Pretratamiento-de-residuos-lignocelulosicos-bagazo-de-agave-para-su-enriquecimiento-en-celulosa-y-valoracion-de-azucares-reductores

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
PRETRATAMIENTO DE RESIDUOS 
LIGNOCELULÓSICOS (BAGAZO DE AGAVE) PARA SU 
ENRIQUECIMIENTO EN CELULOSA Y VALORACIÓN 
DE AZÚCARES REDUCTORES. 
 
 T E S I S 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 
 I N G E N I E R O Q U Í M I C O 
 
 PRESENTA: 
 MÓNICA MORENO GONZÁLEZ 
 
MÉXICO 2011 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: RAÚL GENARO AGUILAR CABALLERO 
VOCAL: Profesor: ROGELIO RODRÍGUEZ SOTRES 
SECRETARIO: Profesor: OSCAR HERNÁNDEZ MELÉNDEZ 
1er. SUPLENTE: Profesor: MILTON THADEU GARCIA MEDEIROS DE 
 OLIVEIRA 
2° SUPLENTE: Profesor: SANDRA PAOLA SÁNCHEZ RODRÍGUEZ 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO. FACULTAD DE QUÍMICA, CONJUNTO E, LABORATORIO DE 
ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA. LABORATORIO 314, CIUDAD UNIVERSITARIA, 
MÉXICO D. F. 
 
 
ASESOR DEL TEMA: OSCAR HERNÁNDEZ MELÉNDEZ 
(Nombre y Firma) 
SUSTENTANTE: MÓNICA MORENO GONZÁLEZ 
(Nombre y firma) 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 Gracias a mi familia, que sin su apoyo no podría haber terminado este 
trabajo. En especial a mis padres que son mi ejemplo a seguir y que siempre me 
han motivado para ser una mejor persona. Gracias por su paciencia y 
comprensión, por dejarme tomar mis propias decisiones, brindándome apoyo y 
levantándome cuando cometía algún error, ayudándome a comprender que debía 
aprender de éste. 
 A mis hermanas y primas, que me escucharon a lo largo de la realización 
de este trabajo, y me motivaron a terminarlo exitosamente. Y que junto a ellas he 
vivido momentos inolvidables. 
 Gracias Dr. Oscar Hernández, por darme la oportunidad de formar parte del 
proyecto de BABETHANOL, completando mi formación profesional en el área de 
investigación, gracias al Dr. Miquel, al Dr. Alberto, a la Dra. Carmina y a todos mis 
compañeros del laboratorio, por permitir mi estancia en él, apoyarme y 
enseñarme. 
 Gracias a mis amigos que recorrieron conmigo este camino y que llenaron 
mi vida en la facultad de química de momentos inolvidables. 
 
 
 
INDICE 
INTRODUCCIÓN…………………….……………………………………………………………1 
ANTECEDENTES…………………………………………………………………………………4 
 BIOCOMBUSTIBLES.……...…………………………………………………………....4 
 MATERIA LIGNOCELULÓSICA…….…………………………………………….…….7 
 COMPOSICIÓN DE LA MATERIA LIGNOCELULÓSICA……………………7 
 TECNOLOGÍAS DE PRETRATAMIENTO…………………………………………....12 
 FACTORES CLAVES PARA LA EFECTIVIDAD DEL 
 PRETRATAMIENTO EN LA BIOMASA LIGNOCELULÓSICA…………….13 
 FACTORES QUE LIMITAN LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA………….……13 
 PRETRATAMIENTOS BIOLÓGICOS…………………………………….…..14 
 PRETRATAMIENTOS FÍSICOS……………………………………………….15 
 MACERACIÓN MECÁNICA…………………….……………………..15 
 EXTRUSIÓN……………………………………….…………………….15 
 PRETRATAMIENTOS QUÍMICOS……………………………….……………15 
 PRETRATAMIENTO ALCALINO……………….……………………..15 
 HIDRÓLISIS ÁCIDA…………………………….………………………16 
 OZONÓLISIS…………………………………………………………….17 
 PROCESO ORGANOSOLVENTE………….…………………………17 
 TRATAMIENTO CON LÍQUIDOS IÓNICOS…………………………17 
 PRETRATAMIENTOS FISICOQUÍMICOS………………….…………….….18 
 “AMONIA FIBER EXPLOSION” (AFEX)………………………….….18 
 “STEAM EXPLOSION”(AUTOHIDRÓLISIS)…………………….…..19 
 “CARBON DIOXIDE EXPLOSION” (“SC-CO2 EXPLOSION”)….…22 
 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA………………………………………………………….....24 
 
 
OBJETIVOS E HIPÓTESIS……………………………………………………………………..29 
 OBJETIVO GENERAL…………………………………………………………….……..29 
 OBJETIVOS PARTICULARES………………………………………………………….29 
HIPÓTESIS…………………………………………………………………………………...…...30 
METODOLOGÍA…………………………………………………………………………………..31 
DETERMINACIÓN DE LOS COMPONENTES DE LA FIBRA DEL BAGAZO DE 
AGAVE…………………………………………………………………………………….31 
 PRETRATAMIENTO FÍSICOQUÍMICO: ENRIQUECIMIENTO DE CELULOSA 
 (MACERACIÓN CON MORTERO)………………………………………………..…...32 
 EXTRACCIÓN DE HEMICELULOSAS……………………………………………......32 
 DELIGNIFICACIÓN DEL RESIDUO LIGNOCELULÓSICO…………………………33 
 “STEAM EXPLOSION”…………………………………………………………………..33 
 “SC-CO2 EXPLOSION”……………………………………………………………….....35 
 VALORACIÓN DE LOS AZÚCARES REDUCTORES PRODUCIDOS POR 
 LA HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DEL RESIDUO LIGNOCELULÓSICO
 PRETRATADO……………………………………………………………………..…….36 
 MEDICIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA……………………………………….…...37 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………………………..…...39 
 1. CUANTIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES DE LAS FIBRAS DE BAGAZO 
 DE AGAVE………………………………………………………………………………..39 
 2. ENRIQUECIMIENTO DE LA CELULOSA MEDIANTE LA MACERACIÓN 
 CON MORTERO…………………………………………………………………………42 
 2.1 VALORACIÓN ENZIMÁTICA……………………………………………...46 
 3. EXTRACCIÓN DE HEMICELULOSAS…………………………………………..…50 
 3.1 VALORACIÓN ENZIMÁTICA……………………………………………...50 
 4. “STEAM EXPLOSION”.….……………………………………………………………52 
 4.1DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR HPLC……..67 
 
 
 4.2 RAYOS X………………………………………………………………….....71 
 4.3 MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO………………………...74 
 4.4 “STEAM EXPLOSION” ÓPTIMO………………………………………….79 
5. “CARBON DIOXIDE EXPLOSION” (“SC-CO2 EXPLOSION”)………...………..89 
 5.1 DETERMINACIÓN DE AZUCARES REDUCTORES POR HPLC……93 
 5.2 RAYOS X…………………………………………………………………….95 
6. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA………………………………..97 
RESUMEN DE RESULTADOS..………………………………………………………105 
CONCLUSIONES ..…………………………………………………………………….109 
BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………….110 
ANEXOS…………………………………………………………………………………113 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABREVIATURAS 
 
SE1 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 180°C L/S=30 t=10 min 
SE2 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 190°C L/S=30 t=10 min 
SE3 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 200°C L/S=30 t=10 min 
SE4 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 180°C L/S=20 t=10 min 
SE5 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 190°C L/S=20 t=10 min 
SE6 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 200°C L/S=20 t=10 min 
SE7 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 180°C L/S=10 t=10 min 
SE8 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 190°C L/S=10 t=10 min 
SE9 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 200°C L/S=10 t=10 min 
SEL1 Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 180°C 
L/S=30 t=10 min 
SEL2 Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 190°C 
L/S=30 t=10 min 
SEL3 Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 200°C 
L/S=30 t=10 min 
SEL4Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 180°C 
L/S=20 t=10 min 
SEL5Licor recuperdado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 190°C 
L/S=20 t=10 min 
SEL6Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 200°C 
L/S=20 t=10 min 
SEL7Licor recuperdado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 180°C 
L/S=10 t=10 min 
SEL8Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 190°C 
L/S=10 t=10 min 
SEL9Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 180°C 
L/S=30 t=10 min 
SEO5 Bagazo patróntratado con “Steam 
Explosión” a 200°C L/S=20 t=5 min 
SEO10 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 200°C L/S=20 t=10 min 
SEO15 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 200°C L/S=20 t=15 min 
 
 
SE020 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 200°C L/S=20 t=20 min 
SEOL5 Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 200°C 
L/S=20 t=5 min 
SEOL10 Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 200°C 
L/S=20 t=10 min 
SEOL15 Licor recuperado del bagazo 
patrón tratado con “Steam Explosión” a 
200°C L/S=20 t=15 min 
SEOL20 Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 200°C 
L/S=20 t=20 min 
SEO*5 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 180°C L/S=20 t=5 min 
SEO*10 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 180°C L/S=20 t=10 min 
SEO*15 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 180°C L/S=20 t=15 min 
SEO*20 Bagazo patrón tratado con “Steam 
Explosión” a 180°C L/S=20 t=20 min 
SEOL*5 Licor recuperado del bagazo patrón 
tratado con “Steam Explosión” a 180°C 
L/S=20 t=5 min 
SEOL*10 Licor recuperado del bagazo 
patrón tratado con “Steam Explosión” a 
180°C L/S=20 t=10 min 
SEOL*15 Licor recuperado del bagazo 
patrón tratado con “Steam Explosión” a 
180°C L/S=20 t=15 min 
SEOL*20 Licor recuperado del bagazo 
patrón tratado con “Steam Explosión” a 
180°C L/S=20 t=20 min 
CDE1 Bagazo patrón tratado con”SC-CO2 
Explosion” a 150°C L/S=1 t=10 min 
CDE2 Bagazo patrón tratado con”SC-CO2 
Explosion” a 150°C L/S=1 t=30 min 
CDE3 Bagazo patrón tratado con”SC-CO2 
Explosion” a 150°C L/S=1 t=60 min 
CDE4 Bagazo patrón tratado con”SC-CO2 
Explosion” a 160°C L/S=1 t=10 min 
CDE5 Bagazo patrón tratado con”SC-CO2 
Explosion” a 160°C L/S=1 t=30 min 
CDE6 Bagazo patrón tratado con”SC-CO2 
Explosion” a 160°C L/S=1 t=60 min 
CDE7 Bagazo patrón tratado con”SC-CO2 
Explosion” a 170°C L/S=1 t=10 min 
CDE8 Bagazo patrón tratado con”SC-CO2 
Explosion” a 170°C L/S=1 t=30 min 
CDE9 Bagazo patrón tratado con”SC-CO2 
Explosion” a 170°C L/S=1 t=60 min 
AR Azúcares Reductores 
ART Azúcares Reductores Totales
 
 
 
RESUMEN 
En México la producción de Tequila es un proceso importante, sin embargo, presenta dos 
problemas la generación: de vinazas y el elevado volumen de bagazo que se genera. 
El bagazo de agave es un compuesto lignocelulósico, que puede ser utilizado para la 
producción de bioetanol de segunda generación. Es considerado como una fuente de 
energía renovable y podría reemplazar a los combustibles derivados del petróleo. El 
bagazo está compuesto principalmente por hemicelulosa, lignina y celulosa. La fracción 
mayoritaria de biomasa es la celulosa (43-47%). Para caracterizar el bagazo se utilizó el 
método de Van Soest y Wine (ADF-NDF), que es un método estándar ampliamente 
utilizado en la industria alimentaria para estimar la concentración de cada uno de los 
polímeros constituyentes de las fibras vegetales (Van Soest y Wine, 1967). 
Un proceso de pretratamiento es reconocido como un paso clave para lograr una 
conversión enzimática completa para la posterior biotransformación de material 
lignocelulósico a etanol. 
En este trabajo se estudiaron tres técnicas de pretratamiento para el enriquecimiento de la 
celulosa del bagazo de agave. Un tratamiento mecánico de maceración con NaOH al 11% 
y con agua a diferentes temperaturas. El tratamiento ““Steam Explosion”” (por sus siglas 
en ingles), que consiste en utilizar un reactor batch, en el cual también se lleva a cabo la 
autohidrólisis del bagazo de agave. El último tratamiento aplicado al bagazo de agave fue 
el “Carbon Dioxide Explosion”, que consiste en la utilización de CO2 en estado 
supercrítico, que actúa como un fluido líquido, el cual en función de la temperatura, puede 
permitir la explosión de las fibras y probablemente una modificación en su estructura, 
promoviendo un incremento en la hidrólisis de los carbohidratos de interés. 
Se evaluó la actividad de las enzimas disponibles en el laboratorio, Accellerase 1500, 
Accellerase XC y Accellerase XY. 
Finalmente, para determinar la efectividad de los pretratamientos se realizó un análisis de 
azúcares reductores utilizando el método del ácido 3,5-Dinitrosalicílico (DNS). Si existe un 
aumento en la cantidad de azúcares reductores, se podría suponer que también se puede 
generar un aumento en la producción de bioetanol. 
1 
 
INTRODUCCIÓN 
Es mundialmente conocida la importancia que tiene la industria del tequila 
en México, principalmente en el estado de Jalisco. Su desarrollo industrial ha ido 
en incremento desde hace tiempo con dos importantes problemas que resolver, 
las aguas residuales llamadas vinazas, producto de la destilación del tequila, y el 
elevado volumen de bagazo de agave, producto de la extracción de los azúcares 
fermentables de las cabezas de la planta Agave tequilana Weber var. azul. 
Según Cedeño (1995) la producción de bagazo de agave es equivalente a 
40% del peso de las cabezas de agave molidas. Si se considera que en el año 
2009 se molieron 924700 toneladas de agave, se concluye que en sólo ese año se 
dejaron de aprovechar cerca de 369880 toneladas de bagazo (CRT 2009). 
Tradicionalmente, el bagazo de agave ha sido utilizado para la fabricación de 
ladrillos y colchones, pero para los grandes volúmenes que se generan, este 
aprovechamiento no presenta un impacto importante en la utilización de este 
material. El proceso de compostaje es la alternativa empleada cotidianamente 
para el manejo y disposición final del bagazo de agave, con ello, se pretende 
reciclar los materiales orgánicos y mantener la fertilidad de los suelos. No 
obstante, Baca y cols., (1993) y Mata-Alvarez y cols., (2000) reportaron que en los 
procesos de compostaje, se emite una gran cantidad de gases de efecto 
invernadero, entre los cuales figuran, alcoholes, cetonas, terpenos, ésteres, 
sulfuros orgánicos, aldehídos, éteres, amoniaco e hidrocarburos de bajo peso 
molecular conocidos como compuestos orgánicos volátiles (COV), situación de 
impacto ambiental mayor inclusive al que se tendría por su quema directa. Por 
esta razón, se pretende valorar al bagazo proveniente de distintas fábricas 
productoras de tequila, para la obtención de fibras enriquecidas en celulosa, las 
cuales incluso se pueden utilizar en la obtención de agromateriales y en la 
obtención de azúcares reductores para la obtención de combustibles renovables. 
La celulosa es el compuesto orgánico más abundante sobre el planeta 
tierra (Bellamy, 1974; Humphery, 1975). Usualmente, la celulosa existe en forma 
de un complejo de celulosa, hemicelulosa y lignina, que conforman la materia 
2 
 
lignocelulósica. La celulosa y la hemicelulosa son convertidas en azúcares por 
medio de ácidos o mediante la hidrólisis enzimática, para ser fermentados y 
producir etanol en el orden de producto de valor agregado. 
La coexistencia de la lignina en la materia lignocelulósica, hace que la 
hidrólisis enzimática de la celulosa se dificulte. Debido a esto, un proceso de 
tratamiento previo a la hidrólisis enzimática es necesario (K.H. Kim, J. Hong 2001). 
Es difícil generalizar un pretratamiento debido a la naturaleza, o bien a la 
cantidad de celulosa, lignina y hemicelulosa que tienen diferentes compuestos, 
como el bagazo de agave o de caña de azúcar. Por eso, durante los últimos años, 
se han sugerido una multitud de tecnologías diferentes, las cuales se puede 
clasificar en procesos biológicos, físicos, químicos y fisicoquímicos (P. Alvira et al. 
2010). 
Entre los pretratamiento fisicoquímicos más prometedores y de menor 
impacto ambiental se encuentran el proceso ““Steam Explosion”” y el proceso “SC-
CO2-Explosion”. 
““Steam Explosion”” es un pretratamiento hidrotérmico, donde la biomasa es 
sometida a vapor presurizado durante un periodo de tiempo que puede seralgunos segundos o minutos y, posteriormente, es despresurizada súbitamente. 
Este pretratamiento combina la fuerza mecánica y los efectos químicos del agua 
debido a la hidrólisis a alta temperatura (autohidrólisis) de los grupos acetilo 
presentes en la hemicelulosa (P. Alvira et al. 2010). 
Los factores más importantes que afectan la efectividad del tratamiento 
““Steam Explosion”” son el tamaño de las partículas, la temperatura y el tiempo de 
residencia. 
El proceso ““Steam Explosion”” ofrece ventajas atractivas cuando se 
compara con otras tecnologías de pretratamiento, éstas incluyen una significativa 
reducción del impacto ambiental, moderada inversión inicial, y alto potencial en la 
eficiencia energética; bajo peligro en el proceso químico y recolección completa de 
3 
 
los azúcares (P. Alvira et al. 2010). Sin embargo, posee una desventaja, como lo 
es la formación de inhibidores, que pueden ser derivados del furano y afectar la 
hidrólisis enzimática, o bien los procesos de fermentación para la obtención del 
bioetanol. 
Otro de los pretratamientos estudiados, es el ““SC-CO2 Explosion”” que 
está basado en la utilización de CO2 en su estado de fluido supercrítico, es decir, 
el fluido en forma gaseosa es comprimido y se lleva a una temperatura por encima 
de su punto crítico, tiene una densidad como si fuera un líquido. Las condiciones 
supercríticas del pretratamiento pueden remover efectivamente la lignina o 
modificando su forma, incrementando la digestibilidad del sustrato. En solución 
acuosa el CO2 forma ácido carbónico, el cual favorece la hidrólisis de los 
polímeros. Las moléculas de CO2 son comparables en tamaño con el agua y el 
amoniaco y, por lo tanto, pueden penetrar de la misma manera en los pequeños 
poros de la lignocelulosa. Este mecanismo es facilitado por la alta presión (P. 
Alvira et al. 2010). 
Se opera a temperaturas menores comparadas con otros métodos, 
previniendo la degradación de los monosacáridos, pero en comparación con el 
proceso ““Steam Explosion”” y el “Amonia Explosion”, el rendimiento de azúcares 
reductores no es tan elevado, sin embargo, la formación de inhibidores es baja, 
comparada con ““Steam Explosion”” (P. Alvira et al. 2010). 
Existen muchos otras tecnologías estudiadas para el pretratamiento de la 
lignocelulosa como son, la ozonólisis, los pretratamientos con ácidos ó la 
utilización de líquidos iónicos. 
Finalmente, todos estos métodos deben hacer a la materia lignocelulósica 
accesible a las reacciones enzimáticas, sin embargo, se deben de tomar en 
cuenta el tipo de proceso que se empleará para pretratar al residuo lignocelulósico 
y, su impacto económico y ecológico. 
 
4 
 
ANTECEDENTES. 
BIOCOMBUSTIBLES 
Debido a que las reservas de petróleo disminuyen, existe la necesidad de 
desarrollar tecnologías alternativas para la producción de combustibles líquidos a 
partir de otros compuestos, que podrían ayudar a prolongar la cultura de los 
combustibles y mitigar los efectos de la escasez de las reservas de petróleo (A. 
Dermibas, 2009). 
Los beneficios que ofrecen los biocombustibles sobre los combustibles 
convencionales son primero cubrir la seguridad energética, la reducción del 
impacto ambiental y el impulso a las actividades socioeconómicas relacionadas 
con el sector rural. Además, la tecnología de los biocombustibles es relevante para 
el desarrollo y la industrialización de los países. Por eso, la participación de los 
biocombustibles en el mercado automotriz se espera que crezca rápidamente 
sobre la siguiente década (A. Dermibas, 2009). 
El concepto de desarrollo sustentable embona con la idea de una inter-
relación y balance entre las cuestiones políticas, económicas y ambientales 
involucradas (A. Dermibas, 2009). 
El creciente problema de las emisiones de CO2, además de las 
preocupaciones sobre la seguridad energética, ha incrementado el interés en 
buscar fuentes de energía no provenientes del petróleo. La biomasa vegetal es 
adecuada como fuente de energía renovable, que puede proveer de combustibles 
alternativos de transporte, como es el bioetanol o el biodiesel. (P. Alvira et. al, 
2010). 
Los biocombustibles son una fuente de energía renovable, producidos por 
materiales naturales, que pueden ser usados como sustitutos de los combustibles 
del petróleo. Los biocombustibles más comunes son el etanol a partir de maíz, 
paja, o remolacha de azúcar y los ácidos grasos provenientes del aceite de 
semillas. El bioetanol es un aditivo del petróleo/ sustituto que puede ser producido 
5 
 
por fuentes de biomasa celulósica como plantas leñosas, hierbas, residuos 
agrícolas y forestales, y por una larga porción de desechos municipales e 
industrias. La producción de bioetanol a partir de biomasa vegetal es una manera 
de reducir el consumo de petróleo y la contaminación ambiental. 
El término biocombustible es referido a un combustible sólido, líquido 
(bioetanol y biodiesel) o gaseoso (biogas) que es predominantemente producido a 
partir de biomasa. La gran diferencia entre los biocombustibles y combustibles de 
petróleo es el contenido de oxígeno (A. Dermibas, 2009). 
Las ventajas que presentan los biocombustibles son: (a) son fácilmente 
producidos a partir de fuentes de biomasa común, (b) representan el ciclo del 
dióxido de carbono en la combustión, (c) son considerados amigables con el 
ambiente, (d) generan beneficios para la economía de los consumidores y, (e) de 
acuerdo a la literatura especializada, son biodegradables y contribuyen con la 
sustentabilidad energética (A. Dermibas, 2009). Entre los beneficios se incluyen la 
reducción de la emisión de gases de efecto invernadero incluyendo las de CO2 (A. 
Dermibas, 2009). 
La importancia del estudio de los biocombustibles está en el interés por 
resolver algunos de los problemas más urgentes que se presentan en este 
planeta. En primer lugar la preocupación por el abasto energético, debido a que 
las reservas de petróleo en nuestros días son un recurso limitado y los 
requerimientos de energía a nivel mundial crecen en tasas elevadas (A. Dermibas, 
2008). 
En segundo lugar está el cambio climático, provocado por la acumulación 
de las emisiones de CO2 provenientes de fuentes fósiles hacia la atmósfera, que 
es producto en gran medida por la expansión del sector de transporte y su efecto 
se ve reflejado en los cambios notables en el ecosistema terrestre (Kádar et al., 
2004). 
Además de los biocombustibles existen otras fuentes de energía renovable, 
como son la energía solar, eolíca, geotérmica y la energía hidrotérmica; sin 
6 
 
embargo, estos tipos de energía tienen la capacidad de generar únicamente 
energía térmica y eléctrica, mientras que el 40% del consumo de la energía 
mundial es requerida en forma de combustibles líquidos, por lo que la 
investigación para el desarrollo de tecnología para la producción de 
biocombustibles es de gran importancia. (Tan et al, 2008). 
Dentro de los biocombustibles líquidos más estudiados se encuentran el 
bioetanol y el biodiesel. El bioetanol producido a partir de biomasa lignocelulósica 
puede ser una fuente renovable de energía importante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
MATERIA LIGNOCELULÓSICA 
La materia lignocelulosa en forma de residuo forestal y agrícola es una 
fuente de energía renovable, abundante e inagotable, tiene grandes posibilidades 
de ser utilizada en la biotecnología como materia prima. La lignocelulosa 
constituye el mayor componente estructural de la madera, plantas, y plantas no 
leñosas como el pasto. Consiste en celulosa, hemicelulosa y lignina. Las 
propiedades químicas de los componentes lignocelulósicos hacen que sea un 
sustrato con un enorme calor biotecnológico, es decir, puede ser utilizada, para 
diferentes procesos biotecnológicos como la producción de bioetanol o bien de 
biodiesel. (Kuhad, 2007). 
Una gran cantidad de la biomasa residualde las plantas es considerada un 
desecho, que generalmente es quemado, pero que podría ser convertido en 
diferentes productos con valor agregado como biocombustibles, productos 
químicos, y fuentes de carbono baratas para procesos de fermentación, mejorar la 
alimentación de los animales y la nutrición humana, debido a la degradación de la 
celulosa por microorganismos en múltiples productos (Kuhad, 2007). 
 Composición de la Biomasa Lignocelulósica. 
La composición de la biomasa lignocelulósica varía: el mayor componente es la 
celulosa (35-50%) seguido por la hemicelulosa (20-35%) y la lignina (10-25%) 
(Sun y Cheng, 2002). Las proteínas y minerales esenciales constituyen la fracción 
restante. La estructura de este material es muy compleja y la biomasa nativa es 
generalmente resistente a la hidrólisis enzimática. Las fibras de celulosa están 
envueltas en la matriz de la lignina. El xilano es un carbohidrato que ocupa un 
papel importante en la integridad estructural de las paredes celulares por sus 
asociaciones covalentes y no covalentes. La composición de la madera dura 
(roble) y la madera blanda (pino) es diferente significativamente. El contenido de 
lignina para la madera blanda es mayor que el de madera dura, y el contenido de 
hemicelulosa en los compuestos de madera dura es mayor a los de la madera 
blanda (Kuhad, 2007). 
8 
 
La celulosa es un homopolímero formado por unidades de glucosa unidas por 
enlaces β-1,4 glucosídicos. El patrón de repetición presenta una unidad 
estereoquímica de la celulosa, la celobiosa (β-1,4 D-glucosil-D-glucosa). La 
glucosa y celodextrina son los productos principales cuando la celulosa es 
hidrolizada (Kuhad, 2007). Típicamente, las cadenas de celulosa son protectores 
en las paredes celulares de las plantas, los grados de polimerización (DPs) 
contienen de 5000 a 7500 unidades de glucosa, el grado de polimerización de la 
celulosa a partir de madera es de alrededor de 10,000 y alrededor de 15,000 para 
la celulosa proveniente del algodón (Wyman et al, 2005). El grado de cristalinidad 
de la celulosa varia de 0% (amorfa) a aproximadamente 100% (Beguin et al, 
1994). El grado de cristalinidad de la celulosa permite que la celulosa sea 
resistente al ataque de los microbios y a la hidrólisis enzimática, a diferencia de la 
celulosa amorfa, que ésta es afocada con una alta rapidez. (Kuhad, 2007). 
Bajo condiciones normales, la celulosa es extremadamente insoluble en agua, 
lo que es una propiedad necesaria para que funcione propiamente como el 
soporte estructural en las paredes celulares de las plantas (Wyman et al, 2005). 
Entre las funciones de la celulosa están proporcionar rigidez, y debido a que la 
microfibra de la celulosa se fortalece dentro de una matriz de hemicelulosas y 
pectinas, que constituyen un componente de apoyo para la pared celular (Wyman 
et al, 2005). 
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
O
OOH
OH
OH
O
OH
OH OH
O
OH
n
Unidad de Celobiosa
 
Las hemicelulosas son generalmente clasificadas de acuerdo al residuo 
principal de azúcar de la cadena principal, por ejemplo, los xilanos, los mananos, y 
los glucanos. Los xilanos y los polímeros de manosa son los más prevalentes 
(Wyman eta al, 2005). 
9 
 
 
 
Se cree que las hemicelulosas están involucradas en la elongación y 
modificación de la pared celular, a diferencia de la lignina, se piensa que tienen un 
efecto fuerte en la interacción entre las microfibras de celulosa. Su composición 
química y sus características estructurales varían ampliamente según las 
diferentes especies, tejido, y la etapa de desarrollo. La adhesión mutua entre la 
celulosa y la hemicelulosa puede ser provista por puentes de hidrógeno y fuerzas 
de van der Waals (Wyman et al, 2005), además de otros enlaces que pudieran 
exitir, mediados por boro y/o calcio. 
Las hemicelulosas son cadenas de heteropolisacaridos ramificados 
compuestas de hexosas y pentosas. D-xilosa y L-arabinosa son el constituyente 
mayoritario de los pentosanos (xilanos) mientras que D-glucosa, D-galactosa y D-
manosa constituyente las hexosas. 
El principal componente de azúcares monoméricos de estas hemicelulosas 
heteropolisacáridas son: D-xilosa, D-glucosa, D-manosa, D-galactosa, L-
arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido 4-O-metil-D-glucuronico, ácido D-
galactouronico, y en menor medida, L-ramosa, L-fucosa y varios azúcares o-
metilados. Tienen un grado de polimerización de 100 a 200 (Kuhad et al, 1997). 
10 
 
O O
O
OOH
H
H
H
H
OH H
H H
H
H
H
OH
H
H
O
O
O
H
H
H
H
OH
OH
H
H
H
H
H
H
OH
H
H
O
OH
H
H
H
OH
O
H
H
OH
OH
O O
O
OOH
H
H
H
H
OH
O
H
O
H H
H
H
H
OH
H
H
O
OH
H
H
OH
H
H
O
OH
H
O
OH
O
O
O
H
H
H
H
OH
O
H
O
H
H
H
H
H
OH
H
H
O
OH
H
H
H
OH
O
H
O
H
OH
O
H
O
OH
H
H
OH
H
OO
OH
O
OH
O
O
O
H
OH
H
H
OH
H
O O
CH3
CH3 CH3 CH3
OH
CH3
CH3
Hemicelulosa
Xilosa
Xilosa
Xilosa
Xilosa
Xilosa
Xilosa
Xilosa
Xilosa
Xilosa
Xilosa
Arabinosa
Arabinosa
Ácido Ferúlico
Ácido Ferúlico
Ácido metilglucorónico
 
Figura 2. Estructura de la Hemicelulosa. 
La lignina es una molécula polimérica altamente ramificada que consiste en 
unidades de una base monomérica de fenil-propano unidas por diferentes tipos de 
enlaces incluyendo alquilo-arilo, alquilo-alquilo, arilo-arilo. El peso molecular de la 
lignina es posiblemente de 100 kDa o más (Kuhad, 2007). Las fibras de este 
polímero usualmente están ligadas a la celulosa formando un complejo. Estos 
complejos, así como las ligninas solas son importantes ya que le dan a las plantas 
la característica de resistencia a los ataques microbianos y a los agentes químicos 
(Balat y Balat, 2008). 
11 
 
OH
O
O
OH
O
CH2
O
OH
CH3
CH2 OH
OH
CH3
Lignina
 
Figura 3. Estructura de la Lignina. 
La materia lignocelulósica es la biomasa renovable más abundante, tiene 
una producción mundial anual estimada de 1x1010 TM (P. Alvira et al, 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
TECNOLOGIAS DE PRETRATAMIENTO. 
Los biocombustibles producidos a partir de materiales lignocelulósicos, 
como el llamado bioetanol de segunda generación, muestra ventajas económicas, 
energéticas y ambientales en comparación al bioetanol producido a partir de caña 
de azúcar, sin embargo, barreras físicas y químicas causadas por la asociación de 
los componentes principales de la materia lignocelulósica dificultan la hidrólisis de 
la celulosa y la hemicelulosa a azúcares fermentables (P Alvira et al, 2010). 
La producción de bioetanol a partir de materia lignocelulósica comprende 
los siguientes pasos: hidrólisis de la celulosa y la hemicelulosa, fermentación de 
los azúcares, separación de la lignina residual y finalmente recuperación y 
purificación del etanol para tener las especificaciones de combustible. El problema 
de hidrolizar lignocelulosa a monosacáridos fermentables es la digestibilidad de la 
celulosa, ya que se dificulta por factores fisicoquímicos, estructurales y de 
composición. Por estas características estructurales, el pretratamiento es un paso 
esencial para obtener azúcares fermentables en la hidrólisis (P Alvira et al, 2010). 
Debido a que existen diferentes biomasas lignocelulósicas (bagazo de 
agave, bagazo de caña de azúcar, olote de maíz) con distintas características (% 
en el contenido de las fibras vegetales, hemicelulosa, lignina y celulosa), es 
necesario adoptar un pretratamiento adecuado para cada lignocelulosa (P Alvira et 
al, 2010). 
El propósito del pretratamiento es incrementar la reactividad y accesibilidad a 
la celulosa, romper la estructura de la lignina y disminuir la cristalinidad de la 
celulosa, para mejorar el acceso de las enzimas en la hidrólisis. El pretratamiento 
debe: mejorar la producción directa de azúcares o la capacidad de formar 
posteriormente azúcares libres por hidrólisis enzimática, asícomo evitar la 
degradación de los carbohidratos, evitar la formación de productos inhibitorios 
para la hidrólisis enzimática o la fermentación y tener un costo-beneficio efectivo 
(Negro et al, 2003). 
13 
 
 Factores claves para determinar la efectividad del pretratamiento de 
diversas biomasas lignocelulósica. 
Existen ciertas propiedades que deben ser consideradas para elegir un residuo 
lignocelulósico, entre ellas, las más importantes son un bajo costo y la elección de 
un proceso adecuado de pretratamiento (P Alvira et al, 2010), además de 
promover: 
1. Alto rendimiento por hectárea para los cultivos. 
2. Alta digestibilidad del residuo sólido tratado. 
3. Baja degradación de azúcares. 
4. Una cantidad mínima de componentes tóxicos. 
5. No requerir un tamaño en las partículas de biomasa muy reducido. 
6. Tamaño razonable de operación y costo moderado de los reactores. 
7. No producir desechos sólidos. 
8. Bajo contenido de humedad. 
9. Obtener una alta concentración de azúcares reductores. 
10. La distribución de los azúcares recuperados entre el pretratamiento y la 
hidrólisis debe ser compatible con los microorganismos seleccionados para 
la fermentación. 
11. Recuperación de ligninas. 
12. Requerimientos de energía bajos (P. Alvira et al, 2010). 
 
 Factores que limitan la hidrólisis enzimática. 
El pretratamiento es un paso necesario para alterar algunas de las 
características estructurales de la lignocelulosa e incrementa el acceso a los 
carbohidratos glucano y xilano favoreciendo su ataque enzimático (P Alvira et al, 
2010). 
Entre los factores que afectan la hidrólisis se encuentran (P Alvira et al, 2010): 
1. Alto grado de cristalinidad de la celulosa. 
2. Grado de polimerización considerable de la celulosa. 
14 
 
3. Superficie de contacto disponible de los sustratos. 
4. Barrera de lignina (contenido y distribución). 
5. Elevado contenido de hemicelulosa recalcitrante. 
6. Tamaño de partícula de la materia prima lignocelulósica. 
7. Baja porosidad. 
8. Espesor de la pared celular. 
9. Cambio en la accesibilidad con la conversión (P. Alvira et al. 2010). 
 
 Pretratamientos Biológicos 
En los pretratamiento biológicos, microorganismos como hongos cafés, 
blancos y de descomposición, son usados para degradar la lignina y la 
hemicelulosa de los materiales residuales. La degradación de la lignina bajo la 
acción de los hongos blancos es el tratamiento biológico que presenta la mayor 
efectividad, ésta se produce debido a las enzimas que degradan la lignina como 
las peroxidasas (Y. Sun, J. Cheng, 2002). 
Varios hongos blancos como Phanerochaete chrysosporium, Ceriporia 
lacerata, Cyathus stercolerus, Ceriporiopsis subvermispora, Pycnoporus 
cinnarbarinus y Pleurotus ostreaus han sido examinados sobre diferentes 
biomasas lignocelulósicas mostrando una alta delignificación (P. Alvira, et al. 
2010). 
En general, estos procesos ofrecen ventajas como son una baja inversión en la 
adquisición de equipo con características especiales, una baja energía, no 
necesita requerimientos de reactivos químicos y sus condiciones de operación son 
intermedias; la desventaja de este tratamiento es la baja velocidad de la hidrólisis 
que se obtiene comparada con los pretratamientos tradicionales (P. Alvira, et al. 
2010). 
 
 
15 
 
 Pretratamientos Físicos 
 
Maceración Mecánica. 
 El objetivo de los pretratamientos físicos es reducir el tamaño de las 
partículas y el grado de cristalinidad de la lignocelulosa, para incrementar el área 
específica y reducir el grado de polimerización. Tomando en cuenta que los 
requerimientos de energía son muy elevados para moler las partículas y los 
incrementos continuos en los precios de la energía, hacen de este proceso poco 
viable económicamente (P. Alvira, et al. 2010). 
Extrusión 
 El proceso de extrusión es un novedoso y prometedor método de 
pretratamiento físico para la conversión de biomasa a etanol. En la extrusión, el 
material es sujeto a calentamiento, mezcla y esfuerzo de corte, y produce una 
modificación física y química durante su paso a través del extrusor. La velocidad 
del tornillo y la temperatura se cree que destruyen la estructura de la lignocelulosa 
causando desfibrilación, y la reducción de las fibras, que, al final incrementa la 
accesibilidad de las enzimas a los carbohidratos (P. Alvira, et al. 2010). 
 Pretratamiento químicos. 
 
Pretratamiento alcalino. 
 El efecto que algunas bases tienen sobre la biomasa lignocelulósica es 
la justificación de este pretratamiento. Su efectividad depende del contenido de 
lignina en la biomasa. Este pretratamiento disminuye el grado de cristalinidad de la 
celulosa y favorece la solubilización de la hemicelulosa y la lignina (P. Alvira, et al. 
2010). 
 El pretratamiento alcalino se puede realizar en un espacio a 
temperatura ambiente y con un tiempo que va de segundos a días. Los hidróxidos 
de sodio, potasio, calcio y amonio son adecuados para el pretratamiento alcalino. 
16 
 
El NaOH acuoso provoca el hinchamiento de la matriz lignocelulósica, 
incrementado el área interna de la celulosa y disminuyendo el grado de 
polimerización y de cristalinidad, lo que provoca que la estructura de la lignina se 
destruya. El Ca(OH)2 remueve las sustancias amorfas como la lignina. La 
eliminación de la lignina incrementa la efectividad de las enzimas sobre los 
carbohidratos, reduciendo los sitios de adsorción no productivos sobre la lignina 
(P. Alvira, et al. 2010). 
Hidrólisis ácida. 
 Ácidos concentrados como el H2SO4 y HCl también se utilizan para 
pretratar la materia lignocelulósica. Los ácidos son poderosos agentes para la 
hidrólisis de la celulosa, los ácidos concentrados son corrosivos, tóxicos y 
peligrosos y requieren que los reactores sean resistentes a la corrosión. 
Adicionalmente, el ácido concentrado debe ser recuperado después de la hidrólisis 
para hacer al proceso más accesible económicamente (Y. Sun, J. Cheng 2002). 
La utilización de ácidos concentrados es menos favorable para la producción de 
etanol debido a la formación de compuestos inhibidores (P. Alvira, et al. 2010). 
 El objetivo de este pretratamiento es solubilizar la fracción de 
hemicelulosas y hacer más accesible la celulosa. Este tipo de tratamiento se 
puede realizar con ácido concentrado o diluido. El ácido diluido es más favorable 
para aplicaciones industriales. Diferentes tipos de reactores pueden ser utilizados 
para este tratamiento como: tubular o intermitente, entre otros. Se puede realizar a 
altas temperaturas con tiempos de residencia cortos (180°C), o a bajas 
temperaturas y tiempos de residencia largos (120°C). Presenta la ventaja de que 
para la fracción de hemicelulosa, se solubiliza principalmente el carbohidrato 
xilano, pero también se convierte en azúcares fermentables. La utilización de 
ácidos diluidos presentan una menor degradación de los productos finales, a 
diferencia de aquellos donde se utilizan ácidos concentrados (P. Alvira et al, 
2010). 
 
17 
 
Ozonólisis. 
 El ozono es un poderoso oxidante que muestra una alta eficiencia en la 
delignificación. Esta eliminación de la lignina incrementa el rendimiento de la 
hidrólisis enzimática (P. Alvira et al, 2010). 
 El pretratamiento de ozonólisis tienes las siguientes ventajas: (1) 
remueve la lignina preferentemente, (2) no produce residuos tóxicos para la 
corriente del proceso, (3) la reacción se puede llevar a cabo a temperatura 
ambiente. Sin embargo, la gran cantidad de ozono que se requiere para el 
proceso, lo hacen muy costoso (Y. Sun, J. Cheng, 2002). 
Proceso Organosolvente. 
 En este proceso, la mezcla de un disolvente orgánico y un ácido 
inorgánico catalítico (HCl o H2SO4), son utilizados para romper la lignina y los 
enlaces de ésta con la hemicelulosa. Los disolventes principales son el metanol, 
etanol acetona, etilenglicol para solubilizar la lignina y proveer celulosa tratadaadecuada para la hidrólisis enzimática. Una de las ventajas que tiene este proceso 
es que se puede recuperar lignina relativamente pura como subproducto (P. Alvira 
et al, 2010). 
 Para reducir el costo, los disolventes utilizados deben ser recuperados 
del proceso por evaporación, condensación y reciclándolos (Y. Sun, J. Cheng, 
2002). El alto precio comercial de los disolventes es un factor importante a 
considerar. Por razones económicas es conveniente usar disolventes con bajos 
pesos moleculares y bajos puntos de ebullición como el etanol y metanol (P. Alvira 
et al. 2010). 
Tratamiento con Líquidos Iónicos (LIs). 
 El uso de líquidos iónicos como disolventes (LIs) para el pretratamiento 
de la biomasa ha recibido mucha atención recientemente. Los LIs son sales, 
típicamente compuestas por una larga cantidad de cationes orgánicos y una 
pequeña cantidad de aniones inorgánicos y existen como líquidos a temperaturas 
18 
 
relativamente bajas. Sus propiedades como disolventes pueden variar ajustando el 
anión o el constituyente alquilo del catión. Entre sus propiedades se incluyen 
estabilidad química y térmica, inflamabilidad y presión de vapor bajas, y la 
tendencia a permanecer siendo líquidos en un amplio intervalo de temperaturas 
(Hayes, 2009). No son tóxicos y tampoco forman gases explosivos, son llamados 
disolventes verdes. Los carbohidratos y la lignina pueden ser solubilizados 
simultáneamente en los LIs con actividad aniónica porque los LIs forman puentes 
de hidrógeno entre los iones no hidratados de cloruro de los LIs y la carga positiva 
parcial generada en los hidroxilos de los azúcares en proporción estequiométrica 
1:1. Como resultado de esta interacción, la red intrínseca de interacciones no 
covalentes entre los polímeros de celulosa, hemicelulosa y lignina de la biomasa 
se debilitan, disminuyendo la degradación de los productos (P. Alvira et al. 2010). 
 Se requiere de investigaciones futuras para mejorar los aspectos 
económicos de la utilización de líquidos iónicos antes de que el pretratamiento se 
aplique a una escala industrial. La tecnología continúa siendo cara y no se han 
desarrollado completamente técnicas de recuperación de los LIs (P. Alvira et al. 
2010). 
 Pretratamiento Fisicoquímicos 
 
Amonia fiber explosion (AFEX). 
 AFEX es un tipo de pretratamiento fisicoquímico donde la materia 
lignocelulósica es expuesta a amoniaco líquido a alta temperatura y presión por un 
periodo de tiempo y, posteriormente, la presión es reducida repentinamente. Las 
condiciones típicas de este tratamiento es la cantidad de amoniaco líquido usado, 
en el intervalo de 1-2 kg de amoniaco/kg de de biomasa seca, a una temperatura 
de 90°C y un tiempo de residencia de 30 minutos (Y. Sun, J. Cheng, 2002). 
 Se ha reportado que el pretratamiento AFEX disminuye el grado de 
cristalinidad de la celulosa y se rompen los enlaces lignina-carbohidratos. Durante 
el pretratamiento, sólo una pequeña cantidad de la materia sólida es solubilizada, 
19 
 
pocas cantidades de hemicelulosa y lignina son removidas. Para reducir el costo y 
proteger el medio ambiente, el amoniaco se debe reciclar (P. Alvira et al, 2010). 
“Steam Explosion” (autohidrólisis). 
 “Steam Explosion” es el método de pretratamiento más usado para 
pretratar la materia lignocelulósica. En este método fibras pequeñas de la materia 
son contactadas con vapor saturado a alta presión y, posteriormente, la presión es 
reducida rápidamente, provocando que la materia se someta a una descompresión 
explosiva. El “Steam Explosion” se promueve a temperaturas de 160-260 °C 
(correspondiente a una presión 0.69-4.83 MPa), durante un periodo de tiempo que 
abarca desde segundos (260°C) hasta minutos (160°C), poco antes que se libere 
la presión repentinamente, y la materia explotada este expuesta a una presión 
atomosférica. El pretratamiento causa la transformación y degradación de la 
lignina debido a la alta temperatura, esto incrementa el potencial de la hidrólisis de 
la celulosa (Y. Sun, J. Cheng, 2001). 
 Este pretratamiento combina la fuerza mecánica y los efectos químicos 
debido a la hidrólisis (autohidrólisis) de los grupos acetilo presentes en la 
hemicelulosa. La autohidrólisis se lleva a cabo debido a que las temperaturas 
elevadas promueven la formación de ácido acético proveniente de los grupos 
acetilo: además, el agua puede actuar como un ácido diluido a altas temperaturas. 
El efecto mecánico es causado debido a que la presión es reducida 
repentinamente al final del proceso y las microfibras se separan por la 
descompresión explosiva. En combinación con la hidrólisis parcial de la 
hemicelulosa y su solubilización, la lignina es redistribuida y en cierto punto 
eliminada de la materia. La solubilización de la hemicelulosa expone la superficie 
de la celulosa e incrementa el acceso de las enzimas a las microfibras de celulosa 
(P. Alvira et al, 2010). 
 La fracción de hemicelulosa que se solubiliza en este tratamiento 
depende del tipo de biomasa y está asociada con la estructura y la composición 
química (Negro et al, 2003). 
20 
 
 Los factores que afectan el pretratamiento “Steam Explosion” son el 
tiempo de residencia, la temperatura, el tamaño de las partículas y el contenido de 
humedad. La solubilización óptima de las hemicelulosas se puede lograr a altas 
temperaturas y tiempos de residencia cortos (270°C, 1 min) o a bajas 
temperaturas y tiempos de residencia largos (190°C, 10 min) (Y. Shun, J. Cheng, 
2001). Altas temperaturas tienen como resultado un incremento en la eliminación 
de la hemicelulosa proveniente de la fracción sólida y mejora la digestibilidad de la 
celulosa, pero también promueve una alta degradación de azúcares. Se pueden 
utilizar tamaños de biomasa grandes (P. Alvira et al, 2010). 
 La adición de H2SO4 (o SO2) o CO2 en el “Steam Explosion” puede 
mejorar la hidrólisis enzimática, disminuir la producción de compuestos inhibidores 
y conduce a una solubilización más completa de la hemicelulosa. (Y. Shun y J. 
Cheng, 2002). La desventaja que se tiene al utilizar ácidos en el proceso “Steam 
Explosion” se refiere a los requerimientos de materiales de construcción de los 
equipos y a la degradación elevada de los productos (P. Alvira et al, 2010). 
 Este proceso es efectivo para maderas duras, residuos agrícolas y 
biomasa herbácea, pero es poco efectiva para las maderas blandas, debido a la 
baja concentración de grupos acetilo en la porción de la hemicelulosa (P. Alvira et 
al, 2010). 
 La mayor desventaja en el pretratamiento “Steam Explosion” es la 
degradación parcial de la hemicelulosa y la generación de algunos compuestos 
que pueden afectar los pasos de la hidrólisis y la fermentación para la producción 
de etanol. La mayoría de los inhibidores son derivados de furano, ácidos débiles y 
componentes fenólicos. Los principales derivados del furano son el furfural y el 5-
hidroximetilfurfural a partir de la degradación de las pentosas y hexosas 
respectivamente. (P. Alvira et al, 2010). 
 Los ácidos débiles generados durante el proceso “Steam Explosion” 
son en su mayoría ácido acético proveniente de los grupos acetilo presentes en la 
21 
 
porción de hemicelulosa, ácido fórmico y levulínico derivados por la degradación 
del furfural (P. Alvira et al, 2010). 
 Las condiciones típicas utilizadas para el pretratamiento “Steam 
Explosion” permiten una degradación parcial de los azúcares derivados de la 
hemicelulosa y solubilizan y transforman la lignina en compuestos químicos que 
pueden inhibir los procesos posteriores. Estos inhibidores se pueden clasificar de 
acuerdo a su estructura química en ácidos orgánicos, furfurílicos y componentes 
fenolíticos. Los inhibidores de la fermentación incluyen a los derivados furfurílicos 
como el furfural y el 5-hidroximetilfurfural (5-HMF), ácidos alifáticos como el 
acético, fórmico y levulínico, y compuestos fenólicos. El furfuraly el 5-HMF son 
productos de la degradación de las pentosas y hexosas. Algunos componentes se 
forman durante la solubilización de la hemicelulosa y la lignina, contaminando la 
fase líquida producto del proceso “Steam Explosion” y otros se integran en la 
biomasa y se liberan durante la bioconversion sucesiva. Estos inhibidores pueden 
afectar a las enzimas en la hidrólisis, reducen la conversión de la glucosa durante 
la fermentación, y reducen la velocidad de producción de etanol (Cantarella, 
2004). 
 La eficiente bioconversión de la biomasa lignocelulósica a etanol 
requiere de algún tipo de pretratamiento, sin embargo, “Steam Explosion” se 
pueden presentar dos problemas: el primero relacionado con la calidad de los 
hidrolizados, que contienen azúcares fermentables y una amplia gama de 
compuestos inhibitorios para los microorganismos usados para la fermentación. La 
composición de estos compuestos depende del tipo de materia lignocelulósica 
utilizada, así como de la química y naturaleza del proceso de pretratamiento. El 
segundo problema concierne a que la hidrólisis de la hemicelulosa contiene 
azúcares de hexosas y también de pentosas. Los azúcares de pentosas son más 
difíciles de fermentar y la economía del proceso depende de esta conversión 
(Cantarella, 2004). 
 
22 
 
Carbon Dioxide Explosion (“SC-CO2 Explosion”) 
 En el intento por desarrollar técnicas de pretratamiento de celulosa 
mejores, la idea de utilizar dióxido de carbono en estado supercrítico a una 
temperatura menor comparada con la requerida para llevar a cabo “Steam 
Explosion” y posiblemente a menor costo que el amonia explosion es un método 
alternativo eventualmente sugerido y que se está desarrollando (Zheng et al, 
1998). 
 Este método está basado en la utilización de CO2 como fluido 
supercrítico, que se refiere a un fluido que está en fase gaseosa pero que es 
compresible a la temperatura por arriba de su punto crítico, presentando una 
densidad equivalente a la de un líquido. Las condiciones del pretratamiento con 
CO2 supercrítico pueden remover efectivamente la lignina e incrementar la 
digestividad del sustrato (P. Alvira et al, 2010). 
 Particularmente, el dióxido de carbono empleado como fluido 
supercrítico tiene muchas ventajas sobre muchos fluidos. El dióxido de carbono 
(temperatura crítica 31.1 °C y presión crítica, 71 atm) no es tóxico, 
fisiológicamente seguro y no es costoso (Zheng et al, 1998). La baja tensión 
superficial de los fluidos supercríticos permite la fácil penetración entre los 
microporos de los materiales (Roozbeh et al, 2010). 
 El CO2 es el componente de lo que se denomina un proceso verde. 
Puede ser removido fácilmente por despresurización y no genera productos de 
desecho. Si el pretratamiento de la lignocelulosa con CO2 se puede aplicar a 
menores temperaturas que procesos similares sin adición de CO2, la degradación 
de la xilosa puede eliminarse y mejorar el rendimiento. Por otro lado, el CO2 
supercrítico puro no mejora el rendimiento en condiciones de 214- 275 bar (211-
271 atm), 112-165°C y tiempos de reacción de 10-60 min. Con la adición de agua, 
alrededor del 70% de saturación, se puede presentar un incremento sustancial en 
el rendimiento de monosacáridos liberados. La aplicación eficiente de agua y 
dióxido de carbono a altas temperaturas y presión es muy prometedora. Se 
23 
 
vislumbran mejoras sustanciales para un proceso de bajo costo (C. Schacht et al, 
2008). 
 Las moléculas de dióxido de carbono son comparables en tamaño con 
las de agua y de amoniaco y deben penetrar en los pequeños poros accesibles 
para las moléculas de agua y amoniaco (Zheng et al, 1998). Este mecanismo es 
facilitado por la alta presión. En solución acuosa el CO2 forma ácido carbónico, 
que favorece la hidrólisis polimérica (P. Alvira et al, 2010). 
 Al igual que en los pretratamientos “Steam Explosion” y el AFEX, la 
presión es liberada repentinamente. Después de la liberación explosiva del CO2 a 
presión, se observa una destrucción en la estructura de la celulosa y la 
hemicelulosa y como consecuencia incrementa el acceso debido a un aumento del 
área superficial del sustrato para mejorar el ataque enzimático (P. Alvira et al, 
2010). 
 Se ha encontrado que el proceso ““SC-CO2 Explosion”” sobre celulosa 
pura o sobre un material lignocelulósico pretratado con la respectiva adicción de 
una disolución acuosa de buffer, se mejora el rendimiento de glucosa proveniente 
de la posterior hidrólisis enzimática del material (K. H. Kim y J. Hong, 2001). 
 Por otro lado, Shun, Y y Cheng, J., (2002), reportaron que el 
rendimiento de azúcares es relativamente bajo comparado con el del 
pretratamiento “Steam Explosion” y del AFEX, pero alto comparado con la 
hidrólisis enzimática de la muestra no tratada. El pretratamiento “SC-CO2 
Explosion” es más económico que el amonia explosion y no causa la formación de 
compuestos inhibitorios como ocurre con el “Steam Explosion”. 
 Los esfuerzos actuales por desarrollar este método aún no garantizan 
viabilidad económica. Los requerimientos de alta presión conciernen a este 
asunto. Por otro lado, la utilización de dióxido de carbono es una alternativa 
atractiva para reducir los costos debido a que éste se produce durante la 
fermentación etanólica. Otra ventaja es que no es significativamente tóxico, no es 
inflamable y es fácil de recuperar después de la extracción (P. Alvira et al, 2010). 
24 
 
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA 
 Cuando el pretratamiento se finaliza, la celulosa se prepara para su 
hidrólisis, es decir, partiendo la molécula por la adicción de moléculas de agua (M. 
Balat et al, 2008): 
 
 Esta reacción es catalizada por un ácido diluido o concentrado, o bien 
por enzimas (celulasas). La utilización de enzimas tiene muchas ventajas como 
son condiciones moderadas (pH= 4.8 y temperaturas de 318-323 K) 
proporcionando altos rendimientos y los costos de mantenimiento son bajos 
comparados con la hidrólisis alcalina y ácida y no tienen problemas de corrosión 
(M. Balat et al, 2008). Los productos de la hidrólisis son usualmente azúcares 
reductores incluyendo la glucosa (Y. Shun y J. Cheng, 2002). 
 La hemicelulosa también puede ser hidrolizada con la adición de agua 
para liberar cadenas de azúcares individuales contenida en la larga molécula de 
hemicelulosa. La estequiometría de la reacción de azúcares de hexosa, galactosa, 
glucosa y manosa que hay en la hemicelulosa es la misma que se muestra en la 
ecuación 1 (Eq. 1). Por otro lado, la adición de agua en carbohidratos conteniendo 
azúcares de cinco carbonos como el arabinano y el xilano en la hemicelulosa, 
procede de acuerdo con la siguiente reacción estequiométrica (Wyman et al, 
2005): 
 
 Donde (C5H8O4)n es una cadena de n móleculas de arabinosa o xilosa, 
que pueden ser llamados como arabina o xilano respectivamente y C5H10O5 es la 
fórmula de uno de los correspondientes azúcares de pentosa formada por la 
whidrólisis de la hemicelulosa (Wyman, et al, 2005). 
 La hidrólisis de la biomasa lignocelulósica es más complicada que la 
hidrólisis de la celulosa pura debido a la presencia de componentes no-glucanos 
como la lignina y la hemicelulosa (M. Balat et al, 2008). 
25 
 
 Tanto hongos como bacterias pueden producir celulasas para la 
hidrólisis de la materia lignocelulósica. Estos microorganismos pueden ser 
aerobios o anaerobios, mesófilos o termófilos. Entre las bacterias se encuentran 
Clostridium, Cellulomonas, Bacillus, Thermosmonospora, Ruminococcus, 
Bacteroides, Erwinia, Acetovibrio, Microbiospora y Streptomyces. Los hongos que 
han sido reportados que produces celulasas incluyen Sclerotium rodfsii, P. 
chrysosporium y especies como Trichoderma, Aspergillus, Schizophylum, y 
Penicillum (Y. Shun y J. Cheng, 2002). 
 La degradación enzimática de la celulosa es un proceso complicado 
que toma lugar en la fase sólido-líquido, donde las enzimas son los componentesmóviles. Cuando el sistema de enzimas celulasas actúa in vitro sobre el sustrato 
celulósico insoluble, ocurren tres procesos simultáneamente: (i) cambios físicos y 
químicos en la (aún no solubilizada) fase sólida residual de la celulosa, (ii) 
hidrólisis primaria, que involucra la liberación de intermediarios solubles a partir de 
la superficie de las moléculas de celulosa reaccionantes y (iii) hidrólisis 
secundaria, que involucra la hidrólisis de intermediarios insolubles a intermediarios 
solubles de bajo peso molecular como la celobiosa y, finalmente, en glucosa (M. 
Balat et al, 2008). 
 La velocidad de la hidrólisis enzimática de la materia celulósica siempre 
disminuye rápidamente. Generalmente, la degradación enzimática de la celulosa 
es caracterizada por una fase inicial rápida, seguida de una fase secundaria lenta 
que puede ser hasta que todo el sustrato se consuma. Esto se puede explicar 
comúnmente por la rápida hidrólisis de la fracción fácilmente accesible de la 
celulosa, la fuerte acumulación de inhibidores y la lenta inactivación de las 
enzimas absorbidas (M. Balat et al, 2008). 
 La cantidad de lignina presente en la matriz de lignocelulosa es un 
punto importante a considerar en la planeación de su hidrólisis enzimática. Según 
el mecanismo de ataque de las enzimas, éstas se unen al sustrato por adsorción, 
formando un complejo enzima-sustrato. Se ha demostrado que las enzimas 
celulasas también se unen permanentemente a la lignina, formando complejos 
26 
 
enzima-lignina, lo cual reduce la cantidad de enzima disponible para actuar sobre 
la holocelulosa (Wyman et al, 2005). 
 Las celulasas son usualmente mezclas de enzimas. Por lo menos tres 
grandes grupos de celulasas están involucradas en el proceso de hidrólisis: (1) 
endoglucanasas (EG, endo 1,4-D-glucohidrolasa, o EC 3.2.1.4.) que atacan 
regiones de baja cristalinidad de la celulosa, creando cadenas terminales libres; 
(2) exoglucanasas o celobiohidrolasas (CBH, celobiohidrolasa 1,4-β-D-glucano, o 
EC 3.2.1.9.1) que degrada la molécula por la eliminación de las unidades de 
celobiosa provenientes de las cadenas terminales libres; (3) β-glucosidasas (EC 
3.2.1.21) que hidroliza la celobiosa para producir glucosa. Además de los tres 
grandes grupos de celulasas, existen también un número de enzimas auxiliares 
que atacan la fracción de hemicelulosa, como son glucuronidasa, acetilesterasa, 
xilanasa, β-xilosidasa, galactomanasa y glucomanasa. Durante la hidrólisis 
enzimática, la celulosa es degrada por celulasas a azúcares reductores que 
pueden ser fermentados por levaduras o bacterias a etanol (Y. Shun y J. Cheng, 
2002). 
 De acuerdo con la visión ampliamente aceptada, las celobiohidrolasas 
actúan como exoglucanasas, liberando celobiosa como producto principal, y las 
endoglucanasas actúan aleatoriamente a lo largo de la cadena de celulosa, con 
esto se producen nuevos sitios para las celobiohidrolasas (este mecanismo se 
conoce como endo-exo sinergismo); la β-glucanasa hidroliza celobiosa, por la 
tanto, elimina un potente inhibidor de las celobiohidrolasas de la mezcla de 
reacción (Medve, 1998). 
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
O
OOH
OH
OH
O
OH
OH OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
OH
Celobiohidrolasas Endo- glucanasas
glucosidasas
 
Figura 4. Hidrólisis enzimática de la celulosa (modificado de Wyman et al, 2005). 
27 
 
 
 
 La estructura de la hemicelulosa hace su hidrólisis enzimática un 
proceso de mayor complejidad comparado con el de la celulosa, requiriendo un 
mayor grado de coordinación entre las enzimas involucradas. Una gran mayoría 
de los trabajos de investigación sobre hemicelulasas se enfocan en la acción de 
enzimas xilanasas, ya que el xilano por su complejidad estructural, es más 
complicado estructuralmente que otros polisacáridos de las plantas (Wyman et al, 
2005). 
 
 Las principales enzimas que participan en la degradación del xilano son 
endo-1,4-β-xilanasa, β-xilosidasa, α-glucoronidasa, α-L-arabinofuranosidasa y 
acetil-xilano esterasa. Los principales productos obtenidos por la acción de estas 
enzimas son xilobiosa, xilotriosa y residuos de 2-4 xilosilo sustituidos (Wyman et 
al. 2005). 
 
 En la degradación de glucomananos y galactomananos están 
involucradas las enzimas β-manasa y β-manosidasa, y los productos principales 
de su acción son la manobiosa, la manotriosa y varios oligosacáridos (Wyman et 
al, 2005). 
 
 
 
 
 
28 
 
O O
O
OOH
H
H
H
H
OH H
H H
H
H
H
OH
H
H
O
O
O
H
H
H
H
OH
OH
H
H
H
H
H
H
OH
H
H
O
OH
H
H
H
OH
O
H
H
OH
OH
O O
O
OOH
H
H
H
H
OH
O
H
O
H H
H
H
H
OH
H
H
O
OH
H
H
OH
H
H
O
OH
H
O
OH
O
O
O
H
H
H
H
OH
O
H
O
H
H
H
H
H
OH
H
H
O
OH
H
H
H
OH
O
H
O
H
OH
O
H
O
OH
H
H
OH
H
OO
OH
O
OH
O
O
O
H
OH
H
H
OH
H
O O
CH3
CH3 CH3 CH3
OH
CH3
CH3
Endoxylanasa
-L-arabinofuranosidasa
D-glucuronidasa
Esterasa de acido ferúlico
Esterasa de acido ferúlico
-L-arabinofuranosidasa
Endoxylanasa
Acetyl xilan esterasa
O O
O
OHOH
H
H
H
H
OH H
H H
H
H
H
OH
H
H
O O
CH3
OH
Acetil esterasa
xylosidasa
 
 
Figura 5. Enlaces susceptibles de hidrólisis enzimática de la hemicelulosa (Wyman et al, 2005) 
 
 
29 
 
 
OBJETIVOS 
Objetivo General 
 Evaluar la cantidad de azúcares reductores producidos por la aplicación 
de diferentes pretratamientos a residuos lignocelulósicos, específicamente del 
bagazo de agave, que puedan ser utilizados en el Proyecto BABETHANOL en 
procesos de fermentación para la producción de bioetanol. 
Objetivos Particulares 
 Caracterización de tres diferentes sustratos de bagazo (Tequila Patrón, 
Tequila Sauza y Tequila Herradura), a partir del método de Van Soest y Wine 
(ADF-NDF) para cuantificar los diferentes constituyentes de las fibras vegetales. 
 Extracción y precipitación de las hemicelulosas extraídas a la fase 
líquida desde bagazo hidrolizado. 
 Enriquecimiento en celulosa de los sustratos (bagazo de Tequila 
Patrón) mediante su reacción/extracción en fase sólida (hidrólisis alcalina e 
hidrólisis acuosa) utilizando diferentes temperaturas. 
 Encontrar las mejores condiciones para el pretratamiento “Steam 
Explosion” para el sustrato de bagazo de agave Patrón. 
 Encontrar las mejores condiciones para el pretratamiento “SC-CO2 
Explosion” para el sustrato de bagazo de agave Patrón. 
 Delignificar de un sustrato previamente tratado. 
 Valoración de la cantidad de azúcares reductores que se obtienen 
después de la aplicación de los pretratamientos establecidos por el método de 
DNS y por HPLC. 
 Determinación de la actividad enzimática de las enzimas utilizadas para 
la hidrólisis enzimática de los residuos lignocelulósicos pretratados. 
30 
 
 
HIPOTESIS 
 
 El pretratamiento “Steam Explosion” en relación a los pretratamientos 
de hidrólisis alcalina y “SC-CO2 Explosion” romperá, con mayor eficiencia, parte de 
la estructura lignocelulósica de la fibra vegetal permitiendo la liberación de una 
mayor cantidad de azúcares reductores. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
 
METODOLOGÍA 
Determinación de los componentes de la fibra del bagazo de Agave 
 
 
 
 
 
Figura 6. Determinación de % de HcHemicelulosa, % de L Lignina, % de C Celulosa, % de 
Minminerales presentes en la fibra de bagazo de agave. Res material resultante después de 
cada tratamiento. 
 Para la caracterización se utilizaron tres bagazos de agave diferentes, 
uno proveniente de Tequila Patrón, y dos más provenientes de las industrias 
tequileras, Tequila Sauza y Tequila Herradura. Este se cortó y tamizó con una 
malla de 40 mesh. Se toma como base aproximadamente un gramo de bagazo su 
caracterización completa. Se puede utilizar un sistema clásico de reflujo con un 
matraz de bola y un refrigerante. 
 Se utilizó la técnica de Van Soest y Wine, que permite obtenerun 
estimado de la proporción principal de cada componente de la fibra vegetal 
(Lignina, Hemicelulosa y Celulosa). Este método consistió en aplicar a la fibra 
vegetal un detergente neutro (NDF) primeramente, seguido de un detergente ácido 
(ADF), ambos a una temperatura de 100°C. Finalmente, la fibra vegetal se trató 
con permanganato de potasio saturado (KMnO4) para eliminar la lignina. 
 Después de cada tratamiento, la fibra se secó completamente a 105°C. 
Este residuo se calcinó para determinar el contenido de minerales presente. 
Res: Min 
Tratamiento 
Con KMnO4 
 
Res: C +min 
Res: L +C + 
min 
Res: Hc + L + C + 
min Tratamiento 
NDF (Detergente 
Neutro) 
 
Materia vegetal= Hc + 
L+ C + min+ otros 
 
Tratamiento 
ADF (Detergente 
ácido) 
 
32 
 
 La estimación de la proporción de los distintos componentes del residuo 
lignocelulósico se determinó gravimétricamente considerando la pérdida en peso 
que la materia presenta después de cada tratamiento. 
Pretratamiento Físico, Enriquecimiento de la Celulosa (Maceración con 
Mortero). 
 En un mortero colocado en una mantilla de calentamiento, se maceró 
durante 1 h el Bagazo Patrón, en presencia de 15 ml solución de NaOH, (J. T. 
Baker grado reactivo analítico) al 11% (w/w) en H2O desionizada. Se utilizaron las 
temperaturas: ambiente, 30°, 40° y 50°C. 
 También, se maceró bagazo en presencia de agua a temperatura 
ambiente, así como a temperaturas de 60°C, 70°C y ebullición (92°C). 
 Posteriormente, el residuo de bagazo pretratado se caracterizó para 
determinar el contenido de celulosa obtenido. 
Extracción de hemicelulosas del Bagazo de Agave. 
 La extracción de las hemicelulosas se llevó a cabo en dos etapas. La 
primera etapa consistió en colocar Bagazo Patrón en solución de NaOH al 5% 
(w/w) en un matraz de bola (o reactor) provisto de un refrigerante y agitación 
magnética. Se dejó reaccionar durante 2 h a 80°C. Al final el residuo 
lignocelulósico fue filtrado y lavado con agua destilada caliente y secado en la 
estufa. 
 La segunda etapa consistió en tratar el filtrado recuperado: este licor se 
llevó a un pH de 7 al añadir Ácido Acético Glacial concentrado (J. T. Baker, con un 
grado de pureza de 99.98%). Se redujo el volumen del licor un 40 o 50% mediante 
evaporación al vacío. Después de concentrar el licor, se llevó a un pH de 4.5 o 5 
agregando nuevamente ácido acético. Finalmente, se adicionaron dos volúmenes 
de etanol (J. T. Baker, al 98%) frío. Las hemicelulosas precipitaron 
espontáneamente al colocar el recipiente en el refrigerador (aproximadamente 
6°C) durante 18 horas, el recipiente se tapó para evitar evaporación del etanol. 
33 
 
 Las hemicelulosas precipitadas se filtraron a vacío con papel filtro, se 
lavaron con etanol durante 30 minutos y fueron nuevamente filtradas. Las 
hemicelulosas sólidas se colocaron en un recipiente y se dejaron secar a 
temperatura ambiente. 
Deslignificación del Residuo Lignocelulósico. 
 Por disponibilidad en el laboratorio, el Bagazo Patrón fue la fuente 
lignocelulósica a deslignificar, para ello, se requiere de una disolución de 
hipoclorito de Sodio (NaClO) (13% w/w en agua, Farmacia Paris), ácido acético 
glacial y un matraz equipado con un refrigerante y con agitación magnética. 
 El residuo lignocelulósico de bagazo Patrón se colocó en el matraz 
junto con una disolución de NaClO (48 mL) (la cual se prepara colocando 7.4 mL 
de NaClO al 13% w/w y se agrega agua destilada hasta completar un volumen de 
48 mL), se colocó el refrigerante, el agitador magnético y se agregó 0.08 mL de 
ácido acético glacial. La mezcla se calienta a 75ºC durante una hora. Transcurrida 
la hora, se agregaron nuevamente disolución de NaClO (0.32 mL de NaClO al 
13% w/w y agua destilada hasta completar un volumen de 4 mL de disolución) y 
0.08 mL de ácido acético. Este procedimiento se repite durante tres horas 
consecutivas. Al transcurrir 5 h se detuvo la reacción. Se dejó enfriar el residuo y 
se separó por filtración al vacío en papel filtro. Posteriormente el residuo se lavó 
con agua y acetona. 
“Steam Explosion”. 
 El Pretratamiento “Steam Explosion” se presentó como una aplicación 
del proceso de Masonite, que consistió en aplicar vapor a alta presión por unos 
minutos a la materia lignocelulósica, sin ningún otro compuesto químico que 
promoviera su hidrólisis. Para lograr lo anterior se empleó un reactor de acero de 
100 mL de capacidad disponible en el laboratorio, cuya presión máxima de 
operación fue de 140 kg/cm2, se agregó agua desionizada y se calentó, 
permitiendo el equilibrio líquido-vapor dentro de éste. El reactor se alimentó con 
Bagazo Patrón tamizado seco con un tamaño de partícula de 40 mesh, el cual se 
34 
 
sostuvo por medio de una canastilla de metal y se le agregó la cantidad de agua 
deseada (operación batch). Se elevó la temperatura del reactor mediante una 
camisa de calentamiento, la cual fue controlada por medio de un sistema 
electrónico con ajuste de temperatura. Para conocer el valor de la temperatura 
interna del reactor se utilizó un termopar conectado a una pantalla, la cual permite 
su registro en línea. Al llegar a la temperatura deseada, se inició el conteo del 
tiempo de residencia establecido. 
 Una vez concluido el tiempo seleccionado, el reactor se despresuriza 
violentamente mediante la válvula de salida, recolectando el licor expulsado en un 
recipiente de metal previamente colocado en un baño de hielo, lo cual permitió que 
el líquido se pudiera condensar. Dicho licor se congeló para su análisis posterior. 
 Al enfriarse el reactor, éste se abrió y se filtró la mezcla resultante al 
vacío, donde el residuo sólido fue lavado con agua destilada y fue secado en la 
estufa a 105°C. 
 Se estudiaron los siguientes parámetros con base en 1 gramo de 
bagazo Patrón: 
Tabla 1. Matriz de experimentos 
Nombre Tiempo (min) Temperatura (°C) Relación 
Líquido/Sólido 
SE1 10 180 30 
SE2 10 190 30 
SE3 10 200 30 
SE4 10 180 20 
SE5 10 190 20 
SE6 10 200 20 
SE7 10 180 10 
SE8 10 190 10 
SE9 10 200 10 
 Al determinar las mejores condiciones de temperatura y relación 
líquido/sólido definidas en la tabla anterior, se realizó la cinética conformada por 
las condiciones: 
 
 
35 
 
 Tabla 2.Cinética del Steam Explosión 
Tiempo (min) Temperatura Relación líquido/sólido 
5 Óptima Óptima 
10 Óptima Óptima 
15 Óptima Óptima 
20 Óptima Óptima 
 
“SC-CO2 Explosion” 
 Se estudió el pretratamiento del bagazo de agave por el método de 
dióxido de carbono en estado supercrítico (SC-CO2). 
 Se colocó 1 g de bagazo Patrón en su canastilla al interior del reactor 
de acero y se introdujo CO2 desde un cilindro (Praxair, grado alimenticio) al reactor 
mediante una bomba, la cual permitió ingresar CO2 con una presión 60 kg/cm
2 y 
mediante su calentamiento se logró presurizar el sistema hasta alcanzar una 
presión 120 kg/cm2, condición necesaria para mantener el fluido en estado 
supercrítico. Con el mismo sistema de control de temperatura descrito en la 
sección anterior, se elevó la temperatura del reactor con todo cuidado y para evitar 
el exceso de presión generada en algunos casos, se eliminó lentamente parte del 
CO2 excedente a este valor de presión mediante la válvula de salida. Al llegar a la 
temperatura deseada comienza a tomarse el tiempo de residencia y de ser 
necesario se introduce nuevamente CO2 para alcanzar la presión de 120 kg/cm
2 
(Parámetro típico establecido según la literatura, con referencia para otros 
sustratos como el bagazo de caña de azúcar). Al concluir el tiempo de residencia, 
se liberó la presión rápidamente abriendo la válvula de expansión del reactor, 
liberando el CO2 a la atmósfera. 
 Finalmente se esperó a que el reactor se enfriara para posteriormente 
abrirlo y filtrar al vacío el residuo sólido lavándolo con agua destilada y secándolo 
en la estufa a 105°C. 
 Las condiciones de ensayo fueronlas siguientes: 
 
36 
 
 
Tabla 3. Matriz de experimentos 
Nombre Tiempo (min) Temperatura (°C) Presión kg/cm
2
 
CDE1 10 150 120 
CDE2 30 150 120 
CDE3 60 150 120 
CDE4 10 160 120 
CDE5 30 160 120 
CDE6 60 160 120 
CDE7 10 170 120 
CDE8 30 170 120 
CDE9 60 170 120 
 
Valoración de Azúcares Reductores provenientes de la Hidrólisis Enzimática 
del Residuo Lignocelulósico Pretratado. 
 Los residuos recuperados después de los pretratamientos de 
maceración en mortero; precipitación de hemicelulosas, deslignificación, “Steam 
Explosion” y “SC-CO2 Explosion” fueron usados como sustratos para su estudio 
en la hidrólisis enzimática al igual que los licores recuperados del “Steam 
Explosion”. 
 La hidrólisis enzimática se llevó a cabo en un matraz Erlenmeyer de 50 
ml equipado con tapa rosca, al cual se agregó buffer de citrato 0.05M, pH 4.8 y 
cualesquiera de los sustratos (bagazo patrón pretratado, residuos lignocelulósicos, 
hemicelulosas precipitadas); cada matraz estudiado se incubó 30 min a 50°C y se 
agregaron las enzimas Accellerase 1500, Accellerase XY y Accellerase XC, 
proporcionadas por Genencor y se incubaron por 72 horas a 50 °C con agitación 
elíptica a 150 rpm y se tomaron alícuotas de 0.2ml de cada hidrolizados a las 8hs, 
24 hs, 48 hs y 72 hs.. 
 Para la evaluar la hidrólisis enzimática de los licores se omitió la adición 
buffer de citrato, adicionando directamente la cantidad necesaria de ácido cítrico 
monohidratado, granular e hidróxido de sodio para ajustar el pH, parámetros 
necesarios para cumplir con la concentración del buffer y su pH. 
37 
 
 Para la estimación de los azúcares reductores se utilizó la técnica 
colorimétrica del ácido 3, 5-dinitrosalicílico (DNS) (T. K. Ghose, 1987). En tubos de 
ensaye equipados con tapa hermética se colocaron 0.5 ml de agua desionizada y 
50 l de las muestras hidrolizadas (sobrenadante después de centrifugar) tomadas 
a las 8 hs, 24 hs, 48 hs y 72 hs, seguido de la adición de 0.5 ml de solución de 
DNS. Se colocaron en un baño de glicerina a una temperatura de 100 °C durante 
5 minutos. Posteriormente, los tubos de ensayo se introdujeron en un baño de 
hielo para detener la reacción. Finalmente, se agrega agua destilada a los tubos 
de ensaye para diluir el color marrón producido y medir su absorbancia a 540 nm 
(entre un valor de 0.1 a 1), utilizando un espectrofotómetro UV/Visible 
(Spectrophotometer Lambda 2S, Perkin Elmer). 
 La concentración de los azúcares reductores fue calculada a partir de la 
pendiente de una curva patrón de glucosa en unidades de absorbancia vs 
concentración de glucosa comprendida entre en el valor teórico de rendimiento 
esperado y 2.5 mg/ml. Para los licores recuperados del pretratamiento “Steam 
Explosion” se utilizó una curva patrón de xilosa y glucosa (50:50 w/w). 
Medición de Actividad Enzimática. 
 Se determinó la actividad enzimática de las mezclas de enzimas o 
cocteles utilizadas en este trabajo Accellerase 1500 (celulasa), Accellerase XY 
(xilanasa) y Accellerase XC (carboximetilcelulasa) de Genencor. 
 Para Accellerase 1500 se realizó el ensayo de Papel Filtro para 
Sacarificar la Celulosa (ensayo de FPU, por sus siglas en inglés); que consistió en 
utilizar como sustrato tiras de papel filtro Whatman No. 1 con una media de 1.0 x 
6.0 cm (≈ 50 mg). Las cuales se colocaron en tubos de ensaye con la dilución de 
la enzima y buffer de citrato 0.05M para incubarse durante una hora a 50Cº. (T. K. 
Ghose, 1987). Posteriormente, se determinó la cantidad de azúcares reductores 
por el método de DNS. 
 La determinación de la actividad enzimática de la mezcla denominada 
Accellerase XC, se realizó empleando como sustrato modelo a la carboximetil 
38 
 
celulosa para cuantificar la actividad de la Endo-β-1,4-Glucanasa, para ello se 
utilizó como sustrato una solución al 2% de carboximetil celulosa CMC con un 
grado de sustitución de 0.7, en buffer de citrato 0.05M y pH 4.8. El sustrato junto 
con la dilución de la enzima correspondiente y buffer de citrato se mezclan en 
tubos de ensaye para ser incubado 30 minutos. Posteriormente, se determinó la 
cantidad de azúcares reductores liberados por el método DNS. Cada disolución de 
enzima fue analizada por DNS sin sustrato (blanco de enzima), para determinar si 
existió liberación de azúcares desde la enzima, de ser así, el valor obtenido con 
enzima sobre el sustrato modelo se corrige restándole el blanco de la enzima. 
 Finalmente se determino la actividad enzimática del la mezcla 
Accellerase XY (xilanasa) proveniente de “Interlaboratoy Testing of methods for 
assay of xylanase activity” de Michael J. Bailey, Peter Biely en 1992. 
 Se utilizó como sustrato 1.0% de Birchwood 4-O-methyl 
glucoronoxylano y de medio acuoso buffer de citrato 0.05M. 
 El sustrato junto con la dilución de enzima correspondiente y el buffer 
de citrato se colocan en tubos de ensaye para ser incubados durante 5 minutos a 
50°C. Posteriormente se determina la cantidad de azucares reductores producidos 
por DNS. 
 
 
 
 
 
 
 
39 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 
1. Cuantificación de los Componentes de las Fibras del Bagazo de Agave. 
 La primera fase de este trabajo consistió en montar una técnica 
completa de caracterización de los constituyentes principales de 3 diferentes tipos 
de bagazo de agave, misma que pudiera reproducirse en el laboratorio para otros 
residuos fibrosos potenciales. Nuestra mejor opción fue el método de Van Soest, 
que causó efecto nulo sobre los azúcares reductores potenciales, a diferencia del 
método de hidrólisis con ácido sulfúrico a altas temperaturas, el cual deteriora los 
azúcares reductores (pentosas). 
 Los residuos lignocelulósicos estudiados de acuerdo a la literatura, 
están compuestos principalmente por Hemicelulosa, Lignina, Celulosa, minerales y 
otros compuestos como proteínas, lípidos y azúcares residuales adheridos a las 
matrices. 
 La técnica de Van Soest y Wine se basa en la hidrólisis de la estructura 
celular de las matrices lignocelulósicas y su extracción mediante detergentes y 
agentes oxidantes. (Van Soest y Wine, 1967). Se empleó un detergente neutro 
(NDF por sus siglas en inglés) para eliminar los restos de lípidos, proteínas y 
glúcidos. El detergente ácido (ADF, por sus siglas en inglés), que permitió 
solubilizar los constituyentes no parietales del contenido celular y la hemicelulosa, 
por lo que la concentración de este carbohidrato se pudo determinar por la 
diferencia de peso entre el residuo obtenido del tratamiento anterior y este último. 
Después de este tratamiento, se generó un residuo que contiene celulosa, lignina 
y minerales. 
 La disolución de KMnO4 y Fe(NO3)3 permitió la oxidación de la Lignina, 
al completarse esta oxidación, el residuo se lavó con solución desmineralizante 
(compuesta por etanol, ácido clorhídrico y oxálico) y la fibras tomaron un color 
blanco, color característico de la celulosa. 
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 Los minerales residuales se encuentran como el producto de la 
calcinación de la celulosa de la etapa anterior a 550ºC y se determinan por 
diferencia de peso entre ambas etapas. 
En la Figura 7, se observa el porcentaje de los constituyentes principales 
del bagazo de agave procedente de distintas fábricas. Después de realizar una 
caracterización completa de los 3 sustratos, el bagazo (BAG) de la casa Herradura 
es el que contiene una mayor cantidad de celulosa, seguido por el BAG de la casa 
Sauza y, finalmente, el BAG de la casa Patrón. 
 
 
 A B 
 
C 
 
Figura7. Componentes de la fibra de bagazo de agave A.bagazo Patrón. B. bagazo Herradura. C. 
bagazo Sauza. 
 
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 Debido a la diferencia en el contenido