Unidad 7 Agentes Físicos

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ACCIÓN DE LOS AGENTES FÍSICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS
El control de los microorganismos patógenos se puede realizar por medio del uso de los agentes físicos. La esterilidad indica la ausencia TOTAL de formas viables de MO. No existen grados de esterilidad, es un término absoluto. Es importante destacar que no todos los procedimientos que impliquen el uso de agentes físicos, están destinados a inhibir el desarrollo microbiano, por ejemplo: algunos agentes físicos pueden utilizarse para conservar MO, para inhibir determinados patógenos sin afectar otras formas microbianas, para aislar por medio de filtros, entre otros.
1. CALOR 
Actúa por desnaturalización de proteínas y contribuye a la fusión de lípidos de membranas. Es el método más confiable y universalmente aplicado para la esterilización. La destrucción de una población bacteriana por medio del calor es un proceso gradual y la cinética de destrucción es exponencial. El tiempo requerido para la esterilización está relacionado con la temperatura de exposición. 
Punto térmico letal: Es la temperatura más baja en la cual muere una población bacteriana en determinado tiempo. 
Tiempo térmico letal: Es el menor tiempo necesario para matar el 100 % de una población de MO a determinada temperatura y bajo condiciones específicas del medio.
Reducción decimal de tiempo: Es el tiempo en minutos necesario para matar el 90 % de la población. 
Calor seco corresponde al fuego directo y al aire caliente y calor húmedo es producido por la ebullición, el vapor de agua a presión (autoclave), la tindalización y la pasteurización.
Mecanismos de la lesión térmica 
CALOR HÚMEDO
El efecto letal del calor húmedo sobre los MO se atribuye a la desnaturalización y coagulación de las proteínas (ya que se rompen los puentes de hidrógeno). Las proteínas en soluciones más diluidas coagulan a menor temperatura que las concentradas. Existen rupturas en la cadena de ADN.
CALOR SECO. 
Actúa oxidando los constituyentes intracelulares. Son prioritarios los procesos oxidativos de las proteínas, fusión de membranas y los efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos, por sobre la desnaturalización. En ausencia de agua, el número de grupos polares de una cadena peptídica, es menor y requiere más energía para abrir las moléculas, por lo cual resulta menos eficiente que el calor húmedo. Así, con calor seco se requieren mayores temperaturas y debido a la lentitud del transporte del calor (convección), se requieren mayores tiempos para producir la muerte microbiana.
Ejemplo que pone en evidencia estas diferencias: un cultivo esporulado de Bacillus anthracis, se destruye con calor húmedo a 120ºC en 20 minutos, mientras que con calor seco se necesitan una hora a 170ºC, o dos horas a 160ºC.
ESTERILIZACION.
Definición: es un estado absoluto que indica la falta total de formas viables. -Calor seco Directo-Incineración Este método se emplea para destruir animales de laboratorio infectados, esqueletos y materiales de desecho, en hornos crematorios. Esterilización con la llama del mechero de Bunsen, se emplea en forma rutinaria para esterilizar el ansa del mango de Kolle, antes y después de efectuar una siembra. Las ansas y otros utensilios metálicos se someten a la llama directa hasta calentarse al rojo. Flameado, pasando dos o tres veces por la llama del mechero de Bunsen varillas de vidrio, bocas de tubos, frascos y similares. Este mismo método pasando los objetos por la llama, es útil para esterilizar material de necropsia, como tijeras y pinzas que se sumergen previamente en alcohol y se dejan flamear fuera de la llama del mechero para evitar que se destemplen. Estos métodos son instantáneos y no mantienen la esterilidad en el tiempo.
Indirecto-Hornos
Se da por calor seco o aire caliente mediante hornos de esterilización. 
Para esterilizar se requieren: 160ºC por dos horas, o 170ºC durante una hora 
Usos
Para elementos de vidrio o de metal 
No se emplean
Para material de caucho, papel o telas porque se queman, ni tampoco para medios de cultivo. 
Dentro de un horno no ventilado se produce una estratificación del calor. La temperatura más alta se encuentra en la bandeja inferior y la más baja en la bandeja superior. Esto se debe tener en cuenta cuando se acopian grandes cantidades de materiales; para unificar las temperaturas se utiliza un sistema de ventilación forzada.
 
Calor húmedo a presión: Autoclave (¡!)
· Relación entre presión, volumen y temperatura 
El agua con presión atmosférica aumenta considerablemente su volumen al pasar al estado gaseoso; en el autoclave no sucede por sus paredes, con lo cual se incrementa la presión interna, y al hacerlo, el agua deja de ebullir y por el momento se establece un equilibrio, el que no es más que un nuevo punto de ebullición del agua a esa presión. Entonces se necesita otra vez cierta cantidad de calor para producir más vapor, y como consecuencia aumentar la presión. 
Esta situación se repetiría hasta que estallaran las paredes, lo cual se evita con una válvula de seguridad que a cierta presión deja escapar el vapor, o bien, suprimiendo el suministro de calor del autoclave.
Si se suprime el suministro de calor, el vapor se enfría, se condensa y, al reducirse el volumen (por convertirse el vapor en agua) desciende la presión y la temperatura.
En resumen, dado que el volumen se mantiene constante, se puede controlar la presión mediante el calor entregado.
 
· Condiciones ideales 
El volumen debe permanecer constante para que se la relación entre presión y temperatura no varíe. Esto sólo se cumple cuando el gas es vapor de agua saturado, cuando no hay condensaciones bruscas y hay buena circulación del vapor dentro del autoclave. Si esto se logra, se estaría cumpliendo con las condiciones ideales de una autoclave:
· Absoluta uniformidad de temperatura dentro de la autoclave en cualquier momento y
· Control completo y constante de la relación tiempo-temperatura. 
· Autoclave 
El modelo clásico es el de Chamberland: constituido por una caldera de cobre batido y estañado internamente, sostenido por una camisa metálica. En su parte inferior lleva una fuente calórica, gas o electricidad. En la parte superior lleva una tapa que debe poseer los siguientes elementos:
· Termómetro: rango de 100 a 200ºC.
· Manómetro: expresado en libras/pulgada cuadrada, en kg/cm2, o en atmósferas. (A veces estos dos se encuentran en un solo indicador).
· Una espita que sirve para eliminar el aire durante el calentamiento, proceso denominado purga. 
· Una válvula de seguridad que permite el escape del vapor, cuando excede la presión adecuada. 
En el interior de la autoclave se encuentra un enrejado y lámina cribada, sobre la cual se apoya el material a esterilizar. 
· Manejo 
1) Colocar agua corriente hasta el nivel de la lámina cribada. Es importante cambiar el agua y realizar la limpieza del interior de la camisa en forma periódica. 
2) Sobre la rejilla o lámina cribada se colocan ordenadamente los elementos a esterilizar, dejando espacios entre ellos para permitir la circulación del vapor. 
3) Cerrar el autoclave ajustando las mariposas de a pares, diametralmente opuestas. 
4) Abrir la espita y controlar la apertura de la válvula de seguridad.
5) Conectar la fuente calórica. El vapor de agua irá desalojando el aire, el cual saldrá por la espita.
6) Dejar que salga vapor por la espita, hasta que el chorro sea continuo: esto significa que el autoclave está purgado.
7) Cerrar la espita y dejar que suba la temperatura hasta 121º C (está a 1 atm respecto del ambiente, o 2 atm absolutos). A partir de aquí se regula la fuente calórica para que la temperatura se mantenga constante y se cuentan los 15 a 20 minutos que durará la esterilización. 
8) Cumplido este tiempo, cerrar la fuente calórica y dejar enfriar hasta que temperatura y presión lleguen a cero. De no ser así, la descompresión rápida puede provocar la ebullición y derrame de los medios de cultivo o fisuras en el material de vidrio.
9) Abrir la espita para que entre aire al autoclave y abrir la tapa.Los materiales se retiran con guantes protectores (y sino, quemate por boludo xD) y se ponen a secar en horno o se llevan a control en estufas. No dejar el autoclave cerrada con materiales adentro.
10) Identificar el material estéril, preferentemente con la fecha.
Ventajas del calor húmedo
· Rápido calentamiento
· Buena penetración
· Corto tiempo de esterilización
· Bajo deterioro del material expuesto (por menor temperatura y menor tiempo)
· No deja residuo tóxico
· Económico
Elementos a esterilizar: Medios de cultivos, soluciones, recipientes contaminados, material de goma y todo elemento que no resista las altas temperaturas del calor seco.
 
· Controles de esterilización (¡!)
· Control químico: Se introducen papeles que contienen sustancias que a determinada temperatura cambian de color (generalmente a 120 ºC). Se venden como cintas adhesivas y a su vez, sirven para cerrar paquetes. El cambio de color de la cinta, indica que se llegó a la temperatura indicada. 
· Desventaja: indican que se ha llegado a 120°C, pero no el tiempo durante el cual se mantuvo esa temperatura.
 
· Control biológico: el más seguro, consiste en introducir entre los elementos a esterilizar un tubo con un trozo de papel de filtro o un hilo, embebido en un cultivo de un microorganismo esporulado, resistente a altas temperaturas como es el Geobacillus stearothermophilus, fácil de cultivar. Luego de la esterilización se lleva el papel de filtro o el hilo a un medio de cultivo y se incuba 48 h (o más) a 60ºC. La falta de desarrollo indicará que la esterilización ha sido correcta. 
También el papel de filtro embebido con el cultivo esporulado, viene en ampollas que tienen un indicador de pH, como el púrpura de bromocresol, que vira al amarillo si el microorganismo es capaz de crecer. 
· Desventaja: tener que esperar 24 h antes de poder usar los materiales procesados. 
 
· Control físico: el sistema más eficaz es el de termocupla. Consiste en un electrodo ubicado en el interior del autoclave que va conectado por fuera a una aguja inscriptora que registra en un gráfico la temperatura en función del tiempo de esterilización. Cualquier variación de temperatura por debajo de la necesaria se debe agregar como tiempo extra de esterilización. 
· Ventaja: el control de temperatura y presión se registra simultáneamente con el proceso de esterilización.
Mantenimiento de la autoclave
Se debe realizar un mantenimiento periódico para lograr el correcto funcionamiento. 
· Cambiar el agua y limpiar el interior una vez cada quince días.
· Controlar la válvula de seguridad, espita y manómetro.
· Supervisar el estado de la fuente calórica, y de las mangueras si son a gas.
· Revisar el estado de la junta de cierre y de las mariposas. 
· Control anual de prueba hidráulica. 
 
Entonces: ¿Qué es lo más importante del divinísimo autoclave? Los PARÁMETROS!!!
Se esteriliza durante 15 a 20 minutos a 121ºC y a 1 atm por ENCIMA de la presión ambiental.
Calor húmedo sin presión
· Ebullición
A 100 ºC a nivel del mar; se destruyen en 10 min las formas vegetativas de la mayoría de las bacterias y algunos virus. Las esporas y ciertos virus no son inactivados. 
Es un método útil para higienizar o disminuir la carga bacteriana en forma rápida y con equipo sencillo ciertos elementos como jeringas, utensilios varios y aún instrumental de cirugía en casos extremos. 
· Tindalización (¡!)
También conocido como esterilización fraccionada. Consiste en tres calentamientos de 60-80ºC durante 30 min, separado por dos incubaciones a 37 ºC durante 24 h.
Con el primer calentamiento se destruyen las formas vegetativas del medio a esterilizar. Con la incubación las esporas presentes pasan a formas vegetativas que se destruyen con el segundo calentamiento. Este se repite para asegurar la esterilización.
Usos: Sobre elementos en los cuales la alta temperatura pueda alterar sus propiedades,
como por ejemplo hidratos de carbono o leche.. 
Inconveniente: El tiempo que demora, por lo cual es poco usado en el laboratorio. 
· Pasteurización (¡!)
Método de higienización mediante el cual se reduce la carga bacteriana en ciertos productos. No es una técnica de esterilización, ya que se eliminan solamente las formas vegetativas de los microorganismos. Se aplica a sustancias que no toleran la temperatura de esterilización sin perder sus caracteres organolépticos. Pasteur la empleó por primera vez en la conservación de vinos y actualmente se utiliza sobre todo en la industria de la alimentación (leche y derivados, vino, cerveza). Para establecer la temperatura y tiempo adecuados, se tiene en cuenta la resistencia de los patógenos que con mayor frecuencia se encuentran en el producto. 
La leche puede transmitir patógenos que son importantes en la salud pública, como Mycobacterium bovis, y algunos parásitos. Para evitar este problema tan serio, se determinó por ley la obligatoriedad de pasteurizar la leche.
Hay varios tipos de pasteurización:
 Baja 62ºC - 30 minutos
 
 Alta 72ºC - 15 segundos
Estas temperaturas solamente reducen la carga de microorganismos por lo que no se deben descuidar las medidas de higiene que buscan evitar la contaminación previa o posterior al proceso.
· Uperización (UHT)
El calentamiento o temperatura ultraelevada comprende: 
· Calentamiento indirecto: 6-10 segundos a 135°C-150°C
· Calentamiento directo: 2-3 segundos a 140°C-150°C
Con este método mueren las formas vegetativas, pero pueden sobrevivir esporas. Ergo, no es esterilización.
Radiaciones Electromagnéticas (¡!)
Las hay de alta energía o ionizantes y de baja energía o no ionizantes.
 
· Radiaciones ionizantes 
Comprende a los rayos alfa, beta, gamma y Röntgen (Rayos X).
Mecanismo de acción:
Empujan los electrones fuera de las moléculas, ionizándolos, mediante una reacción en cadena. Cuando estas radiaciones pasan a través de las células se produce hidrógeno libre, radicales hidroxilo y algunos peróxidos que ocasionan diferentes tipos de daño intracelular. Son poco específicas en sus efectos pero tienen alto poder de penetración. 
Se denomina esterilización fría, dado que se produce relativamente poco calor en el material que se irradia. Así, es posible aplicarlas a sustancias sensibles al calor.
De este grupo los rayos X son letales para los microorganismos y formas superiores de vida, pero no son prácticos para esterilizar por su elevado costo de producción en cantidades suficientes y ser difíciles de manejar porque las radiaciones salen en todas direcciones a partir del punto de origen.
Los rayos gamma tienen mucha energía y son los más usados; son emitidos por ciertos isótopos radiactivos como el cobalto 60 (60Co). Son similares a los anteriores pero de longitud de onda más corta. Resultan cómodos para esterilizar objetos sensibles al calor, como jeringas de plástico o materiales de considerable espesor o volumen. Sin embargo se debe contar con una fuente de radiaciones adecuada y controlada, que no afecte al operador ni elimine radiactividad al medio.
 
· Radiaciones no ionizantes 
Comprende a las radiaciones ultravioletas (UV) e infrarrojas (IR). La porción UV incluye radiaciones desde 150 a 3900 Å; la luz solar tiene acción microbicida pero en grado limitado.
 
Mecanismo de acción
La luz UV es absorbida sobre todo en las bases pirimídinicas, donde forma dímeros entre 2 bases vecinas de timina, los que inhiben la replicación del DNA. 
Estas lesiones del DNA resultan letales, pero pueden ser reparadas por:
a. Foto-reactivación: por acción de luz UV de mayor longitud de onda o de la luz visible (de menor longitud de onda) se reactiva una enzima intracelular que rompe el enlace del dímero de timina, volviendo las bases pirimidínicas a su estado original. 
b. Reparación en la oscuridad: manteniendo la suspensión bacteriana unas horas en frío o en medio de crecimiento escaso, se producen dos fases de reparación: degradación y eliminación del dímero, y posterior reconstrucción de la polimerasa del DNA.
c. Reparación por recombinación:en el caso de las bacterias que no pueden repararse por los mecanismos anteriores, la presencia de dímeros no dificulta su replicación. Las nuevas cadenas de DNA forman fragmentos, dejando un hueco cada vez que alcanza un dímero, estos huecos desaparecen luego del entrecruzamiento entre las nuevas cadenas. 
Las lámparas UV son de uso difundido en quirófanos, salas de envasado de vacunas y ambientes en general. 
En cuanto a la radiación IR es inocua a las sustancias químicas y, por lo tanto, a los microorganismos.
Óxido de etileno
Si bien el óxido de etileno es una agente químico, se lo incluye en este apartado ya que se emplea como esterilizante. 
El óxido de etileno es un gas muy soluble en agua y explosivo. Al igual que el formol actúa como agente alquilante, sustituyendo los átomos de hidrógeno en radicales NH2, OH, COOH y HS de las proteínas, combinándose en forma irreversible y desnaturalizándolas. Es muy eficaz tanto frente a formas vegetativas como esporuladas. Sirve para superficies secas, pero su acción es más lenta que el vapor y más costosa. Además, resulta peligroso por ser explosivo y por su acción como tóxico residual. 
Usos
Para esterilizar objetos sensibles al calor, no es corrosivo sobre los metales y equipos quirúrgicos. Su empleo puede hacerse con o sin autoclave de óxido de etileno (también denominado estufa de óxido de etileno). 
· Con autoclave: Se lleva hasta una concentración 1,5% y la presión que indica el manómetro debe ser subatmosférica para que no explote. La fuente calórica a 41°C. Esta es la temperatura de difusión del óxido de etileno. Si es mayor, estalla y si es menor, no esteriliza pues no difunde. Se deja funcionando entre 18 y 24 horas, se apaga, se enfría y se abre. Se espera 24 horas antes de ser usados.
· Sin autoclave: Se coloca dentro de una bolsa de espesor mayor de 100 µm, colocando en su interior una ampolla de óxido de etileno y lo que se quiera esterilizar. Así se coloca en una estufa a 41°C, se rompe la ampolla, presionando por fuera de la bolsa. Luego de 24 horas está el material estéril, pero hay que esperar otras 24 horas antes de poder utilizar el contenido por los residuos tóxicos.
Filtración
 
Es el pasaje de un fluido a través de una sustancia porosa que retiene los microorganismos contenidos en él. Este medio es un material fibroso o poroso que contiene poros interconectados entre sí de manera de permitir el paso del fluido.
· Mecanismos que interactúan en la retención de partículas:
1. Intercepción directa o tamiz: Si las partículas en el fluido son mayores que los poros o aberturas en el medio filtrante, ellas serán retenidas como resultado de la intercepción directa por dichos poros. 
2. Mecanismo de inercia: Las partículas en un fluido en movimiento tienen masa y velocidad, por lo tanto una cantidad de movimiento asociado a ella, a medida que el líquido y las partículas pasan a través del medio filtrante la vena fluida seguirá la trayectoria de menor resistencia al flujo y se desviará alrededor de la fibra. Una partícula impulsada por la vena fluida, debido a su masa y velocidad, no sigue el trayecto de ésta e impacta con la fibra, quedando retenida.
3. Intercepción por difusión: Es un mecanismo inverso al de la inercia, para partículas extremadamente pequeñas. En este proceso típico de las partículas sub micrónica, éstas se encuentran en choque permanente con las moléculas del fluido. Estos movimientos que pueden ser observados al microscopio se llaman movimientos Brownianos. La difusión Browniana es la causa de que las partículas pequeñas se desvíen de la línea de flujo aumentando la probabilidad de que impacten las superficies de las fibras, siendo allí retenidas.
 
· Clasificación de los filtros:
· Filtros de profundidad actúan los tres mecanismos de retención (tamiz, inercia y difusión); las partículas quedarían retenidas en la superficie y en el espesor del filtro. En los filtros de profundidad existen varias capas, por ejemplo las placas filtrantes de amianto y celulosa.
· Filtros de superficia son las membranas filtrantes.
Esta clasificación es vieja. La nueva habla de los poros según sean o no deformables:
Los de poros deformables dependen principalmente de los mecanismos de separación por inercia o difusión Browniana, que están construidos con un medio filtrante no fijo de espesor suficiente como para retener partículas de un determinado tamaño dentro de su espesor. Los filtros de poro variable están sujetos al fenómeno de migración al medio, esto significa que partes del mismo medio filtrante se desprendan y continúen su recorrido aguas abajo, contaminando el elemento filtrado. 
Los filtros de poro fijo consisten en varias capas de un medio filtrante o una sola capa de mayor espesor de un mismo material. El tamaño del poro puede controlarse durante su fabricación. Su mecanismo de intercepción es de tamiz, aunque en algunas circunstancias pueden actuar por impacto inercial o intercepción por difusión.
Un filtro de superficie o de malla, es uno en el cual todos los poros se encuentran en un plano único y, por lo tanto, dependen únicamente del mecanismo de intercepción directa para separar partículas de un fluido.
Los filtros de amianto-celulosa son de poro deformable, con fibras de amianto entrecruzadas que ofrecen una gran superficie de filtración, la cual al no tener un tamaño de poro determinado no se puede decir que sea absoluta para un determinado tamaño de partícula. La función de tamiz depende de la estructura del filtro y de la forma de las partículas a filtrar.
Membranas filtrantes son de tres tipos:
- de acetato o nitrato de celulosa
- de filamentos orgánicos y 
- nucleares de policarbonatos.
Los filtros de membrana son los más modernos. Están compuestos por ésteres de celulosa (acetato o nitrato de celulosa) de 150 a 200 µm de espesor en 6 a 8 capas y contienen millones de poros microscópicos de tamaño uniforme. La porosidad puede variar de 0,01 a 10 µm. Estos filtros retienen a las bacterias principalmente por el diámetro del poro y son de poro indeformables. Los virus pasan estos filtros con facilidad y son utilizados también para eliminar la carga bacteriana de muestras líquidas destinadas al estudio viral.
Comercialmente se los solicita según el tamaño de poro que se desee. 
· Sistemas de filtración 
Filtración con presión positiva: Se realiza introduciendo el líquido a filtrar en un continente de cierre hermético, que posee una válvula de entrada de aire a presión. El líquido atravesará el filtro y de la parte inferior del soporte saldrá el líquido filtrado que es conducido al receptor final. Es la más recomendable para los filtros de membrana. 
Filtración con presión negativa: Se requiere una bomba de alto vacío que estará conectada a un frasco Kitasato (frasco semejante al erlermeyer con paredes gruesas para resistir el vacío y una tubuladura lateral y superior), mediante mangueras de goma rígida para evitar que se colapse. El soporte del filtro es colocado sobre el kitasato y el líquido a filtrar sobre un receptor superior. El vacío producido por la bomba hará que el líquido atraviese el filtro y sea recibido en el kitasato.
Aplicación:
Es útil para esterilizar líquidos como medios de cultivo que no resisten el tratamiento térmico, sueros u otras sustancias que contengan proteínas que se desnaturalizarían con el calor; azúcares (evitando el caramelizado), soluciones de antibióticos. También para separar productos solubles del crecimiento bacteriano (toxinas) de los medios de cultivo líquidos. 
Sirve para bacterias, pero no para micoplasmas ni virus.
Los filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) son absolutos, destinados a la filtración de aire en el flujo laminar. El filtro HEPA por definición es un filtro con una eficiencia mínima del 99,97% en la partícula más difícil de filtrar que es la de 0,3 µm de diámetro.
Inconvenientes: es necesario filtrar sucesivas veces un mismo elemento para lograr su esterilización, pasando por filtros de diámetro de poro cada vez menor, hasta lograr utilizar filtrosesterilizantes. 
Ultrapresión
Tanto la alta como la baja presión no producen muerte de bacterias. Sin embargo, los microorganismos sobreviven a los cambios bruscos de presión; el fraccionador de Ribi, produce la ruptura celular, primero creando alta presión y después expulsándolas a través de un pequeño orificio que está sujeto a presión atmosférica normal. Este proceso depende de la formación de burbujas de gas intracelulares para su efecto. 
Ultrasonido
Resulta una técnica útil para lisar células bacterianas y obtener sus fracciones (extracción de sus componentes). No suele ser utilizada como método de esterilización ya que quedan muchas células vivas.
El fundamento radica en que el sonido al pasar a través de un líquido provoca cambios de presión, los cuales, si el sonido es suficientemente intenso, generan cavidades en el líquido. Las cavidades, que tienen un diámetro de 10 nm, aumentan su tamaño hasta que se colapsan violentamente, produciéndose altas velocidades y presiones locales del orden de las 1000 atm. Durante este violento estadio la célula se desintegra. 
Centrifugación y Ultracentifugación
La centrifugación diferencial y la centrifugación por gradiente de densidad son métodos que se utilizan para separar de los tejidos o materiales del huésped a los virus previamente concentrados. 
Una muestra concentrada de virus se siembra sobre un gradiente de densidad lineal de sacarosa o glicerol formado previamente, y durante la centrifugación los virus sedimentan como banda, fundamentalmente por el tamaño y peso de la partícula viral. Las muestras se juntan perforando un orificio en el fondo del tubo de la centrífuga.
Los virus pueden purificarse también por centrifugación a altas velocidades en gradientes de densidad de cloruro de cesio, tartrato de potasio, citrato de potasio o sacarosa. Las partículas de virus emigran hacia una posición de equilibrio donde la densidad de la solución iguala a su densidad de flotación, y las partículas virales forman una banda visible. La banda de virus puede ser recogida por punción a través del fondo del tubo de plástico de la centrífuga, analizándose su infectividad.
La ultracentrifugación se utiliza como método de medición de tamaño de los virus. Si se suspenden partículas en un líquido y se le deja reposar, se sedimentarán en el fondo del tubo con una velocidad que será proporcional a su tamaño. 
 
Frío
Las temperaturas inferiores a la óptima para el desarrollo disminuyen la actividad microbiana y, si son bastante bajas, cesa al igual que el metabolismo. 
Las temperaturas bajas son útiles para preservar cultivos, los cuales pueden almacenarse durante largos períodos a temperaturas de refrigeración (4 a 7ºC). 
En estos procedimientos el enfriamiento inicial mata a cierta parte de la población, pero los sobrevivientes permanecen viables durante largo tiempo. A esto se debe que las bajas temperaturas, aún excesivas, no se pueden emplear como método de esterilización. Temperaturas como -196 ºC (nitrógeno líquido) son usadas para conservar cultivos de microorganismos.
Los microorganismos mantenidos a bajas temperaturas se consideran en latencia, ya que no desarrollan actividad metabólica detectable.
El proceso de congelamiento y descongelamiento repetidos produce un efecto más destructivo sobre los microorganismos. Este efecto parece depender de dos fenómenos:
La formación de cristales de hielo que producen lesiones sobre las membranas, con la consecuente salida de compuestos intracelulares y por ende la muerte celular. No tan importante
La formación de cristales de hielo extracelular causa la salida del agua desde el interior de la célula, dando como resultado aumento de la concentración intracelular de electrólitos y desnaturalización de las proteínas. Más importante.