homogénea perfecta.
· Se usar un buffer para diluir la agarosa y poder correr una molécula. Es el mismo buffer de corrida. Ex: TAE (de acetatos) TBE (de boratos>100V). 
· La muestra se mezcla con un buffer de carga y glicerol (aporta peso). 
· La [agarosa] es de 0-2%, en algunos protocolos especiales hasta un 4%. La [ ] determina el poder resolutivo. 
Tiene alto poder resolutivo, permite discriminar desde 1 nt.
· Requiere un agente intercalante como revelador Ex: BrEt, GelRed®.
· Regulando la [acrilamida]/ [ bisacrilamida] y su proporción se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de los geles de agarosa.
· NITRATO DE PLATA para visualizar o azul de metileno.
De Agarosa: para Ac. Nucleicos (RNA O DNA) + Marcador de PM (Φ29) (phi) De Poliacrilamida: acrilamida (neurotóxica) + bisacrilamida 
 SOUTHERN BLOTbases
Técnica que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN concreta en una mezcla compleja.
Electroforesis 
Hibridación 
	
1. Extracción del ADN
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción (Ex: HINDIII) a 37°C
3. Electroforesis en gel de agarosa + BrEt Incubar gel en buffer de desnaturalización (OH o sosa) Transferencia de gel a membrana (Nylon o Nitrocelulosa) por osmolaridad y capilaridad + Buffer (SSC 20X- alta [NaCl]) Fijación del DNA monocatenario a la membrana con luz UV en Crosslinker (forma enlaces covalentes con las aminas de la membrana) Incubar en solución Denhardts de pre-hibridación (para que las sondas se peguen de manera específica) + esperma de salmón (Bloqueo)
4. Buffer de hibridación con sonda marcada de forma:P32
P33
Directa 
Indirecta 
· Enzimas
· Biotina 
· Digoxigenina
· Radioisótopos
· Fluorocromos
Genotipificación
Mapas de restricción
Análisis filogenéticos
APLICACIONES
5. Autorradiografía (Película de rayos X)Evitan que el ARN forme estructuras secundarias 
 NORTHERN BLOTTécnica que permite detectar la presencia de una secuencia de RNA concreta en una mezcla compleja.
1. Extracción del ARN total de una muestra de tejido homogeneizado. El ARNm se aísla mediante cromatografía para retener solo ARN con colas de poli(A). 
2. Electroforesis para separar las muestras de ARN en gel de agarosa (con formamida y formaldehido) +BrEt Transferencia de gel a membrana (Nylon o Nitrocelulosa reforzada con diazobenciloximetil) por capilaridad + Buffer (formamida para mantener RNA desnaturalizado) Fijación del RNA a la membrana en Crosslinker Incubar en solución Denhardts de pre-hibridación con formamida
3. Buffer de hibridación con sonda marcada lavado de sondas no hibridadas 
4. Película de rayos X …. Densitometría
FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION FISHTécnica citogenética utilizada para la detección y localización de ácidos nucleicos en cromosomas, células o tejidos.
* No radioactiva. Primeras sondas de rRNA marcadas con 3H en 1969. FISH apareció mediados de la década de los 1970.
* Identificar aberraciones cromosómicas. Como duplicaciones, translocaciones, inserciones o deleciones. 
* Mapeo genético. Es decir, se puede emplear para genes específicos o porciones de genes.
Metodología
	
	1. Fijación
	2. Tratamiento para permeabilización
	Célula
	Con formaldehído, metanol o ácido acético
	Se emplean solventes orgánicos
	Tejido
	FFPE (formalin-fixed paraffin embedded)
	Se elimina la reticulación de formalina y se trata con proteasas.
3. Desnaturalización. calentando aproximadamente 95°C las sondas y las secuencias diana.
4. Hibridación con sondas. La secuencia de la sonda y la diana se mezclan juntas, se disminuye la temperatura, para que la sonda hibride. Dependerá de la composición y longitud de la sonda y muestra, concentración de buffer (2X SSC), sales, solventes org., etc.
5. Lavado. Varios lavados aseguran la eliminación de sondas FISH no unidas y la especificidad de la señal detectada. 
6. Observar en microscopio de fluorescencia. Además, la tinción nuclear a menudo se realiza antes de la detección de la señal FISH en un microscopio epifluorescente.
7. Análisis. Si la sonda hibrida correctamente, esperamos obtener una seña fluorescente; si no se obtiene puede ser por cualquier tipo de modificación en el gen y la hibridación no será posible.
 Diseño de las sondas
* La sonda debe ser complementaria a la región de interés del cromosoma.
1. Con una DNAsa se crean cortes aleatorios en el DNA, estos cortes también son llamados “nicks”
2. Se proporcionan nucleótidos específicos con fluoróforos unidos a ellos. 
3. La ligasa une estos “nicks” con los nucleótidos fluorescentes.
4. Con PCR las sondas pueden ser amplificadas.
 PCR Técnica utilizada para la amplificación in vitro de un fragmento de DNA.
 
1. Muestra de DNA (DNA molde): De alta integridad (ideal length) y pureza (protein free) p/ evitar por interferencia, la polimerización.
2. Primers (15≈30 nt): Determina la especificidad de la amplificación, forward y reverse, evitar dímeros de primers.
3. Cofactores Mg o Mn según la pol: Para el sitio catalítico
4. DNA polimerasas (taq Pol): Catlizala reacción de polimerización. Capacidad de elongación (#nt) y precisión de la polimerización.
5. Nucleótidos libres (dNTPs): En exceso para no limitar la reacción.
6. Buffer: El adecuado para la polimerasa usada.
7. Coadyuvantes: grlicerol, fomamida, etc
8. Termociclador
ELEMENTOS
Etapas:	
Cebador 1→Forward
Se une a la cadena de sentido 3’-5’
Cebador 2→Reverse
Se une a la cadena de sentido 5’-3’
30-60s x ~30 ciclos
SYBR GREEN · Agente intercalante inespecífico de DNA, se une al primer en la etapa de alineamiento 65°C) y en la de elongación (72°C) máximo de fluorescencia
· Aumenta la fluorescencia conforme a los ciclos dentro del termociclador
· Máximo de fluorescencia al elongar la cadena de DNA
· Ciclo de melting ↑95°C, ↓65°C, ↑72°C
Miden de forma continua toda la fluorescencia – sube a 95°
· Área bajo la curva indica un único punto
· Evitar formación de dímeros, por primer
· Determinar número de transcritos que hay en un muestra
5. Meseta: se acaban los dNTP o se inhibe Taq polimeraza por copias de DNA
CUANTI-
FICACIÓNRELATIVA
ABSOLUTA
	
	
	
	
	
	
· Permite conocer la concentración exacta/habitual en la muestra, número de copias que se expresan
· Es calculable mediante una curva estándar de concentración conocida. Con al menos 5 puntos mediante diluciones.
· SIEMPRE EN FASE LINEAL (Ciclo vs log concentración)
· La eficiencia es igual en un genoma completo, a diferencia de un plásmido, más puro.
· Se toma como patrón el housekeeping, porque no cambia, no hay variaciones (endógeno de expresión cte).
· No hay HK establecidos, tienen que estar validados y que no haya variación
· Si la formación de producto se encuentra antes del HK, indica que la concentración es mayor
· Entre más tarda en aparecer tenemos menos gen
· Determina el producto de PCR dependiendo de los ciclos de PCR en tiempo real.
TAQMAN®Sonda de DNA que tiene una molécula fluorescente en el extremo 5’ y un aceptor en el extremo 3’. Complementaria al cDNA que se quiere amplificar.
6. Sondas de ~10 a ~20 nucleótidos (distancia entre los dos fluoróforos) de manera que la fluorescencia del reportero está apagada por el fenómeno FRET., diseñadas sobre el producto de amplificación. No se puede hacer el melting. 
7. El donador (reporter) se estimula a una longitud de onda (λ), emite otra λ estimulando al aceptor (quencher/apagador), la sonda provoca un incremento en la señal del reportero y ésta aumenta proporcionalmente al incremento del amplicón.
8. Tenemos una sonda con los dos fluorocromos, si están en solución juntos no emiten fluorescencia. Cuando se comienza a polimerizar, la sonda obstaculiza el avance de la Taq pol, que degrada la sonda, aquí es cuando se emitefluorescencia.Sondas de hibridación: similares a Taqman. Dos sondas que van a hibridar sobre un amplicón, sirven para ver mutaciones puntuales. La primera excita a la segunda, si están separadas más de 3 pb no alcanza a excitarla y no se puede medir. Se puede hacer el melting. 
Secuencia de sonda fluorescente bi-marcada monocatenaria sostenida en una conformación de horquilla con un reporter en el extremo 5’ y un quencher en el 3’ unido a un bloqueador
SCORPION
1. Al comienzo de la qPCR, la polimerasa extiende el cebador de PCR y sintetiza la cadena complementaria de la secuencia diana específica. 
2. Durante el siguiente ciclo, el bucle de la horquilla se despliega y la región del bucle de la sonda se hibrida intramolecularmente con la secuencia objetivo recién sintetizada. 
3. Ahora que el reportero ya no está cerca del extintor, puede producirse una emisión de fluorescencia. La señal fluorescente es detectada por el instrumento qPCR y es directamente proporcional a la cantidad de ADN objetivo
PCR ANIDADA
PCR con dos rondas de amplificación y dos pares de primers
Para incrementar la sensibilidad y especificidad.
Ventaja: reduce las amplificaciones no específicas del DNA.
Desventaja: no nos permite cuantificar la muestra.
1. Primer PCR: con primers externos para amplificar una región del DNA más extensa, contiene segmento diana (incluye amplificaciones de DNA no específicas). 
2. Segunda PCR: con primers internos para amplificar región específica (locus de interés amplificado). 
RT-PCR
1. Temperatura a 70°C: para romper estructuras secundarias de RNAPCR que implica a una molécula de RNA y una retrotranscriptasa para síntesis de cDNA
2. Agregar primers: reconocen secuencia específica del RNA, podemos utilizar Oligos-T.
3. Retrotranscriptasas: 
* Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase (AMV-RT) →es más estable, trabaja a T menores de 55°C y previene formación de estructuras secundarias
* Moloney Murine Leukaemia Virus Reverse Trasncriptase (MMLV-RT)
4. Inhibidor de ribonucleasa H: para mayor rendimiento y tamaño del cDNA.
9. Se puede detectar expresión de ciertos genes. La técnica se puede realizar con RNA fragmentado, degradado o en pequeñas concentraciones.
PCR MÚLTIPLE
1. Amplificación se ocupan múltiples primers y una DNA pol.Amplificaciones de diferentes secuencias en una misma reacción.
2. Primers: se diseñan de tal forma que todos los pares de primers puedan trabajar a una misma T durante la PCR y deben ser específicos en las regiones a las que se unirán, para no interferir en secuencias que también serán amplificadas
3. El tamaño de los amplicones puede observarse en un gel de electroforesis mediante las bandas que se formen. Para identificarlos, los primers deben marcarse con colorantes fluorescentes.
10. Ventajas: menos tiempo de preparación, costos y plantillas. Se puede saber si hubo falsos negativos por el control interno de cada amplicón.
11. Desventajas: Sistema complejo con varios primers, baja eficiencia de amplificación y ninguna eficiencia idéntica en diferentes plantillas.
SANGERPara secuencias específicas, como detección de mutaciones puntuales. Consiste en hacer muchas copias de una región blanco de ADN. Con la mezcla del nucleótido normal (dNTP) y su terminador (ddNTP).
1. A los 4 tubos de reacción se agregan todos los nucleótidos normales y un ddNTP diferente a c/u.
2. En la PCR, la DNA pol añadirá nucleótidos a la cadena hasta que aleatoriamente agregue un nucleótido didesoxi en lugar de uno normal. A partir de ese momento, no es posible agregar más nucleótidos y la cadena termina con el ddNTP.
3. Tras varios ciclos, se pueden generar fragmentos complementarios de diferentes tamaños que terminan en el mismo nucleótido.
4. Los fragmentos se separan en un gel de poliacrilamida (debe diferenciar 1 base) con cuatro carriles distintos, para determinar la secuencia.
12. La secuencia que estamos buscando es la complementaria, ya que la polimerasa está metiendo nucleótidos a la secuencia molde.
13. Tiene un límite de potencia para una buena lectura de 800 pb. Para secuencias mayores a, se diseñan primers específicos para secuenciar por partes y que estos fragmentos puedan empalmarse
1500 pb
Primer 1
Primer 2
800 pb
Cobertura
Profundidad
5. Se fundamenta en la secuenciación “step by step” (base de la secuenciación masiva). Se cortaban con enzimas de restricción y se les agregaban adaptadores para poder amplificar. Se analizaba por empalme.
SANGER ACTUAL 
14. Se realizan con fluoróforos y los extremos de los fragmentos tendrán el pigmento que indica su nucleótido final.
4. Los fragmentos se hacen pasar a través de un tubo largo y delgado que contiene una matriz de gel en un proceso llamado electroforesis capilar en gel
5. Cuando cada fragmento cruza la "línea de meta" al final del tubo, un láser lo ilumina y permite la detección del pigmento asociado.
6. Se reconstruye el fragmento de DNA original a partir de los colores de los pigmentos registrados uno tras otro por el detector.
7. Cromatograma: los datos registrados por el detector consisten en una serie de picos en la intensidad de la fluorescencia.
PARA SECUENCIAS DESCONOCIDAS
Para secuencias desconocidas, se pueden usar:RETROTRANSCRITOS
Para
 
a. Oligo-T: el mRNA tiene una cola de poli-A por su maduración
Hexanucleótidos/primers degenerados/rándom primers: se diseñan tras un análisis estadístico para que 6 nucleótidos hibriden con la secuencia diana.
Adaptadores: secuencia de nucleótidos que voy pegar a la secuencia diana (se une con ligasas) y con base en ellos, se elaboran los primers. 
*Primers específicos: se elaboran con base en la secuencia que conocemos. No es muy eficiente para bajas cantidades de mensajero, por lo cual se tendría que amplificar con Oligo-T, retrotranscripción masiva de mensajero y los primers se diseñan sobre este mRNA y haces PCR.
SECUENCIACIÓN 
MASIVAILLUMINA
ION TORRENT
Secuenciación por síntesis de determinación reversible cíclica. Se pueden preparar bibliotecas completas de secuencias.
Secuenciación por síntesis de determinación reversible cíclica. Se pueden preparar bibliotecas completas de secuencias. Con pH.
1. Preparación de DNA: Por tagmentación DNA es cortado en fragmentos de 300 pb y etiquetado con 2 secuencias adaptadoras complementarias a las sondas en superficie de Perlas. Con transposasas.
2. Preparación de Perlas: Perlas en solución, en la superficie tienen ancladas sondas complementarias a las secuencias adaptadoras. Hibrida una hebra por perla. Amplificación por emulsión: en c/gota de agua hay una perla y lo necesario para PCR, se realiza Bridge Amplification hasta cubrir las perlas por amplicones.
1. Preparación de DNA: Por tagmentación, DNA es cortada en fragmentos de 300 pb y etiquetado con 2 secuencias adaptadoras complementarias a las sondas inmovilizadas. 
2. Generación de clusters: Se realiza en una flow cell (vidrio con nano pozos) que contienen 2 sondas complementarias a los adaptadores de DNA. Por medio de lavados, a c/pozo sólo entra una hebra de DNA, se polieriza una hebra. Se hace una Bridge amplification: la hebra se dobla porque el otro extremo se une con otra de las sondas. Se polimeriza, las otra hebra, se repite el ciclo hasta tener ~1000 copias (amplificación clonal) en c/pozo. Las hebras antisentido don eliminadas.
3. Secuenciación por síntesis: primers hibridan a las hebras, se coloca en microchip de silicio en sol. de un solo nucleótido. Se polimeriza y cuando se agrega nucleótido se libera pirofosfato y protón. Los H⁺ causan cambio de pH captado por semiconductor. Se lava al añadir otro nucleótido.
4. Análisis: el software busca lugar en donde la secuencia haga match con otras completando un genoma
3. Secuenciación por síntesis: primers hibridan a las hebras. Se coloca la flow cell en sol. De un solo tipo de nucleótido fluorescente, se emitirá un color distinto por c/nucleótido. La fluorescencia es captada por la computadora y traducida a letras para c/nucleótido. Se lava al añadir otro nucleótido.
4. Análisis:Software busca lugar en donde la secuencia haga match con otras completando un genoma.
DNA RECOMBINANTE
MÉTODOS QUÍMICOS PARA LA TRANSFECCIÓN, ADENOVIRUS Y LENTIVIRUS 
Transfección → Eucariotas
Transformación → Procariotas
Infección → Cuando se usan virus
Fosfatos de calcio
Barato para transfectar células. Se usa una solución salina tamponada con HEPES que contiene iones fosfato y se combina con otra solución qué contiene el ADN a transfectar y cloruro de calcio, al combinarse estas dos soluciones se forma un precipitado fino de calcio cargado de manera positiva y fosfatos cargados de manera negativa, el ADN al tener carga negativa se une al calcio. 
El precipitado se agrega en las células a transfectar que generalmente están en un cultivo celular y absorben el precipitado, y con él, el ADN.
El agregado con calcio protege al ADN de la degradación por las nucleasas celulares. 
Es difícil de repetir debido al tiempo de formación (entre 30 y 60 segundos), la concentración del ADN y la temperatura de la reacción que dependen de cada línea celular con la que se trabaje.
 
DEAE - Dextrana
Es un reactivo polímerico catiónico que se une y transfecta a los ácidos nucleicos. Es endocitado en un complejo DEAE- Dextrana / ADN por medio de un shock osmótico con DMSO o glicerol. Los polímeros tienen una carga que les permite unirse al ADN, una vez unido se pone en contacto con las células a transfectar.
La citotoxicidad del DEAE -DExtrana debe de ser tomada en cuenta, por lo cual las concentraciones y el tiempo de exposición a cada una de las líneas celulares debe optimizarse.
El protocolo se optimiza al cambiar el shock con DMSO o glicerol con un baño de cloroquina o butarato de sodio. La cloroquina se une al ADN e inhibe la degradación intracelular por las hidrolasas lisosomales. El butarato de sodio influye en la formación de una heterocromatina más activa para la expresión de genes introducidos.
Las ventajas de este método son que tiene una relativa simplicidad y velocidad, gastos limitados y una eficiencia de transfección reproducible.
Las desventajas es que solo funciona para transfecciones transitorias porque inhibe el crecimiento celular e induce cambios morfológicos en la célula. Este método es ideal para la sobreexpresión de proteínas. 
Lipofección
Es una técnica que utiliza liposomas (vesículas que pueden fusionarse con la membrana celular con facilidad ya que ambas están hechas por una bicapa lipídica). Se usan lípidos con carga positiva para formar un agregado con el material genético que cuenta con una carga negativa, este método realiza las mismas tareas que DEAE - Dextrana y fosfatos de calcio.
	
Es de vital importancia que se optimicen las condiciones específicas de la transfección para obtener buenas eficiencias que generalmente van entre el 70% y 90%  
Las desventajas de este método son que los lípidos usados tienen un precio elevado, la relación entre el lípido y el ADN es diferente para cada tipo celular, alta toxicidad en concentraciones altas y baja eficiencia en concentraciones bajas. El tiempo de la transfección depende de los reactivos y las condiciones, puede variar de 1 a 24 horas, incubaciones más largas son más tóxicas. 
FuGENE®
Es un reactivo no liposomal comercializado por la casa Promega, es capaz de transfectar directamente a una amplia variedad de células con alta eficacia y baja toxicidad. Se mantiene a temperatura ambiente y se aplica directamente sobre los cultivos celulares y posteriormente se vierte el ADN sobre el cultivo, se incuba entre 24 y 48 horas, pero es muy costoso.
PEI
La polietilenimina condensa en ADN en partículas cargadas positivamente, que unen a los residuos de la superficie celular aniónica y se introducen por endocitosis. 
Estructuralmente PEI es el polímero orgánico de mayor carga positiva que existe debido a que, en su estructura, cada dos átomos de carbono hay un nitrógeno de tipo amino secundario el cual puede ser protonado, cuando se une a los fosfatos del ADN aún quedan grupos positivos que se unen a la membrana celular. Una vez que está dentro de la célula la protonación de las aminas da como resultado una disminución en el potencial osmótico, la hinchazón resulta y la vesícula revienta liberando el complejo polímero - ADN en el citoplasma, el polímero es desempaquetado y el ADN es libre de difundirse al núcleo. PEI
Eficiencia
Los métodos químicos tienen una baja eficiencia, especialmente in vivo, comparados con los virus, pero presentan una baja citotoxicidad, no hay ADN extra, no posee límites para el tamaño del ácido nucleico
Se debe de experimentar cual es el método más adecuado para la línea celular con la que se está trabajando.
Adenovirus
Son virus con baja patogenicidad cuyo genoma está constituido por una doble cadena de ADN. El genoma de estos virus se divide en genes tempranos (E1 - E4) y genes tardíos (L1 - L5), las regiones E1 y/o E3 son las que se sustituyen por el material genético a transfectar.
Quitar E1 implica una replicación defectuosa, lo cual es un elemento de seguridad, quitamos genes qué son importantes para la replicación, si se quita está parte se pueden insertar transgenes de hasta 5,1 kb.
Quitar E3 implica quitar proteínas que no son necesarias para la replicación y en conjunto con la deleción de E1 permiten insertar transgenes de hasta 8,2 kb
En E1 se integra el gen terapéutico logrando un vector adenoviral sin capacidad de replicación. El vector adenoviral se une a la célula mediado por receptores y una vez dentro de ella se produce la lisis y el contenido es liberado al citoplasma. El ADN viral permanece como ADN extracromosómico dirigiendo la expresión del gen terapéutico, su construcción / producción es moderada y dura de 7 - 14 días.
Lentivirus
El material genético que llevan en su cápside son dos cadenas de ARN, son virus que tienen un periodo de incubación muy largo.
Pertenecen al grupo de los retrovirus y se basan en el VIH, sin embargo, a diferencia de los retrovirus convencionales, los lentivirus pueden infectar de manera eficiente a las células que no están en división y por lo tanto se pueden usar en células como las neuronas.
Generan rápidas respuestas inmunes y proveen una expresión estable y a largo plazo. Estos pueden ser dirigidos selectivamente usando envolturas quiméricas qué son reconocidas por péptidos y receptores específicos de la célula. Lentiviral Transfection 
Eficiencia
La citotoxicidad y la inmunogenicidad representan las mayores desventajas de la transfección mediada por virus.
La introducción del virus puede causar una reacción inflamatoria y una mutación insercional debido a que ciertos vectores virales se integran en el genoma del huésped de manera azarosa y puede afectar genes supresores de tumores, oncogenes o interrumpir genes esenciales. Los vectores virales tienen la desventaja de tener una cápside que tiene espacio limitado para qué el gen extraño pueda ser infectivo.
MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN
Electroporación
· OBJETIVO: Inducir la formación de poros en la membrana mediante el aumento de la conductividad eléctrica, aplicada por un campo eléctrico.
· Se forman poros reversibles: tránsito de macromoléculas, iones, mayor absorción de DNA. 
· Impulsos eléctricos controlados de alto voltaje y pulsos cortos de duración de microsegundos a milisegundos, utilizando campos entre los 200 V/cm hasta los 600 V/cm. 
· Cuando se excede la rigidez dieléctrica se forman los poros.
· Si los pulsos y tiempos son correctos los poros son reversibles, sino, puede provocar muerte celular.
· DNA puede estar en plásmido o de manera lineal.
· La concentración de sales en el medio es crítica para una correcta transformación. 
Sonicación
· OBJETIVO: Inducir la formación de poros mediante el uso de ultrasonido con frecuencias mayores a 20 KHz. 
· Efecto de la cavitación acústica (propagación de las ondas de ultrasonido por un medio líquido).
· Formación de burbujas microscópicas que crecen y colisionan entre sí formando ondas de choque que inducen poros en la membrana.· Puede usarse para lisis celular, mediando la frecuencia del ultrasonido.
Biobalística
· OBJETIVO: Uso de microproyectiles recubiertos del DNA que se desea introducir para generar células recombinantes.
· Puede transformar una amplia gama de células (bacterias, hongos, insectos, células animales y células vegetales in vivo).
· Necesita un sistema de selección in vitro.
· Único sistema de transformación que permite transformar organelos celulares.
· Oro o Tungsteno por su densidad.
· Esferas de 0.4 a 4 μm de diámetro.
· Desprendimiento del DNA debido al entorno iónico de la célula.
· El casete del gen puede estar en plásmido o no.
· Existen sistemas por explosión de pólvora o por liberación de gas comprimido (He,Ne,CO2,N2)
· Las esferas alcanzan una velocidad de hasta 400 m/s.
· Todo el sistema funciona en un vacío moderado para evitar el rozamiento con el aire.
Lavado con etanol x 15 min.
 
Microinyección
· OBJETIVO: Usar microcapilares o microagujas de vidrio y sistemas de microscopia para depositar DNA exógeno en el interior de células.
· Gran precisión para la introducción de DNA exógeno dentro de compartimentos intracelulares específicos. 
· Se puede escoger la célula a transformar, se tiene control visual.
· Requiere de equipo especial (micromanipulador) y personal calificado. 
· Sólo puede transformar una célula a la vez. 
· Equipo costoso.
Choque térmico
· OBJETIVO: Inducir la formación de poros usando variaciones en la temperatura.
· El choque térmico se realiza sometiendo a las células a un baño de 42 °C x 50 segundos y después colocarlas inmediatamente en hielo.
· Esto inducirá la formación temporal de poros en la membrana y permitirá que el DNA de interés (contenido en plásmido) entre a la célula. 
Retrovirus (Método Biológico)
· OBJETIVO: Introducir material genético de interés a diferentes tipos celulares mediante un proceso lisogénico.
· Los retrovirus precisan que las células estén en división para que la forma de provirus (cuando el virus retrotranscribió su material genético a DNA) pueda integrarse en el genoma.
· Se eliminan las secuencias gag, pol y env por el gen o genes de interés, lo que permite la incorporación de secuencias de DNA de hasta 8 kb.
El tipo de sonda que se use dependerá del uso que se le quiera dar al chip, específicas a los orígenes de replicación.
Serie de sondas de DNA de diferentes longitudes que están unidas a un soporte sólido, sobre las que podemos hibridar una muestra marcada.
DNA bicatenario
cDNA
Oligonucleótidos 
· La replicación del material genético se da en la fase S del ciclo celular.
· El origen de replicación está compuesto en su mayoría por A y T (menor cantidad de puentes de H+).
· En el genoma humano existen aprox. 10,000 orígenes de replicación.
CHIP
 
En expresión génica. 
15. 1 canal. Tras extraer RNA, se pasa a DNA y se les pone fluoróforo como Cy3. Se exitan y emiten fluorescencia (sobreexpreción génica)
16. 2 canales. Que se lean con dos caneles. Uno con Cy3 y otro con Cy5. El color resultante será la combinación de ambos. Cuando la color es mayoritariamente verde hay mayor expresión del control (subexpresión). Cuando es más roja hubo más cDNA del caso problema (sobreexpresión). Si se queda amarillo 
 TRANSFORMACIÓN CELULAR CON PLÁSMIDOS 
 Origen de replicación: Secuencia en donde comienza la horquilla de replicación. Es fundamental su para la transmisión del plásmido durante la división celular.
A. Marcador. Elemento que permite al investigador apreciar la incorporación del plásmido en el microorganismo. Se acostumbra que haya dos por plásmido. Tradicionalmente es un gen de resistencia a antibióticos, de síntesis de algún fluoróforo (GFP) o de respuesta a algún nutriente (lacZ).
B. Polylinker (MCS-multiple cloning site): Es un conglomerado de secuencias reconocibles por enzimas de restricción. Su utilidad subyace en que en estos sitios se puede insertar material nuevo en el plásmido. 
Este sitio se suele encontrar en la proximidad o sobre uno de los marcadores, de manera que, cuando se inserta un gen nuevo, el plásmido pierde uno de sus indicadores. 
Las células tienen dos maneras de recibir estos plásmidos. Le puede ser heredado de su célula madre (verticalmente), o lo puede tomar de otro organismo (horizontalmente).
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.
Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
Existen 3 tipos de enzimas de restricción:
1. Tipo I y Tipo III:
· Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).
· Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. 
2. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despúes de la secuencia que reconocen.
· Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
3. Tipo II:
· Sólo tienen actividad de restricción.
· Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.
· Sólo requieren Mg++ como cofactor.
· No necesitan ATP.
TRANSFORMACIÓNProceso por el cual ciertas bacterias son capaces de incorporar ADN exógeno que está libre en el medio.
Competencia
La capacidad de captar el ADN exógeno, conservarlo en forma estable e interaccionar con él, se denomina competencia. 
Este estado de competencia es diferente para cada especie bacteriana capaz de experimentar transformación, y dentro de cada especie está influido por parámetros como:
· densidad celular del cultivo
· temperatura
· pH
· nutrientes (fuentes de C o de N, iones...)
No todas las células de un mismo cultivo son transformables en cualquier momento del ciclo de crecimiento.
Especificaciones
El ADN, para que sea capaz de transformar, ha de ser de cadena doble.
Para cada evento de transformación basta la interacción de una sola molécula de ADN con la célula receptora. Por otro lado, el número de moléculas de ADN que puede tomar una misma célula es limitado, y presenta una cinética de saturación (meseta que indica que ya no se pueden captar más moléculas). 
En la transformación natural de diversas especies bacterianas se dan una serie de fases comunes a todas ellas, aunque en cada caso existen rasgos propios:
· Competencia
· Unión y entrada del ADN exógeno a la célula
· Fase de eclipse
· Destino del ADN exógeno (exogenote): recombinación con el endogenote.
En la naturaleza, la fuente de ADN exógeno suele ser la lisis espontánea de células de la misma especie, que actúan como "donadoras" (una especie de inmolación o suicidio altruista, para mayor gloria -o sea, para mayor superviviencia- de la especie). En otros casos no hay lisis, sino que parte de la población bacteriana extruye ADN, que pasa al medio.
Proceso
1. El ADN entra en el espacio periplasmático, entre la pared celular y la membrana plasmática, allí una endonucleasa corta las dobles hélices en fragmentos de menor tamaño
2. posteriormente se degrada una de las dos hélices, de manera que lo que entra en el citoplasma es ADN de una hélice (monocatenario).
3.  Estos fragmentos de ADN monocatenario o ADN transformante pueden sustituir a fragmentos de ADN homólogo del cromosoma principal bacteriano mediante un mecanismo especial de recombinación.
4. La recombinación genética tiene lugar entre el ADN transformante y el ADN de la bacteria receptora y se detecta por la aparición de bacteriasdescendientes transformadas para algún carácter. 
TRANSFORMACIÓN EN BACTERIAS GRAM POSITIVAS: 
1. No distinguen entre DNA homologo (de la misma especie) o no.
2. Estado de competencia:  Se excretan factores al medio que estimulan la competencia. El factor activador de la competencia es un péptido de 5-10 kDa que no ejerce su efecto hasta que la densidad celular es elevada. 
3. La autolisina produce la degradación parcial de la pared celular, dejando al descubierto la proteína de unión al DNAbc y una nucleasa. 
TRANSFORMACIÓN EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS: 
· El DNA que se incorpora debe ser homólogo, sólo se incorpora DNA de la misma especie 
· La reconocen unos receptores de superficie de la membrana externa (transformosomas). 
· Estado de competencia:  No depende de una señal activadora, se induce internamente. 
REPLICACIÓN DE DNA
Proceso fundamental que busca hacer una copia idéntica del DNA para las células hijas. Se tienen errores durante este proceso y al repararse puede haber cambios +, - o nulos.REPLICACIÓN
Arthur Konberg1 y Severo Ochoa2
1Logra sintetizar la DNA polimerasa
2Sintetiza la PNPasa «polinucleótido-fosforilasa», que era la que podría sintetizar RNA artificialmente en el laboratorio.
! Eso fue importante para los procesos celulares, porque se podía transcribir artificialmente DNA o RNA.
Marcaron con 15N (isótopo más pesado de N) el DNA de E. coli. Hicieron un cultivo primario de bacterias con nucleótidos marcados en el medio; originalmente todo el cultivo bacteriano integraba este DNA pesado. En cada generación se tomaba una alícuota y se analizaron en geles, como las bandas cambiaban de peso, llegaron a la conclusión que era semiconservativa.Mathews Meselson y Franklin Stahl
DNA de bacteria lo pone en un cultivo con radioactividad, toma fotografías en tiempo real de la bacteria y observa la horquilla de replicación (burbuja de replicación) Define que hay un origen de replicación (ORI) reconocido por un conjunto de proteínas. A partir del ORI se va a abrir el genoma para producir las secuencias complementarias a las ya existentes. John Cairns (1962)
mecanismo
FASE DE INICIO: consiste en el desenrrollamiento y apertura del DNA
1. El ORI es reconocido por ORP (Proteínas que reconocen el Origen de Replicación), son 6 proteínas conservadas evolutivamente, las más conservadas son la 2 y la 5, son las que reconocen específicamente el origen de replicación.
2. Una vez pegadas las ORP, llaman a las helicasas y a las topoisomerasas. Las helicasas abren la complementariedad del DNA, deshibridando puentes de H en las bases, generando tensión.
3. Las SSB (Single Strain Binding Protein) permiten que el DNA se mantenga abierto y pueda trascribirse. Evita que el DNA se pliegue sobre sí mismo
4. Después interviene las topoisomerasas, de las cuales hay dos tipos:
b. Tipo I: Rompen el DNA de cadena sencilla
c. Tipo II: Rompen el DNA de cadena doble
5. Las ligasas vuelven a pegar el DNA.
! Para modelos eucariontes primero se deben quitar las histonas, se necesitan proteínas que compitan con las histonas.
FASE DE ELONGACIÓN: consiste en la formación de las nuevas hebras de DNA, copias de las cadenas originales. 
1. La primasa, es una polimerasa que va a sintetizar un RNA complementario (primer) a partir de DNA, el cual va a ser reconocido por la Pol III. También sintetiza cebadores sobre las hebras retardadas.
2. La DNA polimerasa III se une a la cadena que tiene el cebador generado por la primasa y trascribe toda la cadena cuando esté en sentido. También sintetiza los fragmentos de Okazaki. 
3. Los fragmentos de Okazaki es la forma en que la hebra retardada se replica, tienen ~1000-1500 pb (en eucariontes son cientos de pb). Varían de tamaño por la capacidad que tiene la burbuja de mantenerse abierta.
4. La DNA polimerasa I es una exonucleasa que reconoce una secuencia que NO es DNA, quita los nucleótidos de RNA e incorpora nucleótidos de DNA. Se ancla al fragmento de Okazaki anterior.
5. La DNA ligasa va uniendo estos fragmentos hasta tener una cadena continua de DNA.
6. En eucariontes se sintetizan histonas nuevas y el DNA naciente se vuelve a empaquetar.
DIFERENCIAS EN EUCARIONTES
· Helicasa → Antígeno T grande en eucariontes, hexámero de proteínas que se ancla al ORI junto con las proteínas de unión.
· SSBP → RPA , proteína de unión al DNA
· Pol III → Pol δ
· Pol I → Pol α
· PCNA: macromolécula proteica que envuelve al DNA para estabilizar a la Pol δ a lo largo de la elongación, es un complejo multiproteico (trímero)
· Rfc: acoplador al PCNA para anclar a la polimerasa.
FASE DE TERMINACIÓN: consiste en la replicación de telómeros.
· Al final de la replicación vamos a tener un pedazo de primasa que no va a poder ser reelongado, porque la Pol III necesita reconocer un sitio de DNA para ser reconocido.
· Una célula puede dividirse dependiendo del tamaño del telómeto. Si llega a cortarse tanto
· La telomerasa (retrotranscriptasa) durante fase embirnoaria se asegura de añadir una región grande de telómetro para que no estén limitadas en s fase de división.
· Estudiada en células tumorales.
1. Pone DNA complementario reconocido a tras de una secuencia interna de RNA grande (200-1500 pb). Este RNA reconoce por complementariedad la secuencia de DNA que quedó cortado en la útima parte del telómero y se hace un híbrido RNA-DNA. 
2. La polimerasa extiende el cebador de RNA para sintetizar una cadena complementaria.
CICLO CELULAR
La progresión del ciclo celular se puede parar si la célula hizo algo mal o no está preparada para continuar. Check point parada del ciclo celular, donde la célula decide si pude continuar o no en la fase S. 
Fase G1
Regiones laxas y regiones muy compactadas. Está enfocada en sintetiza todas las proteínas qe se van a requerrir durante la fase S
Fase S
El DNA se está replicando y puede sintetizar muy pocas regiones, como la síntesis de histonas y proteínas asociadas a los complejos de separación y unión de las histonas. Las histonas se van inercalando y cada hebra tiene la mitad de los cambios epigenético que tenía originalmente.
Fase G2
se concentra en expresar la mayor cantidad de proteínas que va a requerir la célula durante la fase M
Fase M
Compactación del DNA muy grande, es imposible transcripción de un gen.
SÍNTESIS DE HISTONAS
· En las cadenas ancientes se deben meter histonas para que el DNA se vuelva a empaquetar y el tamaño del núcleo sea adecuado para la cantidad de DNA.
· Las modificaciones en el DNA y en las histonas van marcando los procesos de diferenciación que tuvo una célula y son heredables a las cél. hijas. 
· Diferenciación: silenciamiento deciertas reciones de DNA cuando una cél. se compromete a un extirpe celular.
1. En la burbuja de replicación, inicialmente comienzan a mover a las histonas para que la helicasa habra el DNA.
2. Se desacoplan las histonas y se mueven para acomodar las nuevas. Se acomodan de forma bisimil a lo largo de las cadenas que se acaban de replicar (se van intercalando)
3. MCM2-7 es la helicasa. Se encuentra la Polimerasa y el PCNA envolviendo a la Pol con el Rfc. Este complejo va señalizar mediente la fosforilación de los compejos CDK quinasas
· Ciclina CDK es un dímero de una proteína llamada ciclina que va modulándose a través del ciclo celular y una CDK que es una quinasa con actividad para fosforilar a proteínas, pero esa quinasa sólo funciona si está unida a su CDK específica. Cuano se une el complejo ciclina CDK va a fosforilar proteínas que hacen que prosiga el ciclo celular. 
4. La cicila CDK A va a fosforilar proteínas asociadas al desacople de las histonas, para que la helicasa pueda seguir abriendo la burbuja. Modifican la síntesis de histonas.
Ejemplo A (H2B)
1. La ciclina E-CDK2 fosforila a NPAT (coactivador muy estudiado) complejo de coactivadores
Factores de transcripsión: proteínas que tienen un dominio de unión reconocen una región de DNA, 
Coactivadores: interacción proteína-proteína, modulan la capacidad de unirse a la maquinaria transcripcional
2. Unión deNAPT a complejo coactivadores y a su vez interactúan con la maquinaria basal transcripcional (Oct-1)
3. Se activa la síntesis de estas proteínas
4. Se obtienen muchos RNA, en vez de tener cola de Poli A tienen el complejo SLBP hace que el mRNA se pliega como una horquilla hace que la tasa de síntesis sea más eficiente (10 veces más) porque los ribosonas lo reconocen más fácil
5.	Se acoplan a chaperonas (proteína de unión a la histona) para que se unan a la maquinaria de acople del DNA naciente (factores de ensamblaje de cromatina)
· La histona 1 tiene una síntesis mayor. 
Ejemplo B (H4): NAPT se conecta con Tip60 (asociada como coactivador importante durante la síntesis de histonas)
ERRORES EN LA REPLICACIÓN
Errores en el apareamiento incorrecto de las bases nitrogenadas, por especies reactivas de O2, por pH o radiaciones
TAUTOMERÍA: modificación química en las BN
Tautomería imina-amina
En la forma imino se encuentra la C
1. Cuando se tiene el cambio de imino a amino hay pérdida de H
2. limita un puente de H de interacción con la base complementaria, una C se puede unir C a una A
Tautomería ceto-enólica (lactama-lactima)
En la forma ceto, se encuentra la T, ahora cambian a enólica
1. El grupo ceto ahora tendrá un OH como un radical nuevo
2. Libera un sitio más de hidrógeno, para establecer otro puente de hidrógeno. Ahora una T se puede unir con una G.
3. 
DESPURINIZACIÓN
· Retirar del enlace glucosídico entre la base nitrogenada y el azúcar al que está unida con una pérdida de una A o una G.
· La BN y su enlace se pierden, pero se sigue manteniendo el enlace azúcar-fosfato (sitio AP)
· Cuando se está polimerizando, la Pol reconoce como que ahí no hay una base y se lo salta. Puede cambiar marco de lectura
DESAMINACIÓN
Consiste en la pérdida de grupos amino. La C por desaminación se convierte en U y el U empareja con A produciéndose transiciones GC→AT.
Están muy asociadas al tautomerismo, porque es la pérdida del grupo imino, pasando al amino.
DAÑOS OXIDATIVOS EN EL DNA
· El metabolismo aeróbico produce radicales superoxido O2, peróxido de hidrógeno H2O2 e hidroxilo. Esta alteración del DNA produce transversiones: GC→TA. La Timidina se convierne en Glicol de timidina.
· Algunas BN cambian, un enlace se pierde y se va a agregar un OH (por demasiadas reactivas en la célula → producto del metabolismo celular) 
· Para eso tenemos catalasas y peroxidasas para disminuir las especies reactivas, las enzimas son menos eficientes conforme la célula va envejeciendo.
· El enlace OH en la Timina-glicol genera otro enlace de H y que ahora se pueda emparejar con una G
DÍMEROS DE TIMINA
· Originadas por radiación UV o radiación atómica
· Se realiza en un mismo polímero (cadena) de DNA. Distorsión en el dúplex producido por el dímero.
· Las T establecen una unión tal que la polimerasa no las reconoce y se las salta. Esas regiones no se pueden replicar y pierdes 2 nucleótidos en la copia del DNA que se está replicando.
· Muy difíciles de reparar, porque se tendría que cortar todo este fragmento.
· Los dobles enlaces de las T ahora se hacen lineales, se forman enlaces covalentes. 
· La radiación mueve la estabilidad de los enlaces
CAMBIO DE FASE O PAUTA DE LECTURA
Modelo propuesto por Streisinger en el apareamiento erróneo deslizado 
DELECIONES O DUPLICACIONES GRANDES
REPARACIÓN DE DNA
De manera espontánea en cél. somáticas o durante replicación
Neutralizan radicales libres (OH)
Para reparar se tiene que detectar que hay un error con un conjunto de proteínas detecten la inestabilidad del DNA
Puede haber rompimientos mecánicos en el DNA
	Romo generalmente por enzimas (endonucleasas). Poco común.
	Cohesivos cortan de manera escalonada. Rompimientos que dejan DNA de cadena sencilla. 
Endógenamente las células tienen muchos mecanismos. 
Más importante: actividad exonucleasa de la DNA pol (III o I), tienen actividad de proofreading, es decir, antes de anexar el siguiente nucleótido reconocen cuando se equivocaron por la inestabilidad del nucleótido que añadieron durante la replicación y tienen actividad exonucleasa 3’-5’ (se regresan a donde se equivocaron)
Es el primer freno para intentar reparar el daño durante la replicación.
BER (Base Excision Repair)
Escisión de una base 
Para tautomerismo, metilación, desaminación
Se debe reconocer el sitio de daño
1. Glicosilasa del DNA, reconoce enlace glicosídico y (BN-azúcar) y quita la base
2. AP reconocen purinas y pirimidinas, son nucleasas y rompe enlace fosfodiester, quedan fosfatos o hidroxilos libres
4. dRPasa desfosforila 3’ y fosforila 5’ 
5. Llega la pol β y establezca el enlace con la hibridación del pirofosfato
6. Aparecen moléculas auxiliares, scaffold (como XRCC1) son como adaptadores donde, por interacción, se encaja un conjunto de proteínas y promueven reacciones. No funcionan enzimáticamente. XRCC1 promueve la unión de la Pol con el DNA y después a la ligasa. 
Escisión de 2-10 pb
Tras sobreexposición de rayos X
Se pierde el fragmento de DNA 
1. Aparecen las XRCC1 que atraen a otras proteínas para reparar el daño
2. PARP ½ Familia de proteínas polimerasas que en el mecanismo de reparación no funcionan como mol. Se unen a las scaffolds por afinidad.
3. PARP 1 modulador de la cromatina, se posiciona ahí con la afinidad al scaffold y reorganiza el DNA. Ocupa un espacio medio hasta que llega la cinasa PNK
4. La cinasa PNK es la que transfiere en el 5’ el fosfato (para que llegue la Pol) y retira el fosforilo en el 3’ del fragmento que se cortó.
5. Llega PCNAsa que se una a la DNA pol para estabilizar la unión de la pol al DNA y elonga.
6. Fen 1 nucleasa que rompe estos fragmentos mal pegados. La Fen 1 viene con la ligasa para unir fragmentos recién sintetizados.
NER (Nucleotide Excision Repair)
Para dímeros de T 
Se corta el fragmento vecino y se reemplaza con la polimerasa, utilizando como molde la otra hebra.
Región de ~50pb
GGR daños globales en el genoma
1. Rad7/16 familia de proteínas de reconocimiento para daño 
2. Rad4-Rad23 flanquean la zona dañada
3. Rad14, Rad10 y Rad2, con actividad de helicasa y nucleasa (principalmente Rad2), abren el DNA y antes de que corten traen a factores de transcripción TFIIH
4. TFIIH pertenece a la familia de transcripción de FT de la RNA pol II subunidad H. Tiene actividad helicasa.
5. Rad2 y Rad10 cortan el fragmento dañado
6. RPA se unen para que no rehibride la cadena
7. Llega la Pol junto con el PCNA para estabilizar DNA
8. Llega la ligasa para unir todo
TCR durante transcripción
1. Spt4/5, Paf1C y Rpb4/7 familia de proteínas de reconocimiento para daño 
2. Rad 26 se posiciona en el sitio aledaño y se desacopla la RNA pol.
3. Pasos iguales del 3 al 8
MMRR (Mismatch Repair)
Para tautomerismo o depurimización
1. MutS y MutL reconocen el DNA donde está dañado, son endonucleasas que cortan DNA
2. EXO1 exonucleasa, quita fragmentos de DNA dañado
3. RFC funcionan como “pinzas”, proteína que se anclan al DNA para franquear la región, evitan que se peguen otras y atraen ciertas proteínas
4. PCNA estabilizar la polimerasa
5. Cuando las Must cortan, queda DNA de cadena sencilla, por lo cual se unen las RPA 
6. Atraes la Pol δ para completar el fragmento que incidido
7. Ligasa une el fragmento nuevo con la secuencia que ya teníamos
DBR (Double Break Repair)
Rompimiento físico de DNA de cadena doble 
NHEJ (Non-Homologous End Joining)
1. A los dos extremos libres de DNA, se une un complejo llamado DNA-PKcs, formado por 3 subunidades:
2. Catalítica: DNA-PKcs (proteín quinasa)
3. Dos subunidades llamadas KU 70 y KU 80, estas se unen a los extremos y cortan hasta que te queden extremos romo-romo
4. Legan unas MRN que anclan un complejo de proteínas llamada Artemisa
5. Artemisa (RNA recombinasa) tiene la función de unir las cadenas, mediante las KU 
6. Sobre esta unión intervienen la CRCC4 y la Ligasa IV, sellan la unión del DNA, perdiendo algunos nucleótidos en la mayoría de los casos.
HR (Homologous Recombination)
Queda un fragmento muy grande 
1. MRN no pueden cortar todo y se aprovecha el fragmentoque quedó
2. Se unen RPA proteínas de unión a DNA de cadena simple
3. Los Rad51 se unen a la región que se rompió y juntan a la cromátide hermana para deshibridarla.
4. Por complementariedad con Rad51 van a saber cuál es la cromátide hermana y se pega
5. La polimerasa utiliza como molde a la otra cromátida para completar el fragmento que se dañó.
Tipos
Específicas de Locus
Metafase. Unión a región particular del cromosoma. Para determinar en qué cromosoma se encuentra el gen o cuántas copias hay del mismo.
De cromosomas completos 
(SKY)
Metafase. Usando múltiples sondas etiquetadas con una mezcla de diferentes tintes fluorescentes, se etiqueda c/cromosoma en su propio color único. Para anomalías como traslocación.
Repetitivas centroméricas
Interfase. Se genera a partir de cuencias repetitivas ubicadas en el centrómero. Funciona como cariotipo. Puede detectar trisomías.
De Desnaturalizción 
Depende de la cantidad de puentes de H+ que tenga la secuencia a amplificar 
Depende de la capacidad polimerizadora de la polimeraza en nt/s
De Elongación 
Transfecciones Estables (T.E.)
El método más usado para T.E. son vectores virales. El ADN insertado se hereda a su progenie y generan líneas celulares estables.
Transfecciones Transitorias (T.T.)
Existen por un periodo de tiempo limitado, no se transmiten en la división celular.
El ADN foráneo es llevado hasta el núcleo al pasar por la membrana celular y nuclear, es integrado al ADN genómico y expresado de manera sostenible. Usado para tratar enfermedades genéticas.
El ADN foráneo es llevado hasta el núcleo, pero no es integrado al genoma y, así como el mRNA, es traducido para expresar las proteínas. es usado para tratamientos contra el cáncer.
SUPERFICIES
Vidrio: Portaobjetos a los que se fija la sonda mediante grupos reactivos como la polilisina.
Nylon: Se fija la sonda por cargas, el nylon teniendo una carga + atrae al DNA 
Cartuchos especiales: Pequeñas celdillas con oligonucleotidos previamente fijados por el fabricante. 
Los cultivos celulares se sincronizan en el inicio de la fase S con timidina y afidicolina (impiden la progresión de la fase S, pero permiten a la células llegar al inicio de esta fase).
Se permite que la replicación comience (con lavados se retira la afidicolina y timidina para permitir la progresión de la fase S.).
El DNA se fragmenta con enzimas de restricción. (HindIII, EcoRI o DNAsas) y luego se marca con algún fluoróforo.
La muestra se añade al chip.
Estructura génica (circular bicatenaria, descubierta en bacterias) celular capaz de reproducirse independientemente de los cromosomas. 
En su estado silvestre síntetizan moléculas NO esenciales para la vida del organismo, pero que aportan una ventaja de supervivencia bajo condiciones de estrés específico (Ex: resistencia a antibióticos.)
Producción del Plásmido
El plásmido y la secuencia que se desea incorporar son puestos en solución, se añaden enzimas de restricción. Esto genera sitios propicios de unión. Una vez cortados, se incorporan DNA ligasas y ATP para que los fragmentos se unan. No todos los productos son los deseados, hay plásmidos que no se transforman, unión plásmido-plásmido y secuencia-secuencia.
Transformación
Los plásmidos modificados son agregados al medio en el que se encuentran las células. Para que éstas tomen el material se les debe colocar en condiciones de estrés, una manera sencilla es el choque de calor. De la cantidad inicial de células, no todas sobreviven el choque y de las que viven, pocas incorporan el plásmido deseado (1 de cada 10,000).
Los microorganismos necesitan recuperarse y reproducirse. Se les cultiva por 24 horas en un medio nutritivo. Posteriormente, son transferidas a un medio selectivo, normalmente en presencia de medicamentos. Solamente aquellas células que incorporaron el dúplex plásmido-plásmido, el vector transformado o sin transformar sobreviven la transferencia y forman colonias.
Primera Selección
Segunda Selección
Se sabe que todas las colonias han incorporado el plásmido en alguna de sus configuraciones, pero es dificil distinguir exclusivamente a los que se les introdujo el vector con la secuencia. Se realiza una segunda prueba para este fin. Ex: Pérdida de actividad de un gen o dotación de nuevas capacidades a la célula, se pueden hacer experimentos que evalúen este atributo.
MODELOS
Concervativo. De una secuencia de DNA obtenemos un genoma que va a ser conservado y otro con dos copias nuevas. La original se va perdiendo.
Semiconservativo. Cada hebra de DNA actúa como molde para formar una nueva hebra (uniéndose hebra vieja con una nueva).
Mixto. Se tiene partes del genoma original y de la secuencia nueva. Se obtienen fragmetos cruzados.