BIOQUI CON LOS HERMANOS

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UNIVERSIDAD PRIVADA DEL VALLE
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
MEDICINA
Bioquímica III
Estudiantes:
- Arthur Ribeiro Lopes
- Leandro Fabio Cabrerizo
- Nicolas Paolo Cabrerizo
- André Luis Cabrerizo
- Cristian Alexis Ramos Rafael
Docente:
- Jans Velarde Negrete
Introducción:
Sabemos que, temas como Métodos de Extracción de Ác.Nucleicos , Enzimas de
Restricción y Terapia Génica , participan del gran abanico que es el temario de DNA y ARN,
asunto clave para el entendimiento de enfermedades heredadas por generaciones, sobre la
síntesis proteica y entre otros temas.
En estos temas ya hablados en la primera línea buscamos mirar la aplicación de los mismos
por Ingeniería Molecular y sus aplicaciones en las muchas áreas que involucran la
medicina.
Objetivos:
Los objetivos planteados por nuestro trabajo es , demostrar por medios de conocimiento
técnico-científico, averiguando en sitios web,artículos científicos y locales de publicación
científica, la aplicabilidad y los conocimientos básicos de los tres temas que son de
importante valía para la formación de cualquier persona de la área de la salud.
Desarrollo:
El grupo, partió del principio de mezclar los conocimientos propios con las fuentes externas,
su desarrollo fue pautado en demostrar a partir de una construcción lineal de principio hasta
más complejo los conocimientos de importancia tanto básica , mientras también clínica ,
llegando a un valor común que es el desarrollo del pensamiento científico sobre los temas.
1. Metodos de extraccion de acidos nucleicos
Bactérias:
1.1 Tipo de muestra a utilizar
De cualquier bacteria que obviamente contenga ácidos nucleicos
Existe una cantidad considerable de metodologías de extracción de ADN bacteriano,
algunas de ellas son:
1) salting, que utiliza altas concentraciones de sales para la lisis celular
2) Chelex 100, una resina quelante que no requiere una digestión previa con enzimas
como la proteinasa K
3) La metodología fenol cloroformo o extracción con solventes orgánicos que se
fundamenta en la lisis celular y el solventes orgánicos para la eliminación de restos
proteicos y lipídicos presentes
1.2 Materiales, Reactivos y equipos
● Microcentrifuga
● Microtubos y micropipetas
● Baño de Incubación.
● Etanol 70% Isopropanol
● Sistema de electroforesis básico (aparatos y reactivos)
● Sistema de detección de ácidos nucleicos.
● Y obviamente las bacterias de las que se sacara el ADN
1.3 Procedimiento
El primer paso es la incubación del pellet bacteriano con una solución de lisis que romperá
las membranas celulares y liberará los ácidos nucleicos.
Luego se eliminarán las proteínas y restos celulares con la adición de una solución de
precipitación de proteínas. Después de una centrifugación nos quedaremos con el
sobrenadante y haremos precipitar los ácidos nucleicos con isopropanol, seguido de un
lavado con etanol 70% y finalmente la hidratación del ADN.
Lisis celular
1. Añadir 1.5 ml de un cultivo overnight a un tubo de 1.5 ml.
2. Centrifugar a 14.000 x g durante 30 segundos. Eliminar el sobrenadante.
3. Añadir 600 l de Solución de Lisis al pellet celular y pipetear para resuspender y lisar las
células.
4. Incubar las muestras a 80ºC durante 5-10 minutos. Enfriar a temperatura ambiente.
Precipitación de proteínas
1. Enfriar la muestra a temperatura ambiente.
2. Añadir 300 l de Solución de precipitación de proteínas.
3. Vórtex vigorosamente durante 20-30 segundos.
4. Centrifugar a 14.000 x g durante 5 minutos. Se observará que el precipitado proteico
forma un pellet
Precipitación del ADN
1. Pasar el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de 1.5 ml que contenga 600l de
isopropanol Mezclar por inversión varias veces.
2. Centrifugar a 14.000 x g durante 3 minutos.
3. Eliminar el sobrenadante. Añadir 600 l de etanol 70% e invertir varias veces para lavar el
pellet de ADN.
4. Centrifugar a 14.000 x g durante 2 minutos. Cuidadosamente eliminar todo el etanol.
Vigilar no perder el pellet de ADN
5. Invertir el tubo y dejar secar en papel absorbente durante 15 minutos.
Hidratación del ADN
1. Añadir 500-750 l de Solución de Hidratación del ADN. Resuspender mediante micropipeta
el pellet blanco. La incubación a 55ºC con periódicas agitaciones con vortex ayudará a la
disolución del ADN.
1.4 Ventajas
Extracción de ADN
Método Ventajas
Cromatografía por exclusión de tamaño
(ADN o ARN)
Tiempos de separación cortos y bien
definidos. Alta sensibilidad. Reproducible.
Salting-out (ADN) Reactivos inocuos. Material barato.
Chelex (ADN) Previene la degradación del ADN por sus
agentes quelantes. No hay pérdidas
considerables de ADN.
1.5 Desventajas
La desventaja principal de esta técnica es que no proporciona información de la pureza
(como el índice A260:A280), ni de la posible degradación del ARN o ADN, por lo que se
requiere realizar una electroforesis para comprobar la integridad del ácido nucleico
1.6 Utilidad
La identificación de microorganismos a través de técnicas moleculares ha tomado gran
popularidad en los últimos años gracias a su precisión. La Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR) es una técnica de diagnóstico molecular sumamente valorada por su
rapidez de resultados, alta sensibilidad y especificidad, sin embargo, el rendimiento de esta
técnica dependerá de la calidad del ADN extraído. Las muestras fecales contienen una gran
cantidad de sustancias, como sales que pueden comportarse como inhibidores para la PCR,
todo esto muestra la importancia de la extracción de ácidos nucleicos bacterianos para su
identificación y mejora del método.
La miniprep (extracción de ADN de naturaleza plasmídica de un cultivo bacteriano.) es la
técnica inicial de purificación y concentración de ADN plasmídico para cualquiera de sus
posibles fines, entre los que destaca la clonación
Humanos:
1.1 Muestra
Muestra de una célula humana con ADN
1.2 Materiales, Reactivos, Equipos
Material biológico: células en cultivo, tejido de biopsias, órganos o fluidos corporales.
Proteinasa K: es una enzima que sirve para romper/degradar a las proteínas que están
unidas al ADN.
Centrífuga: equipo que ayuda a separar los diferentes componentes de una muestra por
medio de una fuerza giratoria.
Fenol: es un disolventes orgánicos que sirven para separar las proteínas celulares del ADN
Etanol: es un disolvente que no se mezcla con el ADN por lo tanto se usa para precipitar el
ADN RNAsa: proteína (enzima) que rompe el ARN. Espectrofotómetro: equipo que sirve
para medir la cantidad de ADN o ARN.
1.3 Procedimiento
Obtención de la muestra celular Lisis celular: es el proceso físico o químico por el cual se
rompen las membranas para liberar sus componentes celulares.
Degradación de proteínas: se rompen las proteínas que cubren al ADN usando proteasas.
Procesos de separación: procesos físicos o químicos mediante los cuales se separan
diferentes componentes celulares como lípidos, proteínas, ARN, ADN y moléculas
pequeñas. Para esto se usa una centrífuga.
Degradación de ARN por RNAsa: proceso que rompe específicamente cadenas ARN
remanente con el fin de evitar contaminación de este material.
Cuantificación de ADN: técnica mediante la cual se mide la concentración del material
genético usando un espectrofotómetro.
1.4 Ventajas
La capacidad de extraer ADN es de primordial importancia para el estudio de las causas
genéticas de la enfermedad y para el desarrollo de diagnósticos y fármacos. También es
fundamental para la realización de estudios forenses, la secuenciación de genomas, la
detección de bacterias y virus en el entorno y la determinación de la paternidad.
1.5 Desventajas
El principal inconveniente de este procedimiento es que requiere mucho tiempo y utiliza
productos químicos tóxicos como el fenol y el cloroformo. Además, el ADN extraído con
CTAB requiere una mayor purificación para evitar la inhibición de los análisis de PCR.
1.6 Utilidad
La capacidad de extraer ADN es de primordial importancia para el estudio de las causas
genéticas de la enfermedad y para el desarrollode diagnósticos y fármacos. También es
fundamental para la realización de estudios forenses, la secuenciación de genomas, la
detección de bacterias y virus en el entorno y la determinación de la paternidad.
Virus:
La extracción de ácido nucleico viral es un paso crítico en la investigación de enfermedades
infecciosas. La detección de patógenos virales basada en ácidos nucleicos requiere la
extracción tanto de ADN como de ARN (ácidos nucleicos totales)
Durante la extracción de ADN y ARN, todas las muestras pasan por un conjunto común de
pasos que implican la lisis celular, la limpieza, la inactivación de nucleasas, la unión de
ácidos nucleicos, el lavado y la elución. Los métodos para aislar ácidos nucleicos totales son
similares a los métodos para la extracción de ADN o ARN, pero eliminan los pasos de
tratamiento con ADNasa y ARNasa.
El aislamiento del ácido nucleico viral de la sangre o el suero es el primer paso en la
detección y el análisis para la investigación en microbiología o virología. Los métodos para
extraer ADN o ARN viral deben purificar una variedad de títulos de virus y proporcionar una
alta sensibilidad para las aplicaciones posteriores.
La calidad de los ácidos nucleicos extraídos es importante, ya que las impurezas o los
inhibidores en la muestra purificada pueden afectar el éxito de las aplicaciones posteriores,
como qPCR y qRT-PCR.
Protocolo del Kit de extracción de ADN y ARN
Las instrucciones de procedimiento del kit de extracción son muy simples; permitiendo que
sus usuarios puedan purificar ADN o ARN de una gran variedad de fuentes objetivo en tan
solo 30 minutos. De hecho, es el siguiente:
1. Transferir 150 (300) μl de plasma, suero, orina, sobrenadante de cultivo celular,
fluido libre de células o infección de virus en tejido o célula en el tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml.
Si el volumen de la muestra es inferior a 150 μl, la muestra debe ajustarse a 150 μl con agua
tratada con DEPC. En caso de que el volumen de la muestra sea superior, debe utilizarse 15
ml. tubo centrífugo.
2. Agregar 300 (600) μl de tampón de lisis. Si el volumen cambia, variar la
cantidad.
3. Mezclar agitando en vórtex durante 15 segundos.
4. Incubar a temperatura ambiente (15-25 ° C) durante 10 minutos.
5. Agregar 300 (600) μl de tampón de unión y mezclar agitando suavemente.
Si el volumen de la muestra es superior a 150 μl, debemos aumentar la cantidad de tampón de
unión
6. Colocar una columna giratoria en un tubo de recolección de 2 ml provisto.
7. Cargar los lisados en la columna y centrifugar a 13,000 rpm durante 1 minuto.
8. Desechar la solución en el tubo de recolección y colocar la columna nuevamente
en los mismos 2 ml. tubo de recogida.
9. Agregar 500 μl de tampón de lavado A, a la columna y centrifugue durante 1
minuto a 13,000 rpm.
10. Desechar la solución en el tubo de recolección y colocar la columna de
centrifugado nuevamente en los mismos 2 ml. tubo de recogida
11. Agregar 500 μl de tampón de lavado B a la columna y centrifugar durante 1
minuto a 13,000 rpm.
12. Desechar la solución en el tubo de recolección y colocar la columna de
centrifugado nuevamente en los mismos 2 ml. tubo de recogida Centrifugar
durante 1 minuto a 13,000 rpm. Es importante secar la membrana ya que el etanol
residual puede interferir con reacciones aguas abajo.
13. Colocar la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sin RNasa (no
incluido), y añadir 30 – 60 μl de tampón de elución directamente sobre la
membrana de la columna de centrifugado. Es importante secar la membrana ya
que el etanol residual puede interferir con reacciones aguas abajo. No tocar la
membrana con la punta de la pipeta.
14. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto, y luego centrifugar durante 1
minuto a 13,000 rpm.
15. Utilizar 2-5 μl de solución eluida como plantilla para PCR o RT-PCR.
La extracción de ácido nucleico viral es un paso crítico en la investigación de enfermedades
infecciosas. La detección de patógenos virales basada en ácidos nucleicos requiere la
extracción tanto de ADN como de ARN (ácidos nucleicos totales)
razones para automatizar la extracción de ácido nucleico
Proceso de extracción simplificado . El pipeteo preciso y consistente con un protocolo
automatizado ayuda a lograr la uniformidad en los pasos clave del procesamiento de
muestras, como la lisis, el lavado y la elución.
Menos manipulación, menos contaminación . Menos pasos de pipeteo y manipulación
manual reducen la amenaza de contaminación externa y el riesgo de transferencia de
muestras, ya sea que el protocolo se ejecute o no en un espacio de trabajo estéril.
Rendimiento y alcance . Con la extracción automatizada de ácidos nucleicos, puede procesar
un mayor número de muestras con mayor velocidad, aumentando así su rendimiento. Esto
también crea una oportunidad para ampliar el alcance de su investigación al probar una
mayor cantidad de condiciones de prueba, medicamentos, participantes del estudio, etc.
Ahorro de tiempo . Esto es doble. La extracción manual de ácidos nucleicos requiere la
atención exclusiva de personal capacitado. La automatización permite más tiempo libre para
el investigador mientras el robot se encarga del trabajo repetitivo. Los protocolos
automatizados también son generalmente más rápidos que sus contrapartes manuales (en
términos de tiempo empleado por extracción), lo que acelera aún más su flujo de trabajo.
Flujo de trabajo sin problemas . En muchos casos, es posible integrar un protocolo de
extracción de ácido nucleico automatizado con las aplicaciones posteriores previstas, por
ejemplo, extracción automatizada seguida de preparación y purificación por PCR , dejándolo
con una placa perfecta de muestras que está lista para aplicaciones posteriores. Además de lo
anterior, la extracción automatizada también debería facilitar la investigación entre
laboratorios, ya que el impacto de la intervención humana y el error se reduce
considerablemente, lo que conduce a una mayor consistencia y confiabilidad de los datos. Si
está considerando la automatización para su laboratorio, póngase en contacto . Estaremos
encantados de ayudarle a superarlo.
Inconvenientes:
El principal inconveniente de este procedimiento es que requiere mucho tiempo y utiliza
productos químicos tóxicos como el fenol y el cloroformo. Además, el ADN extraído con
CTAB requiere una mayor purificación para evitar la inhibición de los análisis de PCR.
Enzimas de restricción:
2.1- Definición:
Las enzimas de restricción, son enzimas responsables por cortar/romper el segmento de
ADN, de un ser vivo. Estas enzimas están en bacterias, y trabajan junto con la DNA ligase,
que tiene la característica de como su nombre dice de enlazar dos moléculas de DNA y
formar un DNA uniforme. Es válido entender que esta enzima de restricción es
ESPECÍFICA, y por ende solo corta locales preseleccionados. Se supone que estas
enzimas de restricción son mecanismos de defensa y reorganización del material genético
de las bacterias. Un ejemplo de la acción de estas enzimas son las imágenes abajo:
Tenemos acá un sitio por ejemplo, llamado EcoRI que es de frecuente aplicación
laboratorial, que es expresado por los 4 codones , tanto de arriba (2), mientras que de abajo
(2).
Percibimos la ruptura , en su sitio específico en la molécula de ADN , para posterior
aplicación clínica,farmacológica, de ingeniería molecular y etcétera.
2.2- Origen:
Su origen como mencionado antes es bacteriana o protozoaria, en los plásmidos por
ejemplo que es un ADN ajeno al ADN principal, y que tiene importancia clínica, ya que la
resistencia de los antibióticos provienen de ahí.
2.3-Clasificación:
La clasificación de las enzimas de restricción son dadas por su origen bacteriana o de
protozoario , como vemos en la tabla abajo:
Como vemos en el caso de la EcoRI , su origen viene de la Escherichia coli, y su sitio de
reconocimiento es la 5’- GAATTC - 3’ y por apareamiento de bases tendríamos 3’-CTTAAG-
3’.
Pero, además de esta clasificación tenemos el básico , que seria la clasificaciónde tipos
I,II y III.
Centraremos primero en las enzimas de tipo II , ya que al cortar en un punto muy definido
dentro de su secuencia diana, son utilizadas como herramientas en ingeniería genética.
Además las enzimas de restricción de Tipo II reconocen una secuencia específica conocida
como secuencia diana y siempre cortan entre los mismos nucleótidos.
Las enzimas de restricción de Tipo I y III reconocen una secuencia específica pero cortan a
una distancia variable del sitio de reconocimiento (sitio de restricción).
De ahí que generen siempre los mismos fragmentos de restricción. La secuencia diana es
de tamaño variable, la mayoría de 4 y 6 nucleótidos, y con frecuencia es parcialmente
palindrómica. Algunas enzimas de restricción cortan generando extremos llamados romos
mientras que otras cortan generando extremos llamados cohesivos.
2.4- Aplicación Clínica:
Las enzimas de restricción son una herramienta básica en clonación e ingeniería genética;
se utilizan, entre otros fines, para hacer mapas de restricción de plásmidos o genomas. Un
mapa de restricción se define como la serie de fragmentos que se generan por el corte con
determinada(s) enzima(s), específicos en tamaño (y secuencia) y que permiten emplearlos
para la caracterización de dicho ADN. Esta herramienta es sumamente importante para la
clonación con vectores. También, en estudios de determinación de polimorfismos, como la
técnica de RFLP, según se presente o no el sitio de corte de una enzima de restricción, se
puede establecer la variante alélica, ya que el peso molecular del fragmento o fragmentos
de ADN generado(s) permitirá la caracterización de la secuencia. Asimismo, la construcción
de moléculas de ADN recombinante implica el obvio empleo de las enzimas de restricción
para definir y delimitar las secuencias que se insertarán en el constructo recombinante. De
la misma manera, el corte de ADN genómico que suele ser, según el organismo, del orden
de millones de pb, es más manipulable cuando es digerido por estas enzimas en
fragmentos más pequeños.
3) Terapia Gênica
3.1 Definicion
Cuando se hace referencia a la terapia génica , hacemos énfasis a la transferencia o
introducción de material genético (ácido nucleico) a una célula eucariótica con el propósito
de alterar el curso de una enfermedad o corregir una alteración metabólica o genética. Es
una estrategia terapéutica basada en la modificación del repertorio genético de células
mediante la administración de ADN o ARN destinada a curar enfermedades de origen tanto
hereditario como adquirido.
3.2 Clasificación
A) Terapia génica somática
La terapia génica somática se basa en la transferencia de material genético a células
somáticas como forma alternativa de tratamiento para mejorar la salud de las personas.
Esta terapia está todavía en fase experimental
A.1) Terapia in vivo
Este tipo de terapia hace referencia a la transformación celular que toma lugar dentro del
paciente al que se le administra la terapia. Consiste en administrar al paciente un gen a
través de un vehículo (por ejemplo un virus), el cual debe localizar las células a infectar.
A.2) Terapia ex vivo
Este tipo de terapia hace referencia a la transformación celular, en el cual se lleva a cabo a
partir de una biopsia del tejido del paciente y luego se le trasplantan las células ya
transformadas. Esta técnica está casi completamente reducida a células hematopoyéticas
pues son células cultivables, constituyendo así un material transplantable.
B) Terapia Gênica Germinal
Se realizaría sobre las células germinales del paciente, por lo que los cambios generados
por los genes terapéuticos serían hereditarios. Es importante destacar que hasta ahora, se
ha realizado únicamente en animales. Esto se debe a que técnicamente, la terapia en
células germinales es más difícil que en células somáticas, ya que se debe demostrar que
no va a haber efectos adversos en el desarrollo.
3.3 Metodos de envio de Genes
3,3 Transferencia de genes por un vector no viral
A) Físicos
A.1) Electroporación
Se utiliza para cultivos celulares y consiste en el uso de una celda donde se colocan
las células, que se adapta a un electroporador que genera una corriente eléctrica del
orden de milivoltios, con una duración de milisegundos, para generar orificios en la
membrana celular.
A.2) Bombardeo de partículas
Es el método de elección para la transfección de células vegetales, ya que la pared
celular es un obstáculo físico que bloquea de manera natural la transducción.
También se le conoce como pistola de genes y consiste en el uso de un aparato de
balística que dispara micropartículas de oro, rodeadas de ADN plasmídico.
A.3) Microinyección
Consiste en la inyección directa de ADN en el núcleo celular mediante una
microjeringa y un microscopio óptico. Se utiliza principalmente para la producción de
animales transgénicos.
B) Químicos
B.1) Precipitación con fosfato de calcio
Estos precipitados forman microagregados que se depositan sobre la membrana
celular y, posteriormente, son endocitados. Es la técnica más difundida para la
producción de líneas celulares transfectadas de forma estable. y la de elección para
experimentos in vitro por su bajo costo.
B.2) DEAE-Dextran
Se desconoce el mecanismo por el cual el DEAE-Dextran permite la entrada de ADN
a las células y su transporte hasta el núcleo, pero se asume que los complejos
formados por el DEAE-Dextrano y el ADN se adhieren a la superficie celular y entran
por endocitosis.
B.3) Lipossomas
Esta técnica se basa en el uso de moléculas lipídicas de carga neta altamente
positiva (catiónicas) que interactúan con el esqueleto fosfatado de la molécula de
ADN.
3.4 Transferencia de genes por vectores virales y no virales
A) Transferencia de genes por vectores virales
Los virus que se utilizan como vectores virales son retrovirus, adenovirus,
adenoasociados, herpesvirus y baculovirus.
En general, un vector ideal para utilizarse en terapia génica debe cumplir las
siguientes condiciones: Su producción debe ser fácil y eficiente, No debe ser tóxico o
inducir reacciones inmunológicas en el paciente, Debe ser capaz de infectar a
células tanto en reposo como en replicación y Debe transducir tipos celulares de
manera específica.
A.1) Retrovírus
Su principal ventaja es que no contienen proteínas virales en el vector, con lo que la
respuesta inmune del huésped es nula; además, tampoco existe interferencia de una
respuesta inmune previa.
A.2) Herpes Vírus
Puede ser una herramienta muy valiosa en células del sistema nervioso central, ya que sus
células diana son las neuronas y se trata de un virus integrativo, con una capacidad de
expresión persistente. Su complejidad, así como el hecho de que aún se duda de la
existencia de un herpes virus no replicativo o sin capacidad de producir las proteínas líticas,
ponen en entredicho la seguridad de su utilización.
A.3) Adenovirus
Alrededor de 90% de la población humana se encuentra sensibilizada a los adenovirus, por
haber estado en contacto con éstos, y por tanto, presentan anticuerpos circulantes contra
ellos, lo que limita su aplicación en protocolos clínicos.
A.4) Virus Adenoasociado
Su uso es muy prometedor, debido a que no generan respuesta inmune humoral en el
huésped y se ha reportado la expresión del gen terapéutico por más de un año; sin
embargo, tienen el inconveniente de que son difíciles de producir y los títulos que se
obtienen son bajos.
3.5 Vectores virales utilizados
Retrovirus:Los retrovirus son un grupo ampliamente desarrollado. Son virus cuyo
material genético está constituido por una molécula de ARN. Esto los obliga a
realizar el proceso de retrotranscripción para su replicación. Tienen la capacidad de
integrarse en el genoma del huésped, con lo que ofrecen la ventaja de una
expresión persistente del transgén, lo que los hace útiles para su uso en
enfermedades hereditarias y/o crónicas. Sin embargo, la integración en el genoma
del huésped es aleatoria, presentando el riesgo (aunque extremadamente bajo) de
mutagénesisinsercional debido a la posibilidad de alterar un gen vital o un gen
supresor de tumor y por lo tanto interrumpir su expresión, o bien insertarse en un
protooncogén induciendo su activación a oncogén. La gran desventaja que presenta
este tipo de vectores es que sólo son capaces de infectar células en división. Los
retrovirus recombinantes más usados son los derivados del virus de la leucemia
murina, los cuales se modifican para hacerlos deficientes de replicación, con lo que
se suprime su capacidad de formar partículas virales.
Adenovirus:Los adenovirus tienen importancia clínica porque generan infecciones
respiratorias y conjuntivales.Los adenovirus se utilizan en terapia génica in vivo, ya
que pueden infectar de forma eficaz células que no están en fase de división y
facilitan la expresión de grandes cantidades del producto proteico. Los adenovirus
son altamente estables sin integrarse en el material genético de la célula diana8 . La
capacidad para replicarse de los adenovirus in vivo depende del tipo de célula diana,
un inconveniente es que algunas de las proteínas virales pueden ser tóxicas para la
célula.
Adenoasociados (AAV):Los virus adeno asociados (AAV) están constituidos por
ADN de cadena sencilla, requieren de un adenovirus o de un virus herpes que
coopere con sus funciones para que se puedan replicar. Los AAV no son
patogénicos y su genoma con 4.7 kb contiene dos marcos de lectura (ORF) que
están flanqueados por repeticiones terminales invertidas (ITR). En la ausencia de un
virus cooperador, la doble cadena del ADN viral se integra en el genoma de la célula
hospedera gracias a la recombinación dirigida por la región viral rep21 . A los
vectores AAV les han removido la mayor parte de su ADN dejando únicamente los
ITRs lo que permite incorporar un transgene con una capacidad de
aproximadamente 4.9 kb.
Los AAV son uno de los vectores más utilizados. Principalmente porque inducen una
expresión eficiente del transgene por tiempos prolongados en diferentes tejidos
como lo son: el hígado, el músculo, la retina y el sistema nervioso central23. Sin
embargo, su capacidad de empaquetamiento se restringe cuando se realiza a gran
escala, lo que trae como consecuencia una producción ineficiente.
3.6 Ventajas y desventajas de los vectores virales mas empleados
RETROVIRUS
VENTAJAS ● Transducción eficaz.
● Integración genómica y expresión persistente.
● Permite la expresión a largo plazo del gen
terapéutico.
● Penetra efectivamente en las células de división.
● Se integra en material genético de la célula huésped
sin introducir los genes virales
DESVENTAJAS ● Dependencia de la división celular.
● Dificultad para controlar y asegurar la expresión.
● El tamaño de los genes que se introducirán es
limitado.
● Existe potencial de daño al genoma, por integrarse
en éste al azar
ADENOVIRUS
VENTAJAS ● Se logra un alto nivel de expresión.
● Relativamente fáciles de manejar.
● Infectan un buen número de tipos celulares
(incluyendo células que no se están dividiendo).
● Leve efecto como agentes patógenos en el ser
humano (p. ej., resfriados)
DESVENTAJAS ● Expresan varias proteínas virales que resultan
inmunogenéticas.
● La introducción repetida no es satisfactoria
normalmente, a menos que la exposición inicial
esté acompañada de una modulación
inmunológica para suprimir la respuesta inicial a
las proteínas de la cápsula adenoviral.
ADENOASOCIADO
VENTAJAS ● Generan baja respuesta inmune
DESVENTAJAS ● Requieren de los genes virales para integrarse.
● Sólo translucirán células en presencia de un
adenovirus.
● El tamaño del gen que pueden integrar es muy
limitado (menos de 4 kb).
● Necesitan un gran número de partículas víricas
para transducir las células.
● La preparación de partículas víricas de vectores
AAV es difícil.
3.7 Aplicacion clínica
El conocimiento de las bases genéticas de algunas enfermedades y la reciente
secuenciación del genoma humano han abierto la posibilidad de esta estrategia terapéutica.
Esto supone perspectivas para la curación de muchas enfermedades a las que se pretende
combatir mediante los genes, como elementos curativos. Por ello, en este momento la
terapia génica se ve como una nueva forma de medicina molecular aplicable a la mayoría
de las enfermedades, no sólo las monogénicas sino también las multifactoriales, en cuyo
tratamiento puede ser útil la modificación de la expresión génica.
Terapia genica contra el cancer
El cáncer es la enfermedad en la que se encuentran registrados la mayor cantidad de
protocolos clínicos con terapia génica, entre los que se encuentran la estimulación del
sistema inmune para combatir las células cancerígenas, la terapia suicida para inducir la
muerte de las células tumorales, la suplementación de genes supresores de tumores y el
bloqueo de oncogenes.
Entre los diferentes protocolos clínicos, el empleo de oligonucleótidos antisentido o
estrategias de silenciamiento contra una variedad de oncogenes, como k-ras, c-myc, bcr-abl
y bcl-2, han dado buenos resultados cuando estas maniobras se han combinado con
quimioterapia.
Por otro lado, ya que en general la respuesta inmune de los pacientes con cáncer está
disminuida, ésta se ha tratado de potenciar mediante terapia génica ex vivo en células
tumorales o células inmunes efectoras (como linfocitos T o presentadoras de antígenos,
como dendríticas y macrófagos). En este sentido, se han validado, a nivel preclínico,
reportes en que se han empleado células dendríticas modificadas genéticamente para
producir epítopes capaces de inducir respuesta inmune específica. En protocolos clínicos de
vacunación con ADNc, se han empleado citocinas, como interleucina (IL) 2, IL-4, IL-7, factor
de necrosis tumoral, interferón gamma y GM-CSF. En las células de tumor, mediante terapia
génica con estos transgenes, se ha logrado la expresión de las moléculas coestimuladoras,
como CD80 (B7-1) o CD86 (B7-2), presentes en las células presentadoras de antígenos,
pero que no se expresan en las células tumorales —lo que impide una correcta activación y
maduración de las células T contra los epítopes de las células tumorales.
Por otro lado, la terapia suicida es una estrategia de terapia génica que suele aplicarse en
tumores sólidos. Se basa en el empleo de genes de enzimas capaces de activar
profármacos que presentan una leve toxicidad para las células que expresan el transgén y
que, por tanto, pueden metabolizar el fármaco. Estas enzimas son virales, como la cinasa
del herpes simple (HSVTK) o bien bacterias o levaduras, como la citocina desaminasa (CD).
La enzima más empleada es HSVTK, que fosforila al ganciclovir y lo convierte en un
metabolito tóxico. La CD convierte a la molécula farmacológica 5-fluorocitosina (5-FC) en su
forma toxica el metabolito 5-fluorouracilo. Ambos transgenes se han empleado en
https://accessmedicina.mhmedical.com/drugs.aspx?GbosID=365618
numerosos protocolos preclínicos y clínicos para tumores cerebrales, de cabeza y cuello, y
ováricos. Cuando se emplean adenovirus como vectores suelen administrarse directamente
en el tumor, seguidos de la administración de GCV. Para evitar su posible efecto tóxico se
realizan constructos con promotores específicos del tumor para asegurar la transducción
exclusiva de las células blanco tumorales.
Terapia gênica contra agentes infecciosos
Se enfoca en la transducción de genes que bloquean o disminuyen la expresión de genes
involucrados en la replicación del agente infeccioso, o bien que limiten o impidan su
diseminación en el organismo infectado. Las estrategias se basan en la inhibición de
proteínas indispensables para la replicación del microorganismo mediante estrategias
antisentido, señuelos de ARN y ARN catalíticos (ribozimas), o bien en la estimulación
específica del sistema inmune contra el agente infeccioso utilizando vacunas genéticas o
linfocitos específicos del patógeno.
Ejemplos específicos de estas aplicaciones incluyen el uso de ribozimas multidiana para
regiones conservadas del genoma del VIH-1, las cuales han demostrado una inhibicióneficiente de la replicación viral. Para el caso del virus de la hepatitis Cse han empleado
ARNsi, que tienen como secuencia blanco el loop II de la región 5’ no traducida, ya que han
demostrado la inhibición efectiva de la expresión de seis genotipos del virus.
Terapia genica contra enfermedades monogenicas
Los niños que padecen inmunodeficiencia severa combinada (SCID) por deficiencia de la
enzima ADA no tienen respuesta inmune adecuada, ya que la ADA participa en el
metabolismo de las purinas y su deficiencia ocasiona la acumulación de dATP, metabolito
que inhibe la acción de la reductasa ribonucleótido-difosfato, que modifica los
ribonucleótidos a desoxinucleótidos. La proliferación de linfocitos depende de la síntesis de
dNTP, por lo que sin una reductasa de ribonucleótidos funcional, la proliferación de linfocitos
se inhibe y el sistema inmune se compromete. A los pacientes con esta afección se les
conoce como niños burbuja, ya que son muy vulnerables a sufrir infecciones, por lo que era
necesario mantenerlos en un medio ambiente estéril como medida paliativa.
La estrategia de terapia génica dirigida a estos pacientes consistió en aislar linfocitos T de
los niños afectados e introducir el gen ADA normal usando un vector retroviral. Una vez
insertado el gen, las células se devuelven a los pacientes. El tratamiento duró un año con
administraciones cada uno o dos meses, y los niños mostraron mejoras clínicas
significativas, y fueron capaces de iniciar una respuesta inmunitaria, lo que produjo una
importante disminución en el número de infecciones.
El riesgo de una posible mutagénesis insercional, después de repetidas transferencias
retrovirales, se vio confirmado al presentarse leucemia en dos de 12 de los niños tratados.
En febrero de 1991 se autorizó también el mismo protocolo en Italia, al doctor Bordignon, en
el Hospital San Raffaele de Milán. En 1995 ambos grupos de investigación publicaron los
resultados y pusieron de manifiesto la eficacia de la terapia génica con retrovirus en estos
pacientes.
Terapia génica contra la cirrosis hepática
Las estrategias de terapia génica para el abordaje de la cirrosis incluyen la inhibición de la
expresión del TGF-β, el aumento de la expresión de MMP o de moléculas fibrolíticas para
aumentar la degradación de la cicatriz fibrótica. En este sentido, se han desarrollado
vectores adenovirales con los genes de MMP8, uPA y un receptor truncado para TGF-β
para el tratamiento de la cirrosis hepática. Estos vectores ofrecen la ventaja de que
presentan un tropismo natural por el hígado cuando se administran por vía sistémica, lo que
constituye una ventaja cuando se emplean para el tratamiento de la cirrosis hepática.
La MMP8 es una metaloproteinasa cuyo sustrato principal es la colágena tipo I, que se
incrementa considerablemente en la fibrosis. Esta enzima es producida por los neutrófilos,
por lo que su sobreexpresión en células hepáticas es una estrategia innovadora. Los
resultados con este transgén demostraron reducciones de 45% del área fibrótica, un
aumento en la expresión de genes fibrolíticos, como MMP3 y TIMP1 libre, mejorías en
marcadores hepáticos de funcionalidad y regeneración celular (HGF), y reducciones en el
gen de TGF-β1. Por otro lado, el transgén uPA (activador de plasminógeno tipo urocinasa)
induce la activación de varias MMP y, como consecuencia, provoca efectos antifibróticos,
que se reflejan en reducciones de 85% del área fibrótica a los 10 días posadministración y
un aumento significativo en la expresión de marcadores de regeneración hepática celular,
como HGF y su receptor c-Met, y en el número de células positivas a PCNA, así como
mejorías en los niveles de marcadores hepáticos de funcionalidad.
La tercera estrategia es el uso de un receptor truncado de TGF-β que oblitera la
señalización de esta citocina profibrogénica, e induce de esta manera que muchos genes
fibrogénicos se reduzcan (Col I, TGF-β1, PDGF, PAI-1 y TIMP1) y varios genes implicados
en la degradación de MEC se incrementen, como MMP3.
Conclusión:
Es de expresiva magnitud ,que los conocimientos de ADN y ARN, junto con su aplicabilidad
laboratorial nos trae, llamando atención para el amplio espectro de utilidad que podemos
alcanzar con la Ingeniería Genética y su aplicación clínica. A pesar que es un vislumbre, su
aplicación no está tan implementada , ya que estamos hablando de nivel molecular.
Teniendo en vista esto , llegase al consenso que las diferentes áreas se relacionan
alrededor de estos temas y sin ellos , no lograríamos entender cuan grande son los
conocimientos que aún no sabemos.
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