Analisis-energetico-del-efecto-de-la-temperatura-en-la-catalisis-de-la-atpasa-de-h-en-membranas-con-diferente-contenido-de-esfingolpidos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
ANÁLISIS ENERGÉTICO DEL EFECTO DE LA TEMPERATURA EN 
LA CATÁLISIS DE LA ATPasa DE H+ EN MEMBRANAS CON 
DIFERENTE CONTENIDO DE ESFINGOLÍPIDOS 
 
T E S I S 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
INGENIERO QUÍMICO 
 
PRESENTA: 
ILIAN GIORDANO PONCE PINEDA 
 
México, CD. MX. 2016 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Dra. Marina Gavilanes Ruíz 
VOCAL: Dra. Sobeida Sánchez Nieto 
SECRETARIO: Dra. Tatiana Eugenievna Klimova Berestneva 
1er. SUPLENTE: Dra. Carolina Peña Montes 
2do. SUPLENTE: Dra. Aurora Lara Núñez 
 
SITIO EN DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO 101 DEL DEPTO. DE BIOQUÍMICA, DEL CONJUNTO E DE LA 
FACULTAD DE QUÍMICA DE LA UNAM 
 
ASESOR DEL TEMA: 
 
__________________________________ 
MARINA GAVILANES RUIZ 
 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
 
____________________________ 
FRANCISCO MORALES CEDILLO 
 
SUSTENTANTE: 
 
__________________________________ 
ILIAN GIORDANO PONCE PINEDA 
 
 
 
RECONOCIMIENTOS 
 
Este trabajo de tesis fue realizado bajo la dirección de la Dra. Marina Gavilanes Ruíz, en 
el laboratorio 101 del Depto. de Bioquímica, del conjunto E de la Facultad de Química de 
la UNAM 
Al M. en C. Francisco Morales Cedillo por su asesoría, supervisión y apoyo en todo 
momento en la elaboración de esta tesis. 
 
A la Q.F.B. Ma. del Consuelo Enríquez Arredondo por la obtención de las vesículas de 
membrana plasmática de Arabidopsis thaliana utilizadas en la elaboración de este 
trabajo. 
 
Al Dr. Edgar Cahoon (Centre for Plant Science Innovation & Department of Biochemistry, 
University of Nebraska-Lincoln, USA) por proporcionarnos las semillas de la mutante 
sbh1-1 utilizadas en este trabajo. 
 
*************************************** 
 
A la Q. Laurel Fabila Ibarra, por su ayuda en el crecimiento de las plantas y en el uso del 
equipo utilizado en este trabajo 
 
*************************************** 
 
Este trabajo de tesis se llevó a cabo gracias al financiamiento de la DGAPA-UNAM 
(Proyecto IN222815) y por CONACYT (Proyectos 238368 y 252001) 
 
 
i 
CONTENIDO 
RESUMEN ...................................................................................................................................................... 1 
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................................. 2 
1. La membrana plasmática .............................................................................................................. 2 
2. Lípidos de la membrana plasmática .............................................................................................. 2 
2.1. Glicerofosfolípidos ......................................................................................................................... 2 
2.2. Esfingolípidos ................................................................................................................................. 3 
2.2.1. Importancia de los esfingolípidos en plantas ................................................................................ 4 
2.2.2. Síntesis de esfingolípidos .............................................................................................................. 4 
2.3. Esteroles ........................................................................................................................................ 5 
3. La ATPasa de H+ en la membrana plasmática ............................................................................... 5 
3.1. Estructura de la ATPasa de H+ ....................................................................................................... 6 
3.2. Catálisis de la enzima .................................................................................................................... 8 
3.3. Papel fisiológico de la ATPasa de H+ en plantas ............................................................................ 9 
3.4. Regulación de la actividad de la ATPasa de H+ ............................................................................ 10 
3.4.1. Regulación por fosforilación ........................................................................................................ 10 
3.4.2. Regulación por el ambiente membranal ..................................................................................... 10 
4. Efecto del pH en la catálisis enzimática....................................................................................... 11 
5. Efecto de la temperatura en la catálisis enzimática .................................................................... 12 
ANTECEDENTES INMEDIATOS ..................................................................................................................... 15 
JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................................................. 16 
HIPÓTESIS .................................................................................................................................................... 16 
OBJETIVOS ................................................................................................................................................... 16 
1. Objetivo general .......................................................................................................................... 16 
2. Objetivos particulares ................................................................................................................. 16 
MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................................ 18 
1. Diseño experimental ................................................................................................................... 18 
2. Material biológico ....................................................................................................................... 19 
3. Crecimiento de plantas ............................................................................................................... 19 
4. Aislamiento y purificación de vesículas de membrana plasmática ............................................. 20 
4.1. Obtención de la fracción microsomal.......................................................................................... 20 
 
ii 
4.2. Obtención de vesículas de membrana plasmática ...................................................................... 20 
5. Determinación de la proteína por el método de Lowry .............................................................. 20 
6. Determinación de fosfato inorgánico.......................................................................................... 21 
7. Determinación de hidrólisis de ATP ............................................................................................ 21 
8. Curva temporal de la actividad de hidrólisis de ATP ................................................................... 22 
9. Separación de proteínas en geles de poliacrilamida-SDS ...........................................................22 
10. Tinción de geles con azul de Coomassie ..................................................................................... 24 
11. Secado de geles ........................................................................................................................... 24 
12. Detección de la ATPasa por réplica en Western ......................................................................... 24 
13. Análisis estadístico ...................................................................................................................... 26 
RESULTADOS ............................................................................................................................................... 27 
1. Determinación de la hidrólisis química de ATP a diferentes tiempos y temperaturas ............... 27 
2. Determinación de la actividad de hidrólisis de ATP de las plantas de los genotipos silvestre y 
sbh1-1 27 
3. Respuesta de la actividad de la enzima a la temperatura en condiciones no catalíticas ........... 29 
4. Respuesta de la actividad de la enzima a la temperatura en condiciones catalíticas................. 32 
5. Análisis energético de la reacción de hidrólisis de ATP ............................................................... 32 
6. Determinación de la cinética de hidrólisis de ATP para ambas líneas de Arabidopsis thaliana . 34 
7. Determinación de los niveles de ATPasa de H+ en las vesículas de la membrana plasmática de 
plantas silvestre y línea sbh1-1 ............................................................................................................... 36 
DISCUSIÓN ................................................................................................................................................... 38 
1. La mutante sbh1-1 con un desbalance en los esfingolípidos di y trihidroxilados presenta una 
actividad menor comparada con la wt .................................................................................................... 39 
2. La mutante sbh1-1 presenta una menor estabilidad a altas temperaturas en condiciones no 
catalíticas comparada con la wt .............................................................................................................. 40 
3. La mutante sbh1-1 presenta una mayor estabilidad a altas temperaturas en condiciones 
catalíticas comparada con la wt .............................................................................................................. 41 
4. La mutante sbh1-1 presenta una doble capacidad de establecer colisiones efectivas con el 
sustrato en su sitio catalítico con respecto a la wt ................................................................................. 42 
5. La enzima de la mutante sbh1-1 es más lenta pero más afín por el sustrato que la wt ............. 43 
6. Las diferencias en la actividad de la ATPasa de H+ de las plantas de los 2 genotipos no se debe a 
la cantidad de enzima en la membrana respectiva ................................................................................. 44 
CONCLUSIONES ........................................................................................................................................... 45 
 
iii 
PERSPECTIVAS ............................................................................................................................................. 45 
APÉNDICE .................................................................................................................................................... 46 
Apéndice 1 ............................................................................................................................................... 46 
Apéndice 2 ............................................................................................................................................... 46 
Apéndice 3 ............................................................................................................................................... 46 
Apéndice 4 ............................................................................................................................................... 47 
Apéndice 5 ............................................................................................................................................... 48 
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................................. 49 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 | P á g i n a
 
RESUMEN 
Las membranas biológicas contienen proteínas involucradas en el transporte de solutos. 
Una de estas es la ATPasa de H+ de la membrana plasmática, la bomba primaria más 
importante en las plantas, ya que participa en todas las fases del desarrollo. Por ello, es una 
enzima sujeta a formas de regulación transcripcional, traduccional, post-traduccional, y por 
interacción con proteínas específicas y con lípidos membranales. La regulación de la actividad 
de la bomba ATPasa de H+ por esfingolípidos membranales es desconocida en la literatura y es 
muy interesante, pues este tipo de lípidos es muy abundante en las membranas de plantas. 
Una forma de estudiar esta interacción es investigando la posible asociación entre la estabilidad 
de la ATPasa de H+ de la membrana plasmática y el contenido de esfingolípidos. Para cumplir 
este objetivo, se utilizaron plantas de Arabidopsis thaliana del genotipo silvestre y de la línea 
mutante sbh1-1, con un menor contenido de esfingolípidos trihidroxilados y mayor de 
dihidroxilados. Se aislaron vesículas de las membranas plasmáticas de estas plantas, se 
sometieron a diferentes temperaturas de incubación y de reacción, y se midió la catálisis 
enzimática como hidrólisis de ATP. Se determinaron los valores de las energías de activación, 
Vmax y KS para compararlos entre los dos genotipos. También se estimó la cantidad de ATPasa 
mediante inmunodetección. 
Los resultados indicaron que las enzimas de los dos genotipos tuvieron una energía de 
activación similar, sin embargo la constante de frecuencia de colisiones entre las moléculas 
aumentó al doble en la mutante con menor contenido de esfingolípidos trihidroxilados. La Vmax 
en la mutante tuvo una magnitud de casi un tercio de la obtenida para la silvestre, sin embargo 
su afinidad por ATPMg resultó ser aproximadamente del doble. La inmunodetección de la 
ATPasa reveló que la cantidad de enzima en las membranas fue la misma en todas las 
preparaciones de los dos genotipos. Los resultados obtenidos sugieren que la hidroxilación de 
los esfingolípidos afecta la conformación de la ATPasa de H+ tanto en condiciones catalíticas 
como condiciones no catalíticas. Un mayor contenido de esfingolípidos dihidroxilados y un 
menor contenido de esfingolípidos trihidroxilados favorecen la estabilidad de la ATPasa ante la 
temperatura, pero afectan negativamente su catálisis debiéndose posiblemente a un sitio 
catalítico más expuesto a la superficie de la enzima. 
2 | P á g i n a
 
INTRODUCCIÓN 
1. La membrana plasmática 
Las membranas biológicas forman los límites alrededor de la célula y de los distintos 
organelos. Estas actúan como barreras permeables selectivas permitiendo que el medio interior 
de la célula u organelo difiera del medio exterior [Staehelin y Newcomb, 2000]. Las membranas 
están involucradas en procesos de transporte de solutos, de comunicación intercelular, de 
señalización, etc., para lo que contienen elementos específicos como acarreadores, canales, 
proteínas ligantes, receptores específicos para la estimulación externa, etc. Todas las 
membranas contienen 2 componentes básicos: lípidos y proteínas, aunque en menor 
proporción contienen carbohidratos unidos covalentemente a los lípidos y/o a las proteínas. La 
composición de lípidos, proteínas y carbohidratos difiere de una membrana a otra [Stryer y col,2004; Hames y Hooper, 2005]. 
La estructura de la membrana celular consiste en 2 monocapas de lípidos contrapuestas 
entre sí por la parte no-polar y exponiendo las caras polares al exterior, formando una 
estructura bimolecular continua (bicapa lipídica). Cada monocapa es diferente a la contrapuesta 
en proporciones de lípidos y proteínas asociadas, por lo que se considera que ambas 
monocapas son asimétricas entre sí [Stryer y col, 2004]. 
2. Lípidos de la membrana plasmática 
Los lípidos son componentes estructurales de las membranas que forman la matriz en la 
que se insertan las proteínas, dichos lípidos son amfifílicos, lo que significa que tienen 2 
regiones: una parte polar o hidrofílica y una no polar o hidrofóbica. En las membranas los tres 
principales lípidos son glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles [Hames y Hooper, 2005]. 
2.1. Glicerofosfolípidos 
Los glicerofosfolípidos contiene 3 componentes: una cabeza fosforilada, un esqueleto de 
glicerol de 3 carbonos y 2 cadenas de ácidos grasos. La cabeza fosforilada está ligada al C3 del 
esqueleto de glicerol, mientras que las 2 cadenas de ácidos grasos están ligadas a los otros 2 
átomos de carbono. El glicerofosfolípido más simple es el fosfatidato (diacilglicerol 3-fosfato) 
que tiene solamente un ácido fosfórico esterificado al C3 del glicerol. Aunque el fosfatidato por 
sí mismo está presente en pequeñas cantidades en la membrana, la mayoría de los 
glicerofosfolípidos son derivados de este. En estos otros lípidos el fosfato esta adicionalmente 
esterificado al grupo hidroxilo de algunos alcoholes (colina, etanolamina, glicerol, inositol o 
3 | P á g i n a
 
serina). La mayor parte de glicerofosfolípidos encontrados en las membranas de eucariontes y 
de procariontes también incluyen a la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina, el fosfatidilglicerol, 
el fosfatidilinositol y la fosfatidilserina. En los glicerofosfolípidos, las 2 cadenas de ácidos grasos 
son hidrofóbicas, mientras que el esqueleto de glicerol y la cabeza fosforilada son hidrofílicas y 
pueden tener cargas dadas por el grupo fosfato y por los alcoholes unidos al fosfato [Stryer y 
col, 2004; Hames y Hooper, 2005]. 
2.2. Esfingolípidos 
Los esfingolípidos se encuentran en prácticamente todos los animales, plantas y hongos, 
y en algunos organismos procariontes y en virus (Fig. 1A). Están compuestos por una base 
esfingoidea o base de cadena larga (esfingosina), que es el esqueleto sobre el que se 
ensamblan covalentemente un ácido graso a través de un enlace amida y/o una cabeza polar 
en el primer hidroxilo de la base (Fig. 1B). La cabeza polar puede ser desde un hidrógeno (para 
esfingosina y ceramida) hasta fosfatos y unidades de carbohidratos en diferente número. 
 
Fig. 1. Estructura básica de un esfingolípido complejo. Se ilustra el esqueleto de ceramida, conteniendo un ácido 
graso de 16 carbonos unido por el enlace amida a la base esfingoidea de 18 carbonos que contiene una insaturación 
en el carbono 4. El sustituyente polar no se desglosa [Modificado de Merrill, 2008]. 
Las subespecies de esfingolípidos no son completamente conocidas, pero hay cientos 
de diferentes combinaciones del esqueleto esfingoideo con diferentes ácidos grasos y con 
alrededor de 400 diferentes cabezas polares. La base esfingoidea de 18 carbonos mostrada en 
la Fig. 1 tiene la estructura química (2S, 3R, 4E)-2-aminooctadec-4-ene-1,3-diol, pero es 
típicamente llamada esfingosina o (E)-esfingo-4-enina [Merrill, 2008]. 
Existen 3 grupos de esfingolípidos, los cuales se clasifican dependiendo de la cabeza 
polar que presentan: las esfingomelinas, los glicoesfingolípidos y los gangliósidos. Las 
esfingomelinas tienen fosfocolina o fosfoetanolamina como cabeza polar. Los 
4 | P á g i n a
 
glicoesfingolípidos suelen tener uno o más azúcares unidos al C1 de la ceramida. Estos se 
clasifican en cerebrósidos, con un solo azúcar unido, y globósidos, con 2 o más azúcares 
unidos. Los gangliósidos son los esfingolípidos más complejos debido a que presentan 
oligosacáridos como cabeza polar y uno o más residuos de ácido-N-acetilmurámico o ácido 
siálico [Chen y col, 2009]. 
2.2.1. Importancia de los esfingolípidos en plantas 
Las 2 clases de esfingolípidos mayormente presentes en plantas son las 
glucosilceramidas también llamados esfingolípidos neutros y los derivados de la 
inositolfosforilceramida o esfingolípidos acídicos [Lynch y col, 2009]. Sin embargo, dentro de 
cada una de estas dos clases de esfingolípidos complejos hay un gran número de especies 
moleculares diferentes, debido a las múltiples posibilidades de la estructura de cada uno de los 
tres componentes de los esfingolípidos complejos [Hames y Hooper, 2005]. Se ha reportado 
que ciertas especies tienen funciones asignadas en la fisiología de las plantas. Entre ellas están 
funciones estructurales en las membranas, de reconocimiento de ligandos, en la transducción 
de señales. Estas funciones se integran a la vida celular en condiciones regulares o de 
exposición a estreses como patógenos, bajas temperaturas y sequía [Saucedo y col, 2015]. 
En las membranas los esfingolípidos contribuyen a la formación de la matriz lipídica, en 
particular de las membranas plasmática, de la vacuola, del retículo endoplásmico y del Aparato 
de Golgi [Chen y col, 2009]. En la membrana plasmática, los esfingolípidos forman las regiones 
de la membrana plasmática denominadas 'balsas lipídicas', que se enriquecen en receptores, 
transportadores y otras proteínas, especialmente proteínas que están unidas covalentemente a 
un esfingolípido-glicosilfosfatidilinositol (GPI) [Merrill, 2008]. 
2.2.2. Síntesis de esfingolípidos 
Los esfingolípidos son sintetizados en el retículo endoplásmico (RE) y en el aparato de 
Golgi. La síntesis involucra varias reacciones (Fig. 2). La primera es la condensación del 
palmitoil-CoA y la serina formando 3-cetoesfinganina, reacción catalizada por la enzima serina 
palmitoiltransferasa. Posteriormente, se lleva a cabo una reducción de la 3-cetoesfinganina 
produciendo esfinganina. La cual es acilada con un ácido graso para formar ceramidas a las 
que se les incorporan diversos grupos polares para la formación de esfingolípidos complejos. La 
esfinganina puede fosforilarse a través de la esfinganina cinasa formando la esfinganina-1-
fosfato [Lynch y Dunn, 2004]. 
5 | P á g i n a
 
 
Fig. 2. Vía de síntesis de esfingolípidos en plantas [Modificada de Lynch y Dunn, 2004]. 
2.3. Esteroles 
Están formados por un núcleo de ciclopentanoperhidrofenantreno, una cadena lateral y 
un grupo polar que es un hidroxilo en la posición 3 del sistema de anillos [Hames y Hooper, 
2005]. El colesterol es el esterol más abundante de las membranas plasmáticas de animales, 
aunque se encuentra ausente en los procariontes. Las plantas contienen una pequeña cantidad 
de colesterol pero en su lugar tienen otros esteroles, mayormente el stigmaesterol y el β-
sitoesterol que difieren del colesterol únicamente en sus cadenas alifáticas [Buchanan y col, 
2000]. 
3. La ATPasa de H+ en la membrana plasmática 
Las proteínas membranales se clasifican en 2 tipos diferentes: periféricas (extrínsecas) o 
integrales (intrínsecas) dependiendo de la región a la que están unidas a la membrana. Las 
proteínas periféricas se unen a la superficie polar de la membrana por lo que pueden ser 
removidas lavando la membrana con una solución de alta fuerza iónica o alto pH. A diferencia 
de las proteínas periféricas, las proteínas integrales están estrechamente unidas a la membrana 
6 | P á g i n a
 
mediante interacciones con la parte hidrofóbica de la membrana y pueden ser extraídas de la 
membrana únicamente usando agentes que rompan la estructura de la membrana como lo son 
solventes orgánicos o los detergentes. Como los lípidos, las proteínas integrales son 
amfipáticas, teniendo las 2 regiones (polar y no polar) y están distribuidasasimétricamente a 
través de la bicapa. Estas proteínas pueden atravesar solo una monocapa de la bicapa, o bien 
ambas partes. A estas últimas proteínas se les conoce como proteínas transmembranales 
[Hames y Hooper, 2005]. 
3.1. Estructura de la ATPasa de H+ 
La ATPasa de H+ de la membrana plasmática es una proteína transmembranal de entre 
948-957 aminoácidos, lo cual corresponde a un peso molecular aproximado de 100 kDa. Esta 
enzima pertenece a la familia de ATPasa tipo P, las cuales durante el ciclo catalítico de 
transporte de iones son fosforiladas reversiblemente y son inhibidas por vanadato, que es 
estructuralmente parecido al fosfato gama del ATP. Esta ATPasa bombea protones a través de 
la membrana plasmática en contra de su gradiente de concentración (reacción endergónica) 
usando la energía de la hidrólisis de ATP (reacción exergónica). Con este transporte de H+ la 
enzima genera un potencial de membrana de 200 mV [Auer y col, 1998; Palmgren y Harper, 
1999]. 
Topológicamente, dicha ATPasa tiene las siguientes características (Fig. 3) [Kasamo, 
2003]: 
 Los casi 1000 aminoácidos están distribuidos en tres grandes dominios hidrofílicos 
y en el dominio hidrofóbico que comprende 10 α-hélices transmembranales (M1-
M10) con 15 a 30 aminoácidos cada una. 
 El 70 % de la masa proteica aproximadamente es hidrofílica y está expuesto a la 
superficie citosólica. 
 El 5 % de la región hidrofílica está expuesta a la superficie extracelular. 
 Los amino y carboxilo terminales están localizados en el espacio citosólico. 
 Los sitios activos y los sitios de fosforilación están localizados intracelularmente en 
el asa hidrofílica más grande localizada entre los dominios transmembranales M4 y 
M5. 
7 | P á g i n a
 
 
Fig 3. Modelo estructural de la ATPasa de H
+
 de la membrana plasmática en donde se representan sus dominios 
hidrofílicos e hidrofóbicos. La parte superior representa la región citosólica [Modificada de Kasamo, 2003]. 
Funcionalmente, la estructura de la ATPasa de H+ de la membrana plasmática consiste 
de los dominios A, M, P, N, y R. El dominio A (actuador) consiste en el amino terminal y el asa 
pequeña (ver Fig. 4). El dominio M (membrana) corresponde a un dominio transmembranal con 
10 α hélices, M1 a M10. El dominio P (fosforilación) se encuentra en el asa grande (ver Fig. 4). 
El dominio N (de unión a nucleótido) se encuentra entre dos partes de la secuencia de la 
formación del dominio P. El dominio R (regulador) consiste en el fragmento que contiene el 
carboxilo terminal de la proteína mismo que actúa como un dominio auto-inhibitorio de la 
catálisis (Fig. 3) [Pedersen y col, 2007; Duby y Boutry, 2009]. 
 
Fig. 4. Estructura cristalográfica de la 
isoforma AHA2 de la ATPasa de H
+
 de 
la membrana plasmática. Se muestra la 
forma activa de la bomba de protones y 
tres de los cuatro dominios reconocidos 
en la ATPasa de H
+
 [Pedersen y col, 
2007] 
 
8 | P á g i n a
 
3.2. Catálisis de la enzima 
El ciclo catalítico de la ATPasa de H+ se lleva a cabo a través de 2 estados 
conformacionales principales, E1 y E2 (Fig. 5). Los estados E1 y E2 se alternan durante el 
transporte. Los dominios N, P y A de la ATPasa de H+ son los encargados de la hidrólisis de 
ATP, los cambios conformacionales en estos dominios durante la catálisis permiten 
movimientos simultáneos en la parte de la ATPasa que lleva a cabo el trasporte de protones. 
En cuanto a la función de transporte del catión, la bomba de H+ de la membrana 
plasmática contiene una región donadora/aceptora de H+, integrada por un único residuo 
protonable de ácido aspártico (Asp684), un residuo de asparagina (Asn106), un residuo de 
arginina (Arg655) y una gran cavidad central que puede ser llenada con agua. El Asp 684 está 
estrechamente conectado al Asn106. Se cree que la protonación en la estructura E1-P del 
Asp684 facilita la formación del puente de hidrógeno entre este y el Asn106. La fosforilación 
crea cambios conformacionales de E1-P a E2-P y la liberación del H+ del Asp684. Se cree que 
la Arg665 juega un papel importante en la liberación del H+ y del transporte contra altos 
potenciales de la membrana. La carga positiva del Arg655 cercana al Asp684 favorecería la 
liberación del H+ de Asp684 e impediría la reprotonación del Asp684 con otro H+ extracelular. 
Se cree que en la membrana plasmática un solo protón es transportado por cada ATP 
hidrolizado, sin embargo también se ha propuesto que existe desacoplamiento parcial entre la 
hidrólisis de ATP y el transporte de protones [Janicka-Russak, 2011]. 
El transporte de H+ ocurre desde el citosol hacia el espacio apoplástico estableciendo 
una diferencia electroquímica de aproximadamente 2 unidades de pH y 250 mV. Ya que el 
citosol tiene un pH aproximado de 7 y el espacio apoplástico un pH de entre 5 y 6 unidades, el 
transporte se lleva a cabo en contra del gradiente de concentración, por lo que se requiere la 
reacción de hidrólisis de ATP para generar la energía que costee ese transporte. La reacción 
de ATPasa libera entre 60 y 65 kJ/mol, dependiendo de la concentración de ATP, lo que hace la 
reacción muy exergónica y capaz de sustentar el transporte [Nelson y Cox, 2007]. 
9 | P á g i n a
 
 
Fig 5. Mecanismo simplificado de funcionamiento de la ATPasa de H
+
 [Modificado de Kühlbrandt y col, 2002]. 
3.3. Papel fisiológico de la ATPasa de H+ en plantas 
Todas las células vegetales expresan a la ATPasa de H+ de la membrana plasmática, 
sin embargo se ha encontrado que la cantidad de esta proteína varía en diferentes tipos de 
células y tejidos. En las células de epidermis, endodermis y floema de raíces se han encontrado 
grandes cantidades de la enzima por inmunodetección. Esto se puede explicar ya que la 
ATPasa de H+ de la membrana plasmática es responsable de establecer el gradiente de 
protones implicados en la energización de la membrana usada para el transporte nutrientes que 
son tomados del suelo, por lo que la enzima controla el proceso más importante de transporte 
en la planta: la absorción de nutrientes de la raíz, y la carga del xilema y floema que son 
arreglos celulares especializados en la raíz. . 
Además de su rol fundamental en la absorción de nutrientes, la ATPasa de H+ tiene un 
papel importante en el crecimiento de la célula. La teoría llamada “crecimiento ácido” sugiere 
que los protones extruidos por una ATPasa de H+ activada disminuyen el pH apoplástico que 
activa a las enzimas que intervienen en la disminución de la rigidez de la pared celular. Se ha 
reportado que las auxinas, hormonas vegetales, incrementan el flujo de membranas 
sintetizadas de novo ricas en moléculas de ATPasa desde el retículo endoplásmico hasta la 
membrana plasmática [Frías y col, 1996]. 
10 | P á g i n a
 
Igualmente la ATPasa de H+ está relacionada con la regulación del pH intracelular, ya 
que una acidificación del citosol activa a la enzima aumentando la extrusión de protones desde 
el citosol hacia el apoplasto, contribuyendo a la alcalinización del citosol [Janicka-Russak, 
2011]. 
3.4. Regulación de la actividad de la ATPasa de H+ 
Se sabe que en algunos casos, un aumento en la actividad de ATPasa se lleva a cabo 
por una regulación transcripcional que permiete un aumento en la expresión del gen de la 
ATPasa. Pero la actividad de la enzima también puede regularse post-traduccionalmente. Entre 
las formas de regulación post-traduccionales, el mecanismo más estudiado involucra la 
regulación auto-inhibitoria por el dominio carboxilo terminal (aproximadamente 100 
aminoácidos) de la enzima. La eliminación del carboxilo terminal por medio de un tratamiento 
con tripsina o por ingeniería genética resulta en una enzima constitutivamente activa. Aunque 
está claro que el carboxilo terminal es el principal dominio regulatorio relacionado con la 
activación de la ATPasa de H+, los resultados recientes indican que el amino terminaligualmente participa en la modificación de la actividad de la bomba protones de la membrana 
plasmática [Janicka-Russak, 2011]. 
3.4.1. Regulación por fosforilación 
La fosforilación y desfosforilación de proteínas es otro mecanismo de regulación post-
traduccional. La actividad de la ATPasa de H+ puede ser regulada por la interacción con la 
proteína 14-3-3. La fosforilación de la treonina Thr 947 por una cinasa de membrana genera un 
sitio de unión para la proteína 14-3-3, y esto origina un aumento en la actividad enzimática 
[Svennelid y col, 1999]. 
3.4.2. Regulación por el ambiente membranal 
Se ha descrito que varios agentes amfifílicos, incluyendo lípidos típicos de la membrana, 
pueden modificar la actividad de la ATPasa de H+. Esto se ha encontrado con glicerolípidos y 
esteroles. Por ello, se cree que el entorno membranal puede tener un efecto en la regulación de 
la actividad de la enzima [Kasamo, 2003]. 
La regulación de la actividad de las enzimas por los lípidos membranales que la rodean 
se ha explicado por dos modelos: la teoría de los lípidos en conjunto y la teoría de los lípidos 
frontera (anulares) (Fig. 6). 
11 | P á g i n a
 
La teoría de los lípidos en conjunto (bulk) establece que cambios en la composición de 
lípidos en la membrana plasmática alteran la fluidez de la membrana, lo cual causa un cambio 
conformacional en la enzima y en su actividad. 
La teoría de los lípidos frontera o anulares establece que hay moléculas lipídicas 
específicas de la membrana que están estrechamente unidas a la proteína. La interacción 
directa entre dichos lípidos anulares y las proteínas en la membrana causan la regulación de la 
actividad de la proteína. La composición de los fosfolípidos anulares alrededor de la proteína 
podría diferir de la composición del resto de fosfolípidos que integran el resto de la bicapa, lo 
cual permite dar una mejor explicación en la especificidad de las interacciones y uniones 
específicas entre lípidos y proteínas de la membrana [Kasamo, 2003]. 
. 
Fig 6. Representación esquemática de la teoría de 
lípidos frontera/anulares (arriba) y la teoría de los 
lípidos en conjunto (abajo) [Modificada de Kasamo, 
2003]. 
4. Efecto del pH en la catálisis enzimática 
El pH es una medida de la concentración del ión [H+] presente en una solución. Los 
sitios activos enzimáticos se componen casi siempre de grupos ionizables que deben 
encontrarse en la forma iónica adecuada, con el fin de mantener la conformación del sitio 
activo, unir sustratos o catalizar la reacción. Por esto mismo, la variación en la concentración de 
H+ puede afectar positiva o negativamente la catálisis de la enzima, además de que una 
variación del pH del medio puede causar la desnaturalización de la misma [Purich, 2010]. 
Los efectos del pH en la estabilidad de una enzima deben ser considerados y 
diferenciados de los efectos del pH en la unión y la catálisis del sustrato. En la Fig. 7 se pueden 
observar ambos efectos. La primera curva (curva A) muestra el valor de la velocidad de la 
reacción según el pH del medio. El pH de máxima actividad (a veces llamado óptimo) es de 6.8, 
12 | P á g i n a
 
sin embargo la curva A no dice por qué la velocidad disminuye a un pH diferente de 6.8. La 
curva B muestra el efecto del pH sobre la estabilidad de la enzima, y se puede observar que 
entre un pH de 5 y un pH de 8 la enzima es estable, así la disminución de la actividad entre un 
pH de 5 y 6.8 y entre 6.8 y 8 puede explicarse por una interacción incorrecta entre la enzima y/o 
el sustrato. La disminución de la actividad a un pH menor a 5 o mayor a 8 se debe además de 
la desnaturalización de la enzima [Segel, 1974]. 
 
Fig 7. Efecto del pH sobre la actividad y la estabilidad de una enzima. La curva A indica la actividad observada según 
el pH del medio. La curva B indica el efecto del pH sobre la estabilidad de la enzima [Segel, 1974]. 
5. Efecto de la temperatura en la catálisis enzimática 
La temperatura es una medida de la energía cinética molecular promedio de un sistema. 
En prácticamente todas las reacciones químicas, la velocidad se incrementa al incrementar la 
temperatura debido a que las moléculas se mueven con mayor velocidad, aumentan la distancia 
recorrida por unidad de tiempo y con esto, aumenta la probabilidad de choques efectivos. 
Además, una mayor velocidad implica una mayor energía en los choques, lo que favorece la 
probabilidad de alcanzar la energía necesaria para llevar a cabo la reacción [Petrucci y col, 
2013]. La relación entre la velocidad y la temperatura de las reacciones químicas está definida 
en la ecuación de Arrhenius: 
 
𝑘 = 𝐴𝑒−
𝐸𝑎
𝑅𝑇 
En donde: 
k = Constante de velocidad específica 
Es
ta
b
ili
d
ad
 
A
ct
iv
id
ad
 
13 | P á g i n a
 
A = Constante de Arrhenius 
e = Base de los logaritmos naturales (2.71828) 
Ea = Energía de Activación 
R = Constante de los gases ideales 
T = Temperatura absoluta 
 
Energía de Activación. Es la energía necesaria para que los reactivos alcancen el estado 
activado. Representa un estado que se alcanza tras superar una barrera energética que los 
reactivos deben rebasar para convertirse en productos (Fig. 8A). La energía de activación se 
relaciona en forma inversa con la velocidad (Fig. 8B). 
 
Constante de Arrhenius. El valor de esta constante está relacionado con el cambio de 
entropía de la reacción porque depende de la forma y tamaño de las moléculas, mientras más 
complejas son las moléculas del reactivo, menor es el valor de la constante [Velázquez y 
Ordorica, 2014]. 
 
 
Fig. 8. Energía de activación. A, Interpretación gráfica de la energía de activación. B, Relación de la energía de 
activación con la velocidad específica (1.1 y 1.2 son factores que se multiplican por la energía de activación, así 
Ea<1.1Ea<1.2Ea) [Modificada de Velázquez y Ordorica, 2014]. 
 
Las reacciones catalizadas por enzimas siguen la ecuación de Arrhenius. La naturaleza 
proteica y su estructura terciaria se conservan por un gran número de enlaces débiles no 
covalentes, por lo que la estructura es frágil y muy delicada. Si la molécula absorbe demasiada 
energía, la estructura terciaria se rompe y la enzima se desnaturaliza y con esto, pierde su 
14 | P á g i n a
 
actividad catalítica. Al aumentar la temperatura, el aumento esperado en V debido al aumento 
de las colisiones entre la enzima y el sustrato llega a ser anulado por el aumento en la 
velocidad de desnaturalización [Segel, 1974]. 
 
En un sistema sencillo de equilibrio rápido, Vmax/[E]t = kp , la constante de velocidad es 
de primer orden, por lo que una representación de log Vmax/[E]t contra 1/T da Ea para el proceso 
catalítico. Experimentalmente solo se puede representar log Vmax, ya que la Vmax de una 
preparación dada es proporcional a kp. 
 
Debido a que la Ks varía con la T, no se puede asegurar una concentración de 
saturación de sustrato para todas las temperaturas. Esto nos lleva a que la Ea calculada a partir 
de la ecuación de Arrhenius sea un valor aparente o “medio”. La representación de Arrhenius 
puede ser no lineal si a diferentes temperaturas los procesos limitantes de la velocidad son 
diferentes. Algunas veces la representación puede mostrar un cambio agudo en la pendiente a 
alguna temperatura debido a que la dependencia de Vmax cambia de un proceso limitante de 
velocidad a otro (Fig. 9, curva B) y a esto se le conoce como temperatura de transición. Una 
caída brusca en la representación de Arrhenius a 1/T baja (T alta) indica la desnaturalización de 
la proteína (Fig. 9, curva C). 
 
Fig. 9. Cálculo gráfico de la Energía de activación. Para reacciones catalizadas enzimáticamente se puede graficar 
log Vmax/[E]t o solo log Vmax vs 1/T. A, Comportamiento usual. B, Algunas veces la gráfica muestra un cambio en la 
pendiente si a cierta temperatura existe un paso limitante. C, Una caída drástica en la gráficaindica inactivación 
enzimática [Segel, 1974]. 
15 | P á g i n a
 
ANTECEDENTES INMEDIATOS 
La ATPasa de H+ de la membrana plasmática de plantas está sujeta a múltiples formas 
de regulación. Una de estas formas de regulación es debida al ambiente membranal que la 
rodea. Esto ha sido estudiado con glicerofosfolípidos y con esteroles, ya que estos son los 
lípidos de mayor abundancia en las membranas, pero no existen datos en la literatura acerca de 
la regulación por esfingolípidos membranales. 
En nuestro grupo de trabajo se ha encontrado que los esfingolípidos juegan un papel 
importante en la regulación de la actividad de la ATPasa de H+. Se determinó que en la línea de 
Arabidopsis thaliana Atlcb2bhp/Atlcb2a, que tiene un contenido 34 % menor de esfingolípidos 
totales, la actividad de ATPasa de H+ aumentó alrededor de un 100 % respecto a la actividad de 
la ATPasa de H+ de las plantas control (genotipo silvestre) [Vázquez- Vázquez, 2007]. Se 
encontró que en la enzima de esta misma mutante, la Vmax está aumentada aproximadamente 
un 32 % con respecto al genotipo silvestre [González-Reyes, 2010]. Además se demostró que 
la glucosilceramida regula negativamente la actividad de la ATPasa de H+ mientras que la 
glicosil-inositolfosforil-ceramida regula positivamente la actividad de la misma [Morales-Cedillo, 
2014]. 
Para conocer un poco más acerca del efecto de los distintos esfingolípidos en la 
actividad de la ATPasa de H+ y en particular si la tercera hidroxilación de los mismos afectaba a 
la ATPasa de H+, se utilizaron plantas de Arabidopsis thaliana (ecotipo Col-0) del genotipo 
silvestre y de la línea mutante sbh1-1 (la cual tiene una inserción de T-DNA en el gen de la 
hidroxilasa 1 de bases esfingoideas) que produce una menor cantidad de esfingolípidos 
trihidroxilados y un mayor número de esfingolípidos dihidroxilados [Chen y col, 2008]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
16 | P á g i n a
 
JUSTIFICACIÓN 
 En la actualidad el problema del calentamiento global ha aumentado considerablemente. 
En los últimos 100 años la temperatura global promedio ha aumentado 0.6 °C y se cree que 
continuará aumentando a un ritmo mayor [Root y col, 2003] por lo que es importante estudiar el 
efecto del incremento de la temperatura sobre los seres vivos. Se ha demostrado que una 
respuesta de los animales ante un estrés por incremento de temperatura es el aumento de 
esfingolípidos fosforilados [Skrzypek y col, 1999]. Adicionalmente, las respuestas de las 
actividades enzimáticas a los cambios de temperatura en las plantas, que son organismos 
poiquilotermos, no están bien estudiadas. Por lo que una forma de estudiar el efecto de la 
temperatura en las plantas es analizar el efecto de la misma sobre una proteína 
transmembranal que es la bomba primaria más importante de las plantas, la ATPasa de H+ de 
la membrana plasmática, tanto en plantas silvestres como en mutantes con diferente contenido 
de esfingolípidos totales. 
HIPÓTESIS 
La temperatura modifica la actividad de la ATPasa de H+ de la membrana plasmática 
dependiendo del entorno de esfingolípidos trihidroxilados membranales. 
OBJETIVOS 
1. Objetivo general 
Determinar si los esfingolípidos de la membrana plasmática modifican la actividad de la 
ATPasa de H+ en respuesta a diferentes temperaturas. 
2. Objetivos particulares 
Se estudiará la ATPasa de H+ de Arabidopsis thaliana Col-0, del genotipo silvestre y de 
la mutante sbh1-1, esta última es una mutante de Arabidopsis thaliana en el gen SBH1 que 
codifica a una enzima encargada de la tercera hidroxilación de la base de cadena larga en los 
esfingolípidos. 
Cultivar plantas de ambos genotipos hasta la edad adulta y cosechar las hojas. 
17 | P á g i n a
 
Obtener membranas plasmáticas purificadas de las hojas de las plantas de los genotipos 
mencionados. 
En las preparaciones membranales purificadas de las plantas de ambos genotipos: 
Determinar las condiciones para medir la actividad de la ATPasa de H+ como hidrólisis 
de ATP. 
Determinar las temperaturas adecuadas para medir su efecto sobre la actividad de la 
enzima. 
Determinar el efecto del sustrato en el efecto de la temperatura sobre la actividad de la 
enzima. 
Determinar la Vmax, Ks, Vmax/Ks, K’ y n de la ATPasa de H
+ de la membrana plasmática de 
las líneas estudio. 
Determinar el efecto de diferentes tiempos a diferentes temperaturas sobre la actividad 
de la enzima. 
Determinar las constantes de Arrhenius a partir de las actividades obtenidas. 
Estimar los niveles de ATPasa de H+ en todas las preparaciones membranales 
utilizadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
18 | P á g i n a
 
MATERIALES Y MÉTODOS 
1. Diseño experimental 
Se llevó a cabo una estrategia experimental (Fig. 10) diseñada para cumplir los objetivos 
presentados. 
 
Fig. 10. Estrategia experimental llevada a cabo con el fin de cumplir los objetivos de esta tesis. 
 
 
 
Aislamiento de vesículas de membrana 
plasmática 
Separación de proteínas 
membranales, SDS-PAGE 
Réplica tipo Western 
Determinación de 
temperatura y tiempo 
óptimos 
Condiciones no catalíticas (No 
sustrato) 
Tiempo de incubación 
0’, 5’, 10’, 20’, 30’ y 40’ 
Condiciones 
catalíticas 
Tiempo de reacción 
20’ 
Temperatura de reacción 
28, 29, 32, 36 y 40 °C 
Medición de actividad de ATPasa 
OBTENCIÓN DE CONSTANTES 
CATALÍTICAS Y ANÁLISIS 
ENERGÉTICO 
ESTIMACIÓN DEL 
NIVEL DE ATPasa 
Crecimiento de plantas (wt, sbh1-1) 
19 | P á g i n a
 
2. Material biológico 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. Crecimiento de plantas 
Se utilizaron plantas de Arabidopsis thaliana ecotipo Col-0 de los genotipos silvestre (wt) 
y de la línea sbh1-1, la cual está genéticamente modificada para expresar una menor cantidad 
de esfingolípidos trihidroxilados y un mayor contenido de esfingolípidos dihidroxilados [Chen y 
col, 2008]. 
Las semillas de Arabidopsis thaliana fueron germinadas y crecidas por tres semanas en 
una maceta-almácigo, a un fotoperiodo de 8 h de luz y 16 h de oscuridad a una temperatura de 
22 °C y con riego discrecional con agua. Después de este tiempo se transfirieron a macetas con 
un sustrato compuesto de 3 partes de Mix 4 Agregate Plus (Sunshine, Sun Gro Horticulture; 
Canada Ltd.), 1 parte de Vermiculita Premium Grande (Sunshine, Sun Gro Horticulture; Canada 
Ltd.) y 1 parte de Agrolita Dica Mex (Dicalite de México S.A. de C.V.; Tlalnepantla, Edo de 
Línea de 
Arabidopsis 
thaliana 
sbh1-1 [Chen y col, 2008] 
 Silvestre (Col-0, wt) 
Inserciones de 
T-DNA en el gen de 
la hidroxilasa 1 de 
bases esfingoideas 
(sbh1). 
Sin modificación. 100 % de 
esfingolípidos 
complejos. 
50 % de los esfingolípidos 
trihidroxilados del control, 
200 % del contenido de 
esfingolípidos dihidroxilados 
del control. 
Modificaciones 
genotípicas 
Contenido de 
esfingolípidos 
20 | P á g i n a
 
México). La mezcla de estos componentes se realiza en una tina grande y se humedece con 
agua de la llave. Posteriormente, se vacía en las macetas y con mucho cuidado se transfieren 
las plántulas, ayudándose de pinzas y espátulas, colocando de una a tres plántulas por maceta. 
Las macetas, así como las charolas en donde se colocan las macetas, deben haber sido 
previamente lavadas y remojadas con HClO4 comercial al 30%. Una vez remojadas, deben ser 
bien enjuagadas con agua de la llave para ser usadas. Durante el crecimiento después del 
trasplante las charolas con macetas se cubren con domos transparentes para mantener la 
humedad y se riegan con medio de Hoagland (ver Apéndice 1) por la orilla de la superficie de 
cada maceta, o bien con un atomizador aproximadamente 2 veces a la semana. Las plantas se 
crecen en el invernadero con un fotoperiodo natural y aire acondicionado o bien con un 
fotoperiodo de 8 h de luz y 16 h de oscuridad a una temperatura de entre 22 a 25 °C. 
 Una vez alcanzada la edad y tamaño deseado (de 2.5 a 4 semanas) se procedea 
cosechar las hojas, cortando con tijeras todas las hojas jóvenes y adultas, pero no tallos ni 
raíces. Se pesan y se guardan en paquetes de 25 g en papel aluminio, congelándolos 
inmediatamente con N2 líquido. Se almacenan en bolsas a -70°C hasta su uso posterior para la 
obtención de vesículas de la membrana plasmática. 
4. Aislamiento y purificación de vesículas de membrana plasmática 
4.1. Obtención de la fracción microsomal 
Las fracciones microsomales o vesículas de las membranas y organelos de la célula se 
obtienen a partir de las hojas congeladas y homogeneizadas, seguido de un fraccionamiento 
subcelular por centrifugación diferencial [Carmona-Salazar y col, 2011]. 
4.2. Obtención de vesículas de membrana plasmática 
Se aislaron a partir de las fracciones microsomales utilizando un procedimiento de 
distribución de las membranas celulares en un sistema de dos polímeros acuosos 
(polietilenglicol y dextrán) de acuerdo a Carmona-Salazar y col [2011]. 
5. Determinación de la proteína por el método de Lowry 
La concentración de proteína en una muestra se realizó mediante un ensayo 
colorimétrico, utilizando una curva estándar con albúmina sérica bovina (BSA) a una 
concentración de 1 mg/ml, desarrollando una reacción de color y midiendo la absorbancia a 750 
nm [Peterson, 1977]. 
21 | P á g i n a
 
6. Determinación de fosfato inorgánico 
Se realizó en tubos de ensayo (previamente lavados con Extran y tratados con ácido 
sulfúrico). Para la realización de la curva patrón, inicialmente se añaden de 1 a 60 μL de 
solución estándar de fosfato 1 mM de K2PO4 llevándolos a un volumen final de 150 μL con agua 
bidestilada, posteriormente se añaden 150 μL de solución A (SDS 24 %). Luego se añaden 300 
μL de solución B/C (molibdato de amonio 2 % y ácido ascórbico 2 %, ambos en HCl 1N en 
relación 1:1, v/v). Se incuba por 3 a 7 min a temperatura ambiente y se añaden 450 μL de 
reactivo E (citrato de sodio 2 %, metarsenito de sodio 2 % y de ácido acético 2 %, todo disuelto 
en agua bidestilada). Se incuba por 20 min para el desarrollo y estabilización del color, y se lee 
su absorbancia a 850 nm. 
7. Determinación de hidrólisis de ATP 
 Tanto los tubos de ensayo como el recipiente contenedor del medio de hidrólisis de ATP 
ya preparado se mantienen en una gradilla colocada en hielo. Para la preparación del medio de 
hidrólisis se deben mezclar los siguientes componentes a concentraciones finales de: 250 mM 
de sacarosa/PIPES 20 mM ajustado a pH 6.5 con BTP (Bis-Tris-Propano), 7 μM CCCP 
(carbonilcianuro-m-clorofenilhidrazona), 0.015 % Brij 58 (v/v), 10 mM MgCl2 y 10 mM de ATP 
(adenosín trifosfato) a pH 6.5. Se colocan tres tubos para cada condición a ensayar: hidrólisis 
total, hidrólisis química (T0) e hidrólisis en presencia de inhibidores. En el último caso, el medio 
se suplementa con inhibidores de diferentes enzimas que hidrolizan ATP y que pudieran estar 
en la muestra membranal (si se usa Na2VO4 se utiliza una concentración final de 200 μM; si se 
usa la mezcla de inhibidores NaN3, Na2MoO4·H2O y KNO3, las concentraciones finales son de 2 
mM, 2 mM y 50 mM, respectivamente). El volumen final en todos los tubos debe ser de 150 μL. 
 
 La reacción se inicia con la adición de 4 μg de proteína al primer tubo con medio de 
hidrólisis, se agita manualmente por unos cuantos segundos y se coloca el tubo en una gradilla 
dentro de un baño maría a 29°C por 20 min cronometrados. Se lleva a cabo el mismo 
procedimiento con todos los tubos que contienen medio de hidrólisis sin o con inhibidores en 
intervalos de 30 s de diferencia entre cada uno. En el caso de la determinación de la hidrólisis 
química sólo se adicionan 150 μL del medio de hidrólisis en cada tubo y se coloca en una 
gradilla a las mismas condiciones que los demás tubos. 
 Pasados los 20 min de incubación, se le adicionan a cada tubo 150 μL de SDS 24 % o 
solución A, agregándose directamente en el interior del tubo cuando éste aún se encuentre en 
el baño maría e inmediatamente se agita con ayuda del vórtex y luego es transferido a una 
22 | P á g i n a
 
gradilla en baño de hielo. Ya detenida la reacción en todos los tubos, se determina el Pi liberado 
en la reacción de hidrólisis de ATP de acuerdo a lo descrito anteriormente. Paralelamente al 
ensayo de hidrólisis de ATP se realiza una curva patrón de determinación de fosfato inorgánico. 
8. Curva temporal de la actividad de hidrólisis de ATP 
En un matraz se preparó el medio para medir la reacción de hidrólisis de ATP a usar, 
añadiéndose a este matraz el volumen correspondiente al número de ensayos que se vayan a 
hacer más un ligero exceso. La composición y concentración de cada uno de los componentes 
del medio de hidrólisis de ATP fue la descrita en el punto 7. En este caso, únicamente se 
realizaron hidrólisis total e hidrólisis química de ATP a diferentes tiempos. Cada uno de los 
tubos a usar debe contener previamente 150 μL de solución A y deben estar colocados en una 
gradilla en baño de hielo. 
La reacción se inicia tomando 150 μL del medio de hidrólisis y agregándolos 
directamente en un tubo de ensayo con solución A, se agita con ayuda del vortex y se coloca de 
nuevo en la gradilla con baño de hielo. Se repite 2 veces el mismo procedimiento, teniendo un 
intervalo de 30 s entre cada tubo. Posteriormente se agregan 4 μg de proteína por cada 150 μL 
de medio de hidrólisis contenidos en el matraz, se agita brevemente y se coloca en baño maría 
a 29°C. Inmediatamente se toman 150 μL de medio de hidrólisis ya con proteína y se colocan 
en un nuevo tubo de ensayo que contiene solución A, se agita con ayuda del vortex y se 
regresa a la gradilla en baño de hielo. Se repite el mismo procedimiento para los tiempos de 5, 
10, 20, 30, 40 y 50 min cronometrados. Una vez detenidas todas las reacciones, se procede a 
determinar el Pi liberado por la reacción de hidrólisis de ATP. Paralelamente a la curva temporal 
se realiza una curva patrón de fosfato inorgánico. 
9. Separación de proteínas en geles de poliacrilamida-SDS 
Las proteínas de las vesículas de membrana plasmática fueron separadas 
electroforéticamente en geles de poliacrilamida-SDS de acuerdo al método descrito por 
Schagger y Von Jagow (1987) como se muestra a continuación. 
I. Limpiar los vidrios utilizados para el gel con SDS 10% o alcohol. 
II. Colocar las placas de vidrio del lado del separador y montarlo con cuidado en el 
soporte, comprobando ausencia de fugas con un poco de agua bidestilada. 
Retirar el agua y secar el interior con ayuda de papel filtro. 
III. Preparación del gel separador. Mezclar en un vaso de precipitados los reactivos 
siguientes en el orden descrito a continuación. 
23 | P á g i n a
 
a) 1631.9 μL de acrilamida-bis acrilamida (10-0.3 %) 
b) 1631.9 μL de amortiguador del gel (Tris 3M –SDS 0.3 %, pH= 8.9) 
c) 660.16 μL de glicerol 
d) 990.98 μL de H2O desionizada 
e) 25 μL de persulfato de amonio 10 % 
f) 2 μL de TEMED (tetrametiletildiamina) 
Inmediatamente verter la mezcla en el espacio entre las dos placas. Una vez 
lleno el espacio, se coloca un poco de SDS al 0.3 % sobre el gel para evitar un 
borde cóncavo y se deja polimerizar aproximadamente 30 min. 
IV. Una vez polimerizado, desechar el SDS y enjuagar con agua. Secar con ayuda 
de papel filtro. 
V. Preparación del gel concentrador. Mezclar los siguientes reactivos en el orden 
descrito. 
a) 264.25 μL de acrilamida-bis acrilamida (10-0.3%) 
b) 495.5 μL de amortiguador del gel (Tris 3M –SDS 0.3 %, pH= 8.9) 
c) 1221.15 μL de H2O desionizada 
d) 25 μL de persulfato de amonio 10% 
e) 2 μL de TEMED (tetrametiletildiamina) 
VI. Agregar un poco del gel concentrador encima del gel separador y colocar el 
peine de 10 pozos introduciendo casi hasta el final del peine. 
VII. Dejar polimerizar entre 45 min y 1 h a temperatura ambiente asegurando que la 
cantidad de gel concentrador llegue al borde de las placas. 
VIII. Unavez polimerizado retirar el peine cuidadosamente para no dañar los carriles. 
IX. Fijar el gel ensamblado entre las placas de vidrio en el soporte de la cámara de 
electroforesis. 
X. Colocar el buffer del cátodo (ver Apéndice 2) en el interior casi hasta arriba de las 
placas de vidrio. 
XI. Cargar un marcador de pesos moleculares comercial en el primer carril del gel 
concentrador y posteriormente las muestras siguientes, cuidando cargar 
cantidades iguales y volúmenes iguales de proteína, ajustando la diferencia en 
volumen con buffer de ajuste de peso. 
XII. Colocar el buffer del ánodo (ver Apéndice 2) dentro de la cámara hasta cubrir la 
mitad de los tornillos inferiores. 
24 | P á g i n a
 
XIII. Colocar la tapa de la cámara de electroforesis cuidando de hacer coincidir los 
extremos del cátodo y ánodo. Conectar a la fuente de poder y dejar correr el gel 
a 50 V por 30 min (para dar tiempo a que las proteínas se apilen en una línea en 
el gel concentrador) y posteriormente a 100 V por 2 a 3 h (se sobrecorre el gel 
para poder visualizar la banda de ATPasa). 
10. Tinción de geles con azul de Coomassie 
Posteriormente a la separación de proteínas por electroforesis se colocó el gel en un 
recipiente de plástico que contenía solución fijadora (ver Apéndice 3) asegurando de que se 
cubriera completamente; se dejó en agitación constante por 2 h a temperatura ambiente. 
Posteriormente se tiñó el gel con solución azul de Coomassie (ver Apéndice 3) por 30 min con 
agitación constante a temperatura ambiente. Finalmente se destiñó con la solución desteñidora 
(ver Apéndice 3) manteniendo en agitación constante hasta que aparecieron las bandas. Se 
almacenó el gel en una solución de glicerol al 5 %. 
11. Secado de geles 
Los geles teñidos se escanearon y posteriormente se secaron para preservarlos. Para 
secarlos el gel se coloca entre una hoja de papel absorbente 3M y papel celofán previamente 
humedecidos, se alisa para eliminar burbujas y se coloca en el equipo GEL DRYER (modelo 
583 Bio-Rad) durante 2 h a 80°C. 
12. Detección de la ATPasa por réplica en Western 
Una vez que las proteínas fueron separadas en geles de poliacrilamida-SDS se 
transfirieron a una membrana de PVDF como se describe a continuación. 
I. Ya que se corrió la electroforesis remover el gel de las placas de vidrio y sin 
fijarlo ni teñirlo, colocarlo en un recipiente con solución amortiguadora de 
transferencia (ver Apéndice 4) de 15-30 min a temperatura ambiente y agitación 
constante. 
II. Colocarlo en un cassette armado que contiene una capa de esponja saturada 
con solución amortiguadora de transferencia, sobre la esponja, colocar un cuadro 
de papel filtro empapado en disolución amortiguadora de transferencia, encima 
del papel, colocar el gel ya incubado en solución amortiguadora de transferencia 
y sobre éste colocar una hoja de de PVDF del tamaño del gel previamente 
humedecida con metanol y solución amortiguadora de transferencia, sobre la 
25 | P á g i n a
 
membrana colocar otro papel filtro humedecido con solución amortiguadora de 
transferencia, luego otra esponja saturada con disolución amortiguadora de 
transferencia y ya al final, cerrar la rejilla del cassette. 
III. Colocar el cassette en la cámara de electrotransferencia de tal manera que el gel 
esté orientado hacia el cátodo y la membrana de PVDF hacia el ánodo. La 
cámara debe tener suficiente solución amortiguadora de transferencia. 
IV. Encender la fuente de poder y realizar la electrotransferencia a 22 volts por 150 
min. Una vez transcurrido este tiempo, apagar la cámara y remover el cassette, 
colocar la membrana de PVDF en un recipiente. Realizar un lavado rápido con 
H2O desionizada y añadir 4 mL del reactivo Pierce® Western Blot Signal 
Enhancer, que se deja actuar por 2 min y después se realizan 5 lavados rápidos 
con H2O desionizada. Una vez realizados los lavados añadir 4 mL del segundo 
reactivo Pierce® Western Blot Signal Enhancer y se deja actuar por 10 min. Al 
finalizar se realizan 5 lavados rápidos con H2O desionizada. 
V. Posteriormente realizar los siguientes sigientes pasos: 
a) Bloqueo: Colocar la membrana en la solución bloqueadora (ver Apéndice 
4) por 1 h en agitación constante a temperatura ambiente. 
Posteriormente realizar 2 lavados, uno con TTBS (ver Apéndice 4) en 
agitación rotatoria por 5 min y posteriormente con TBS (ver Apéndice 4) 
por 10 min. 
b) Primer anticuerpo (ver Apéndice 4): Colocar la membrana en una bolsita 
que contiene el primer anticuerpo durante toda la noche a temperatura 
ambiente en ausencia de luz. Posteriormente realizar 2 nuevos lavados, 
uno con TTBS en agitación rotatoria por 5 min y posteriormente con TBS 
por 10 min. 
c) Segundo anticuerpo (ver Apéndice 4): Colocar la membrana en una 
solución con el segundo anticuerpo por 2 h en agitación constante a 
temperatura ambiente. Posteriormente realizar 3 lavados con TTBS en 
agitación rotatoria por 10 min cada uno y posteriormente uno con TBS 
igual por 10 min. 
d) Revelado: Añadir la mezcla para desarrollar color (ver Apéndice 4), en 
cuanto las bandas se hacen visibles, retirar la solución y se añadir agua 
bidestilada para detener la reacción. 
26 | P á g i n a
 
13. Análisis estadístico 
Cada experimento se realizó un mínimo de 4 veces con al menos 3 preparaciones 
membranales independientes. El análisis estadístico se llevó a cabo en el programa Excel 2010, 
con la función de promedio, error estándar y análisis de varianza de un factor. Este último fue 
calculado para determinar diferencias significativas en 2 muestras, con un valor de α = 0.05. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 | P á g i n a
 
RESULTADOS 
1. Determinación de la hidrólisis química de ATP a diferentes tiempos y 
temperaturas 
Debido a que se realizarían experimentos de determinación de la actividad enzimática a 
diferentes tiempos de reacción y a que en estas condiciones se genera paralela y 
espontáneamente Pi derivado de una hidrólisis no-enzimática del ATP, se midió la producción 
de nmol Pi vía su hidrólisis química. Para ello, esta se determinó a diferentes tiempos a 29°C y 
para determinar su magnitud con respecto a la hidrólisis medida por la enzima, se realizó a la 
par una curva temporal de la hidrólisis producida por la ATPasa de H+. Los resultados obtenidos 
se muestran en la Fig. 11A, en donde se observa que la producción de Pi debido a la ATPasa 
(puntos azules) aumentó progresivamente y de forma lineal con respecto al tiempo. Además se 
observa que la producción de Pi debido a la hidrólisis química (puntos rojos) tuvo un único 
aumento en el tiempo 0, este nivel de Pi generado por hidrólisis química se mantuvo a lo largo 
del tiempo de reacción. 
Debido a que la hidrólisis química depende de la temperatura de reacción y a que en 
este trabajo se iba a medir la actividad de la ATPasa de H+ a varias temperaturas, se midió la 
producción de Pi vía hidrólisis química a las temperaturas de 28, 32, 36 y 40 °C durante 20 min 
de reacción. En la Fig. 11B se muestran los resultados obtenidos, los cuales indican que la 
hidrólisis química no varió en el rango de temperaturas evaluado por los 20 min de reacción 
llevados a cabo. 
2. Determinación de la actividad de hidrólisis de ATP de las plantas de los 
genotipos silvestre y sbh1-1 
Anteriormente, experimentos de medición de actividad de ATPasa de H+ en vesículas 
purificadas de membrana plasmática demostraron que la línea mutante sbh1-1 de Arabidopsis 
thaliana con un 30% menos de esfingolípidos trihidroxilados tenía una actividad 20% menor 
respecto a la actividad de la enzima de las plantas silvestres [Peña-Moral, 2015]. En este 
trabajo previo, la actividad obtenida era dependiente del grado de purificación de las 
membranas plasmáticas en las que se determinó la actividad de la ATPasa de H+. Por ello, 
procedimos primeramente a determinar las actividades de hidrólisisde ATP en preparaciones 
actuales obtenidas en condiciones de purificación ya estandarizadas para ambas líneas. 
28 | P á g i n a
 
 
Fig. 11A. Determinación del Pi producido por hidrólisis química y enzimática del ATP. La hidrólisis de ATP fue 
determinada a 29°C en ausencia de membranas, hidrólisis química (rojo) y en presencia de membranas (4 μg), 
hidrólisis enzimática (azul), a diferentes tiempos de reacción. Se presentan los valores promedio ± EE 
correspondientes a cinco determinaciones llevadas a cabo con tres preparaciones membranales independientes. 
 
 
Fig. 11B. Determinación del Pi producido por la hidrólisis química a diferentes temperaturas de reacción. La hidrólisis 
de ATP fue determinada a 29 °C, 32 °C, 36 °C y 40 °C en ausencia de membranas y medida durante 20 min de 
reacción. Se presentan los valores promedio ± EE correspondientes a ocho determinaciones llevadas a cabo con 
cuatro preparaciones de ATP independientes. 
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60
n
m
o
l P
i 
Tiempo de reacción (min) 
Hidrólisis enzimática
Hidrólisis química
0
5
10
15
20
25
30
28 32 36 40
n
m
o
l P
i 
Temperatura de reacción (°C) 
Hidrólisis química
29 | P á g i n a
 
 
Fig 12. Determinación de la actividad de hidrólisis de ATP en las plantas wt y sbh1-1. Se determinó la hidrólisis de 
ATP en vesículas de membrana plasmática de las plantas de los dos genotipos a 29 °C y durante 20 min de 
reacción. Se presentan los valores promedio ± EE correspondientes a seis determinaciones llevadas a cabo con tres 
preparaciones membranales independientes. El asterisco indica diferencia significativa del valor con respecto al de la 
silvestre según la prueba de análisis de varianza (α=0.05). 
 
 
En la Fig. 12 se muestran los resultados de la determinación de la actividad de ATPasa 
de H+ de la membrana plasmática para ambos genotipos. Se observa la correspondencia con 
los resultados anteriores, siendo la actividad de la línea silvestre (azul) aproximadamente 100 
nmol Pi mg-1 min-1, mientras que la línea mutante (roja) un 20 % menor. 
3. Respuesta de la actividad de la enzima a la temperatura en condiciones no 
catalíticas 
 
Ya que comprobamos la diferente actividad entre ambas líneas, se analizó la estabilidad 
de la enzima en condiciones no catalíticas (condiciones en ausencia de sustrato). Esto se hizo 
incubando a la enzima en el medio de reacción pero sin su sustrato por diferentes tiempos, para 
posteriormente agregar el sustrato (ATP/Mg2+) e iniciar la reacción por 20 min a 29 °C. En la 
Fig. 13A se muestran estos resultados, en los que la actividad de ATPasa de H+ de la 
membrana plasmática de la línea silvestre permaneció constante durante los 40 min de 
incubación. Lo mismo ocurrió con la actividad de la enzima de las plantas de la línea mutante, 
solo que es este caso la actividad de la enzima fue 35 % menor. 
0
20
40
60
80
100
120
A
ct
iv
id
ad
 (
n
m
o
l P
i m
g-
1 
m
in
-1
) 
Genotipos 
wt
sbh1-1
* 
30 | P á g i n a
 
 
Fig. 13A. Curso temporal de la actividad de la ATPasa de H
+
 de las plantas con los genotipos wt y sbh1-1 a 29 °C y 
con condiciones previas de incubación sin sustrato. La incubación consistió en calentar el medio de reacción con las 
vesículas de membrana plasmática a 29 °C por 6 diferentes tiempos: 0, 5, 10, 20, 30 y 40 min. Posteriormente se 
determinó la hidrólisis de ATP en vesículas de membrana plasmática de las plantas de los dos genotipos a 29 °C por 
20 min. Se presentan los valores promedio ± EE correspondientes a cuatro determinaciones llevadas a cabo con tres 
preparaciones membranales independientes. 
 
Al encontrar que la incubación de la enzima en condiciones no catalíticas a 29 °C no 
producía cambios en la reacción de la enzima con el sustrato en ninguno de los dos genotipos, 
se probó una temperatura mayor en la misma condición de incubación (sin la inclusión del 
sustrato previamente a la reacción de hidrólisis de ATP). Para ello, se tomó la temperatura de 
36 °C y se repitieron los mismos tiempos de incubación. La Fig. 13B muestra como la actividad 
de la línea silvestre disminuyó paulatinamente al aumentar el tiempo de incubación hasta una 
disminución del 20 % a los 40 min. La actividad de las membranas de la línea sbh1-1 también 
presentó una disminución de 45 % de actividad a los 40 min. En ambos casos, la actividad 
disminuyó no linealmente, en un patrón bifásico con dos pendientes diferentes, presentándose 
un mayor decremento de la actividad en los primeros 20 min de la incubación. 
Ya que ambos genotipos presentan niveles de actividad diferentes, con objeto de 
comparar la proporción de la inhibición de cada genotipo, se calculó la actividad relativa para 
ambos genotipos. Para ello, se tomó como un 100 % la actividad obtenida a los 0 min de 
incubación. Los resultados se observan en la Fig. 13C en la que los valores experimentales de 
la actividad muestran que a 29 °C no había diferencias en la actividad a lo largo del tiempo de 
incubación para ninguno de los dos genotipos. Sin embargo, a 36 °C se encontró una clara 
disminución en la actividad de la enzima de ambos genotipos, con la diferencia de que mientras 
esta pérdida de actividad alcanzó un máximo del 20 % en el genotipo silvestre, en la línea 
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 10 20 30 40 50
A
ct
iv
id
ad
 (
n
m
o
l P
i /
 m
g 
m
in
 )
 
Tiempo de incubación (min) 
wt
sbh1-1
31 | P á g i n a
 
mutante la disminución de la actividad fue de un 45 %. Además, la actividad en este caso 
disminuyó con mayor rapidez que en el genotipo silvestre. En ambos genotipos podemos 
observar una disminución máxima a los 30 min de incubación, y en tiempos posteriores se 
mantuvo la misma actividad. 
 
Fig. 13B. Curso temporal de la actividad de la ATPasa de H
+
 de las plantas con los genotipos wt y sbh1-1 a 29 °C y 
con condiciones previas de incubación sin sustrato. La incubación consistió en calentar el medio de reacción con las 
vesículas de membrana plasmática a 36 °C por 6 diferentes tiempos: 0, 5, 10, 20, 30 y 40 min. Posteriormente se 
determinó la hidrólisis de ATP en vesículas de membrana plasmática de las plantas de los dos genotipos a 29 °C por 
20 min. Se presentan los valores promedio ± EE correspondientes a cuatro determinaciones llevadas a cabo con tres 
preparaciones membranales independientes. 
 
 
Fig 13C. Curso temporal de la actividad relativa de la ATPasa de H
+
 de las plantas con los genotipos wt y sbh1-1 a 
diferentes temperaturas. Los datos gráficos se tomaron de los de las Figs. 13A, B. El 100 % en cada curva 
corresponde a la actividad determinada en el tiempo cero de exposición a la temperatura indicada. Actividad de la 
enzima de las plantas wt a 29 °C (Δ azul) y a 36 °C (Δ verde). Actividad de la enzima de las plantas sbh1-1 a 29 °C 
(□ rojo) y a 36 °C (□ morado). 
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 10 20 30 40 50
A
ct
iv
id
ad
 (
n
m
o
l P
i m
g-
1 
m
in
-1
) 
Tiempo de incubación (min) 
wt
sbh1-1
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
A
ct
iv
id
ad
 R
e
la
ti
va
 (
%
) 
Tiempo de incubación (min) 
wt 29 °C
sbh1-1 29 °C
wt 36 °C
sbh1-1 36 °C
32 | P á g i n a
 
4. Respuesta de la actividad de la enzima a la temperatura en condiciones 
catalíticas. 
Para explorar si la temperatura afectaba a la enzima de ambos genotipos en condiciones 
catalíticas, se estudió la actividad de la ATPasa de H+ a 4 diferentes temperaturas de reacción 
durante 20 min de reacción. En la Fig. 14 se muestra la actividad de la ATPasa de H+ de la 
membrana plasmática obtenida de ambos genotipos a diferentes temperaturas de reacción. En 
el caso del genotipo silvestre, se encontró que a medida de que aumentaba la temperatura, 
aumentaba la actividad enzimática, 20 % y 50 % a los 32 y 36 °C, respectivamente, con 
respecto al control, que en este caso fue la actividad a 28 °C. Sin embargo,al llegar a 40 °C, se 
presentó una disminución de 25 % de actividad con respecto a la actividad a 36 °C. En la línea 
sbh1-1 se observó que igualmente la actividad aumentó un 20 % y 30 % a los 32 y 36 °C, 
respectivamente, con respecto al control. Pero en este caso, la actividad a 40 °C no disminuyó 
como en el caso del genotipo silvestre, sino que aumentó un 80 %. 
 
Fig. 14. Efecto de la temperatura en la actividad de ATPasa de H
+
 de las plantas con los genotipos wt y sbh1-1 a 
diferentes temperaturas de reacción. La hidrólisis de ATP se determinó en las vesículas de membrana plasmática 
purificadas de las plantas con los genotipos indicados. La actividad se inició con la adición de sustrato y durante 20 
min, tiempo en el que la temperatura fue la indicada. Se presentan los valores promedio ± EE correspondientes a 
cinco determinaciones llevadas a cabo con tres preparaciones membranales independientes. El asterisco indica 
diferencia significativa del valor con respecto al de la silvestre según la prueba de análisis de varianza (α=0.05). 
5. Análisis energético de la reacción de hidrólisis de ATP 
A partir de los valores de actividad obtenidos a las diferentes temperaturas, se procedió 
a hacer el análisis energético de la reacción de hidrólisis de ATP por la enzima de ambos 
genotipos. Para ello, los datos de actividad fueron tratados con la ecuación de Arrhenius, 
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
28 32 36 40
A
ct
iv
id
ad
 (
n
m
o
l P
i m
g-
1 
m
in
-1
) 
Temperatura de reacción (°C) 
wt
sbh1-1
* 
* 
33 | P á g i n a
 
obteniéndose los valores de la energía de activación (Ea) y la constante de Arrhenius (A). En la 
Fig. 15 se muestran las gráficas de Arrhenius que describen el comportamiento de la reacción 
de hidrólisis de ATP llevada a cabo por la ATPasa de H+ de acuerdo a los parámetros de la 
gráfica de Arrhenius. En ambos casos se graficaron los valores los valores de actividad a las 
temperaturas de 28, 32, 36 y 40 °C. En el caso de la actividad de las plantas wt, solo tres de los 
cuatro puntos experimentales se alinearon y dieron muy buen ajuste a una recta, pero el valor 
de 40 °C se desvió totalmente de la misma. Esto corresponde al único valor de actividad que 
aumentó respecto a los controles. En el caso de los valores de la línea mutante, los cuatro 
puntos dieron una recta también con muy buen ajuste. Se muestra que la actividad de la enzima 
en las membranas plasmáticas purificadas de ambas líneas presentó prácticamente una 
pendiente idéntica, lo cual se asocia a un mismo comportamiento de la enzima. De los datos de 
la Fig. 15 se obtuvieron los valores de Ea y de la constante de Arrhenius, los cuales se 
muestran en la Tabla 1. Al comparar los valores obtenidos podemos apreciar una mínima 
variación de la Ea, que se puede asociar a un mismo comportamiento enzimático. Sin embargo, 
al comparar las constantes de Arrhenius observamos que la enzima del genotipo silvestre 
presenta prácticamente el doble del valor de la constante de Arrhenius obtenida de la enzima 
del genotipo sbh1-1. 
 
Fig 15. Gráfica de Arrhenius de la reacción de hidrólisis de ATP de la ATPasa de H
+
 de la membrana plasmática de 
las plantas de los genotipos silvestre y sbh1-1. Se determinó la actividad de la ATPasa a las temperaturas de 28, 32, 
36 y 40 °C por un tiempo de 20 min, se tomaron los valores de actividad de la Fig 14 para el análisis. 
 
y = -1928.1x + 8.3891 
R² = 0.9999 
y = -2210.2x + 9.2327 
R² = 0.9966 
1.85
1.90
1.95
2.00
2.05
2.10
2.15
2.20
0.0032 0.0032 0.0032 0.0032 0.0033 0.0033 0.0033 0.0033 0.0033
lo
g 
V
 
1/T (K-1) 
wt
sbh1-1
wt 40°C
34 | P á g i n a
 
Tabla 1. Energía de activación y constante de Arrhenius para la reacción de hidrólisis de ATP por la ATPasa de H
+
 de 
la membrana plasmática de las plantas con los genotipos silvestre y sbh1-1. Los valores mostrados se calcularon a 
partir de la Fig. 15. Ea es Energía de activación. A es constante de Arrhenius. 
 
 
 
 
6. Determinación de la cinética de hidrólisis de ATP para ambas líneas de 
Arabidopsis thaliana 
Con objeto de obtener más información sobre la catálisis llevada a cabo por las enzimas 
de las plantas con los dos genotipos en estudio, se determinaron las constantes cinéticas de la 
reacción de hidrólisis de ATP para ambas enzimas. En la Fig. 16 se muestran las gráficas que 
describen el comportamiento cinético de la reacción de hidrólisis de ATP llevado a cabo por la 
ATPasa de H+ de membranas plasmáticas purificadas de ambas líneas de Arabidopsis thaliana. 
Los datos experimentales fueron sometidos al ajuste descrito por la ecuación de Michaelis-
Menten (en azul), ya que previamente se había demostrado que la línea silvestre presentaba un 
patrón michaeliano [González-Reyes, 2010], e igualmente a un ajuste descrito por la ecuación 
de Hill (en rojo), ya que en la literatura existe evidencia de que la enzima puede oligomerizarse 
e inclusive tener cooperatividad negativa [Roberts y col, 1995; Sánchez-Nieto y col, 2011]. Se 
observó que ambas enzimas alcanzaron la saturación casi asintóticamente desde 
aproximadamente 6 mM del sustrato ATP/Mg2+. 
De las gráficas ajustadas al modelo de Michaelis-Menten se obtuvieron los valores de 
Vmax y Ks. De las gráficas ajustadas al modelo de Hill se obtuvieron los valores de Vmax, K’ y el 
número de Hill (n), el cual refleja la cooperatividad. Un número de Hill mayor a 1 indica que la 
enzima tiene cooperatividad positiva y menor a 1 indica cooperatividad negativa. En caso de 
que el número de Hill sea igual a 1 indica que la enzima no tiene cooperatividad y por tanto 
tiene un comportamiento michaeliano. 
Mientras los valores de actividad de la enzima de la línea silvestre tuvieron un ajuste 
michaeliano como se esperaba, la actividad de la enzima de la línea mutante presentó un mejor 
ajuste al modelo de Hill. 
Los ajustes hiperbólico y sigmoidal se llevaron a cabo en el programa Origin 5.0 Data 
Analysis and Graphing Software®. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Se observaron 
 wt sbh1-1 
Ea (kcal/mol) 8.8119042 10.1010852 
A (dm3/mol s) 4398.81 10226.15 
35 | P á g i n a
 
valores similares para la Ks de ambas líneas, sin embargo, se puede denotar una clara 
disminución en el valor de Vmax de aproximadamente un 55 % en la línea mutante con respecto 
a la línea control. 
 
 
Fig 16. Comportamiento cinético de la reacción de hidrólisis de ATP de la ATPasa de H
+
 de la membrana plasmática 
de las plantas de los genotipos silvestre (A) y sbh1-1 (B). Las determinaciones fueron sometidas a 2 tipos de ajustes: 
(−) ajuste hiperbólico (modelo de Michaelis-Menten) y (−) ajuste sigmoidal (Modelo de Hill). Se determinó la actividad 
de ATPasa a las concentraciones de sustrato indicadas, por un tiempo de 20 min y a una temperatura de 29 °C. Los 
ajustes se realizaron con el programa Origin 5.0 Data Analysis and Graphing Software®. 
36 | P á g i n a
 
Tabla 2. Constantes catalíticas de la reacción de hidrólisis de ATP por la ATPasa de H
+
 de la membrana plasmática 
de las plantas con los genotipos silvestre y sbh1-1. Las constantes se calcularon a partir de los valores de las 
gráficas de la Fig. 16 y ajustándose a la ecuación de Michaelis-Menten y ecuación de Hill con el programa Origin 5.0 
Data Analysis and Graphing Software®. Se presentan los promedios ± DE. 
 
Parámetro cinético 
Genotipos de Arabidopsis thaliana 
wt sbh1-1 
Michaelis- 
Menten 
Vmax (nmolPi mg
-1
 min
-1
) 168.205 ± 10.383 70.2 ± 4.626 
Ks (mM) 2.05 ± 0.365 1.673 ± 0.368 
Vmax/Ks (s
-1
) 13.67x10
2 
± 474 6.99x10
2
 ± 209 
Hill 
Vmax (nmolPi mg
-1
 min
-1
) 169.291 ± 21.22 82.743 ± 19.42 
K' (mM) 2.008 ± 0.469 1.923 ± 0.782 
n 0.968 ± 157 0.678 ± 0.161 
Vmax/K' (s
-1
) 14.05x10
2 
± 754 7.17x10
2
 ± 413 
 
7. Determinación de los niveles de ATPasa de H+ en las vesículas de la 
membrana plasmática de plantas silvestre y línea