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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA Andamios de Poli (alcohol vinílico)/SiO2-CaO-P2O5 obtenido mediante electrohilado para estudios in vitro y de sincronía de células ventriculares de corazón de pollo. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: QUÍMICO PRESENTA: ESQUIVEL POSADAS HÉCTOR TOMÁS CIUDAD DE MÉXICO 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Chávez García María de Lourdes VOCAL: Rivera Torres Filiberto SECRETARIO: Tavizón Alvarado Gustavo 1er. SUPLENTE: Arcos Ramos Rafael Omar 2° SUPLENTE: Ordoñez Hernández Javier SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: Instituto De Investigaciones En Materiales, UNAM. ASESOR DEL TEMA: Dr. Filiberto Rivera Torres. SUPERVISOR TÉCNICO: Dr. Ricardo Vera Graziano. SUSTENTANTE: Esquivel Posadas Héctor Tomás. AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES. A la universidad Nacional Autónoma de México por brindarme la formación académica y personal. Al instituto de Investigaciones en Materiales de la UNAM por permitirme desarrollar mi proyecto de investigación en sus instalaciones y así permitirme la realización de este trabajo. Al Dr. Filiberto Rivera Torres (Facultad de Química) por sus valiosos consejos y puntos de vista de este trabajo. Al Dr. Ricardo Vera Graziano (Instituto de Investigaciones en Materiales) por permitirme desarrollar mi proyecto de investigación en su laboratorio y por sus valiosos comentarios respecto a este proyecto de investigación. Al Dr. Alfredo Maciel Cerda (Instituto de Investigaciones en Materiales) por los conocimientos que me brindó y por sus valiosos comentarios respecto a este proyecto de investigación. A la Dra. Gertrudis Hortensia González Gómez (Facultad de Ciencias) por su apoyo con los cultivos biológicos que involucraron las células de cardiomiocitos de corazón de pollo, así como la interpretación de resultados obtenidos. A la QFB. María Alicia Falcón Neri (Facultad de Ciencias) por su apoyo con los cultivos biológicos que involucraron las células de cardiomiocitos de corazón de pollo, así como la interpretación de resultados obtenidos. A la I.Q Karla Eriseth Reyes Morales responsable del laboratorio de Análisis Térmico por su apoyo con las pruebas térmicas. Al Q. Miguel Ángel Canseco (Instituto de Investigaciones en Materiales) por su apoyo en los análisis de espectroscopia de infrarrojo por transformada de Fourier. A la Dra. Adriana Tejeda Cruz (Instituto de Investigaciones en Materiales) por su apoyo en los análisis de difracción de rayos X. Al Dr. Omar Novelo Peralta (Instituto de Investigaciones en Materiales) por apoyarme con el análisis de microscopia electrónica de barrido (SEM). Al Dr. Josué Esau Romero Ibarraa (Instituto de Investigaciones en Materiales) por el apoyo con el análisis de microscopia electrónica de transmitancia (TEM). Al Ing. Gerardo Cedillo Valverde (Instituto de Investigaciones en Materiales) por su apoyo con los análisis de resonancia magnética nuclear de carbono 13 y RMN de protón. Al Laboratorio C-202 del Instituto de Investigaciones en Materiales por brindarme el espacio para la realización de este trabajo. Al proyecto PAPITT-UNAM: IN108116 por los recursos otorgados para este proyecto. A los compañeros de laboratorio en el que se desarrolló este trabajo de investigación en el Instituto de Investigaciones en Materiales: Linda Martínez, Erick Robles, Denise Altamirano, Andrés Usi, Antonio Avilés, Emmanuel Arce, Josué David, Eliza Miranda. AGRADECIMIENTOS PERSONALES. Este trabajo lo dedico a mis padres que con mucho cariño los sigo apreciando y queriendo a pesar de las dificultades que hemos afrontado. A mis hermanos que me han apoyado en las tantas dificultades pero que siempre hemos salido adelante. A mi hermana Clara Esquivel Posadas por brindarme su apoyo para continuar con mis estudios y darme valiosos consejos para continuar con mi formación académica, a mi hermana Gisela Esquivel Posadas por sus consejos en la vida y el tiempo que me dedico, a mi hermana Sherezada Esquivel Posadas por el tiempo que hemos convivido y, a mi hermano Jacobo Esquivel Posadas por sus consejos y la ayuda que me ha brindado. Al Dr. Filiberto Rivera Torres que ha sido un amigo y un apoyo para poder seguir adelante y no renunciar. A los compañeros de por su amistad y apoyo: Linda Martínez, Erick Robles, Denise Altamirano, Andrés Usi, Antonio Avilés, Emmanuel Arce, Josué David, Eliza Miranda. Por último y no menos importante a mi padrino Don Ángel por la motivación que me brindo para seguir a delante con este trabajo. Índice General I. Índice de Figuras. .......................................................................................................................... 1 II. Índice de Tablas. .......................................................................................................................... 9 III. Abreviaturas y símbolos........................................................................................................... 11 1. Resumen. .................................................................................................................................... 12 2. Justificación. ............................................................................................................................... 14 2.1. Enfermedades cardíacas en México. .............................................................................. 14 3. Objetivos...................................................................................................................................... 17 4. Introducción. ............................................................................................................................... 18 4.1. Biomateriales. ...................................................................................................................... 18 4.1.1. Biopolímeros. ............................................................................................................... 18 4.1.2. Biocerámicos. ............................................................................................................... 20 4.1.3. Metales. ......................................................................................................................... 23 4.1.3. Biomateriales híbrido (O/I). ........................................................................................ 23 4.2. Ingeniería Tisular. ............................................................................................................... 25 4.2.1. Ingeniería tisular en tejido cardiaco. ......................................................................... 25 4.2.2. Propiedades de los andamios destinados para la regeneración de tejido cardiaco........................................................................................................................................ 26 4.3 Tejido muscular cardíaco. ............................................................................................. 28 4.3.1.Células cardiacas. ....................................................................................................... 29 4.3.2. Falla cardíaca............................................................................................................... 29 4.3.3. Acoplamiento excitación-contracción cardiaca. ..................................................... 31 4.4. Proceso sol-gel. .................................................................................................................. 33 4.4.1. Hidrólisis en medio ácido. .......................................................................................... 33 4.4.2. Condensación en medio ácido. ................................................................................ 34 4.5. Técnica de electrohilado. ................................................................................................... 35 4.5.1 Concentración. ............................................................................................................. 37 4.5.2 Peso molecular. ........................................................................................................... 38 4.5.3 Viscosidad. .................................................................................................................. 38 4.5.4. Tensión superficial. ................................................................................................... 39 4.5.5. Diferencia de potencial. ............................................................................................. 39 4.5.6. Velocidad de flujo. ...................................................................................................... 40 4.5.7. Distancia entre el colector y la punta de la jeringa. .............................................. 40 4.5.8. Parámetros ambientales. ........................................................................................... 40 4.6 Descripción del equipo de electrohilado que se utilizó en el proceso experimental. 41 4.7. Revisión de trabajos realizados respecto de este tema, en los cuales se ha utilizado biovidrio para la regeneración de tejido cardiaco. ................................................................. 42 5. PARTE EXPERIMENTAL. ........................................................................................................ 45 5.1. Materiales. ........................................................................................................................... 45 5.1.1 Reactivos para la síntesis del biovidrio SiO2-CaO-P2O5, andamios de PVA y andamios híbridos O/I. ........................................................................................................... 45 5.1.2. Reactivos para cultivo de cardiomiocitos de corazón de pollo............................. 45 5.2. Técnicas de caracterización. ............................................................................................ 51 5.2.1. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) y análisis de los diámetros para los andamios electrohilados de PVA/biovidrio. ........................................................................ 51 5.2.2. Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM). .................................................... 55 5.2.3. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). .................... 56 5.2.4. Difracción de rayos-X (DRX). .................................................................................... 58 5.2.5. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). .............................................................. 60 5.2.7. Análisis Temogravimétrico (TGA). ............................................................................ 62 5.3 Procedimiento experimental............................................................................................... 64 5.3.1 Síntesis del biovidrio 58%SiO2-33%CaO-9%P2O5 por el método sol-gel. .......... 64 5.3.2. Método para la formación de andamios de PVA. ................................................... 66 5.3.3. Método para la formación de andamios electrohilados de PVA/biovidrio. ......... 67 5.3.4. Método para estabilizar el andamio de PVA y los híbridos PVA/biovidrio. ........ 69 5.3.5. Pruebas biológicas. ..................................................................................................... 71 5.3.5.7. Incorporación del colorante a cultivos celulares ................................................. 79 6. Resultados y su discusión. ....................................................................................................... 81 6.1 Andamios electrohilados de PVA. ..................................................................................... 81 6.1.1. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) y análisis de los diámetros para los andamios electrohilados de PVA. ........................................................................................ 81 6.1.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). .................... 87 6.1.3. Difracción de Rayos-X (DRX). ................................................................................... 88 6.1.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). .............................................................. 89 6.1.5. Análisis Termogravimétrico (TGA)............................................................................ 91 6.2. Andamio electrohilado de PVA estabilizado con glutaraldehído (GA). ...................... 93 6.2.1. Microscopia electrónica de barrido (SEM). ............................................................. 93 6.2.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). .................... 94 6.2.3. Difracción de rayos-X (DRX). .................................................................................... 96 6.2.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). .............................................................. 97 6.2.5. Análisis Termogravimétrico (TGA) . ....................................................................... 100 6.3 Biovidrio de composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. ................................ 102 6.3.1. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM). ........................................................... 102 6.3.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier. ............................... 103 6.3.3. Difracción de rayos-X (DRX). .................................................................................. 104 6.3.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). ............................................................ 105 6.3.5. Análisis Termogravimétrico (TGA).......................................................................... 106 6.4. Andamios híbridos O/I electrohilados de PVA/biovidrio (58%SiO2-33%CaO- 9%P2O5) % mol. ........................................................................................................................ 107 6.4.1. Microscopia Electrónica de Barrido (SEM). ........................................................... 107 6.4.2. Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) y mapeo de los componentes del biovidrio en las fibras de PVA/biovidrio. ..................................................................... 111 6.4.3. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). .................. 113 6.4.4. Difracción de Rayos-X (DRX). ................................................................................. 118 6.4.5. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). ............................................................ 120 6.4.6. Análisis Termogravimétrico (TGA).......................................................................... 121 6.5. Andamios híbridos O/I electrohilados de PVA estabilizado con GA/biovidrio (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol.....................................................................................126 6.5.1. Microscopia electrónica de barrido (SEM). ........................................................... 126 6.5.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). .................. 130 6.5.3. Difracción de Rayos-X (DRX). ................................................................................. 132 6.5.4. Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) de los andamios electrohilados de PVA estabilizado con GA/biovidrio. ................................................................................... 134 6.5.5. Análisis Termogravimétrico (TGA).......................................................................... 136 6.6. Pruebas biológicas. ......................................................................................................... 140 6.6.1. Cultivos celulares de cardiomiocitos ventriculares de corazón de pollo sobre los andamios electrohilados de PVA estabilizado con GA y PVA estabilizado con GA/biovidrio. .......................................................................................................................... 140 6.6.2. Comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. .................................................................................................................. 142 7. Conclusiones. ........................................................................................................................... 155 8. Recomendaciones. .................................................................................................................. 157 9. Apéndice. ..................................................................................................................................... 158 10. Referencias. ............................................................................................................................ 166 1 I. Índice de Figuras. Figura 2.1. Principales causas de defunción en 2015. Defunciones y porcentaje respecto al total. No suman 100 % debido a que sólo se muestran las principales causas. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales…………………………………………………………………………….…15 Figura 2.2. Defunciones por enfermedades cardiovasculares específicas en 2015. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales [1]…………………………………………………...15 Figura 2.3. Defunciones por enfermedades del corazón, según sexo y grupo de edad en 2015. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales [1]……………………...……………………………16 Figura 4.1. Estructura molecular de poli (alcohol vinílico). (a) Parcialmente hidrolizado y (b) totalmente hidrolizado.……………………..…………………………………………….…..20 Figura 4.2. Daño causado por infarto al miocardio en un corazón humano. Figura tomada de la referencia [30]………...……………………………………………….……………………30 Figura 4.3. Modelo de regulación de Ca2+ en cardiomiocitos. La despolarización del sarcolema provoca la apertura de los canales de Ca2+, dependientes del voltaje y la entrada de Ca2+ en el medio extracelular. El flujo de Ca2+ activa los canales de liberación de Ca2+ activados por Ca2+ en el retículo sarcoplásmico cercano (SR) causando aumentos adicionales en Ca2+ y ciclos de liberación de Ca2+ inducida por Ca2+. El aumento de Ca2+ interactúa con los miofilamentos para mejorar la interacción entre actina y miosina y así aumentar la contractilidad. El Ca2+ se reduce mediante la recaptación en la SR a través de la Ca2+ ATPasa. El Ca2+ también se expulsan a través del intercambiador de Na+ / Ca2+ y otras bombas de Ca2+. Figura tomada de la referencia [32]…………………………………32 Figura 4.4. Hidrólisis de TEOS en medio ácido. (a) Ataque nucleofílico de la molécula de agua a la molécula de TEOS, (b) la molécula de H2O forma un sustrato hipervalente con la molécula de TEOS, (c) transferencia del protón del agua al grupo alcóxido adyacente, (d) ruptura del enlace O-Si y formación del alcohol correspondiente.………………………….34 Figura 4.5. Etapas de condensación de TEOS en la producción de oligómeros de sílice. La condensación entre grupos silanol entre dos moléculas de TEOS hidrolizadas (a y b) y entre un grupo silanol y un grupo alcoxi adyacente (c y d) da como resultado la producción de H2O libre y etanol, respectivamente. ……………………………..……….………………..35 Figura 4.6. Diagrama esquemático de la configuración básica de electrohilado. Figura tomada de la referencia [36]…………………………………………………...………………..36 2 Figura 4.7. Imágenes SEM de la evolución de los productos con diferentes concentraciones de baja a alta durante el electrohilado. Figura tomada de la referencia [37]………………………………………………………………………………………………….38 Figura 4.8. Fotografía del equipo de electrohilado que se utilizó para la generación de los andamios híbridos O/I. En esta fotografía se muestra: (a) el sistema de inyección, (b) la caja de acrílico que aísla el sistema, (c) el colector y (d) la fuente de poder…………………………………………………………………………………………….…41 Figura 5.1. Contornos de la deposición de energía en un sólido de número atómico bajo (polimetilmetacrilato) como función de la posición, medida experimentalmente mediante grabado y según lo calculado por la simulación de trayectoria de electrones Monte Carlo [52]...…………………………………………………………………………………………….….52 Figura 5.2. Diagrama de los componentes de un sistema SEM [52]……………………….53 Figura 5.3. Microscopio electrónico de barrido JOEL JSM-7600F………………………….53 Figura 5.4. Microscopio electrónico de transmisión JEOL JEM-1200 EX……..…………..56 Figura 5.5. Equipo de infrarrojo con transformada de Fourier. Espectrómetro Thermo Scientific Nicolet 6700……………………………………….…………………………………...58 Figura 5.6. Planos de un cristal para la obtención de la ley de Bragg……….…………….59 Figura 5.7. Equipo de difracción de rayos-X. Defractómetro Siemens D500…….………..60 Figura 5.8. Calorimetría diferencial de barrido (DSC). (a) Aparato (S= muestra; R= referencia), (b) curva DSC típica, una respuesta endotérmica está representada por un pico positivo, es decir, ascendente ……………………...……………………………………..61 Figura 5.9. Equipo de DSC modulado TA Instruments DSC 2910…………..……………..62 Figura 5.10. Equipo analizador termogravimétrico de alta resolución TA Instruments TGA 2950…………………………………………………………………………………….……….….63 Figura 5.11. La figura a) muestra la separación de fases tolueno – HCl(ac) para la estabilización de los andamios de PVA y los andamios de PVA/biovidrio, la fase superior es la fase de tolueno - GA y la fase inferior es la fase de HCl(ac). La figura b) muestra la forma de los andamios que se cortaron circularmente para su posterior estabilización con GA.……………………………………………………….……………………………………..….70 Figura 6.1. Imágenes obtenidas por SEM de los andamios electrohilados de poli (alcohol vinílico). a) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 13 kV. b) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 15 kV. c) concentración de 20 % m/m, distancia inyector- colector de 15cm y diferencia de potencial de 13 kV. d) concentración de 20 % m/m, 3 distancia inyector-colector de 15cm y diferencia de potencial de 15 kV. e) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 20 cm y diferencia de potencial de 15 kV. f) concentración de 25 % m/m, distancia inyector-colector de 10cm y diferencia de potencial de 15 kV..…………………………………………………………………………………...……..83 Figura 6.2. Histogramas de los andamios híbridos de PVA para obtener las mejores condiciones de electrohilado. a) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 13 kV.b) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 15 kV. c) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 15 cm y diferencia de potencial de 13 kV. d) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 15 cm y diferencia de potencial de 15 kV. e) concentración de 20 % m/m, distancia inyector-colector de 20 cm y diferencia de potencial de 15 kV. f) concentración de 25 % m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y diferencia de potencial de 15 kV…………………………...…………………………………84 Figura 6.3. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR de la muestra electrohilada de PVA. Parámetros de electrohilado: concentración de 20% m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y una diferencia de potencial aplicado de 15 kV...……………..…………………………87 Figura 6.4. Patrón de difracción de rayos-X para el andamio electrohilado de PVA. Parámetros de electrohilado: concentración de 20% m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y una diferencia de potencial aplicado de 15 kV………..………………………………...88 Figura 6.5. Análisis DSC del andamio electrohilado de PVA…………………………….....89 Figura 6.6. Análisis DSC del andamio electrohilado de PVA obtenido mediante ciclos de calentamiento. a) ciclo de calentamiento y enfriamiento que se realiza para descastar la presencia de disolventes. b) análisis DSC obtenido después del ciclo de calentamiento y enfriamiento realizado en a)……………… ………………………………………………..…..90 Figura 6.7. Termograma (TGA) del andamio de PVA electrohilado……….…………….....91 Figura 6.8. Mecanismo de descomposición del polímero de PVA. Descomposición del polímero en la primera etapa……………………………………………………………………92 Figura 6.9. La figura a) muestra la micrografía obtenida mediante SEM del andamio de PVA estabilizado con GA. La figura b) muestra el histograma de los diámetros del andamio de PVA estabilizado...…………………………………………………………………93 Figura 6.10. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR de la muestra electrohilada de PVA estabilizada con GA. Parámetros de electrohilado: concentración de 20% m/m, distancia inyector-colector de 10 cm y una diferencia de potencial aplicado de 15 kV.……..……………………………………………………………………………………………95 Figura 6.11. Propuesta de reacción entre los grupos -OH superficiales del polímero de PVA con GA.……………………………………………………………………………………....96 4 Figura 6.12. Patrones de difracción de rayos-X. a) andamio de PVA. b) andamio de PVA estabilizado con GA.…………………… ………………………………………………………..97 Figura 6.13. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA…....…………….....98 Figura 6.14. Análisis DSC del andamio de PVA y del andamio de PVA estabilizado con GA…………………………………………………………………………………………………..99 Figura 6.15. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA estabilizado con GA…………………………….……………………………………………….………………….100 Figura 6.16. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA y del andamio de PVA estabilizado con GA……………………………………….…………………………………….101 Figura 6.17. Micrografías tomadas por SEM de la muestra de biovidrio con una composición de (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol. a) Micrografía de biovidrio con un aumento de 500 veces. b) Micrografía de biovidrio con un aumento de 2 500 veces..…102 Figura 6.18. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR de biovidrio con una composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol…………………..……………………………………...103 Figura 6.19. Patrón de difracción de rayos-X del Biovidrio (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol………………….……………………………………………………………………………..104 Figura 6.20. Análisis DSC del biovidrio con una composición (58%SiO2-33%CaO- 9%P2O5) % mol………………………………………………………………………………….105 Figura 6.21. Análisis termogravimétrico (TGA) de la muestra de biovidrio con una composición (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol…………………………………………..106 Figura 6.22. Micrografías tomadas por SEM de los andamios híbridos de PVA/biovidro. a) híbrido al 5 %, b) híbrido al 10 %, c) híbrido al 15 %, d) híbrido al 20 %, e) híbrido al 25 % y f) híbrido al 30 %..........…………………………………………………………………..…..108 Figura 6.23. Histogramas de frecuencias absolutas de los andamios híbridos de PVA/biovidro. a) híbrido al 5 %, b) híbrido al 10 %, c) híbrido al 15 %, d) híbrido al 20 %, e) híbrido al 25 % y f) híbrido al 30 %. ……………………………………………………….109 Figura 6.24. Imágenes tomadas por Microscopia (TEM) del andamio híbrido al 20 %. a) micrografía que muestra la superficie de una fibra del andamio híbrido al 20 %. b) mapeo de los componentes del Biovidrio (silicio, calcio y cloro) en la fibra de PVA……………..112 Figura 6.25. Mapeo de los componentes del biovidrio (silicio, calcio y fósforo) en la fibra de PVA que se presentó en la figura 6.18 a. a) mapeo de silicio en la fibra de PVA. b) mapeo de calcio en la fibra de PVA y c) mapeo de fósforo en la fibra de PVA.…………112 5 Figura 6.26. Espectros de infrarrojo obtenido por FTIR de los andamios de PVA/biovidrio. a) andamio de PVA/biovidrio al 5 %, b) andamio de PVA/biovidrio 10 % y c) andamio de PVA/biovidrio 15 %. ………………………………………………………………………..…..113 Figura 6.27. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR del andamio electrohilado de PVA/ biovidrio al 20 %. Caracterización de las principales bandas...........................................115 Figura 6.28. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR del andamio electrohilado de PVA/ biovidrio al 25 %. Caracterización de las principales bandas.……………………………..116 Figura 6.29. Espectro de infrarrojo obtenido por FTIR del andamio electrohilado de PVA/ Biovidrio al 30 %. Caracterización de las principales bandas.……………………………117 Figura 6.30. Patrones de difracción de rayos-X obtenidos por el método de polvos para los andamios híbridos electrohilados de PVA/58%SiO2-33%CaO-9%P2O5, análisis realizado para los andamios de PVA/biovidrio al 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % y 30 %..................................................................................................................................119 Figura 6.31. Comparación de los análisis DSC del andamio de PVA y los andamios de PVA/biovidrio. a) andamio de PVA, b) andamio de PVA/biovidrio 5 %, c) andamio de PVA/biovidrio 10 %, d) andamio de PVA/biovidrio 15 %, e) andamio de PVA/biovidrio 20 %, f) andamio de PVA/biovidrio 25 %, g) andamio de PVA/biovidrio 30 %......................120 Figura 6.32. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA, el andamio de PVA/biovidrio al 5 % y al 10 %..........................................................................................122 Figura 6.33. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA y del andamio de PVA/biovidrio al 15 %.......................................................................................................123 Figura 6.34. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA y de los andamios de PVA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 %.................................................................................125 Figura 6.35. Micrográfias tomadas mediante SEM de los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA/biovidro. a) híbrido al 5%, b) híbrido al 10%, c) híbrido al 15%, d) híbrido al 20%, e) híbrido al 25% y f) híbrido al 30%........................................................127 Figura 6.36. Histogramas de los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA/biovidro. a) híbrido al 5%, b) híbrido al 10%, c) híbrido al 15%, d) híbrido al 20%, e) híbrido al 25% y f) híbrido al 30%.............................................................................................................128 Figura 6.37. Espectros de infrarrojo obtenido por FTIR de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. a) andamio de PVA/biovidrio al 5 %, b) andamio de PVA/biovidrio al 10 %, c) andamio de PVA/biovidrio al 15 %, d) andamio de PVA/biovidrio al 20 %, e) andamio de PVA/biovidrio al 25 % y f) andamio de PVA/biovidrio al 30 %...131 6 Figura 6.38. Patrones de difracción de rayos-X obtenidos por el métodode polvos para los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio, análisis realizado para los andamios de PVA/biovidrio al 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % y 30 %....………………………………133 Figura 6.39. Comparación de los análisis DSC de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. a) andamio de PVA/biovidrio 5 % , b) andamio de PVA/biovidrio 10 %, c) andamio de PVA/biovidrio 15 %, d) andamio de PVA/biovidrio 20 %, e) andamio de PVA/biovidrio 25 %, f) andamio de PVA/biovidrio 30 %...................................................134 Figura 6.40. Termograma TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5 % ………………………………………………………………………………………..…………...136 Figura 6.41. Termograma TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10 % …………………………………………………………………………………………….……....137 Figura 6.42. Termograma TGA del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15 % ………………………………………………………………………………………………...…..138 Figura 6.43. Termogramas TGA de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 %, 25 % y 30 % ……………………………………………………………………………..139 Figura 6.44. Imágenes reveladas por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamios de PVA y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio. a) y a’) células en el andamio de PVA, b y b’) células en el andamio al 5%, c y c’) células en el andamio al 10%, d y d’) células en el andamio al 15 %, e y e’) células en el andamio al 20 % y f y f’) células en el andamio al 25 %. Las figuras a), b), c), d), e) y f) muestran las células de cardiomiocitos en reposo. Las figuras a’), b’), c’), d’), e’) y f’) muestran las células de cardiomiocitos en contracción…………140 Figura 6.45. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]…………………..……….143 Figura 6.46. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 5 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]…………………………………………………………………………………………...…144 Figura 6.47. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 10 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de 7 fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]…………………………………………………………………………………..………….146 Figura 6.48. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 15 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ y b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+]…………………………………………………………………………………….………..148 Figura 6.49. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA /biovidrio al 20 %. a) áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ, b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+] y c) muestra la alineación o desfase de los máximos de contracción………………………….149 Figura 6.50. Secuencia de contracción revelada por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular en cardiomiocitos de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20%. a) la región iluminada corresponde a la región de alta concentración de [Ca2+] y que está relacionada con la contracción celular de los cardiomiocitos. b) diagramas de la propagación de onda correspondientes a la figura a)…………………..150 Figura 6.51. Métodos de análisis utilizados para el comportamiento contráctil de los cardiomiocitos de corazón de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25%. a) Áreas de interés seleccionadas con la ayuda del programa ImageJ, b) muestra las variaciones en la actividad del cultivo mediante picos de intensidad de fluorescencia, las cuales están asociadas a cambios en la movilización de [Ca2+] y c) muestra la alineación o desfase de los máximos de contracción……………………..…..151 Figura 6.52. Secuencia de contracción revelada por fluorescencia al cambio de la [Ca2+] intracelular en cardiomiocitos de pollo sobre el andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25%. a) la región iluminada corresponde a la región de alta concentración de [Ca2+] y que está relacionada con la contracción celular de los cardiomiocitos. b) diagramas de la propagación de onda correspondientes a la figura a)……….…………..152 Figura A-1. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 5%.......................................158 Figura A-2. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 10 %....................................158 Figura A-3. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 15 %....................................159 Figura A-4. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 20 %....................................159 Figura A-5. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 25 %....................................160 Figura A-6. Análisis DSC del andamio de PVA/biovidrio al 30 %....................................160 8 Figura A-7. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 5 %......161 Figura A-8. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 5 %......161 Figura A-9. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 10 %....162 Figura A-10. Análisis termogravimétrico (TGA) del andamio de PVA/biovidrio al 15 %..162 Figura A-11. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 5 %...163 Figura A-12. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 10 % ………………………………………………………………………………………………….....163 Figura A-13. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 15 %. …………………………………………………………………………………………………….164 Figura A-14. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 20 %.. …………………………………………………………………………………………………….164 Figura A-15. Análisis DSC del andamio de PVA estabilizado con GA/biovidrio al 25 %.. …………………………………………………………………………………………………….165 9 II. Índice de Tablas. Tabla 4.1. Propiedades mecánicas de algunos biomateriales usados en ingeniería tisular para tejido cardiaco [23]……………… …………………………………………………………27 Tabla 4.2. Principales iones liberados de biovidrio que se consideran para la ingeniería de tejidos blandos [48]………… ……………………………………………………………………44 Tabla 5.1. Cantidades necesarias para obtener 500 mL de la disolución de Hanks……………………………………………………………………………….…………..….46 Tabla 5.2. Cantidades necesarias para preparar la solución enzimática de T (inhibidores de tripsina……………………………………………………………….……..…………………..47 Tabla 5.3. Cantidades de DMS8 (10x) y Trypsina para preparar la disolución de DesOxyRibonucleasa I (DMI)……… …………………………………………………………...47 Tabla 5.4. Cantidades de DMS8 (10x) y DNasa para preparar la disolución DMII…………………………………………………………………………………….……….….48 Tabla 5.5. Sustancias y cantidades necesarias para preparar elMedio 818A……….…...48 Tabla 5.6. Cantidades de sales y glucosa para preparar la disolución DBSK (10x)…...…49 Tabla 5.7. Sustancias y cantidades necesarias para preparar la disolución DBSK (100x)…………………………………………………………………………………………..…..49 Tabla 5.8. Sustancias y cantidades necesarias para preparar la disolución DMS8 (10x)……. ………………………………………………………………………………………....50 Tabla 5.9. Parámetros estudiados para el electrohilado de poli (alcohol vinílico)………...66 Tabla 5.10. Parámetros de electrohilado que han sido establecidos a partir de los experimentos con PVA…………………………………………………………………………..68 Tabla 5.11. Nombre y descripción del andamio de PVA y los andamios híbridos O/I……………………………………………………………………………………………..…...69 Tabla 5.12. Identificación de los andamios de PVA y PVA/Biovidrio, cantidades en porciento de cada componente. Agente estabilizante y tiempo de inmersión……………..70 Tabla 6.1. Identificación de las pruebas para los andamios de PVA electrohilados..…….81 Tabla 6.2. Diámetros de las fibras de los andamios híbridos de PVA.……………….…….86 Tabla 6.3. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio de PVA………………………………………………………………………………………………...87 Tabla 6.4. Valores de Tg y Tm para el andamio electrohilado de PVA…………………….91 Tabla 6.5. Comparación del diámetro de las fibras de PVA con las fibras de PVA estabilizadas con GA. Los valores se reportan con su incertidumbre absoluta……………94 10 Tabla 6.6. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del Biovidrio (58%SiO2- 33%CaO-9%P2O5) % mol.………… ………………………………………………………..…103 Tabla 6.7. Diámetros de las fibras de los andamios híbridos de PVA/biovidrio………………………………………………………………………………..…...110 Tabla 6.8. Principales bandas observadas en los espectros de FTIR de los andamios híbridos de PVA/biovidrio al 5 %, 10 % y 15 %.……………………………………………..114 Tabla 6.9. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio híbrido PVA/biovidrio al 20%.………………………………………………………………….………..115 Tabla 6.10. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio híbrido PVA/biovidrio al 25 %.…………………………………………………………………………..116 Tabla 6.11. Principales bandas observadas en el espectro de FTIR del andamio híbrido PVA/biovidrio al 30 %………………………………………………………………………......118 Tabla 6.12. Intervalos de temperatura para los procesos endotérmicos de los andamios de PVA/biovidrio…………………………………………………………………………………121 Tabla 6.13. Diámetros de las fibras de los andamios híbridos de PVA estabilizado con GA/biovidrio.…………….………………………………………………...……………….…….129 Tabla 6.14. Principales bandas observadas en los espectros de FTIR de los andamios de PVA establizado con GA/biovidrio al 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % y 30 %……………..131 Tabla 6.15. Intervalos de temperatura para los procesos endotérmicos de los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio ………………………………………………….….…135 Tabla 6.16. Actividad de los cardiomiocitos ventriculares de corazón de pollo sobre el andamio de PVA y los andamios de PVA estabilizado con GA/biovidrio ………….……..164 11 III. Abreviaturas y símbolos. PVA: Poli (alcohol vinílico) TEOS: Tetraetilortosilicato TEP: Trietilfosfato FTIR: Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier DRX: Difracción de rayos-X SEM: Microscopia Electrónica de Barrido TEM: Microscopia Electrónica de Transmisión TGA: Análisis Termogravimétrico DSC: Calorimetría Diferencial de Barrido OMS: Organización Mundial de la Salud SS: Secretaría de Salud ECV: Enfermedades cardiovasculares INEGI: Instituto Nacional de Estadística y Geografía Híbrido (O/I): Híbrido orgánico/inorgánico GA: Glutaraldehído Bv: Biovidrio (58%SiO2-33%CaO-9%P2O5) % mol CM: Cardiomiocitos VEGF: Expresión del factor de crecimiento endotelial vascular 12 1. Resumen. La ingeniería de tejidos en miocardio intenta superar los obstáculos para prolongar la vida de los pacientes después de un infarto de miocardio. Comprende la manufactura de un andamio (estructura tridimensional que favorece la proliferación y adhesión celular) basado en un biomaterial, ya sea un andamio poroso o un parche denso, hecho de materiales poliméricos naturales o sintéticos, para ayudar al transporte de las células a la región enferma del corazón. Se han sugerido muchos tipos de células para la terapia celular y la ingeniería de tejidos aplicada al miocardio, estos incluyen tanto células madre autólogas como embrionarias. Los biomateriales sugeridos para esta aplicación específica de ingeniería de tejidos deben ser biocompatibles con las células cardíacas y tener propiedades mecánicas que coincidan con las del miocardio nativo. Recientemente se ha prestado mucha atención a diferentes familias de biovidrios con respecto al tratamiento de afectaciones que involucran al tejido cardíaco, como el infarto al miocardio. Las propiedades inherentes de los biovidrios incluyen su capacidad para unirse a tejidos duros y blandos, estimular la angiogénesis y provocar efectos antimicrobianos, junto con su excelente biocompatibilidad. Estas propiedades respaldan las estrategias propuestas en este trabajo, además, los biovidrios también pueden actuar como una fase bioactiva y que provee una mayor hidrofilicidad a los polímeros usados para reparar el tejido cardíaco. En el presente trabajo se sintetizó un biovidrio con la composición 58%SiO2- 33%CaO-9%P2O5 en % mol (Bv), utilizando la ruta de síntesis sol gel, para lo cual se utilizaron los reactivos: tetraetilortosilicato (TEOS), trietilfosfato (TEP) y cloruro de calcio dihidratado (CaCl∙2H2O) y H2O deionizada. Se obtuvieron andamios de poli (alcohol vinílico)/biovidrio por electrohilado y la ruta de síntesis sol gel. La composición del biovidrio se mantuvo constante en todos los andamios sintetizados, sin embargo, se varió la relación poli (alcohol vinílico) (PVA) /biovidrio en porcentaje masa/masa y se generó una serie de 13 composiciones de: 100 PVA/0 Bv, 95 PVA/5 Bv, 90 PVA/10 Bv, 85 PVA/15 Bv, 80 PVA/20 Bv, 75 PVA/25 Bv y 70 PVA/30 Bv. En la serie de composiciones, el PVA se estabilizó con glutaraldehído para disminuir su hidrofilicidad y para un posterior uso en cultivos de células cardiacas. Los andamios híbridos (O/I) estabilizados y sin estabilizar, así como el biovidrio, se caracterizaron por Microscopia Electrónica de Barrido (SEM), Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM), Espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR), Difracción de Rayos X (DRX), Análisis Termogravimétrico (TGA) y Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC). Sobre los andamios híbridos estabilizados se depositaron cultivos de células embrionarias de corazón de pollo, los cuales provienen de la granja (ALPES) Aves Libres de Patógenos Específicos. S. A. de C. V. Con el objetivo de analizar la influencia de la composición química de los andamios híbridos en los estímulos eléctricos del tejido cardiaco. Se realizó el seguimiento de la contracción celular mediante un fluoróforo, utilizando el registro de imágenes se realizó un gráfico de la intensidad de la señal del fluoróforo en función del tiempo, con los resultados se pudo llegar a una conclusión que relaciona la frecuencia e intensidad de los estímulos cardiacos con la composición y estructura del andamio híbrido. 14 2. Justificación. 2.1. Enfermedades cardíacas en México. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), las enfermedades cardiovasculares (ECV) son desórdenes del corazón y de los vasos sanguíneos, estas se han convertido en la principal causa de muerte en todo el mundo, a continuación se mencionan algunas: Cardiopatía coronaria: enfermedad de los vasos sanguíneos que irrigan el músculo cardiaco. Enfermedades cerebrovasculares: enfermedades de los vasos sanguíneos que irriganel cerebro. Arteriopatías periféricas: enfermedades de los vasos sanguíneos que irrigan los miembros superiores e inferiores. Cardiopatía reumática: lesiones del músculo cardiaco y de las válvulas cardíacas debidas a la fiebre reumática, una enfermedad causada por bacterias denominadas estreptococos. Cardiopatías congénitas: malformaciones del corazón presentes desde el nacimiento. Trombosis venosas profundas y embolias pulmonares: coágulos de sangre (trombos) en las venas de las piernas, que pueden desprenderse y alojarse en los vasos del corazón y los pulmones. Del total de defunciones por ECV, según la OMS, más de tres cuartas partes se producen en los países de bajos y medios ingresos. De acuerdo con información del Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI), en México, las enfermedades del corazón representaron casi 20 % de las defunciones totales en el país en 2015 como se observa en la figura 2.1. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs317/es/ 15 Figura 2.1. Principales causas de defunción en 2015. Defunciones y porcentaje respecto al total. No suman 100 % debido a que sólo se muestran las principales causas. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales. De las enfermedades del corazón, las isquémicas ocupan el primer lugar como causas del defunción con 68.5 %, como se muestra en la figura 2.2. Figura 2.2. Defunciones por enfermedades cardiovasculares específicas en 2015. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales [1]. 16 Del número de muertes causadas en 2015 por enfermedades del corazón, la mayoría tuvieron lugar en personas del sexo masculino con 68,052 muertes, es decir, 7,382 más que el sexo femenino que registró 60,670 defunciones. Cabe mencionar que, si bien el número de muertes por ECV en hombres es mayor, en las mujeres representan 20.8% del total de defunciones, mientras que en los hombres representan 18.7%. Es a partir de 65 años en adelante donde las ECV se convierten en la principal causa de mortalidad en ambos sexos, como se muestra en la figura 3. Figura 2.3. Defunciones por enfermedades del corazón, según sexo y grupo de edad en 2015. Tomado de la base de datos de INEGI. Dirección General de Estadísticas Sociodemográficas; Estadísticas Vitales [1]. Cabe destacar que de acuerdo con el boletín de prensa publicado el 24 de septiembre de 2016 por la Secretaría de Salud (SS), tener una enfermedad cardiovascular reduce en siete años la esperanza de vida [1]. Este panorama sobre ECV me permite, a través de este trabajo, proponer un andamio tisular con propiedades eléctricas y mecánicas tal que se pueda colocar en el tejido cardíaco con la finalidad de regenerar la zona afectada. https://www.gob.mx/salud/prensa/una-de-cada-tres-defunciones-en-el-pais-es-por-enfermedades-cardiovasculares-68612 17 3. Objetivos. 3.1. Objetivo general. Crear un andamio híbrido (O/I) compuesto de poli (alcohol vinílico)/58%SiO2- 33%CaO-9%P2O5, utilizando la técnica de electrohilado y la ruta de síntesis sol gel in situ para su aplicación en cultivos de células cardiacas embrionarias provenientes de corazón de pollo. 3.2. Objetivos particulares. Definir las condiciones que permitan obtener la mejor morfología de las fibras en los andamios electrohilados de PVA, contemplando los parámetros de concentración, diferencia de potencial y distancia inyector-colector. Obtener mediante la ruta de síntesis sol gel un biovidrio en el sistema ternario de 58%SiO2-33%CaO-9%P2O5 en % mol, a partir de tetraetilortosilicato (TEOS), trietilfosfato (TEP) y cloruro de calcio dihidratado (CaCl2∙2H2O). Obtener una serie de andamios electrohilados de PVA/58%SiO2-33%CaO- 9%P2O5, realizando una serie de composiciones de: 100 PVA/0 Bv, 95 PVA/5 Bv, 90 PVA/10 Bv, 85 PVA/15 Bv, 80 PVA/20 Bv, 75 PVA/25 Bv y 70 PVA/30 Bv Estabilizar el PVA de la serie de andamios (O/I) para proporcionarle resistencia a la disolución en agua. Caracterizar por (SEM), (TEM), (FTIR), (DRX), (DSC) y (TGA) la serie de los andamios híbridos (O/I) sin estabilizar y estabilizados con GA. Realizar cultivos con células embrionarias de corazón de pollo en los andamios híbridos (O/I) estabilizados para demostrar su biocompatibilidad con las células. Realizar un perfil de respuesta en función del tiempo de las células embrionarias de corazón de pollo, para demostrar que los andamios son aptos en cuanto a la sincronía del pulso eléctrico y conectividad celular. 18 4. Introducción. 4.1. Biomateriales. "Un biomaterial es cualquier sustancia, que no sea un medicamento, y que puede ser una combinación de sustancias, de origen sintético o natural, es usado durante cualquier período de tiempo, como un todo o como parte de un sistema que trata, aumenta o reemplaza cualquier tejido, órgano o función del cuerpo". [2] Los materiales que son biocompatibles se denominan biomateriales. La biocompatibilidad es un término descriptivo que indica la capacidad del material para funcionar con una respuesta apropiada del tejido circundante, en una aplicación específica. En términos sencillos, implica la compatibilidad del biomaterial con los sistemas vivos. Los biomateriales de la primera generación se desarrollaron en las décadas de 1960 y 1970, cuyo objetivo principal era lograr las propiedades físicas y químicas que coincidan con la del tejido del huésped (con una respuesta citotóxica mínima o nula). La característica principal de estos biomateriales era la 'inercia' para evitar cualquier rechazo biológico. Durante 1980-1990, el énfasis de la investigación se desplazó hacia el desarrollo de materiales bioactivos, lo que provocó una respuesta biológica en la interfaz entre el biomaterial y el huésped. Los biomateriales convencionales se clasifican en cuatro categorías [3]: 1. Biopolímeros. 2. Biocerámicos. 3. Metales. 4. Biocompuestos. 4.1.1. Biopolímeros. Los biopolímeros generalmente se clasifican en naturales y sintéticos. Ambas categorías tienen ventajas e inconvenientes. 19 4.1.1.1. Biopolímeros naturales. Los biopolímeros naturales poseen propiedades químicas intrínsecas necesarias para la unión y la proliferación de las células. Sus productos de degradación no son tóxicos, con una respuesta inmune baja. Sin embargo, la mayoría de esta categoría de polímeros requiere una etapa adicional de estabilización para volverse insoluble en soluciones acuosas, tales como los medios de cultivo. Los polímeros naturales comúnmente utilizados en la ingeniería del tejido cardíaco incluyen colágeno, fibrinógeno, quitosano, gelatina, elastina y seda [4]. 4.1.1.2. Biopolímeros sintéticos. Los biopolímeros sintéticos tienen reproducibilidad alta así como un proceso sencillo de control de calidad. Por otra parte, su costo es menor en comparación con los naturales y sus propiedades mecánicas se ajustan de manera efectiva a las propiedades del tejido, carecen de moléculas de señalización bioquímica que deberían introducirse agregando un paso adicional de funcionalización o combinándolas con polímeros naturales. Su ventaja es su facilidad para electrohilarse y su bajo costo, pero por otro lado, el tratamiento y modificación de su superficie suele ser necesaria para fines de cultivo celular [5]. 4.1.1.1. Poli (alcohol vinílico). El poli (alcohol vinílico) (PVA), es un polímero sintético, hidrofóbico, con grupos -OH en su estructura; es utilizado desde principios de la década de 1930 en una gama de aplicaciones industriales, comerciales, médicas y alimentarias, incluidas resinas, lacas, hilos quirúrgicos y aplicaciones de contacto con alimentos. El polímero de PVA se prepara en dos etapas debido a la inestabilidad de las unidadesmonoméricas de alcohol vinílico (pronta tautomerización en acetaldehído). En una primera etapa, se prepara el polímero poli (acetato de vinilo); polimerizando acetato de vinilo en una solución alcohólica y en una segunda etapa, se lleva a cabo la hidrólisis parcial de poli (acetato de vinilo) para https://en.wikipedia.org/wiki/Vinyl_acetate 20 dar lugar al PVA. El PVA generalmente se clasifica en dos grupos: parcialmente hidrolizado (a) e hidrolizado por completo (b), como se muestra en la figura 4.1 [6]. OH O O CH3 n m OH n Figura 4.1. Estructura molecular de poli (alcohol vinílico). (a) Parcialmente hidrolizado y (b) totalmente hidrolizado [6]. Al variar la longitud inicial de la cadena del poli (acetato de vinilo) y el grado de hidrólisis en condiciones alcalinas o ácidas, se obtienen productos de PVA que difieren en el peso molecular; que varía entre (20 000 - 400 000) g/mol, solubilidad en agua, flexibilidad y resistencia a la tracción. Se miden diversas propiedades para caracterizar el PVA, como el pH, viscosidad, pérdida de peso en el secado, punto de fusión e índice de refracción en los productos finales. El PVA con un bajo grado de hidrólisis, posee una mayor solubilidad en agua a baja temperatura en comparación con el PVA que posee un alto grado de hidrólisis. Lo anterior se debe a que los grupos de acetato residual (hidrofóbico en naturaleza) debilitan los enlaces de hidrógeno intra e intermoleculares de los grupos adyacentes -OH y para el PVA con alto grado de hidrólisis, la temperatura debe elevarse a 70 °C o más para disolver en agua [7]. 4.1.2. Biocerámicos. Los biocerámicos, es un campo relativamente nuevo; no existía hasta comienzos de 1970, cuando estos materiales fueron utilizados para restaurar las funciones osteoarticulares y dentales, también como material de reemplazo para autoinjertos (a) (b) 21 y aloinjertos en la reconstrucción de hueso. Numerosos materiales sintéticos para injertos óseos están disponibles como alternativos al hueso autógeno (hueso obtenido a partir de un mismo individuo con fines de reparación, sustitución y aumento). Incluidos en estos biomateriales sintéticos se encuentran las vitrocerámicas especiales, que se describen como vidrios bioactivos y fosfatos cálcicos (fosfato de calcio, hidroxiapatita cálcica, fosfato tricálcico, y fosfato cálcico bifásico). Las biocerámicas usadas para reemplazar, reparar o reconstruir partes del cuerpo humano o tejidos vivos complejos tienen diferencias en su naturaleza química, propiedades y aplicaciones [8]. 4.1.2.1. Biovidrios. La palabra «biovidrio» significa el vidrio que, es compatible con los tejidos vivos circundantes, no mutágeno, no carcinogénico y no antigénico, para evitar cualquier efecto adverso sobre las células. Los biovidrios poseen una estructura amorfa, resistencia mecánica y poseen un carácter hidrofílico. Los biovidrios se utilizan en la reparación ósea y se están desarrollando para aplicaciones en ingeniería de tejidos. Las características importantes de los biovidrios, que los convierte en candidatos adecuados para la ingeniería de tejido óseo, es su capacidad para mejorar la revascularización, la adhesión de los osteoblastos, la actividad enzimática y la diferenciación de las células madre mesenquimales, así como las células osteoprogenitoras [9]. El primer biovidrio fue inventado por Larry Hench en la Universidad de Florida en 1969. El profesor Hench comenzó su trabajo para encontrar un material que pudiera unirse al hueso, el problema que se tenía era que todos los materiales de implantes disponibles en ese momento, por ejemplo, metales y polímeros que se diseñaron con el propósito de ser bioinertes, desencadenaban la encapsulación fibrosa después de la implantación, en lugar de formar una interfaz estable con los tejidos. Hench decidió hacer un vidrio degradable en el sistema Na2O-CaO-SiO2- P2O5. 22 Este material se procesa usando temperaturas de fusión en el intervalo de (1300 – 1450) °C, este proceso es una ruta de síntesis por fundición de los reactivos. Desde su descubrimiento se han estudiado diversas composiciones utilizando la síntesis sol gel para demostrar sus propiedades bioactivas en cultivos biológicos [10]. Los biovidrios pertenecen a una categoría especial de materiales bioactivos, un material bioactivo representa un material que sigue un proceso después de su implantación dentro del cuerpo. Algunos de los requisitos que deben tener los biovidrios para desempeñarse exitosamente como biomaterial dentro de un huésped son: 1. Los biovidrios deben exhibir las propiedades mecánicas requeridas para resistir cualquier tipo de presión o tensión para prevenir cualquier falla estructural durante las actividades rutinarias normales del paciente, así como durante la manipulación del material. 2. La biocompatibilidad de los biovidrios es una propiedad indispensable, lo que significa que no deben ser tóxicos y, por lo tanto, favorecer la adhesión celular y la proliferación celular. 3. Los vidrios bioactivos no deberán exhibir ninguna respuesta inflamatoria. 4. La arquitectura de los andamios preparados con biovidrio debe tener una estructura porosa tridimensional (3 D) para promover la proliferación celular, la vascularización y la difusión de nutrientes, lo que proporciona un microambiente regulado para la síntesis de nuevos tejidos. 5. Para la ingeniería ósea, los andamios tridimensionales preparados a partir del biovidrio deben poseer porosidad interconectada para soportar la vascularización con el fin de dirigir a las células a crecer en la estructura física requerida. Se requiere una porosidad típica del 90% junto con un diámetro de poro de al menos 100 μm para la vascularización adecuada del tejido [11]. 23 4.1.3. Metales. Los biomateriales metálicos son uno de los grupos de biomateriales más utilizados junto con la cerámica, polímeros sintéticos y productos naturales. La utilidad de estos materiales metálicos se basa en la formación de una capa de óxido fina protectora. La capa de óxido se forma al exponerse al oxígeno y vuelve a formarse en milisegundos después del daño. Esta capa reduce la corrosión, uno de los requisitos de un biomaterial. Los otros requisitos incluyen biocompatibilidad, bioadhesión, bioactividad y procesabilidad [12]. En la práctica, cada metal o aleación, es decir, aleaciones de titanio, acero inoxidable y aleaciones Co-Cr, tienen sus propias ventajas para diferentes aplicaciones basadas en propiedades mecánicas, químicas y biofuncionales. Generalmente, los biomateriales metálicos se usan para aplicaciones estructurales tales como implantes, clavos y andamios para huesos debido a sus excelentes propiedades mecánicas; como el módulo de Young, la resistencia a la tracción, la ductilidad, la resistencia a la fatiga y la resistencia al desgaste. Sin embargo, se pueden usar para dispositivos completamente funcionales y sin carga, como válvulas y marcapasos cardíacos. La primera generación de biomateriales metálicos fue diseñada para una toxicidad mínima. La segunda generación ha sido diseñada para la funcionalidad tanto a nivel mecánico como molecular para mejorar la integración del material en el entorno biológico y aumentar la longevidad del implante. La tercera generación se ha centrado no solo en la funcionalidad, sino también en la regeneración del tejido circundante junto con el material bioactivo [13]. 4.1.3. Biomateriales híbrido (O/I). Una definición de lo que es un material híbrido es dada por la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada, por sus siglas en inglés (IUPAC) y dice: "Un material 24 híbrido se compone de una mezcla íntima de componentes inorgánicos, componentes orgánicos o ambos tipos de componentes. Nota: los componentes suelen interpenetrarse en escalas demenos de 1 μm" [14]. La clasificación de la IUPAC tiene la desventaja de que cubre una gama de materiales, incluidos los materiales cristalinos inorgánicos, mezclas de polímeros y nanocompuestos. Una definición específica sería: “un material híbrido consiste en al menos dos componentes, generalmente un componente orgánico y otro inorgánico, que se dispersan molecularmente”. Siguiendo esta definición, los materiales híbridos son un caso especial de compuestos que muestran una mezcla de los diferentes componentes en la escala molecular [15]. 4.1.3.1. Híbridos basados en polímeros. Los componentes orgánicos en materiales híbridos orgánicos/inorgánicos son moléculas orgánicas llamadas polímeros o compuestos macromoleculares. Los híbridos basados en polímeros se obtienen mediante diferentes procesos. Una ruta de síntesis es el proceso de sol gel, que se aplica en presencia de un polímero en disolución y que podría o no formar un enlace químico entre los dos componentes. En el caso de no formar un enlace químico entre los componentes orgánicos y los inorgánicos, los componentes inorgánicos se incorporan al polímero como bloques moleculares [16]. La mayoría de las veces se prefieren las interacciones químicas entre el polímero orgánico y el componente inorgánico, lo que generalmente conduce a materiales estables y altamente homogéneos. Se usan diversas estrategias para formar tales sistemas, uno de los enfoques aplicados es la polimerización in situ del polímero orgánico en presencia del componente inorgánico. Para obtener sistemas homogéneos, es importante que el polímero y los componentes inorgánicos muestren una compatibilidad alta que generalmente se logra mediante algún tipo de interacción química, de tipo fuerzas van-der-Waals, puentes de hidrógeno, enlaces coordinados o covalentes [17]. 25 4.2. Ingeniería Tisular. La ingeniería tisular implica el desarrollo de reemplazos funcionales para tejidos u órganos dañados. Un enfoque común para producir andamios tisulares es agregar células a una matriz extracelular natural o sintética, que proporciona soporte mecánico y señales bioquímicas. El andamio tisular puede prepararse total o parcialmente antes de la implantación para activar la capacidad regenerativa del cuerpo. La ingeniería tisular es un subconjunto del amplio campo de la medicina regenerativa, que busca reparar o reemplazar los órganos dañados. Esto podría ocurrir por inyección directa de células o modificando procesos celulares para iniciar la reparación y proliferación. A pesar de los avances importantes de investigación en biología celular y biomateriales, algunos productos han surgido de estos esfuerzos hasta la fecha, lo que apunta a los desafíos para desarrollar tejidos funcionales [18]. La clave en el diseño para producir tejidos funcionales in vitro son reproducir la estructura del tejido y la densidad celular in vivo , identificar fuentes adecuadas de células, promover el crecimiento y la diferenciación de las células, diseñar un constructo que reproduzca la matriz extracelular, con las señales moleculares apropiadas y las propiedades mecánicas adecuadas; así como, crear una vasculatura dentro del constructor para permitir la oxigenación y la integración del andamio con el tejido después de la implantación [19]. 4.2.1. Ingeniería tisular en tejido cardiaco. El andamio ideal para la ingeniería del tejido cardíaco es el que combina las características siguientes. I. Propiedades mecánicas apropiadas que coincidan con las propiedades mecánicas del tejido cardíaco nativo (anisotropía, elasticidad, contractibilidad, entre otras). 26 II. Estructura apropiada que imita el microambiente del tejido cardíaco nativo (alineación anisotrópica fibrosa característica del miocardio, porosidad, morfología y porosidad del andamio). III. Propiedades superficiales apropiadas para promover la adhesión, proliferación y viabilidad de las células cardíacas, similar a la del tejido cardiaco nativo (biocompatibilidad, humectabilidad). IV. Conductividad eléctrica apropiada del andamio para permitir la propagación de la estimulación eléctrica, que ha demostrado tener un efecto positivo sobre el comportamiento celular [20]. El objetivo de la ingeniería del tejido cardíaco es reparar, regenerar o reemplazar tejidos nativos dañados mediante: I. El trasplante de células. II. La ingeniería in vitro de tejidos cardíacos para la implantación y reparación del tejido cardiaco. III. El diseño de biomateriales bioactivos para su uso en reparación cardíaca in situ mediante la promoción de la vascularización del material, la supervivencia y el crecimiento celular [21]. 4.2.2. Propiedades de los andamios destinados para la regeneración de tejido cardiaco. 4.2.2.1. Propiedades mecánicas. En cuanto a las propiedades mecánicas, debe tenerse en cuenta que el mejor andamio para la regeneración del tejido cardíaco debe tener un módulo de Young entre decenas de kPa y 1 MPa, ya que se ha informado que la rigidez del ventrículo izquierdo es de aproximadamente (10-20) kPa en el inicio de la diástole y en el intervalo (0.2-0.5) MPa al final de la diástole [22]. Otros estudios indicaron 27 que el módulo de Young del tejido cardíaco nativo está en el intervalo de (10-15) kPa, mientras que en el caso de tejido isquémico (se produce cuando el flujo de sangre que va al corazón se reduce, lo que impide que este reciba oxígeno suficiente) asociado con fibrosis, aumenta hasta (30-50) kPa. Además, Engler et al. Al aislar las células cardíacas, mostró que los cardiomiocitos solamente podían formar sarcómeros maduros con pulsaciones regulares sobre geles de poliacrilamida con un módulo de Young de aproximadamente 10 kPa [23]. Tabla 4.1. Propiedades mecánicas de algunos biomateriales usados en ingeniería tisular para tejido cardiaco [23]. Biomaterial Módulo de Young Resistencia a la tracción PGA sintético (7-10) GPa 70 MPa PLLA o PDLLA sintético (1-4) GPa (30-80) MPa Alginato natural (2.25-2.4) GPa (24.72) MPa Fibras de colágeno (2-46) GPa (1-7) MPa Gel de colágeno (0.002-0.022) MPa (1-7) KPa Miocardio de Humano (0.2-0.5) MPa (al finalizar la diástole) (3-15) KPa 4.2.2.2. Interacción entre las células cardiacas y los biomateriales con propiedades conductoras. El ventrículo del corazón en el cuerpo humano muestra una notable contractibilidad, y el mecanismo que controla esta capacidad de contracción celular, está impulsado por la contracción sincrónica de los cardiomiocitos. Para que los cardiomiocitos (CM), se contraigan con éxito, una señal eléctrica impulsa la contracción y es respaldada por las propiedades mecánicas del miocardio humano [24]. Los andamios conductores podrían regular la expresión de los marcadores específicos de cardiomiocitos, incluyendo la tropónina cardiaca T, tropónina cardiaca I y conéxina 43, lo que lleva a la funcionalización mejorada de los CM y una excelente contracción sincrónica. Los cardiomiocitos sembrados en un andamio conductivo, no sólo exhiben un comportamiento contráctil sincrónico sino 28 que aumentan los niveles de las proteínas relacionadas con la contracción cardíaca y el acoplamiento eléctrico. Por lo tanto, se afirma que uno de los problemas para la ingeniería del tejido cardíaco es, la mejora en la conductividad eléctrica del andamio (velocidad de conducción eléctrica adecuada). El control de la conductividad eléctrica en los andamios electrohilados ayudará a promover la funcionalización y la maduración de los tejidos regenerados. Los materiales que han sido tradicionalmente usados para la producción de los andamios electrohilados, no combinan las propiedades mecánicas y eléctricas apropiadas. Esta es la razón detrás de la incapacidad de la ingeniería tisular para mantenerse y promover el ritmo sincrónico de la contraccióndel miocardio nativo [25]. 4.3 Tejido muscular cardíaco. El tejido muscular cardíaco es un tipo especial de musculo que forma exclusivamente el corazón. El miocardio, junto con el endocardio y el pericardio, son los tres tejidos que forman el órgano. Este musculo debe ser capaz de contraerse y relajarse de forma ininterrumpida, desde antes del nacimiento de la persona y hasta el momento de su muerte. El miocardio se caracteriza por transmitir el impulso nervioso; además, el corazón genera una diferencia de potencial eléctrico propio, que es el responsable de su contracción [26]. El tejido miocárdico muestra una estructura jerárquica con células fibrosas alineadas, inmersas en estructuras 3D tipo panal, formados por fibras de colágeno perimisial onduladas y diferentes proteínas de la matriz extracelular. Por lo tanto, un andamio con estructura fibrosa es crucial para la organización celular, la supervivencia y la función de las células cardíacas sembradas. Para respetar la organización anisotrópica del tejido cardíaco y promover el desarrollo de un tejido cardiaco funcional, la estructura fibrosa necesita alinearse. Varios estudios demostraron que la presencia de una superficie alineada, facilita la orientación y la organización de los cardiomiocitos. Además, una alta relación superficie-volumen 29 y porosidad son elementos indispensables para la migración de las células y la vascularización [27]. 4.3.1. Células cardiacas. Los cardiomiocitos son células que forman el órgano del corazón, que deben contraerse al unísono para proporcionar una acción efectiva del bombeo sanguíneo que asegure una perfusión adecuada en los diversos órganos y tejidos. La función principal del corazón es bombear sangre eficientemente mediante un ciclo de contracción-relajación dirigido por los cardiomiocitos que trabajan. La regulación de la contractilidad de estas células individuales se logra mediante la activación de canales iónicos especializados e intercambiadores que controlan con precisión la entrada y salida de Ca2+ en la célula [28]. Las características principales de los cardiomiocitos son: I. Son las células responsables de generar la fuerza contráctil en el corazón. II. Forman el sistema de conducción cardíaca, responsable del control del latido rítmico del corazón. III. Experimentan un agrandamiento (hipertrofia) en respuesta a la demanda crónica de una mayor fuerza contráctil, la incapacidad de satisfacer estas necesidades conduce a un gasto cardíaco suficiente para la demanda en comparación con el organismo (insuficiencia cardíaca), una de las causas comunes de muerte en el mundo occidental. Una característica distintiva de los cardiomiocitos adultos es que tienen dos núcleos separados [29]. 4.3.2. Falla cardíaca. La inhibición del corazón para administrar suficiente sangre y cumplir con los requisitos metabólicos del cuerpo provocará insuficiencia cardíaca. Es una de las 30 principales causas de muerte en las naciones industrializadas, y es el resultado de cualquier enfermedad que dañe al miocardio, lo que da como resultado una menor capacidad para bombear sangre. Los daños más comunes son la enfermedad arterial coronaria y la hipertensión (presión arterial alta), pero el daño a cualquier parte de la intrincada estructura del corazón puede afectar el rendimiento cardíaco y provocar insuficiencia cardíaca. Esto incluye a las válvulas cardíacas, el sistema de conducción eléctrico del corazón o la presión externa alrededor del corazón, debido a la constricción del saco pericárdico en el que se encuentra el corazón. El infarto al miocardio es causado por una reducción significativa del suministro de sangre coronaria a un área del corazón durante un período sostenido, eventualmente formando tejido cicatricial fibroso no contráctil, con capacidad contráctil reducida o ausente en comparación con el resto del corazón sano. En la figura 4.2, se muestra un diagrama esquemático, representando el área dañada después de un ataque al corazón debido a una arteria coronaria bloqueada. Figura 4.2. Daño causado por infarto al miocardio en un corazón humano. Figura tomada de la referencia [30]. El miocardio es un tejido diferenciado que no se regenera. No puede compensar la pérdida celular que ocurre con el infarto al miocardio, lo que finalmente, lleva a una remodelación ventricular izquierda incapaz de responder a los estímulos eléctricos y a una insuficiencia cardíaca terminal. Por esta razón, el interés en desarrollar métodos nuevos para reparar y regenerar el área infartada del miocardio [30]. 31 4.3.3. Acoplamiento excitación-contracción cardiaca. El acoplamiento de excitación-contracción cardiaca es el proceso desde la excitación eléctrica de los cardiomiocitos, hasta la contracción del corazón (que impulsa la salida de la sangre). El segundo mensajero presente en el sistema contráctil es el ion Ca2+, que es esencial en la actividad eléctrica cardíaca y es el activador directo de los miofilamentos, que causa la contracción. El mal manejo del ion Ca2+ por los cardiomiocitos es una causa central de disfunción contráctil y arritmias en condiciones fisiopatológicas. Durante el potencial de acción cardíaco, el Ca2+ ingresa a la célula a través de los canales de Ca2+ activados por la despolarización como corriente de Ca2+ (ICa), lo que contribuye a la meseta del potencial de acción, como se muestra en la figura 4.3. La entrada de Ca2+ desencadena la liberación de Ca2+ desde el retículo sarcoplásmico (RS). La combinación de Ca2+ que entra y que, posteriormente promueve la liberación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico, aumenta la concentración de Ca2+ intracelular libre ([Ca2+]i), permitiendo que el Ca 2+ se una a la proteína del miofilamento (tropónina C), que luego enciende la maquinaria contráctil. Para que ocurra la relajación, la concentración de Ca2+ intracelular libre ([Ca2+]i), debe disminuir, permitiendo que el Ca2+ se disocie de la tropónina C. Esto requiere el transporte de Ca2+ fuera del citosol por cuatro vías: (1) RS Ca2+ -ATPasa, (2) intercambio sarcolemal de Na+ / Ca2+, (3) Ca2+ -ATPasa sarcolemal y (4) uniportador mitocondrial de Ca2+ [31]. 4.3.3.1. Requisitos de Ca2+ para la activación de miofilamentos. ¿Cuánto Ca2+ se requiere para activar los miofilamentos y que se produzca la contracción? Por lo general, la respuesta del miofilamento al Ca2+ se muestra como una función de [Ca2+]i libre, figura 4.3, y los miofilamentos responden 32 cooperativamente a [Ca2+]i. En el músculo ventricular, un promedio de la concentración de Ca2+ para la media activación es de 600 nmol/L. La fuerza contráctil del cardiomocito está en función de la concentración de [Ca2+]i, sin embargo, no indica cuánto Ca2+ total se requiere para activar los miofilamentos. Este problema se complica por el hecho de que hay otros receptores de unión de Ca2+ en la célula que, están en competencia dinámica con la tropónina C. De hecho, la concentración del ion calcio libre ([Ca2+]i), está tamponado, de manera que toma >100 μmol Ca2+/L citósol para elevar [Ca2+]i desde un nivel diastólico de 100 nmol/L a un nivel sistólico máximo de 1 μmol/L [32]. Figura 4.3. Modelo de regulación de Ca2+ en cardiomiocitos. La despolarización del sarcolema provoca la apertura de los canales de Ca2+, dependientes la diferencia de potencial y la entrada de Ca2+ en el medio extracelular. El flujo de Ca2+ activa los canales de liberación de Ca2+ en el retículo sarcoplásmico cercano, causando aumentos adicionales en Ca2+ y ciclos de liberación de Ca2+. El aumento de Ca2+ interactúa con los miofilamentos para mejorar la interacción entre actina y miosina y así aumentar la contractilidad. El Ca2+ se reduce mediante la recaptación en la SR a través de la Ca2+ ATPasa. El
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