inbound2557935019907979157 - RICARDO JAIR CASILLAS CORAL

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE 
NAYARIT 
 
UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS QUÍMICO 
BIOLÓGICAS Y FARMACÉUTICAS 
 
 
Manual De Laboratorio De 
Fisiología Bacteriana 
 
ACADEMIA DE 
BIOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Marzo 2021 
INTEGRANTES: 
DR. MARCELO VICTORIO DE LOS SANTOS 
DRA. ADELA Y. BUENO DURÁN 
M. en C. GPE. HERMINIA VENTURA RAMÓN 
M. en C. ANGÉLICA NALLHELY RODRÍGUEZ 
OCAMPO 
DRA. VERONICA A. MONDRAGÓN JAIMES 
DR. CHRISTIAN GONZÁLEZ REYES 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
Debido a que los microorganismos son seres pequeños con un índice de refracción 
cercano al agua, se requieren tinciones biológicas que permitan su visualización al 
microscopio. 
 
Actualmente, las tinciones son utilizadas para evidenciar estructuras celulares tales 
como pared, cápsula, esporas, flagelos, organelos, etc., así como para demostrar 
funciones fisiológicas. Las tinciones que se realizan en el laboratorio se llevan a 
cabo con colorantes derivados de la anilina. Los colorantes derivados de la anilina 
están compuestos por uno o más anillos bencénicos y se asocian a la producción 
de color al oxidarse o reducirse. 
 
Los anillos bencénicos poseen algunos radicales químicos tales como C=C, C=O, 
C=S, C=N, N=N, N=O, etc., los cuales funcionan como cromóforos, el número de 
ellos en una molécula determinará la intensidad del color del compuesto. Los 
colorantes se clasifican en dos grupos: ácidos y básicos de acuerdo a su estructura 
química. De hecho, los colorantes básicos tiñen estructuras celulares ácidas, por 
ejemplo el ADN. Contrariamente, los colorantes ácidos teñirán estructuras básicas, 
por ejemplo, las que se encuentran en el citoplasma. 
Las técnicas de tinción más comúnmente usadas son: 
1. Tinción Simple 
2. Tinción de Gram 
Práctica No. 1 Tinciones Microbiológicas 
A. Tinción de Gram 
 
 
3. Tinción de Cápsula 
4. Tinción de Espora 
5. Tinción para BAAR 
 
Figura 1.1 Morfología bacteriana. Al microscopio es posible observar diferencias morfológicas entre 
las células bacteriana 
 
 
Forma y Tamaño 
Las tinciones usadas en el laboratorio de Microbiología, han permitido identificar 
tres tipos morfológicos celulares; 
1. Cilíndrica (bacilos) (Fig.1.2) 
2. Esférica (cocos) (Fig. 1.3 b) 
3. Espiralada (espirilos) (Fig. 1.3 a) 
Son unicelulares y a menudo se agrupan formando agregados o filamentos. 
Generalmente son muy pequeñas su tamaño es del orden del micrón. 
 Las de forma bacilar generalmente tienen 1 u de diámetro y 5 u de largo, las de 20 
o más micras de largo se consideran "gigantes". Las bacterias gigantes son de 
crecimiento lento, la mayor de ellas es Thiomargarita namibiensis, bacteria esférica 
cuyo diámetro puede alcanzar 0,75 mm. 
 
Figura 1.2 Morfología celular bacteriana. En los esquemas se muestra la morfología típica de los bacilos 
 
Al microscopio los miembros de los géneros Pseudomonas y Bacillus se observan 
como varillas (bacilos) rectos. 
El género Vibrio aparece como un bacilo curvado o forma de coma. 
Corynebacterium tiene forma de maza y tendencia a cambiar de forma. 
Mycobacterium presenta ramificaciones incipientes. 
El género Streptomyces puede formar un micelio. 
El método usual de división en procariotas es la fisión binaria. Tras el alargamiento 
de la célula construyen de fuera hacia dentro paredes transversales que van 
progresando, y las células hijas se separan. Sin embargo, muchas de ellas en 
determinadas condiciones, permanecen unidas durante un cierto tiempo, dando 
origen a agrupaciones características. Según el plano y número de divisiones las 
bacterias esféricas pueden agruparse formando diplococos, estreptococos 
estafilococos y sarcinas. 
En 1844 un médico danés Christian Gram, desarrolló un método de tinción de gran 
utilidad que lleva su nombre. La técnica es valiosa en los laboratorios de 
microbiología y permite revelar los detalles referentes a la forma y agrupación 
bacteriana, así como cualquier otra técnica de tinción. Permite, además, clasificar a 
las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas La figura 1.5 
y 1.6 muestran la estructura y diferencias entre los dos tipos de paredes bacterianas 
Gram positivas y Gram negativas. 
 
Figura 1.3 (a) Morfología clásica de un espirilo. En la fotografía de muestra al espirilo 
Treponema pallidum, la spiroqueta que causa la sífilis.(b) La fotografía muestra la 
morfología celular de los cocos. 
 
Las paredes celulares de ambos grupos, poseen una capa basal de peptidoglicanos 
responsables de la rigidez característica de la pared. Sin embargo, existen 
diferencias estructurales en lo que respecta a las capas más externas. Las bacterias 
Gram positivas están constituidas principalmente por ácidos teicoicos con diversas 
sustituciones químicas (en el caso de las Gram negativas existe una membrana 
externa cuya constitución química es similar a la de cualquier otra membrana 
biológica fosfolípidos y proteínas) pero que poseen además un alto contenido de 
lipopolisacárido (LPS o endotoxina). Como se detalla en la figura 1.6. 
 
Durante el proceso de tinción, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram 
negativas toman el colorante primario. Sin embargo, al aplicar el agente 
decolorante, la pared de las bacterias Gram positivas sufre una deshidratación que 
impide la salida del colorante. En el caso de las bacterias Gram negativas, el agente 
decolorante destruye la integridad de la membrana externa, incrementando así su 
permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario (Fig. 1.7). 
 
 
Figura 1.5 Estructura general de una pared de bacterias Gram positivas. 
 
Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fácilmente en las 
bacterias Gram positivas debido a la deshidratación de la pared, además de que 
estas bacterias quedaron previamente teñidas con el colorante primario. Por el 
contrario, las bacterias Gram negativas se tiñen fácilmente con el colorante de 
contraste. El resultado final es que las bacterias Gram positivas se tiñen de violeta 
y las Gram negativas de rojo (figuras 1.7 y 1.8). 
La tinción de Gram es aplicada en forma universal como primer paso en la 
identificación de las bacterias (Fig. 1.7). Desafortunadamente existen algunos 
grupos bacterianos en los cuales la tinción de Gram no es de utilidad taxonómica, 
por ejemplo: las espiroquetas, los micoplasmas, las micobacterias, las clamidias y 
las rickettsias. 
El método de la tinción de Gram ha sufrido varias modificaciones y algunas de estas 
son incluso mejores que el método original. Los objetivos principales para modificar 
la tinción han sido: 
1. Obtener un colorante primario más estable que el original, ya que éste se 
deteriora rápidamente. 
2. Reducir el tiempo requerido para completar la técnica. 
 
 
Figura 1.6. Estructura general de una pared de bacterias Gram negativas. 
 
 
 PROPÓSITO ESPECÍFICO DE LA PRÁCTICA 
1. El alumno realizará la técnica de tinción de Gram. 
2. Observará y explicará las diferencias tintoriales entre los dos grupos. 
NÚMERO DE ALUMNOS POR UNIDAD DE PRÁCTICA 
Para la realización de la práctica es necesario trabajar en equipo, cada equipo 
estará integrado con un máximo de cuatro estudiantes. 
 
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 
MATERIAL 
Cultivos § S. aureus y K. pneumoniae en agar nutritivo 
§ Cultivo mixto de S. aureus y K. pneumoniae en agar nutritivo 
Reactivos § Juego de reactivos para la Tinción de Gram 
§ KOH al 3% 
 
 
 
Figura 1.7 Tinción de Gram. Etapas para la realización de una tinción de Gram y su observación 
en el microscopio. 
PROCEDIMIENTO 
 
1. Prepare frotis fijos a partir de cada uno de los cultivos y una vez secos, fijar al 
calor pasando la preparación por la llama del mechero unas tres veces. 
2. Cubra el frotis con la solución de cristal violeta (colorante primario). Una o dos 
gotas son suficientes para cubrir el área del frotis. Deje actuar el colorantepor 
15 segundos. Lave con agua corriente. 
3. Sacuda la laminilla para eliminar las gotas gruesas de agua. Aplique la solución 
de yodo (mordiente) y déjela actuar durante 15 segundos. Lave con agua 
corriente de la llave. 
4. Sacuda la laminilla y aplique el alcohol cetona (agente decolorante) durante 3 a 
5 segundos. Lave nuevamente con agua corriente. 
FIJAR LA MUESTRA
CRISTAL VIOLETA
IODO – LUGOL
DECOLORACIÓN
SAFRANINA
GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS
1. Sacuda la laminilla y agregue la fucsina básica (colorante de contraste y déjela 
actuar por 15 segundos). Lave con agua corriente, seque el frotis por presión 
con una toalla absorbente o al aire, y observe al microscopio con el objetivo de 
inmersión (100X). Al microscopio podrá observar las diferencias de coloración 
entre los dos grupos de paredes bacterianas (Fig. 1.8). 
 
Existen algunas variantes que pueden afectar los resultados de la tinción de Gram, 
por ejemplo: 
Las bacterias en los cultivos viejos (más de 24 H de incubación) liberan enzimas por 
autólisis. Estas degradan a la pared celular de las bacterias y modifican sus 
propiedades estructurales, propiciando que las bacterias Gram positivas se tiñan de 
color rojo. 
Esta misma situación se puede presentar al observar frotis directos de los tejidos 
animales infectados. 
i. Una decoloración excesiva puede ocasionar que las bacterias Gram positivas 
se tiñan de rojo. 
ii. Una decoloración deficiente puede ocasionar que las bacterias Gram 
negativas se tiñan de violeta. 
iii. Los frotis gruesos pueden teñirse irregularmente. 
 
 
PRUEBA DE HIDRÓXIDO DE 
POTASIO (KOH) AL 3%. 
 
La prueba de KOH nos 
permite ratificar los 
resultados de la tinción de 
Gram. Esta prueba consiste 
en colocar sobre una laminilla 
una gota de KOH al 3 % y con 
el asa hacer en ella una 
Figura 1.8 Observación microscópica entre 
bacterias Gram + y Gram - 
suspensión de las bacterias 
problema, mezclando con 
movimientos giratorios. 
 
Si al separar el asa de la mezcla se forma una hebra viscosa, esto indica que se 
trata de bacterias Gram negativas. Si la hebra no se forma, se trata de bacterias 
Gram positivas. 
 
SISTEMA DE EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA 
Lineamientos generales para la evaluación. 
La evaluación será de acuerdo con los criterios de desempeño especificados como 
se indicó previamente, además se incluirán preguntas relacionadas con esta 
práctica en la evaluación parcial o final del curso. 
Las destrezas se revisarán durante la práctica y a través de la observación y 
cuestionamientos por parte del maestro, así como las actividades del estudiante. 
Las actitudes se evaluarán a través de la responsabilidad del estudiante ante su 
práctica y su entorno. 
Evaluación intermedia: Los puntos a evaluar en esta parte intermedia de la 
práctica son: 
I. Forma de trabajar en equipo 
II. Manejo de la técnica 
III. Manejo del equipo de manera correcta 
IV. Recomendaciones para continuar el desarrollo de la práctica 
Método de asignación de calificaciones de la práctica 
Se calificará bajo los siguientes criterios: originalidad, redacción, ortografía y 
presentación; el formato incluye introducción, propósito, revisión de literatura, 
materiales y métodos, resultados, discusión, conclusiones, cuestionario y literatura 
citada. Se utilizará una escala del 1 al 100 y tendrá un valor del 5% de la calificación 
total del curso. 
 
RESULTADOS 
Realice esquemas de sus resultados y discútalos con fundamentos bibliográficos. 
1. Observe como responde a la tinción de Gram los cultivos que se le 
proporcionaron. Anote sus observaciones. 
2. Anote la morfología celular y la agrupación bacteriana de los cultivos 
proporcionados. 
3. Anote los resultados obtenidos con el KOH. 
4. Esquematice cada una de sus observaciones. 
5. Incluye tus laminillas en tu reporte. 
 
CUESTIONARIO 
1. Enliste un mínimo de 5 géneros bacterianos Gram positivos y un mínimo de 5 
para Gram negativos, de importancia médica, veterinaria e industrial. 
2. Realice un esquema topológico de la estructura de la pared de las bacterias 
Gram positivos y de las Gram negativos. 
3. Con base a la pared celular de las paredes de Gram positivos y Gram negativos, 
explica que acción ejerce el alcohol en cada una de ellas. 
4. Explique el papel que desempeña el mordiente en la tinción. 
5. Explica la teoría más aceptada para explicar las diferencias tintoriales en la 
técnica de Gram. 
 
BIBLIOGRAFÍA 
Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas Color. Koneman, EW., Allen, SD., Janda, 
WM., Schreckenberger PC., Winn WC. Editorial Médica Panamericana. Quinta 
edición, 2008. 
 
 
INTRODUCCIÓN 
Las bacterias ácido alcohol resistentes forman un grupo de microorganismos que 
se definen en base a sus propiedades tintoriales. Son relativamente impermeables 
a los colorantes básicos, pero una vez teñidos, retienen el colorante con tenacidad, 
resistiendo la decoloración con solventes orgánicos acidificados (por ejemplo, 
alcohol-ácido). 
 
La resistencia al alcohol-ácido está determinada por la pared celular, la cual además 
de contener peptidoglicano, está constituida por un alto porcentaje de glicolípidos 
hidrofóbicos. Un componente importante de estos, son los ácidos micólicos (Fig. 
1.9). La presencia de estas capas hidrofóbicas previene la penetración de 
soluciones acuosas, siendo esta la causa por la cual estos microorganismos no 
pueden teñirse con los métodos convencionales (tinción de Gram). 
 
Uno de los métodos más comúnmente usados para demostrar la resistencia al ácido 
alcohol es el método de Ziehl-Neelsen. En este método la penetración del colorante 
primario se facilita debido a que este se encuentra disuelto en fenol y a que es 
aplicado en presencia de calor. 
 
Práctica No. 1 Tinciones Microbiológicas 
B. Tinción de BAAR 
 
 
 
 
 
Fig. 1.9 Estructura general de la pared de una bacteria ácido alcohol resistente. 
 
 
Una vez que el colorante penetra a la célula bacteriana, este se combina con las 
mismas estructuras con las que se combina en cualquier otra bacteria (ácidos 
nucleicos, proteínas, etc.) y además reacciona con ácidos micólicos libres, lo cual 
hace que la pared celular se vuelva aún más hidrofóbica. 
 
Con la tinción de Ziehl-Neelsen, tanto las bacterias ácido alcohol resistentes como 
el no ácido alcohol resistentes se tiñen con el colorante primario. Sin embargo, al 
aplicar el agente decolorante, compuesto por una mezcla de alcohol ácido, éste no 
solubiliza los lípidos de la pared de las bacterias ácido alcohol resistentes, y por lo 
tanto no se decoloran. Las bacterias no ácido alcohol resistentes se decoloran 
fácilmente, por lo que se vuelven a teñir al aplicar el colorante de contraste (figura 
1.10). 
 
Este grupo de bacterias está representado principalmente por el género 
Mycobacterium. Algunas especies de este género juegan un papel muy importante 
como agentes etiológicos de la tuberculosis y otras enfermedades crónicas 
granulomatosas tanto en el hombre como en los animales. 
 
Figura 1.10. Bacilos ácido alcohol resistentes teñidos con la técnica de Ziehl-Neelsen. 
En el análisis de un frotis de material clínico sospechoso de contener bacilos de la 
tuberculosis, el hallazgo de un solo bacilo ácido alcohol resistente puede tener valor 
diagnóstico, ya que en la mayoría de los casos no son abundantes. Sin embargo, la 
interpretación del hallazgo de bacilos ácido alcohol resistentes debe de hacerse con 
cautela y con base a la historia clínica y otras pruebas de laboratorio, ya que la 
presencia de especies saprófitas de Mycobacterium podría conducir a un 
diagnóstico falso. Por otra parte, existen algunas especies de Corynebacterium y 
Nocardia que ocasionalmente pueden comportarse como bacterias ácido alcohol 
resistentes. 
 
 PROPÓSITO ESPECÍFICO DE LA PRÁCTICA 
 
1. El alumno realizarála técnica de tinción de Ziehl- Neelsen para la 
observación de bacterias ácido alcohol resistentes. 
2. Conocerá la importancia en patogenicidad de las especies de 
Mycobacterium. 
3. Describirá los componentes de las paredes de bacterias ácido alcohol 
resistentes 
Bacilos ácido alcohol 
resistentes
NORMAS DE SEGURIDAD ESPECÍFICAS DE LA PRÁCTICA 
Normas de seguridad específicas 
Las referidas en las prácticas generales de seguridad. 
 
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 
 
MATERIAL 
Material § Palillos de madera estériles 
§ Papel filtro 
Equipo § Platinas con regulación de temperatura 
Material Biològico § Espectoraciones frescas de sujetos sanos 
Reactivos § Juego de reactivos de Ziehl Neelsen 
 
PROCEDIMIENTO 
 
Utilizando una sola laminilla prepare dos frotis a partir de las muestras que se le 
proporcionarán, utiliza palillo de madera, no use asa de platino. Fíjelos en una 
platina caliente. Tíñalos siguiendo la técnica de Ziehl Neelsen. 
 
TINCIÓN DE ZIEHL NEELSEN. 
 
1. Coloque un trozo de papel absorbente sobre el frotis, el cual debe ser más 
pequeño que la superficie de la laminilla. 
 2. Humedezca el papel con la fucsina fenicada (colorante primario) 
 y coloque el frotis sobre una caja de petri y ésta sobre la platina 
 caliente (700C). Continúe agregando colorante para evitar que el 
 frotis se seque. Permita la emisión de vapores durante 5 
 minutos. Retire el frotis de la platina, quíte el papel, déjelo 
 enfriar y lave con agua corriente de la llave. 
 3. Decolore con el alcohol ácido, permitiéndole actuar durante 2 
 minutos. Es importante realizar la decoloración perfectamente, 
 ya que de no ser así se corre el riesgo de observar reacciones 
 falsas positivas. Lave con agua corriente de la llave. 
 4. Contraste con azul de metileno de Loeffler durante 1 minuto 
 Lave con agua corriente, seque y observe al microscopio con el 
 objetivo de inmersión. 
 5. Los microorganismos ácido alcohol resistentes se tiñen de color 
 rojo, el no ácido alcohol resistentes de color azul. 
 
SISTEMA DE EVALUACIÓN DE LA PRÁCTICA 
Lineamientos generales para la evaluación. 
La evaluación será de acuerdo con los criterios de desempeño especificados como 
se indicó previamente, además se incluirán preguntas relacionadas con esta 
práctica en la evaluación parcial o final del curso. 
Las destrezas se revisarán durante la práctica y a través de la observación y 
cuestionamientos por parte del maestro, así como las actividades del estudiante. 
Las actitudes se evaluarán a través de la responsabilidad del estudiante ante su 
práctica y su entorno. 
Evaluación intermedia: Los puntos a evaluar en esta parte intermedia de la 
práctica son: 
i. Forma de trabajar en equipo 
ii. Manejo de la técnica 
iii. Manejo del equipo de manera correcta 
iv. Recomendaciones para continuar el desarrollo de la práctica 
 
Método de asignación de calificaciones de la práctica 
Se calificará bajo los siguientes criterios: originalidad, redacción, ortografía y 
presentación; el formato incluye introducción, propósito, revisión de literatura, 
materiales y métodos, resultados, discusión, conclusiones, cuestionario y literatura 
citada. Se utilizará una escala del 1 al 100 y tendrá un valor del 5% de la calificación 
total del curso. 
 
RESULTADOS 
 
1. Esquematice sus resultados para ambas tinciones 
2. Señale en sus observaciones, la morfología bacteriana encontrada y como 
respondieron a la tinción, así como el tipo de células encontradas. 
 
CUESTIONARIO 
 
1. Mencione la importancia en patogenicidad de los componentes de la pared celular 
de Mycobacterium tuberculosis. 
2. Mencione la utilidad taxonómica y diagnóstica de la tinción de Ziehl Neelsen. 
3. Investigue la razón por la cual los BAAR no se decoloran con el alcohol ácido. 
4. Explique el fundamento de las tinciones realizadas. 
5. Menciona en qué tipo de muestras se investiga BAAR. 
6. Explique por qué no se recomienda utilizar el asa de nicromo para la extensión 
del frotis. 
7. Enliste 5 especies de bacterias ácido alcohol resistentes de importancia médica 
y veterinaria. 
 
BIBLIOGRAFÍA 
Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas Color. Koneman, EW., Allen, SD., Janda, 
WM., Schreckenberger PC., Winn WC. Editorial Médica Panamericana. Quinta 
edición, 2008. 
 
 
OBJETIVO 
Practicar las diferentes técnicas de siembra para el desarrollo de cultivos de 
bacterias, en medios de cultivo en caja de Petri y en tubos microbiológicos. 
Desarrollar en los estudiantes, la capacidad de selección de una metodología 
específica de acuerdo a los criterios proporcionados, para la aplicación correcta de 
las técnicas de siembra según el microorganismo y la finalidad de la prueba. 
INTRODUCCION 
La caracterización de los microorganismos se basa en la observación de las 
características microscópicas y de desarrollo que presentan en diferentes medios 
de cultivo. Esto último, se aplican técnicas de siembra o de inoculación específicas 
para cada microorganismo y de acuerdo a la presentación del medio. 
Se denomina “siembra”, al proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos 
cultivables en medios de cultivos; esto se realiza a partir de muestras biológicas 
(orina, secreciones corporales, heces fecales, etc), de análisis para control de 
calidad (alimentos, agua, medicamentos, cosméticos, etc), de muestras 
ambientales (agua, suelo, aire, etc) o de un cultivo microbiano a otro (subcultivo o 
replique). 
La formación de colonias visibles en determinados medio de cultivos, presentan 
características particulares que permite diferenciar a los microorganismos. Es 
importante señalar que las colonias provenientes de un mismo microorganismo 
deben ser iguales en forma, tamaño y color, mientras que al microscopio deben 
presentar las mismas características morfológicas y tintoriales. También como parte 
de la identificación bacteriana, es posible evaluar el comportamiento de las bacterias 
Práctica No. 2 Técnica de Siembra y Cultivo 
Bacteriano 
 
 
frente a diferentes compuestos nutritivos o proporcionarles aquellos nutrientes 
adecuados para favorecer su desarrollo. 
Existen técnicas adecuadas para realizar el cultivo de bacterias donde se utilizan 
elementos indispensables para lograr tal objetivo, como mechero de bunsen o 
Fisher, asa bacteriológica estéril, cámara de flujo laminar o un espacio adecuado en 
condiciones asépticas y medios de cultivos ya preparados y atemperados (éste 
último de gran importancia, ya que los microorganismos en estudio, deben evitarse 
ser estresados por cambios bruscos de temperatura u otros factores). 
TÉCNICAS DE SIEMBRA 
La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la 
transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de 
cultivarlos. Sin embargo, para lograr su identificación mediante la evaluación de las 
características coloniales en los diferentes medios de cultivo, es preciso obtenerlas 
de manera pura (cultivo axénico). 
Existen una gran variedad de técnicas de siembras donde diferentes especies de 
bacterias en una muestra natural pueden ser aisladas en cultivo puro; a 
continuación, se describen diferentes técnicas de siembras para bacterias. 
TÉCNICAS DE SIEMBRA EN CAJA PETRI 
a) Siembra en caja Petri por Técnica de estría cruzada, de 
agotamiento o aislamiento. 
Es un buen método para el aislamiento de colonias (obtención de colonias aisladas), 
mediante esta técnica buscamos obtener colonias separadas a partir de un inóculo. 
Para su realización: 
i. Se coloca la caja de Petri en la palma de la mano y ligeramente inclinada; con la 
mano contraria, se toma el asa bacteriológica previamente esterilizada por flameado 
directo a la llama y con ella se recoge la muestra a inocular, se coloca en un área 
periférica de la caja haciendo movimientos circulares para homogenizar el inóculo. 
ii. Con el asa nuevamente flameada y enfriadaen un lateral del agar, se realiza una 
estría partiendo el inóculo depositado y arrastrando los microorganismos presentes 
en él hacia el extremo contrario de la superficie del agar y regresando nuevamente 
al área de inóculo para arrastrar nuevamente hacia el lado contrario. Se continúa 
realizando varias estrías trazadas de manera separada sobre la superficie del agar 
(evitar tocar el área, previo a ésta sección). 
iii. Repita el paso ii por dos veces más (es aceptable hasta tres), recordando flamear 
y enfriar el asa cada vez que se realice una sección de estriado, esto permitirá ir 
reduciendo la cantidad de microorganismos que serán arrastrados por el asa. 
Finalmente se esteriliza el asa antes de desocuparla (Figura 2.1). 
 
 
 
 
 
 
 
b) Siembra en caja de Petri por Técnica de siembra en cuadrantes 
El objetivo de esta técnica, es el de diluir el inóculo a medida que se realizan estrías 
en la superficie del agar. Para realizar la siembra, la caja se divide en cuatro 
cuadrantes (imaginariamente o con el uso de un marcador); se esteriliza el asa 
bacteriológica y se enfría, se toma el inóculo y se inicia el estriado de la superficie 
del agar en cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o 
tomar nuevamente inóculo). Las cajas así sembradas, se incuban a la temperatura 
adecuada según la bacteria. Con esta técnica se espera que en el único cuadrante 
se encuentren colonias de la bacteria aisladas (Figura 2.2). 
Figura 2.1. Pasos para la siembra de bacterias por la técnica de agotamiento 
 
 
c) Siembra en caja de Petri por Técnica de siembra masiva 
Este método es muy utilizado para obtener un gran número de microorganismos 
(incremento de inóculo), en la superficie de la placa en distintas direcciones y 
finalmente por el borde para que el crecimiento de los microorganismos sea total en 
la superficie de la placa (Figura 2.3). 
 
 
 
 
 
 
 
TÉCNICA DE SIEMBRA EN MEDIOS CONTENIDOS EN TUBOS 
La siembra de medios en tubos requiere de mayor cuidado, debido a que un solo 
organismo contaminante del aire puede superar en crecimiento al microorganismo 
de interés, por lo tanto, se deben tener las siguientes precauciones: 
Figura 2.2. Técnica de siembra en cuadrantes, donde se observan las cuatro zonas 
de estrías realizadas una a continuación de la otra, sin cargar el asa nuevamente. 
Figura 2.3. Técnica de siembra en masivo, utilizando hisopos estériles y sobre la 
superficie de un agar en caja de Petri. 
1. Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo 
que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en 
la boca de éste. 
2. Los tapones se deben mantener en la mano contraria a aquella que contiene el 
tubo, sosteniéndolos entre el dedo meñique, el anular y el dedo del corazón. Nunca 
deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar. 
3. Flamear la boca del tubo antes de cerrarlo, después de la siembra o inoculación. 
4. Esterilizar el asa adecuadamente (toda la porción que entra en contacto con el 
medio de cultivo). 
5. Sumergir el asa en el medio de cultivo sin tocar las paredes del tubo. 
6. Enfriar el asa en una parte del medio, sin deteriorar el mismo. 
7. Después de realizar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca 
del tubo. 
8. Trabajar en campana de flujo laminar o en su defecto con mechero de Bunsen. 
9. En las siembras por picadura y mixtas, evite romper el medio de cultivo y utilice 
asas totalmente rectas. 
a) Siembra en tubos por estría simple 
Se realiza en un tubo con medio sólido inclinado (en bisel o pico de flauta), 
deslizando el asa sobre la superficie expuesta del agar de manera que se marquen 
surcos o estrías (Figura 5A). 
b) Siembra mixta en tubos (picadura y estría) 
Se realiza sobre medios inclinados o en pico de flauta, haciendo una picadura hasta 
poco antes del fondo del tubo con asa recta y luego continuando la siembra en estría 
deslizando el asa sobre el pico de flauta marcando las estrías (Figura 2.4B). 
c) Siembra en tubos por picadura 
Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con el asa recta en tubos 
con medios sólido y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo 
el asa cargada con el inóculo al medio de cultivo por el centro de la superficie y 
llegando con el extremo del asa hasta poco antes del fondo del tubo (Figura 2.4 C 
y D). 
d) Siembra en tubo en medio líquido 
Para transferir material a partir de un medio líquido o sólido a otro líquido, puede 
usarse el asa bacteriológica con aro, o en algunos casos pipetas estériles o hisopos. 
Si se utiliza el asa bacteriológica, se inocula el microorganismo en el medio líquido 
haciendo rotar del mango (Figura 2.4 E). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MATERIAL 
Material § 2 Asas bacteriológicas 
§ 2 hisopos 
 
 
 
Equipo § Incubadora a 37°C 
§ Mechero Fisher 
 
 
 
Material Biológico § Cultivo bacteriano de las cepas: 
 E. coli, Klebsiella sp., Proteus sp., S. aureus 
Figura 2.4. Técnica de siembras aplicadas a medios de cultivos contenidos en tubos. 
(A) Siembra por estría simple, (B) siembra mixta (picadura y estría), (C y D) siembra por 
picadura en agar inclinado y recto, y (E) siembra en medio de cultivo líquido. 
Reactivos § 6 cajas Petri con agar nutritivo 
§ 2 tubos con caldo nutritivo 
§ 2 tubos con agar SIM 
§ 4 tubos con agar nutritivo inclinado 
§ 2 tubos con agar nutritivo inclinado 
 
PROCEDIMIENTO 
De acuerdo a los fundamentos encontrados en la introducción de esta práctica y a 
las instrucciones del profesor, realice las siembras según se indica a continuación: 
1. Siembre el inóculo de la cepa que le corresponde a su equipo en: 
a. tubos con agar semisólido (medio SIM) por la técnica de siembra por 
picadura. 
b. tubo con agar inclinado por la técnica de estría simple. 
c. tubo con agar inclinado por la técnica mixta (picadura y estría). 
d. tubo con caldo nutritivo por la técnica de agitación. 
2. Siembre el inóculo en caja de Petri con agar nutritivo mediante: 
a. la técnica de estría cruzada (de agotamiento o aislamiento). 
b. la técnica en cuadrantes. 
c. la técnica masiva (con ayuda de un hisopo). 
 
CUESTIONARIO 
1. ¿Cuál es la finalidad de una siembra por agotamiento? 
2. Describa el proceso de aislamiento de una bacteria que se encuentra en un exudado 
faríngeo 
3. ¿Qué utilidad tiene la siembra en masivo? Exponga ejemplos. 
 
BIBLIOGRAFÍA 
Madigan, M.T., Martinko, J.M. y Parker J. 2003. Brock: Biología de los 
Microorganismos. Editorial Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 10ª. Ed. Madrid. 
1011p. 
Rojas-Tiviño, A. 2011. Conceptos y Práctica de Microbiología Genral. Universidad 
Nacional de Colombia. Sede Palmira. Colombia. 161p. 
 
 
 
OBJETIVO 
Identificar las fases de una curva de crecimiento bacteriano en cultivo y aprender la 
técnica de dilución y cuenta en placa para cuantificar microorganismos viables. 
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
1. Observar la dinámica del crecimiento bacteriano mediante una curva de 
crecimiento. 
2. Determinar el tiempo de generación utilizando dos métodos de 
mediciones bacterianas. 
3. Relacionar la importancia de cada uno de los métodos utilizados. 
INTRODUCCION 
Para el estudio del crecimiento de la población bacteriana se requiere la inoculación 
de células viables en un caldo estéril y la incubación del cultivo bajo condiciones 
óptimas de temperatura, pH y O2 o CO2. Bajo estas condiciones, las células se 
reproducen rápidamente y la dinámica del crecimiento microbiano puede ser 
seguido mediante una curva del crecimiento donde se grafica el incremento de 
número de células versus el tiempo de incubación y puede ser utilizado para 
delimitar las fases del ciclo celular. También facilita las mediciones del número de 
células y la velocidad del crecimiento de un organismo determinado bajo 
condiciones estandarizadas como es expresada porsu tiempo de generación, 
tiempo requerido para que una población microbiana se duplique. 
Práctica No. 3 Curva de Crecimiento y 
Dilución en Placa 
 
 
 
Las fases de una curva de crecimiento típica son (Ver Figura 3.1): 
 
1. Fase Lag: En esta fase las células se adaptan a su nuevo ambiente; el 
metabolismo celular se acelera provocando una rápida biosíntesis de 
macromoléculas celulares, principalmente enzimas; es la preparación para la 
siguiente fase del ciclo. Aunque las células son incrementadas de tamaño, 
no hay división celular y por lo tanto no hay aumento en número. 
2. Fase exponencial o Log (logarítmica): Bajo condiciones físicas y 
nutricionales óptimas, las células se reproducen a una velocidad rápida y 
uniforme mediante fisión binaria. Además hay un rápido crecimiento 
exponencial dentro de la población, la cual se duplica regularmente hasta 
alcanzar un número máximo de células. La longitud de la fase log varía 
dependiendo del organismo y de la composición del medio, aunque el 
promedio estimado puede ser de 6 a 12 horas. 
3. Fase estacionaria: Durante esta fase el número de células que se 
encuentran en división es igual al número de células que mueren. No hay un 
incremento en el número de células y la población se mantiene en su nivel 
máximo por un período de tiempo. Los factores primarios responsables para 
esta fase son la depleción de metabolitos esenciales y la acumulación de 
productos tóxicos ácidos y alcalinos en el medio. 
4. Fase de muerte: Debido al agotamiento continuo de nutrientes y a la 
acumulación de desechos metabólicos, los microorganismos mueren a una 
velocidad constante. Esta disminución en la población es cercanamente 
paralelo al incremento durante la fase log. Teóricamente, la población entera 
debería morir durante un intervalo de tiempo igual que en la fase log, sin 
embargo esto no ocurre, debido a un número pequeño de organismos 
altamente resistentes que persisten por un lapso de tiempo indeterminado. 
 
Para la construcción de una curva de crecimiento bacteriano se requiere la 
medición de alícuotas de cultivos que se han mantenido en agitación constante 
por intervalos de tiempo durante un período prolongado, sin embargo, tal 
procedimiento no se presta para realizarse en una sesión de laboratorio, por lo 
que se ha diseñado un experimento que incluye solamente la fase lag, log y 
posiblemente la fase estacionaria de crecimiento de la población. 
 
 Figura 3.1. Curva de crecimiento de una población bacteriana. 
 
Existen dos métodos utilizados para este propósito: 
a) Método directo. Este método requiere el uso de diluciones seriadas que se 
siembran en placas siguiendo un orden y con intervalos de 30 minutos. Se 
calculan las unidades formadoras de colonias (UFCs) en un tiempo 
determinado. 
b) Método indirecto. Se realiza mediante una extrapolación de la fase log como 
se ilustra en la Figura 2.2. Se seleccionan dos puntos en la escala de la 
densidad óptica, tales como 0.4 y 0.8. Con la ayuda de una regla se extrapola 
dibujando una línea entre las densidades ópticas seleccionadas en el eje de 
las ordenadas y la línea de la curva de crecimiento correspondiente. Después 
se dibujan líneas perpendiculares de esos puntos sobre la línea de la curva 
de crecimiento hasta sus respectivos intervalos de tiempo sobre la abscisa 
(Figura 2.2). Con esta información, se determina el tiempo de generación 
utilizando la siguiente fórmula: 
 
 
Para la determinación del tiempo de generación en el método directo, se usa el 
número de células en fase log de la escala de la curva de crecimiento y la siguiente 
fórmula: 
 
 
 
Donde GT= Tiempo de generación, B= Número de UFCs en algunos puntos de la 
fase log, b= número de células bacterianas en un segundo punto de la fase log y 
t= tiempo en horas o minutos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.2. 
Representación gráfica del método indirecto de mediciones del crecimiento 
bacteriano, densidad óptica vs tiempo. 
 
GT = t2(O.D. ) – t1(O.D.) 
 
GT= t log 2/[log b - log B] 
 
El tiempo de generación es determinado utilizando dos puntos dentro de la porción 
exponencial de la curva de crecimiento donde la población duplica en tamaño, en 
este ejemplo: GT= t(O.D.1) - t(O.D.2)=263 minutos – 222 minutos= 43 minutos, así que el 
tiempo de generación de esta población hipotética es de 43 minutos. 
 
I. Mediciones indirectas del crecimiento bacteriano. 
Espectrofotometría y densidades ópticas. 
 
MATERIAL 
• 100 mL de Caldo LB o Nutritivo 
• Cultivo bacteriano de la cepa bacteriana E. coli 
• 4 asas bacteriológicas 
• 1 Incubadora a 37ºC 
• 1 juego de micropipetas de volumen variable (200-1000 µL, 20-200 µL y 1-
10 µL) 
• 1 caja de cada volumen de puntillas para micropipetas estériles 
• 4 Mecheros Fisher 
• 2 Espectrofotómetros 
• 1 caja de cubetas de polipropileno 
 
PROCEDIMIENTO 
3. Seleccionar una colonia bacteriana con un asa bacteriológica estéril y 
depositarla en medio LB o en caldo nutritivo. 
4. Realizar la primera lectura en un espectrofotómetro a 600nm. Utilizar como 
blanco el medio utilizado para el cultivo. 
5. Incubar el cultivo a 37°C en agitación constante y después de 30 minutos realizar 
una segunda lectura a 600nm. 
6. Repetir el punto 3 hasta completar un total de 4 lecturas. 
7. Graficar cada uno de los puntos obtenidos contra tiempo de crecimiento y 
calcular el tiempo de generación. 
 
II. Mediciones directas del crecimiento bacteriano. Diluciones 
seriadas y conteo de placa. 
 
MATERIAL 
• Cultivo bacteriano de la cepa bacteriana E. coli en TSB inoculadas a 
diferentes tiempo 
• 4 tubos de ensaye 13x100 mm con 9.9 mL de agua 
• 16 tubos de ensaye 13x100 mm con 9.0 mL de agua 
• 16 cajas con agar TSA 
• Vaso precipitado con alcohol al 95% 
• 4 matraces de Erlenmeyer de 125 mL estériles 
• 1 Incubadora-agitador (Shaking) 
• 1 Incubadora a 37ºC 
• 4 juegos de micropipetas de volumen variable (200-1000 µL, 20-200 µL y 1-
10 µL) 
• 1 caja de cada volumen de puntillas para micropipetas estériles 
• Mechero de Fisher 
• Varillas de vidrio 
• Tornamesas 
 
PROCEDIMIENTO 
Día uno: 
1. El cultivo bacteriológico se inoculará previo a la clase y se incubará a 37°C en 
una incubadora con agitación. 
2. Tomar la primera lectura correspondiente al tiempo 0 y realizar el resto de las 
lecturas cada 30 minutos por un total de 4 tiempos. 
3. Marcar 5 tubos como 10-2 (tubo con 9.9mL de agua), 10-3, 10-4, 10-5 y 10-6 (tubos 
con 9.0mL de agua) y 4 cajas de Petri como 10-4, 10-5, 10-6 y 10-7, por cada 
tiempo, estas marcas corresponden a las diluciones que se realizarán según el 
diagrama 1. 
4. Tomar 100 µL de cultivo y agregar al tubo 10-2 (blanco). Mezclar el tubo 
rodándolo entre las manos. 
5. Remover 1mL de la dilución blanco (tubo 10-2) y transferir al tubo 10-3. Mezclar 
el tubo rodándolo entre las manos y continuar con los siguientes tubos según el 
diagrama 3.1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. Tomar 100 µL de cada dilución y colocarla en su respectiva caja con agar TSA. 
7. Esterilizar la varilla de vidrio de la siguiente manera: primero sumergir en alcohol 
al 95% y posteriormente flamear hasta la evaporación del alcohol (Figura 3.3). 
8. Expandir el inóculo sobre la superficie del agar por rotación del plato mientras 
que la varilla fría se rueda ligeramente a través de la superficie del agar. 
9. Permitir que el inóculo se seque en el agar e incubar las cajas invertidas a 37°C. 
 
 
 
 
Diagrama 3.1 
 
 
 
 
Día dos: 
1. Contar el número de colonias de cada caja, tomar nota. 
2. Por cada kit de tiempo, mantener solamente aquellas cajas que contienen entre 
30 y 300 colonias, descartar el resto. Si más de algún plato contiene 30-300 
UFC, obtener el promedio. 
3. Determinar el número de UFC/mL del cultivo original para cada kit de tiempo. 
4. Reportar y discutir. 
 
CUESTIONARIO 
4. ¿Tiene el mismo el mismo significado eltérmino “crecimiento” cuando se aplica 
a una bacteria y a organismos multicelulares? Explique. 
5. ¿Por qué existe variación en el tiempo de generación: 
a. entre diferentes especies de microorganismos? 
b. dentro de una misma especie microbiana? 
6. ¿El tiempo de generación es un parámetro útil para indicar los tipos de medios 
adecuados para el crecimiento de un organismo específico? Explique. 
 
 
 
 
OBJETIVO 
 
Comparar la susceptibilidad de diferentes organismos ante diferentes factores 
físicos, observando sus modificaciones en el crecimiento. 
 
INTRODUCCION 
 
Las actividades de los microorganismos se ven muy afectadas por las condiciones 
químicas y físicas del medio. El conocimiento de los efectos ambientales nos permite 
explicar la distribución de los microorganismos en la naturaleza y hace posible diseñar 
métodos que controlen o potencien las actividades microbianas. A este respecto se 
pueden considerar muchos factores ambientales, pero hay cuatro factores que tienen 
una función destacada en el control del crecimiento microbiano: la temperatura, el pH, 
la disponibilidad de agua y el oxígeno. Los microorganismos pueden ser eliminados, 
inhibidos o muertos por agentes físicos, procesos físicos o agentes químicos. Es unos 
de los factores físicos ambientales más importantes, que influyen en el crecimiento. 
La temperatura ambiental es uno de los factores físicos más importantes que afectan 
directamente el funcionamiento de las enzimas bacterianas, mismas que se inactivan por 
debajo de la temperatura mínima y por encima de la máxima. Mientras que la temperatura 
óptima de crecimiento de un microorganismo es la temperatura a la cual se multiplica a su 
máxima velocidad. 
Por otro lado, el crecimiento bacteriano también es afectado por las cantidades de agua 
que entran a la célula o salen de ella. Cuando el medio que rodea a un organismo contiene 
una menor cantidad de solutos que la célula, es decir, un medio hipotónico, resulta una 
presión osmótica mayor dentro de la pared, excepto para algunas especies marinas que no 
son afectadas. La pared celular de la mayoría de las bacterias es tan fuerte y rígida, que 
generalmente es inapreciable un hinchamiento celular ligero. 
Práctica No. 4 Factores Físicoquímicos que 
Afectan el Crecimiento Bacteriano 
 
 
Sin embargo, cuando las bacterias son colocadas en una solución hipertónica (contiene 
más cantidad de solutos que la célula) su crecimiento puede ser inhibido 
considerablemente. El grado de inhibición dependerá del tipo de soluto y de la naturaleza 
del organismo; el citoplasma se deshidrata y el agua sale de la célula causando una 
plasmólisis. En estos casos la célula es inhibida en ausencia de agua celular suficiente. En 
casos extremos hay una inactivación enzimática permanente y las células no se recuperan 
en soluciones isotónicas. 
MATERIAL POR EQUIPO 
• Lámpara de luz ultravioleta 
• Espectrofotómetro 
• Asas bacteriológicas 
Micropipetas de volumen variable (200-1000 µL, 20-200 µL y 1-10 µL) 
• Incubadora (4°, 25°, 37° y 50°C) 
• Cultivos de E. coli, Pseudomona fluorescens y/o aeruginosa, Serratia 
marcescens y Staphylococcus aureus. 
• Cultivos en caldos nutritivos con E. coli y Bacillus sp. 
• 4 tubos con caldo nutritivo 
• tubos con caldo nutritivo a diferentes pH (2, 5, 7 y 9) 
• Discos con antibióticos o impregnados con desinfectantes comunes (cloro, 
iodo, violeta de genciana, merthiolate) 
• 5 cajas Petri con agar nutritivo o cuenta estándar 
 
I. PROCEDIMIENTO 
Factores físicos. Temperatura 
1. En un tubo con 3 ml de caldo nutritivo, resuspender varias asadas de su cultivo de 
24h. 
2. Inocular con 0.1 ml ó 2 gotas cada uno de los tubos que se incubaran a las 
diferentes temperaturas. Marcar cada tubo. 
3. Incubar durante 24 horas a las diferentes temperaturas. 4, 25, 37, 50oC. 
4. Registrar el grado de turbidez en cruces, anotando sus resultados en una tabla. 
5. Hacer una gráfica indicando crecimiento y temperatura de cada uno de sus 
microorganismos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Radiación ultravioleta 
1. Marcar cinco cajas Petri con agar nutritivo de acuerdo a los siguientes tiempos de 
exposición 0, 30, 60, 90 y 120 segundos. 
2. Depositar dos gotas de inóculo. 
3. Sembrar masivamente con un asa o con una varilla acodada a su microorganismo 
en las cajas de Petri. 
4. Dejar una caja sin irradiar. 
5. Las cajas restantes destaparlas e irradiarlas con luz ultra violeta durante el tiempo 
indicado. 
6. Tapar las cajas e incubarlas a 370C durante 24 horas. 
7. Registrar el grado de crecimiento en cruces, anotando sus resultados en una tabla 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tubo 
1 
Tubo 
2 
Tubo 
3 
Tubo 
4 
Temp°C 4° 25° 37° 50° 
Crecimiento 
 
Caja 
1 
Caja 
2 
Caja 
3 
Caja 
4 
Caja 
5 
Tiempo de exposición (seg) 0 30 60 90 
 
120 
Crecimiento 
II. FACTORES QUÍMICOS. 
Efecto del pH 
 
1. En un tubo con 3 ml de caldo nutritivo, resuspender varias asadas de su cultivo de 24 
h. 
2. Inocular con 2 gotas a cada uno de los tubos con los diferentes pH. 
3. Incubar a 37ºC por 24 horas. 
4. Anotar en una tabla sus resultados, registrando el grado de turbidez en cruces. 
5. Hacer una gráfica para cada uno de sus microorganismos respecto a su crecimiento 
en las diferentes concentraciones de pH. 
 
 
 
 
 
 
Antibióticos 
1. En una caja Petri con agar nutritivo, adicionar cinco gotas de la suspensión del 
microorganismo en el centro. 
2. Realizar la dispersión con una varilla acodada. 
3. Con unas pinzas estériles colocar en la superficie de la caja el multidisco impregnado 
con antibióticos, tratando de que quede colocado en el centro de la misma, presionar 
suavemente. 
4. Después de 15min de haber colocado el disco, invertir la caja y pasar a la incubadora 
de 35–37°C por 18 a 24 Hrs. 
5. Observar el crecimiento obtenido en la placa. 
6. La medición de los halos de inhibición se hace con una regla, por el fondo de la caja 
la cual se ilumina con luz reflejada. 
7. En el caso de utilizar discos de papel filtro impregnados con desinfectantes comunes, 
colocar los discos de tal manera que estén bien distribuidos en la caja y que no 
queden cerca de los extremos de la misma. 
8. Seguir los pasos 5 y 6. 
 
CUESTIONARIO 
1. Haga una discusión de los resultados obtenidos con las diferentes temperaturas y 
determine las temperaturas cardinales para su microorganismo. 
 
Tubo 
1 
Tubo 
2 
Tubo 
3 
Tubo 
4 
pH 3 5 7 9 
Crecimiento 
2. Investigue y dé ejemplos del efecto y uso de las temperaturas sobre los 
microorganismos. 
3. Diga que efecto tiene la luz ultravioleta sobre los microorganismos y determine que 
efecto tuvo en su cultivo en base a los tiempos de exposición utilizados. 
4. Haga una discusión de los resultados obtenidos con las diferentes concentraciones 
de pH e indique como clasificaría a su microorganismo. 
5. Investigue y dé ejemplos del efecto y uso de los diferentes pH sobre los 
microorganismos 
6. Investigue y explique el mecanismo de acción de tres antibióticos y tres 
desinfectantes. 
 
 
 
 
 
 
 
INTRODUCCION 
Para realizar el estudio de las bacterias es necesario recuperarlas del hábitat natural 
donde se encuentran y hacer que proliferen en medios artificiales que proporcionen 
sus requerimientos nutricionales. A este procedimiento se le conoce como cultivo 
bacteriano in vitro. 
Las bacterias para su metabolismo necesitan donadores y aceptores de Hidrógeno, 
fuentes de Carbono, fuentes de Nitrógeno y Minerales. Además del uso de un medio 
nutritivamente adecuado para el cultivo bacteriano, es necesario considerar factores 
ambientales tales como la temperatura, pH, humedad relativa y atmósfera de 
incubación. 
 
DONADORES DE HIDRÓGENO 
 Las bacterias, como cualquier organismo vivo, requieren de una fuente de energía 
como donadores de Hidrógeno, es decir, substratos oxidables. El sustrato más 
comúnmente usado es la glucosa.ACEPTORES DE HIDRÓGENO 
Estos se requieren para la realización de reacciones de óxido-reducción que 
conducen a las síntesis de ATP. Las bacterias aerobias requieren Hidrógeno como 
aceptor de electrones, mientras que las bacterias anaerobias utilizan compuestos 
orgánicos o inorgánicos (sulfatos, nitratos) como aceptores de Hidrógeno. 
FUENTES DE CARBONO 
Todos los organismos requieren de fuentes de Carbono para la síntesis de 
compuestos orgánicos celulares. Generalmente, los mismos compuestos utilizados 
Práctica No. 5 Medios de Cultivo, Siembra y 
Morfología Colonial 
A. Siembra en diferentes medios 
 
 
como fuente de energía, pueden ser utilizados como fuente de Carbón. Por ejemplo, 
la glucosa. 
FUENTE DE NITRÓGENO 
El Nitrógeno es un elemento esencial de las proteínas y de otros componentes 
celulares, el tipo de substrato que se requiere puede variar de un microorganismo a 
otro, pero en términos generales la mayoría de las bacterias puede no obtener 
Nitrógeno a partir del Amonio (NH4+). 
OTROS MINERALES 
Aparte del Carbono, las bacterias requieren de otros minerales. Estos pueden actuar 
como cofactores enzimáticos, por ejemplo el Magnesio y el Potasio, o pueden ser 
constituyentes de los diversos compuestos orgánicos de la bacteria, por ejemplo el 
Azufre presente en los grupos sulfhidrilos (-SH) de muchas proteínas, o el Fósforo 
presente en los grupos fosfato de los ácidos nucleicos, del AIF y de algunas 
coenzimas. Estos Minerales son generalmente incorporados en los medios de 
cultivo en forma iónica o como substratos inorgánicos. 
TEMPERATURA 
Las bacterias pueden crecer a diferentes rangos de temperatura; estos las clasifica 
en: 
1. Psicrófilas (crecen entre 15 y 200C) 
2. Mesófilas (crecen entre 20 y 45ºC) 
3. Termófilas (crecen a temperaturas mayores a 450C) 
pH. 
La mayoría de las bacterias de interés médico crecen en medios de cultivo con un 
pH de 6 a 6, aunque existen bacterias que se desarrollan a un pH óptimo tan bajo 
como 2 y otras en 10.5. 
 
HUMEDAD RELATIVA 
La humedad relativa óptima para la mayoría de las bacterias en cultivo es de 70 a 
80%. 
ATMÓSFERA 
Según sus requerimientos atmosféricos las bacterias se clasifican en: 
1. Aerobias estrictas (requieren la presencia de Oxígeno libre como aceptor 
de Hidrógenos) 
2. Anaerobias estrictas (requieren como aceptor de Hidrógeno una 
sustancia distinta al Oxígeno y mueren en presencia de éste) 
3. Facultativas (pueden multiplicarse en presencia o ausencia de Oxígeno) 
4. Microaerofílicas (requieren bajas concentraciones de Oxigeno libre y de 
un 5-10% de C02) 
 
MÉTODOS DE SIEMBRA 
Estos métodos están directamente relacionados con la consistencia del medio, los 
cuales pueden ser líquidos, semisólidos y sólidos. 
 
MEDIOS LÍQUIDOS 
Son medios que no contienen agar y son envasados en tubos. Se inoculan por 
medio de agitación del asa, por medio de una pipeta Pasteur, por medio de hisopos 
o depositando una porción de la muestra. La utilidad de estos medios es aumentar 
las posibilidades de crecimiento cuando las bacterias no son muy abundantes en el 
inóculo. 
El crecimiento bacteriano en este tipo de medios se manifiesta con turbidez. 
Los medios líquidos también pueden utilizarse para diluir los efectos de substancias 
tóxicas, así como para observar la motilidad bacteriana por medio de preparaciones 
húmedas. El método para sembrar en este tipo de medios es simplemente 
inoculando la muestra en el caldo y agitando ligeramente el asa dentro del tubo. 
(Figura 5.1). 
MEDIOS SEMISÓLIDOS 
Estos medios contienen de 0.5% a 0.75% de agar (polisacárido extraído de ciertas 
algas). Son envasados en tubos, y son sembrados por picadura con asa recta. La 
utilidad de estos medios es detectar la motilidad bacteriana, la cual se manifiesta 
por una turbidez hacia los lados de la línea de inoculación. La consistencia suave 
de estos medios permite que las bacterias móviles se desplacen, mientras que las 
inmóviles crecen solamente sobre la línea de inoculación. Las reacciones negativas 
a motilidad de estos medios deben ser confinadas mediante preparaciones 
húmedas, a partir de cultivos en caldo. 
Otra utilidad de estos medios es la conservación de cepas bacterianas. 
MEDIOS SÓLIDOS 
Existen dos tipos de estos medios, los que contienen 1.5% de agar y aquellos que 
contienen de 3-7% de agar; a estos últimos se les conoce también como medios 
duros. 
 
Figura 5.1 Método de siembra para 
medio de cultivo sólido en tubo. 
 
Los medios sólidos pueden ser envasados en cajas de petri, botellas o tubos de 
cultivo, y son utilizados para la conservación de cepas, pruebas de susceptibilidad 
bacteriana o realizar aislamientos en cultivo puro. El método de siembra en este tipo 
de medios es por estría cruzada, picadura, o en masivo formando un tapetillo por 
toda la superficie del agar (Figura 5.2). 
 
 
 
 
 
Figura 5.2. Métodos de siembra en medio de cultivo sólido en caja 
1. Medios Sólidos para la conservación de cepas. - En este caso, el medio es 
envasado en tubos y se permite su solidificación de tal manera que se logre una 
superficie inclinada. La siembra se realiza por estría continua en toda la 
superficie (Fig. 3.1) El uso de tubos de tapón de baquelita prolonga el tiempo de 
deshidratación del medio. 
2. Medio Sólido para pruebas de susceptibilidad a quimioterapéuticos. - En 
este caso, el medio es envasado en cajas de petri y la inoculación se hace por 
medio de estrías continuas en toda la superficie con un asa, hisopo o varilla 
(Figura 5.2). 
 En masivo Por estría 
cruzada 
3. Medio Sólido para el aislamiento en cultivo puro. En este caso, los medios 
se envasan en cajas de petri, y el objetivo es obtener el crecimiento aislado de 
colonias bacterianas, es decir, colonias puras y de otros gérmenes 
contaminantes. Esto se hace con el fin de estudiar e identificar a una especie 
bacteriana. La inoculación se realiza con asa como se ilustra en la Figura 5.2. 
A. Depositar el inóculo en el cuadrante 1 únicamente. 
B. Flamear y enfriar el asa entre cada cuadrante. 
C. Asegurar que exista contacto entre las estrías de cada cuadrante (1 con 
2, 2 con 3 y 3 con 4). 
4. Medios Duros para disminuir el crecimiento invasivo. - Existen bacterias que 
presentan una exagerada motilidad, lo que produce un crecimiento invasivo en toda 
la superficie del medio, aún, cuando se realiza la técnica de aislamiento en cultivo 
puro. Es en estos casos que se utilizan los medios duros que por su elevada 
concentración de agar dificultan el desplazamiento de las bacterias invasivas 
permitiendo la obtención de colonias puras. 
 
OBJETIVO 
1. Realizar las diferentes técnicas de siembra para el cultivo de bacterias in 
vitro. 
2. Clasificar a los medios de cultivo según el propósito con que se utilizan. 
3. Conocer algunos de los medios selectivos y diferenciales más usados. 
4. Comprender las bases de la selectividad de los medios. 
5. Conocer la importancia del cultivo de las bacterias in vitro. 
6. Enunciar las condiciones necesarias para el cultivo de las bacterias, 
nutrientes, pH, temperatura, humedad y atmósfera de incubación. 
7. Diferenciar los medios de cultivo de acuerdo a sus características físicas: 
Líquidos, Semisólidos y Sólidos. 
8. Conocer la utilidad de los medios de cultivo de acuerdo a sus características 
físicas. 
9. Realizar las técnicas de siembra en los diferentes medios de cultivo: 
Líquidos, semisólidos y sólidos. 
10. Determinar el número relativo de bacterias, en un cultivo en medio sólido en 
caja inoculado mediante la técnica de aislamiento en cultivo puro. 
MATERIAL 
Cultivos § Cultivo de E. coli en agar Maconkey. 
§ Cultivo mixto A. Contiene Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeuruginosa en 
caldo. 
§ Cultivo mixto B. Contiene Escherichia coli, y Salmonella typhimurium en caldo.
 
Medios de 
Cultivo 
§ Caldo nutritivo. 
§ Agar nutritivo en tuboinclinado. 
§ Medio semisólido SIM. 
§ Agar Nutritivo, Verde Brillante y Agar Manitol Sal, Cetrimida y MacConkey y XLD 
en caja. 
 
PROCEDIMIENTO 
I. SIEMBRA EN MEDIO LÍQUIDO, SEMISÓLIDO Y SÓLIDO 
1. Inocular un medio sólido en superficie inclinada, un medio semisólido y un 
medio líquido. 
2. Realizar la siembra de E. coli picando una colonia y agitando el asa en el 
medio líquido (caldo nutritivo). 
3. Realizar la siembra en el medio semisólido a partir de una colonia del cultivo 
de E. coli. 
 
Figura 5.3 Cultivo de E. coli en medio líquido, semisólido e inclinado 
E. coli
líquido semisólido inclinado
4. Realizar la siembra en el medio sólido con superficie inclinada a partir de una 
colonia del cultivo de E. coli. Figura 5.3. 
 
2. AISLAMIENTO MICROBIANO 
1. Realizar la siembra del Cultivo Mixto A siguiendo el esquema de inoculación 
de la tabla 5.1. Utilice la técnica para aislamiento en cultivo puro Figura 5.1 
2. Realizar la siembra del Cultivo Mixto B siguiendo el esquema de inoculación 
de la tabla 5.1. Utilice la técnica para aislamiento en cultivo puro Figura 5.1 
3. Identificar adecuadamente sus cultivos e incúbelos a 37ºdurante 24 horas. 
Tabla 5.1 Esquema de inoculación 
MEDIO Cultivo Mixto A Cultivo Mixto B 
Agar Nutritivo Inocular ______ 
Manitol Sal Inocular ______ 
Cetrimida Inocular ______ 
MacConkey ______ Inocular 
XLD ______ Inocular 
Verde Brillante. ______ Inocular 
 
RESULTADOS 
Realice un esquema de sus resultados y discútalos con fundamentos bibliográficos. 
CUESTIONARIO 
1. Determinar el número relativo de bacterias encontrado en su caja mediante 
la técnica de aislamiento. 
2. Explicar cuál es la importancia en el laboratorio de microbiología de la técnica 
de aislamiento en cultivo puro. 
3. Explicar la importancia médica de las especies bacterianas trabajadas. 
BIBLIOGRAFÍA 
Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas Color. Koneman, EW., Allen, SD., Janda, 
WM., Schreckenberger PC., Winn WC. Editorial Médica Panamericana. Quinta 
edición, 2008. 
 
PARA SABER MÁS 
Consulta de artículos científicos, notas científicas, avances de investigación y 
páginas de Internet relacionados con el tema, así como la realización de glosario 
de términos relacionados con la práctica. 
 
 
 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
Los requerimientos nutricionales de las bacterias son muy variados, lo cual hacer 
necesario contar con una amplia gama de medios de cultivo, los cuales se pueden 
clasificar basados en la utilidad diagnóstica. 
 
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 
 
1. MEDIOS DE CULTIVO BÁSICOS. 
Son medios simples que promueven el desarrollo de microorganismos 
nutricionalmente poco exigentes. Estos medios reciben también el nombre de 
medios generales. Se utilizan principalmente para la realización de análisis 
cuantitativos, muestreos de medio ambiente o superficies y conservación de cepas. 
Ejemplo: agar nutritivo, caldo nutritivo, agar de soya y tripticaseína, caldo triptosa, 
agar triptosa, etc. 
2. MEDIOS ENRIQUECIDOS. 
Son medios que han sido suplementados con elementos que proporcionan factores 
de crecimiento para promover el desarrollo de microorganismos de requerimientos 
nutricionales exigentes. Estos medios generalmente contienen uno o más de los 
siguientes ingredientes: sangre, suero, plasma, líquido ascítico, huevo, carne, 
vitaminas, aminoácidos específicos, NAD o hemina entre otros. Ejemplos; agar 
sangre, agar chocolate, agar infusión cerebro corazón, medio Lowenstein-Jensen, 
etc. 
 
 
Práctica No. 5 Medios de Cultivo, Siembra y 
Morfología Colonial 
B. Medios Selectivos y Diferenciales 
 
MEDIOS SELECTIVOS. 
Estos medios contienen substancias inhibitorias para suprimir total o parcialmente 
el desarrollo de microorganismos no deseados. Las substancias utilizadas con 
mayor frecuencia son colorantes, sales inorgánicas, sales biliares, antibióticos y 
detergentes. 
 Los medios selectivos tienen una gran utilidad para el aislamiento de gérmenes 
patógenos a partir de muestras clínicas que contengan bacterias de la microflora 
normal. Ejemplo: agar Verde Brillante y agar SaImoneIIa–ShigeIIa selectivos 
para Salmonella spp. 
 Agar MacConkey, ENDO y eosina azul de metileno (EMB del inglés 
eosinmetilenblue); selectivo para enterobacterias. 
 Agar manitol sal, agar Staphylococcus110 y agar Chapman Stone; selectivos para 
Staphylococcus spp. 
 Es importante recordar que también se logra un efecto selectivo hacia ciertos grupos 
de microorganismos simplemente variando la temperatura y la atmósfera de 
incubación. 
MEDIOS DIFERENCIALES 
Estos medios contienen indicadores que permiten diferenciar algunos géneros o 
especies bacterianas por el aspecto característicos de sus colonias. La mayoría de 
los medios selectivos son también diferenciales. 
§ Ejemplos: Agar verde brillante, agar Salmonella Shigella, agar MacConkey, 
ENDO EMB. etc. Estos permiten diferenciar enterobacterias fermentadoras 
de la lactosa (coliformes) de las no fermentadoras de la lactosa (no 
coliformes). 
§ Agar Manitol Sal, para diferenciar estafilococos fermentadores del manitol (S. 
aureus) de los no fermentadores del manitol (S. epidermidis). 
§ Cuando el microorganismo a seleccionar a partir de una población mixta es 
fastidioso (nutricionalmente exigente), se utilizan medios enriquecidos 
adicionados con algunos de los inhibidores antes mencionados. 
Ejemplos de medios de este tipo son: agar PPLO con acetato de talio y penicilina, 
utilizado para el aislamiento de Mvcoplasma spp. Agar sangre con telurito de 
potasio, utilizado para el aislamiento de Listeria spp. 
Agar sangre con azida de sodio utilizado para el aislamiento de Streptococcus spp. 
 MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO 
 Estos medios son liquidas y poseen efecto inhibitorio sobre ciertos géneros 
bacterianos, favoreciendo al mismo tiempo el desarrollo de otros que se encuentran 
en menor proporción en la muestra. Son medios muy utilizados en la bacteriología 
del tracto intestinal, principalmente para el aislamiento de Salmonella spp a partir 
de muestras de heces en las cuáles el número de salmonelas puede ser bajo en 
comparación al elevado número de bacterias que normalmente habitan en el tracto 
intestinal. 
Estos medios se inoculan mediante un hisopo o bien depositando directamente la 
muestra en el medio en una proporción de 1:10 (por ejemplo 1 gramo de muestra 
en 10 ml de medio). 
El periodo de incubación en estos medios debe ser de 18 horas y es necesario 
resembrar a partir de ellos en medios selectivos y diferenciales para identificar 
colonias características. 
Ejemplos de estos medios son el caldo selenita y el caldo tetrationato, medios de 
enriquecimiento para Salmonella spp. 
MEDIOS DE TRANSPORTE 
Son medios utilizados para el transporte de las muestras clínicas desde el lugar de 
su colección hasta el laboratorio. Su finalidad es preservar la viabilidad de los 
microorganismos cuyo aislamiento va a intentarse posteriormente. 
La composición de este tipo de medios varía considerablemente de acuerdo al 
microorganismo cuya viabilidad se desea preservar. Estos medios pueden ser 
desde una simple solución fisiológica amortiguadora hasta medios más complejos 
que contienen substancias inhibitorias, agentes reductores, substancias 
osmóticamente activas (sacarosa), suero, etc. 
Algunos ejemplos de estos medios son: medio de Stuart, medio de Cary-Blair, 
utilizados como medios de transporte de uso general para un gran número de 
bacterias aerobias y anaerobias. 
Solución amortiguadora de Bovarnik, para preservar la viabilidad de Clamidias y 
Rickettsias. 
MORFOLOGÍA COLONIAL 
Cuando se examinan los microorganismos asociados o presentes en un animal, 
planta, suelo, agua o alimento se encuentra una gran variedad de ellos y raramente 
hay un solo tipo de microorganismo. Si se quiere trabajar con un cultivo puro, se 
deben obtener colonias separadas o aisladas. La observación cuidadosa delas 
colonias muestra que éstas varían en apariencia. Una colonia o clona microbiana 
está constituida por individuos de la misma especie provenientes de una célula o de 
un grupo de ellas. Las colonias bacterianas presentan características morfológicas 
muy variadas, mismas que son constantes para cada especie bacteriana en 
idénticas condiciones de cultivo. Estas características pueden modificarse cuando 
factores tales como humedad relativa, medio de cultivo, temperatura y atmósfera de 
incubación varían. 
Por definición un buen aislamiento en placa es aquel que nos da colonias aisladas, 
con una distancia que permita distinguir y describir la morfología colonial que 
incluye: 
TAMAÑO. Se describe en milímetros y puede variar desde colonias 
extremadamente pequeñas que miden apenas una fracción de milímetro 
hasta aquellas que llegan a medir 10 mm.; algunas especies bacterianas pueden 
extenderse en toda la superficie de la caja. Para poder observarlas es necesario 
utilizar un microscopio estereoscópico. 
COLOR. Las colonias pueden tener variados colores, debido a pigmentos propios 
o absorción de algunas sustancias del medio. 
FORMA. Puede ser puntiforme, circular o irregular. Las colonias puntiformes son 
tan pequeñas que no se les puede distinguir el resto de sus características. 
BORDES. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lóbulos, filamentos, 
proyecciones como dientes de sierra o enrollados. 
ELEVACION. La colonia puede ser plana o elevada, esta última a su vez puede ser 
convexa, pilvinada, umbonada crateriforme o umbilicada. 
SUPERFICIE. Puede ser lisa, rugosa o granular. 
ASPECTO. Puede ser húmedo o seco. 
LUZ REFLEJADA. Puede ser brillante o mate. 
LUZ TRANSMITIDA. Puede ser transparente, translúcida u opaca. 
PRODUCCIÓN DE PIGMENTO. Algunas bacterias producen pigmentos solubles 
en agua, que puede difundir al medio de cultivo. 
CONSISTENCIA. Dura o suave, esta última puede ser butirosa, mucoide o friable. 
Esta característica se determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto debe 
ser la última en describirse (Figura 5.4). 
 
Con la experiencia en la observación de cultivos, las características de morfología 
colonial vienen a constituir una guía muy útil en el reconocimiento de los principales 
grupos de microorganismos. 
 
CRECIMIENTO EN MEDIO LÍQUIDO 
Los medios líquidos utilizados para el cultivo de microorganismos, reciben el nombre 
de caldos. Los diferentes tipos de desarrollo en medio líquido pueden ser: 
homogéneo, floculento, en anillo, membrana y película (Figura 5.5). 
 
Figura 5.4 Tipos de Morfología colonial. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5.5 Tipos de crecimiento microbiano en medio líquido 
 
 
OBJETIVOS 
1. Definir medio de cultivo básico, enriquecido, diferencial, selectivo, de 
enriquecimiento y de transporte. 
2. Conocer el mecanismo de acción de las sustancias inhibitorias utilizadas en los 
medios selectivos. 
3. Comprender el fundamento de los medios selectivos y diferenciales 
4. Distinguir la apariencia de las colonias de Staphylococcus, Pseudomonas, 
Escherichia y Salmonella en los medios selectivos y diferenciales. 
 
MATERIAL 
Cultivos § Medios de cultivo previamente sembrados en la práctica anterior. 
§ Cultivos líquido, sólido, inclinado y semisólido previamente sembrados en la 
práctica anterior. 
Reactivos § Reactivos para la tinción de Gram 
Material § Asas bacteriológicas 
§ Portaobjetos 
Equipo § Microscopio óptico 
 
PROCEDIMIENTO. 
SIEMBRA EN MEDIO LÍQUIDO, SEMISÓLIDO Y SÓLIDO 
Anotar los resultados del medio líquido, sólido y semisólido inoculados en la 
práctica anterior. Describir el tipo de crecimiento desarrollado en el medio 
líquido. 
 
AISLAMIENTO MICROBIANO 
Observe y compare la morfología de las colonias desarrolladas en los medios de 
cultivo que se indican. Es importante que tome en cuenta el número relativo de 
cada una de éstas, es decir la cantidad de colonias crecidas en los diferentes 
cuadrantes. Se considera crecimiento abundante cuando desarrollan colonias 
hasta los cuadrantes 3 o 4, crecimiento moderado hasta el segundo cuadrante, 
y crecimiento escaso sólo en el primer cuadrante. Las colonias que crezcan fuera 
de las estrías o únicamente en los últimos cuadrantes se consideran 
contaminantes. 
I. Cultivo Mixto A. Observe que el cultivo en agar nutritivo en caja contiene 
dos tipos diferentes de colonias. Describa las características de la morfología 
colonial observada en cada uno de los medios que se indican y anote sus 
resultados en la tabla 5.2. 
Tabla 5.2 Anote los resultados obtenidos de sus cultivos 
MEDIO Staphylococcus aureus Pseudomonas 
aeruginosa 
 Crecimiento + - 
 
Morfología 
colonial 
Crecimiento 
+ - 
Morfología 
colonial 
Agar Nutritivo 
Manitol Sal 
Cetrimida 
 
§ Realice un frotis de una colonia de Manitol Sal y otro a partir de Cetrimida y 
un tercero a partir de una mezcla del crecimiento en Agar Nutritivo. Tiña 
los frotis con la técnica de Gram. 
§ Observe y anote sus resultados. 
§ Las colonias de S. aureus se observan amarillas en Manitol Sal. Explique por 
qué. 
§ Las colonias de Pseudomonas aeruginosa en Cetrimida, se observan verdes. 
Explique por qué 
II. Cultivo Mixto B. Describa las características de la morfología colonial 
observada en cada uno de los medios que se indican. 
§ En MacConkey, las colonias fermentadoras de la lactosa se observan rojas 
y las no fermentadoras incoloras. E. coIi es una bacteria fermentadora de la 
lactosa y S.typhimurium no fermenta lactosa y sacarosa. Explique el 
mecanismo físico-químico de esta observación. ¿Por qué se obtuvieron 
colonias amarillas y rojas en XLD? ¿Cómo se explica metabólicamente esta 
diferencia? 
 
Tabla 5.3 Anote sus resultados obtenidos de sus cultivos 
MEDIO Escherichia coli Salmonella typhimurium 
 Crecimiento 
 + - 
Morfología 
colonial 
Crecimiento 
+ - 
Morfología 
colonial 
MacConkey 
XLD 
Verde Brillante 
 
§ En Verde Brillante S.typhimurium crece en colonias con un centro negro, 
explique por qué. 
§ Identifique las colonias obtenidas correspondientes a E. coIi y S.typhimurium 
en cada caja. 
§ Realice una tinción de Gram a partir de los dos tipos de colonias encontradas 
en Verde Brillante. 
§ Observe y anote sus resultados 
 
RESULTADOS 
Realice un esquema de sus resultados y discútalos con fundamentos bibliográficos. 
 
CUESTIONARIO 
1. Mencione las diferencias que existen entre los siguientes medios de cultivo: 
básico, enriquecido, diferencial, selectivo, de enriquecimiento y de transporte. 
Cite tres ejemplos de cada tipo de medio. 
2. Mencione un mínimo de 5 substancias inhibitorias utilizadas en los medios de 
cultivo y explique su acción. 
3. Explique por qué no todas sus cepas crecieron en los medios inoculados. 
¿Existen inhibidores? ¿Cuáles son? ¿Cómo actúan? 
BIBLIOGRAFÍA 
Diagnóstico Microbiológico. Texto y Atlas Color. Koneman, EW., Allen, SD., Janda, 
WM., Schreckenberger PC., Winn WC. Editorial Médica Panamericana. Quinta 
edición, 2008. 
 
PARA SABER MÁS 
Consulta de artículos científicos, notas científicas, avances de investigación y 
páginas de Internet relacionados con el tema, así como la realización de glosario 
de términos relacionados con la práctica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INTRODUCCIÓN 
 
Una célula requiere para poder crecer y dividirse tomar nutrientes del ambiente, 
procesarlos y liberar energía además de construir bloques que le permitan sintetizas 
macromoléculas. Aunado a esto, la célula excreta los productos que no le sirven. 
Todas estas actividades juntas son llamadas metabolismo. El metabolismo lo 
podemos dividir en dos partes de acuerdo a la finalidad de la función; procesos 
degradativos llamados en conjunto catabolismo y procesos biosintéticos llamados a 
su vez anabolismo. Es necesario enfatizar que ambos tipos de procesos se 
interrelacionan. 
 
Los procesoscatabólicos están involucrados en la provisión de energía para llevar 
a cabo todas y cada una de las actividades celulares, tales como biosíntesis, 
transporte y motilidad. Para los organismos heterotróficos (organotróficos) los 
procesos catabólicos involucran la degradación de materia orgánica para producir 
energía y productos de desecho. En muchos casos el catabolismo resulta en la 
formación de pequeñas moléculas orgánicas que sirven como esqueletos 
carbonados de la biosíntesis. 
 
La presente práctica se ha dividido en dos partes, en la primera parte (Parte A), se 
trabajará con el metabolismo de carbohidratos y de ácidos orgánicos, lo cual 
requiere de la glucólisis, fermentación y respiración. Podrá poner en evidencia la 
formación de productos terminales para una mejor comprensión de las vías 
metabólicas que realizan los microorganismos. 
Práctica No. 6 Metabolismo, Biosíntesis y 
Nutrición 
A. Carbohidratos y Ácidos Orgánicos 
 
La Parte B consiste del uso de diferentes amino ácidos y observarás la capacidad 
degradativa y utilización de dichos aminoácidos por parte de las bacterias, así como 
la obtención del nitrógeno como lo hacen a través de la utilización de la urea. 
 
 PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN 
MICROBIANA 
Tabla 6.1. Pruebas bioquímicas del Metabolismo del C y N 
UTILIZACIÓN DEL C UTILIZACIÓN DEL N 
 OF DE GLUCOSA 
 KLIGLER 
 RMVP 
 CITRATO 
 MANITOL 
 SACAROSA 
 FAD 
 LIA 
 INO3 
 SIM 
 UREA 
 ORNITINA 
 
En el laboratorio se cuenta con una serie de pruebas, las cuales permiten ayudar a 
identificar a cada uno de los géneros de nuestro interés. La mayoría de ellas llaman 
la atención por el colorido que se desarrolla al crecer los microorganismos y cambiar 
las condiciones de acidez del medio. Además, la complejidad de las mismas y su 
comprensión permiten su uso y manejo adecuado. Son muchas las pruebas 
bioquímicas, pero solamente se usarán las más comunes que se muestran en la 
tabla 6.1. 
OBJETIVO 
Realizar las pruebas bioquímicas y relacionarlas con el metabolismo del carbono. 
 
OBJETIVOS ESPECFICOS 
1. Realizar pruebas bioquímicas que ponen de manifiesto las actividades que llevan 
a cabo los microorganismos sobre los azúcares y ácidos orgánicos para poner 
de manifiesto la actividad microbiana. 
2. Comprender el mecanismo bioquímico que ocurre en la utilización de los 
carbohidratos y ácidos orgánicos. 
3. Comprender la utilidad de las enzimas en el mecanismo de la obtención de la 
energía. 
4. Comprender el fundamento y la interpretación de cada una de las pruebas 
utilizadas. 
INTRODUCCIÓN 
El estudio de los microorganismos con base a la descripción colonial o microscópica 
no es suficiente para hacer una identificación satisfactoria, es por ello que se tiene 
que recurrir al estudio de su comportamiento fisiológico, es decir, como utilizan los 
nutrimentos y que sustancias producen. Para lograr esto, existe un gran número de 
pruebas metabólicas que nos permiten llegar a la caracterización de un 
microorganismo dado. El metabolismo es la suma de todos los procesos químicos 
que ocurren dentro de un microorganismo y se divide en anabolismo y catabolismo. 
El primero se refiere a las reacciones bioquímicas que suceden en la célula para 
formar macromoléculas y el segundo representa las reacciones que están 
involucradas en el rompimiento de los sustratos con el propósito de suplir la energía 
utilizada en el anabolismo. 
Los tres principales procesos que conducen a la formación de energía como ATP 
son la fermentación que obtiene el ATP por fosforilación a nivel de sustrato. La 
respiración obtiene ATP por fosforilación oxidativa. La fermentación es un proceso 
anaeróbico en el cual tanto los donadores como los aceptores de electrones son 
compuestos orgánicos. Estos compuestos incluyen carbohidratos, ácidos orgánicos 
y aminoácidos entre otros. Existen varios tipos de fermentaciones que pueden llevar 
a cabo los microorganismos, los productos de la fermentación de los carbohidratos 
son ácidos orgánicos, alcoholes, cetonas y CO2. 
 
MATERIAL 
• 2 tubos de 13 x 100 con campana de Durham y caldo base rojo de fenol 
adicionados de glucosa. 
• 2 tubos de 13 x 100 con campana de Durham y caldo base rojo de fenol 
adicionados de sacarosa. 
• 2 tubos de 13 x 100 con campana de Durham y caldo base rojo de fenol 
adicionados de manitol. 
• 2 tubos de 13 x 100 con Kligler 
• 2 tubos de 13 x 100 Citrato de Simmons 
• 2 tubos de 13 x 100 Caldo Malonato 
• 4 tubos de 13 x 100 con OF glucosa 
• Solución de lugol 
• alfa naftol 
• KOH creatina 
• Cultivos de E. coli, Proteus, Pseudomona aeruginosa, Klebsiella, Shigella, 
Enterobacter. 
 
PROCEDIMIENTO 
Inocular los tubos de acuerdo al siguiente esquema que se muestra en la Tabla 6.2. 
Tabla 6.2 Protocolo de inoculación de las pruebas bioquímicas de fermentación 
MEDIOS TUBO No 1 TUBO No. 2 SIEMBRA 
Manitol E. coli Proteus Agitación 
Sacarosa E. coli Proteus Agitación 
Glucosa E. coli Pseudomonas Agitación 
RMVP E. coli Klebsiella Agitación 
OF glucosa Pseudomonas E. coli Picadura 
Kligler E. coli Shigella o Proteus Picadura y estría 
Citrato Klebsiella E. coli Estría 
Malonato Enterobacter E. coli Agitación 
 
1. Fermentación de azúcares en tubos de Durham 
a. lnocular con una asada de cada microorganismo, los tubos con campana de 
Durham con los diferentes azúcares o polialcoholes. 
b. lncubar los tubos a 37º C durante 24 hrs. Es muy importante no sobreincubar 
los tubos debido a que puede provocar confusión al momento de hacer la 
lectura debida a fenómenos de alcalinización del medio por acumulación de 
amonio. 
c. Observar el resultado, indicando en cada combinación de las cepas con los 
carbohidratos si hay o no producción de ácido (vire del indicador amarillo) si 
hay acumulación o no de gas dentro de la campana de Durham. 
2. Fermentación de azúcares en medio de Kligler 
a. lnocular por picadura en la superficie de los tubos de Kligler cada una de las 
cepas proporcionadas. 
b. Incubar los tubos a 37º C durante 24 o 48 hrs. 
c. Observar el resultado e interpretarlo como se cita a continuación. 
d. Fermentación de glucosa: vire del indicador a amarillo en el fondo del tubo. 
Tabla 6.3 Esquema de interpretación de resultados de la prueba de Kligler 
K alcalino / Rojo A ÁCIDO / Amarillo 
Pico/ fondo Lactosa Glucosa 
K/A - + 
A/A + + 
Gas Burbujas de CO2 
H2S Precipitado negro 
 
• Fermentación de lactosa: vire del indicador a amarillo en el pico del tubo. 
• Producción de gas: formación de burbujas en el medio de cultivo, 
principalmente en el fondo. 
• Producción de H2S: formación de un precipitado negro en el medio de 
cultivo. Es importante que revises la formación del precipitado antes de 
las 24 horas, ya que es muy común que no se pueda observar la 
fermentación por la presencia del precipitado (Tabla 6.3). 
3. Fermentación de azúcares. Pruebas de rojo de metilo y de Voges Proskauer. 
a. lnocular las cepas en dos tubos de caldo (etiquetados como MR y VP 
respectivamente) 
b. Incubar los tubos a 37 º C durante 24 hrs. 
c. Añadir al tubo MR 4 gotas de reactivo rojo de metilo 
d. Añadir al tubo VP 6 gotas de alfa naftol y 3 gotas de KOH y agitar suavemente 
dejarlo en reposos unos minutos. La presencia de un color rojo en el tubo es 
una prueba positiva de Voges Proskauer 
e. (producción de acetil metil carbinol): 
 
1. RM : agregar 4 gotas de rojo de metilo. 
Interpretar los resultados de acuerdo al esquema que se muestra en la 
tabla 6.4. 
2. VP: agregar 6 gotas de alfa naftol y 3 de KOH, agitar el tubo destapado. 
Reposar por 15 minutos. 
 
1. Utilización de ácidos orgánicos. 
a. Sembrar un tubo con citrato de Simmons por estría superficie y uno de caldo 
Malonato con una asada. 
b. Incubar los tubos