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Aprendiendo Biologia

20/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS PROTEOMAS DE
MICOBACTERIAS NO TUBERCULOSAS DE
AISLAMIENTOS AMBIENTALES

T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

MAESTRIA EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS

P R E S E N T A:

MARTHA ELVA MERCADO MORALES

MÉXICO, D. F. 2009

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
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respectivo titular de los Derechos de Autor.

JURADO ASIGNADO:

Presidente: Dr. Marco Antonio Cerbón Cervantes

Vocal: Dr. Guillermo Mendoza Hernández

Secretario: Dr. Enrique Ortega Soto

1er Suplente: Dr. Ignacio Camacho Arroyo

2do Suplente: Dr.José Edgardo Escamilla Marván

Sitio en donde se desarrolló el tema: Programa de Inmunología Molecular Microbiana, en el 4º
piso del Edificio de Investigación de la Facultad de Medicina, UNAM.

Dra. Yolanda López Vidal QFB. Martha E. Mercado Morales
Asesor Sustentante

iii

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a la Dra. Yolanda López Vidal por la asesoría y el gran apoyo brindado para la
realización de esta tesis.

Agradezco a la Universidad Nacional Autónoma de México por el apoyo económico otorgado al
“Programa Transdisciplinario en Investigación y Desarrollo para Facultades y Escuelas” para el
Megaproyecto: “Nuevas Estrategias Epidemiológicas, Genómicas y Proteómicas en Salud
Pública. Tuberculosis” SDEI.PTiD.05.4

DEDICATORIAS

DDeeddiiccoo eessttaa tteessiiss aa mmii ffaammiilliiaa,, aammiiggooss yy ccoommppaaññeerrooss ddeell PPrrooggrraammaa ddee
IInnmmuunnoollooggííaa MMoolleeccuullaarr MMiiccrroobbiiaannaa.. GGrraacciiaass ppoorr ttooddoo ssuu ccaarriiññoo,, ssuu
aayyuuddaa yy eell aappooyyoo iinnccoonnddiicciioonnaall qquuee mmee hhaann bbrriinnddaaddoo ssiieemmpprree..

v
INDICE

Pág.

Abreviaturas………………………………………………………………………………………………..vii
Introducción………………………………………………………………………………………………..viii
Resumen………………………………………………………………………………………………….....x

I. Antecedentes
I.1. Micobacterias no tuberculosas (MNT)....................................................................... .........1
I.1.1. Generalidades.…………………………………………………………………..………..1
I.1.2. Epidemiología.…………………………………………………………………………….4
I.1.3. Vía de Infección.……………………………………………………………………...…..6
I.2. Importancia de las MNT en el control de la Tuberculosis.……………………………………7
I.2.1. Interferencia con la vacuna M. bovis BCG.………………………………………...….8
I.2.2. Interferencia en el diagnóstico de Tuberculosis.…………………………………….13
I.3. Proteómica. Nuevas estrategias para el estudio de las proteínas.……………………….14
II. Justificación…….…………………………………………………………………………………..17
III. Objetivos.……………………………………………………………………………………………18
IV. Hipótesis…………………………………………………………………………………………….19
V. Metodología
V.1. Selección de cepas de MNT…………………………………………………………………20
V.2. Obtención de cultivos semilla………………………………………………………………..20
V.3. Elaboración de curvas de crecimiento……………………………………………………...21
V.4. Obtención de proteínas de extracto celular………………………………………………..22
V.5. Electroforesis en gel de dos dimensiones (2D-GE)……………………………………….23
V.5.1. Primera dimensión…………………………………………………………………...24
V.5.2. Segunda dimensión………………………………………………………………….24
V.6. Análisis de geles bidimensionales…………………………………………………………..25
V.7. Identificación de proteínas……….………...………………………………………………..25
VI. Resultados
VI.1. Caracterización macro- y microscópica de las cepas de MNT seleccionadas………..27
VI.2. Cultivos semilla……………………………………………………………………………….28
VI.3. Curvas de crecimiento……………………………………………………………………….30
VI.4. Proteínas de extracto celular……………………………………………………………….32
vi
Pág.

VI.5. Electroforesis en gel de dos dimensiones (2D-GE)
VI.5.1. Estandarización de las condiciones electroforéticas y de separación………..40
VI.5.1.1. Intervalo de pH………………………………………………………….40
VI.5.1.2. Cantidad de proteínas………………………………………………….41
VI.5.1.3. Isoelectroenfoque………………………………………………………42
VI.5.2. Geles bidimensionales de las cepas de MNT estudiadas…………………..…43
VI.6. Análisis comparativo de los proteomas de las MNT estudiadas………………………..49
VI.7. Identificación de proteínas…………………………………………………………………..52
VII. Discusión…………………………………………………………………………………………...58
VIII. Conclusiones………………………………………………………………………………………66
IX. Anexos
IX.1. Anexo A. Medios de cultivo y soluciones utilizadas……………………...……………….67
IX.2. Anexo B. Tinción de Ziehl-Neelsen…………………………………………………………69
IX.3. Anexo C. Tinción con nitrato de plata………………………………………………………70
IX.4. Anexo D. Tinción con Coomasie coloidal (Silver Blue)…………………………………...71
IX.5. Anexo 1. SDS-PAGE de proteínas extracto celular de los cultivos independientes…..72
IX.6. Anexo 2. Identificación de proteínas de extracto celular de las diferentes especies de
MNT………………………………………………………………………………….73
X. Referencias........................................................................................................ ..................78

vii

ABREVIATURAS

ATCC American Type Culture Collection
BCG Bacilo Calmette-Guérin.
DNA Ácido Desoxirribonucléico
IEF Isoelectroenfoque
LJ Medio Löwenstein Jensen
M Molar
MAC Complejo M. avium-M.intracellulare
MAIS Complejo M. avium-M. intracellulare-M.scrofulaceum
MNT Micobacterias no tuberculosas
M7H9 Medio Middlebrook 7H9
M7H10 Medio Middlebrook 7H10
PPD Derivado Proteico Purificado
RNAr Ácido Ribonucleico ribosomal
SDS-PAGE Electroforesis desnaturalizante en geles de
poliacrilamida
SIDA Síndrome de Inmunodeficiencia Humana
UFC Unidades formadoras de colonia
VIH Virus de Inmunodeficiencia Humana
ZN Tinción Ziehl-Neelsen
2D-GE Electroforesis en gel de dos dimensiones
2D Dos dimensiones
°C Grados centígrados
h Hora
kDa Kilodaltones
kVh Kilovolts hora
μg Microgramos (1x10-6 g)
μm Micrómetros (1x10-6 m)
mg Miligramos
min Minutos
mL Mililitros
mm Milímetros
mM Milimolar
ppm Partes por millón
rpm Revoluciones por minuto
s Segundos
V Volts
Vh Volts hora

viii

Introducción

La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por M. tuberculosis yes
responsable de la muerte de más de dos millones de personas cada año. Esta situación se
agrava debido a la creciente coinfección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y al
surgimiento de cepas de M. tuberculosis fármaco-resistentes [1].

La tuberculosis se presenta en todo el mundo independientemente de factores
geográficos o raciales. Sin embargo, la mayor incidencia se concentra en los países en vías de
desarrollo, frecuentemente asociado a las clases socioeconómicas bajas, siendo característicos
la desnutrición, el hacinamiento humano y las malas condiciones de higiene en estas regiones
[2].

La medida de prevención más importante contra la tuberculosis es la vacunación con
una cepa viva atenuada de M. bovis comúnmente conocida como BCG (bacilo Calmette-Guérin),
la cual, no previene la infección, pero si protege contra las formas graves de la enfermedad
(tuberculosis miliar y meníngea) y reduce el riesgo de progresión a tuberculosis pulmonar y de
muerte. Sin embargo, los ensayos clínicos controlados realizados en los más de 80 años de uso
de la vacuna BCG mostraron que su eficacia protectora no ha sido consistente ya que varía entre
0% y 80% [3]. En México este comportamiento se refleja en la disminución discreta de nuevos
casos de tuberculosis.

ix
Actualmente una de las hipótesis más aceptadas sobre la causa de variación en la
eficacia protectora de la vacuna M. bovis BCG, es la interferencia ocasionada por la previa
sensibilización con micobacterias no tuberculosas (MNT) debido a la reacción cruzada que
presentan con M. tuberculosis y M. bovis [4]. Las MNT están ampliamente distribuidas en la
naturaleza y han sido aisladas de una amplia variedad de reservorios ambientales, por lo que la
exposición a ellas es un evento frecuente [5].

En vista de estas limitaciones, se ha incrementado el interés en el desarrollo de nuevas
vacunas y la búsqueda de herramientas diagnósticas específicas. En los últimos años una
variedad de novedosas tecnologías han surgido para el estudio de biomoléculas, dentro de este
campo se encuentran los mapas de expresión proteica cuyo principio es comparar los espectros
de proteínas expresadas bajo ciertas condiciones, con el objetivo de identificar la presencia o
ausencia de ciertas proteínas, su expresión diferencial o modificaciones específicas que ocurran
en éstas y que permitan desarrollar reactivos diagnósticos y/o determinar posibles blancos
terapéuticos.

Con el fin de contribuir al desarrollo de reactivos específicos de diagnósticos, se ha
realizado en este trabajo la determinación e identificación de proteínas que estuvieron presentes
en todas las cepas de MNT aisladas del agua para uso y consumo humano de la Ciudad de
México, con la perspectiva de ser utilizadas como marcadores de exposición únicamente a MNT.
Para lograr este objetivo se empleó uno de los métodos más ampliamente usados para el
estudio de proteínas, la electroforesis bidimensional, debido a su capacidad de separar miles de
proteínas diferentes simultáneamente resultando una técnica muy útil cuando se trata de
mezclas complejas de proteínas.

ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS PROTEOMAS DE MICOBACTERIAS NO
TUBERCULOSAS DE AISLAMIENTOS AMBIENTALES

Resumen

Las micobacterias no tuberculosas incluyen aquellas especies del género
Mycobacterium que no son miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis encontrándose
ampliamente distribuidas en la naturaleza. Las MNT son consideradas microorganismos
oportunistas afectando principalmente a la población inmunocomprometida, aunque cada vez
son más frecuentes las infecciones por MNT en sujetos inmunocompetentes [6]. Hasta el
momento no existe evidencia de transmisión de persona a persona, por lo que se sugiere que el
vehículo principal de transmisión es el agua.

Adicionalmente, investigaciones recientes señalan a la exposición a MNT como una de
las principales causas en la variación de la eficacia protectora de la vacuna M. bovis BCG así
como de la baja sensibilidad y especificidad de la prueba de intradermorreacción (PPD), debido a
la reacción cruzada que presentan antígenos de MNT con M. bovis y M. tuberculosis [7,8]. Por lo
que, la búsqueda de proteínas con potencial para su uso en el desarrollo de vacunas y reactivos
de diagnóstico se ha incrementado.

El objetivo de este trabajo es realizar un análisis comparativo de los proteomas de MNT
frecuentemente aisladas en agua para uso y consumo humano en la Zona Metropolitana de la
xi
Ciudad de México y determinar cuáles son aquéllas proteínas de expresión única y común entre
las diferentes cepas de MNT.

Se seleccionaron seis cepas de MNT para este estudio, cuatro fueron aisladas de agua
para uso y consumo de la Ciudad de México (M. nonchromogenicum tipo I, M.
nonchromogenicum tipo II, M. gordonae y M. peregrinum), una recuperada en agua superficial de
los Canales de Xochimilco identificada como M. avium y por último una cepa de M.
nonchromogenicum ATCC 19550. A partir de cultivos realizados bajo las mismas condiciones y
cosechados en la misma fase de crecimiento, se obtuvieron las proteínas de extracto celular de
cada una las MNT. Las proteínas fueron separadas por electroforesis en gel de dos dimensiones
(2D-GE) y analizados in silico con el programa PDQUEST 2-D v8.0. Posteriormente, se
seleccionaron nueve proteínas detectadas como comunes a todas las cepas de MNT estudiadas
y de 4-6 proteínas únicas para identificación por espectrometría de masas.

Al comparar los patrones proteicos obtenidos en los geles de dos dimensiones de las
diferentes cepas de MNT estudiadas obtenidos bajo las mismas condiciones, se encontró que el
porcentaje de proteínas compartidas entre cepas se correlaciona con su cercanía filogenético, el
80% de las proteínas son de expresión común (en al menos dos cepas de MNT) y el 17-24% de
las proteínas restantes son de expresión única para cada una de las cepas. La distribución de
las proteínas de extracto celular por masa molecular y punto isoeléctrico fue similar en las cinco
cepas de MNT, detectándose un mayor número de proteínas resueltas por 2D-GE para M. avium
(1,486 proteínas).

En las proteínas comunes seleccionadas para su identificación, se encontró seis
proteínas de metabolismo y cuatro proteínas que participan en mecanismos de duplicación,
xii
transcripción y traducción. En cuanto a las proteínas únicas para cada cepa de MNT la mayoría
está involucrada principalmente en metabolismo, tres más están asociadas a virulencia y cuatro
son reportadas como de función desconocida.

El potencial de las proteínas comunes a las cinco especies de MNT como marcadores
de exposición depende no solo de su presencia o ausencia en el proteoma de M. tubercuosis y
M. bovis BCG, sino también del reconocimiento inmune en individuos con tuberculosis e
individuos sanos. Sin embargo, resulta interesante el hecho de que cuatro proteínas comunes de
las MNT no presentan una secuencia de aminoácidos similar a las reportadas para M. bovis BCG
o para M. tuberculosis, siendo posible su identificación únicamente por la disponibilidad de una
secuencia similar en otras micobacterias saprofitas o en otros microorganismos.

ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS PROTEOMAS DE MICOBACTERIAS NO
TUBERCULOSAS DE AISLAMIENTOS AMBIENTALES

I. ANTECEDENTES

I.1. Micobacterias no tuberculosas (MNT)

Las micobacterias no tuberculosas (MNT) incluyen aquellas especies del género
Mycobacterium que no son miembros del complejo Mycobacterium tuberculosis (de ahí el
término micobacterias no tuberculosas). Se distinguen de las del complejo, por no ser patógenos
obligados y encontrarse ampliamente distribuidas en el ambiente [5].

Desde su identificaciónse han empleado una gran variedad de términos para
describirlas: anónimas, inclasificadas, oportunistas, atípicas, ambientales, no tuberculosas o
MOTT (mycobacteria other than tubercle bacilli) por sus siglas en inglés. Aunque todos estos
términos son aceptados, la mayoría de los autores emplean el término de atípicas o no
tuberculosas [9].

I.1.1. Generalidades
Las micobacterias son microorganismos aeróbicos -con excepción de algunas especies
que crecen bajo atmósferas de oxígeno reducido-, crecen más lentamente que otras bacterias,
no forman esporas, son inmóviles, no capsuladas y no presentan una agrupación característica.

2
La morfología colonial de las micobacterias varía entre especies, puede ir de lisa a
rugosa y de no pigmentada a pigmentada (amarillas, naranjas o raramente rosas) usualmente
debido a la formación de pigmentos carotenoides (figura 1A, tabla 1). Son bacterias
pleomórficas (bacilos rectos y/o ligeramente curvos), miden 0.2 a 0.6 m de ancho por 1.0 a 10
m de largo (figura 1B) y exhiben gran variación en la velocidad de crecimiento con tiempos de
duplicación de 2 a 48 h. Además, contienen una pared celular gruesa y con un elevado
contenido lipídico que le confiere una escasa permeabilidad celular, que es responsable entre
otras cosas, de la ineficacia de múltiples agentes antimicrobianos, así como de la característica
ácido-alcohol resistencia en determinadas tinciones para su visualización microscópica (figura
1C) [10].

Figura 1. Características macro- y microscópicas del género Mycobacterium. (A) Colonias
aisladas típicas de M. tuberculosis (B) Microscopia electrónica del género Mycobacterium (C)
Tinción de Ziehl-Neelsen. El colorante primario es la fucsina fenicada (carbolfucsina), el cual
penetra al interior de la micobacteria por medio de calor. Una vez dentro, el colorante no puede ser
extraído tras la exposición al alcohol-ácido debido a que los residuos de ácido micólico de la pared
celular retienen el colorante primario. Los bacilos se tiñen de rojo sobre un fondo azul o verde
dependiendo del colorante de contraste utilizado.

El 60% de la pared celular de las micobacterias se encuentra conformada por lípidos
diversos. La pared celular peptidoglicolípida contiene ácido meso-diamin-opimélico, alanina,
ácido glutámico, glucosamina, ácido murámico, arabinosa y galactosa. Los ácidos micólicos
www.pasteur.ac.ir/researchDepartment/Mycobacteriology/Index.htm
A B C
3
(contienen entre 60 y 90 átomos de carbono) junto con lípidos libres (como 6,6’-dimecolato de
trehalosa), le proporcionan una barrera impermeable hidrofóbica (figura 2). Otros ácidos grasos
importantes son las ceras, fosfolípidos, ácidos micoserosicos y ácidos ftienoicos. Diversos
ácidos grasos (10-20 átomos de carbono) son encontrados también, incluyendo ácido
tuberculosteárico (ácido 10-R-metil octadecanoico), único componente celular para algunos
miembros de los Actinomycetales [10].

Su pared bacteriana con alto contenido de lípidos complejos les confiere una alta
resistencia a la desecación, al poder bactericida o bacteriostático de álcalis, ácidos y oxidantes
haciéndolas capaces de sobrevivir por semanas o hasta meses sobre objetos inanimados
(protegidos de la luz solar) [10].

Figura 2. Envoltura celular del género Mycobacterium. Tres estructuras mayores la
conforman: membrana citoplasmática, pared celular y la capa lipídica externa. La
pared celular está compuesta de peptidoglicanos unidos covalentemente a la
arabinogalactana y en la porción más distal y externa se hallan esterificadas largas
cadenas carbonadas (ácidos micólicos) [14].

4
Se han aislado MNT de una amplia variedad de reservorios ambientales: agua, suelo,
aire, alimentos, protozoarios, plantas, animales y humanos [11-13].

Actualmente se han identificado más de 100 especies diferentes de micobacterias no
tuberculosas [15]. Aunque muchas de ellas son saprofitas, algunas son potencialmente
patógenas para el hombre (aproximadamente una tercera parte ha sido asociada con
enfermedades en humanos), teniendo un impacto significativo en la mortalidad y morbilidad en
humanos y un impacto económico importante en la agricultura [16].

I.1.2. Epidemiología

Las enfermedades causadas por MNT tienen diversas manifestaciones clínicas y han
sido agrupadas de manera general como micobacteriosis.

Antes del advenimiento del SIDA, las enfermedades predominantes causadas por MNT
eran pulmonares, afectando principalmente a hombres de 60 años, con condiciones pulmonares
predisponentes o bien, secundarias a funciones laborales, agrícolas o domésticas debidas a la
inhalación de humo de carbón o polvo produciendo pneumoconiosis (pulmón negro) [6, 17].

A mediados de la década de 1980, el panorama de las enfermedades por micobacterias
no tuberculosas cambió radicalmente en todo el mundo debido a la emergente epidemia del
SIDA. Actualmente las MNT han emergido como la principal causa de infecciones oportunistas
en individuos con SIDA, por lo que su importancia en la salud pública, aún en países
industrializados, se ha incrementado (en Estados Unidos y Europa entre el 25 y 50% de los
pacientes con SIDA son infectados con MNT) [6].
5

Las infecciones por MNT son más frecuentes en pacientes inmunocomprometidos, sin
embargo, cada vez se diagnostica un mayor número de infecciones micobacterianas en sujetos
inmunocompetentes [18].

La infección causada por MNT puede ser local o sistémica dependiendo de la
predisposición local y/o grado de inmunidad. En algunos casos los factores predisponentes son
muy obvios como bronquioectasia, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema,
pneumoconiosis, silicosis, fibrosis quística, escoliosis torácica, procedimientos quirúrgicos,
inyecciones, ruptura de la superficie de la piel debido a heridas y estados de inmunidad
deficiente generalizados (SIDA, uso de agentes inmunosupresores en pacientes con
transplantes, alcoholismo crónico). Sin embargo las condiciones predisponentes son menos
claras en otros individuos como en la adenitis infantil [16].

En pacientes inmunocompetentes, diferentes MNT pueden causar enfermedad
pulmonar localizada, adenitis, infecciones de tejido blando, infecciones de articulaciones/hueso,
úlceras de piel; las enfermedades diseminadas se presentan con mayor frecuencia en individuos
inmunodeficientes como pacientes transplantados o con leucemia [16, 18].

Las micobacterias no tuberculosas también se han reportado como responsables de
infecciones nosocomiales y enfermedades ocupacionales. Las infecciones nosocomiales están
frecuentemente asociadas con los distribuidores de agua a hospitales y el equipo de lavado [16].
En cuanto a la salud ocupacional, las MNT son consideradas agentes causales de pneumonitis
hipersensible, asma y bronquitis en trabajadores de máquinas expuestos a fluidos metálicos y
sus aerosoles, que son usados en la industria metalúrgica para enfriado y lubricación [19-22].
6
Infecciones en piel, generalmente asociadas con cortes o abrasiones de esta, se han observado
en personas que trabajan en la industria pesquera o en aquellas en las que sus labores
requieren del contacto constante con agua (albercas, acuarios, turismo acuático, etc), siendo el
principal agente causal M. marinum [6].

I.1.3. Vía de infección

No se ha confirmado la transmisión de MNT de persona a persona, por lo que se sugiere
que la infección ocurre a través de fuentes ambientales siendo el agua el principal vehículo de
transmisión [16]. Los humanos son expuestos a las micobacterias presentes en agua por
contacto, ingestión e inhalación de aerosoles siendo un ejemplo la linfadenitis cervical en niños,
la cual es resultado de la ingestión de micobacterias en el agua para beber y posiblemente de
objetos contaminadosen el suelo que son llevados a la boca.

La tolerancia de las micobacterias a un intervalo amplio de pH y temperatura, su
resistencia a diferentes desinfectantes [10, 23, 24] y su capacidad de crecer en bajas
concentraciones de materia orgánica las hacen capaces de sobrevivir, colonizar, persistir, crecer
y multiplicarse no solo en las fuentes ambientales sino también en los sistemas de distribución
de agua potable [25-30].

Las actividades humanas también influyen en la distribución y prevalencia de
micobacterias [5,6]. El tratamiento del agua con cloro u otros desinfectantes como el ozono con
el fin de potabilizarla, favorece la persistencia y selección de las micobacterias ambientales
altamente resistentes [26-30]. El complejo M. avium por ejemplo, exhibe una mayor resistencia
7

al cloro en comparación a otras especies; M. aurum, una de las especies más débiles, es 10 a la
100 veces más tolerante que E. coli [5].

I.2. Importancia de las MNT en el control de la Tuberculosis

Un factor adicional de la importancia del estudio de MNT es que son consideradas como
una de las posibles causas de la variabilidad en la eficacia protectora de la única vacuna
disponible contra la tuberculosis.

La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por M. tuberculosis y es
responsable de la muerte de más de dos millones de personas cada año [1]. La tuberculosis se
presenta en todo el mundo independientemente de factores geográficos o raciales (figura 3). La
medida de prevención más importante contra la tuberculosis es la vacunación con una cepa viva
atenuada de M. bovis comúnmente conocida como BCG (bacilo Calmette-Guérin). Sin embargo,
su eficacia protectora no ha sido consistente ya que varía entre 0% y 80%, observándose una
mayor protección en niños sobre todo contra las manifestaciones más graves de la enfermedad
(meníngea y miliar). De manera generalizada se ha observado que la menor eficacia se presenta
en regiones tropicales y subtropicales cercanas al ecuador, donde se concentran los países
menos desarrollados [4, 31] .

La variación de la eficacia protectora de la vacuna BCG ha sido sujeta a debate desde
1950 y se han propuesto diferentes hipótesis para explicarla: diferencias genéticas en la
8
susceptibilidad del hospedero, variaciones en las cepas de BCG, la edad de vacunación, las
diferencias metodológicas y la exposición a MNT [4, 5, 32].

I.2.1. Interferencia con la vacuna M. bovis BCG

Actualmente una de las hipótesis más aceptadas es la interferencia ocasionada por la
previa sensibilización con MNT. Las micobacterias ambientales, presentan características
genotípicas y fenotípicas comunes con M. tuberculosis y M. bovis que resulta en reactividad
cruzada por la presencia de antígenos comunes, incluso con los antígenos más
inmunodominantes como el Ag85 [7, 8].
Figura 3. Distribución de la tuberculosis en el mundo en el 2006 [1].
9

Algunos estudios realizados sugieren que la previa sensibilización a micobacterias
ambientales afecta la eficacia de la vacunación con BCG en humanos en algunas áreas. Por
ejemplo, la vacuna BCG es eficiente en estudios en los que los donadores que tienen una
prueba positiva a la tuberculina previa vacunación no son incluidos y además los criterios de
exclusión aplicados entre los distintos estudios son totalmente diferentes. En países
desarrollados como Reino Unido, la prueba de la tuberculina se considera positiva cuando la
induración es mayor a 5 mm de diámetro, por el contrario, en los trópicos en donde existen
niveles de sensibilización elevados a MNT y una baja cobertura en protección de BCG, se
necesita un diámetro de 10-15 mm de la induración para considerar la prueba como positiva [8,
33].

En un estudio realizado en Malawi, una de las zonas con mayor incidencia de
tuberculosis, se encontró que existe respuesta inmune a antígenos de MNT previa vacunación
con M. bovis BCG y aún más, esta respuesta se asoció a niveles bajos de respuesta de IFN- a
BCG en adultos [34-36]. Este efecto podría ser dependiente de la frecuencia de exposición y de
las especies encontradas en la región.

En Inglaterra, en donde la protección de BCG contra la tuberculosis pulmonar es del 60-
70%, Weir y col. [37] evaluaron la respuesta inmune previa vacunación con BCG en
adolescentes (13-15 años de edad) determinando concentraciones de IFN- y la respuesta de
hipersensibilidad de tipo tardío al PPD con M. tuberculosis y MNT. Sus resultados mostraron que
aunque existe sensibilización a micobacterias no tuberculosas antes de la vacunación, la
respuesta es considerablemente más baja para todas las especies de MNT estudiadas en
10
comparación con la reportada por Black y col. [35] en Malawi, donde el nivel de protección por la
vacuna es bajo.

En Finlandia, en donde la incidencia de tuberculosis es baja, Kröger y col. [38]
evaluaron la reactividad a la tuberculina y la sensibilización a MNT en niños de 4-6 años,
reevaluándolos 6 años después. Su estudio muestra que tanto la reacción a la tuberculina como
la sensibilización a MNT disminuye significativamente con la edad y aún más, se encontró una
asociación positiva entre los sujetos que tenían contacto con mascotas o animales de granja y
una respuesta elevada en ambas pruebas.

En modelos animales se ha encontrado que las MNT son capaces de alterar la
respuesta inmune inducida por vacunación [39]. El mecanismo preciso por el cual ocurre esto no
ha sido aclarado, aunque existen algunas propuestas, basadas en la cercanía filogenética de las
especies dentro del género Mycobacterium.

Una de las hipótesis fue propuesta por Palmer y colaboradores en 1966 y se denominó
hipótesis del enmascaramiento. Esta propuesta sugiere que la exposición a micobacterias
ambientales ofrece algún nivel de respuesta inmune protectora contra la tuberculosis y el efecto
protector adicional que pueda conferir la vacuna BCG sobre la respuesta inmune previamente
inducida por las MNT es limitado. Sin embargo, esta hipótesis sugiere que las áreas con altos
niveles de sensibilización a las micobacterias ambientales deberían tener incidencias bajas de
tuberculosis ya que el nivel respuesta inmune producido por MNT sería igual o mayor al
conferido por BCG, lo cual no ocurre [4].

11
Otra hipótesis propuesta es denominada hipótesis de bloqueo, la cual sugiere que la
respuesta inmune pre-existente a los antígenos comunes de las micobacterias ambientales
bloquea la replicación de M. bovis BCG. La respuesta inmune previa inducida por las MNT es
reclutada después la vacunación, controlando la replicación de la cepa vacunal y bloqueando la
diseminación de BCG. Los niveles de protección provistos por las MNT no tienen que ser
necesariamente elevados, para interferir con la replicación. A diferencia de la hipótesis de
enmascaramiento, en la hipótesis de bloqueo, la inmunidad parcial inducida por las
micobacterias ambientales tiene una influencia mínima sobre la cepa virulenta M. tuberculosis
[4].

Las dos hipótesis anteriores no son mutuamente excluyentes y es posible que ambos
mecanismos estén involucrados. Sin embargo, existen algunas evidencias que señalan al
bloqueo como el mecanismos más probable [7, 8, 40].

Brandt y col. [40] demostraron que la exposición previa a MNT vivas puede resultar en el
desarrollo de una respuesta inmune que es rápidamente evocada después de la vacunación con
BCG y es capaz de controlar la multiplicación de la cepa vacunal, provocando una respuesta
inmune protectora deficiente contra M. tuberculosis. En su estudio evaluaron 6 diferentes
aislamientos de MNT recuperadas de agua y suelo en el distrito de Karonga (M. fortuitum, M.
chelonae y el complejo M. avium), sus resultados muestran que solo las cepas de MNT capaces
de multiplicarse en el huésped(M. avium) pueden bloquear la actividad de la BCG. Por lo que
sugieren que la variación en la protección de la vacuna BCG depende de la virulencia de las
cepas de MNT a las que se es expuesto.

Demangel y col. [7] evaluaron el efecto de la sensibilización con tres especies diferentes
de MNT (M. avium, M. scrofulaceum y M. vaccae) en la persistencia y eficacia protectora de la
cepa BCG en modelo murino. La multiplicación del bacilo M. bovis BCG previa exposición a M.
scrofulaceum o M. vaccae fue diferente a la de M. avium. La sensibilización con M. avium
resultó en el aclaramiento de BCG en pulmones y bazo a los 21 días después de la inoculación,
mientras que la sensibilización con M. scrofulaceum y M. vaccae solo elimina al bacilo vacunal
en pulmón pero no en bazo, en donde su persistencia no fue modificada. Aún más, los animales
expuestos a M. scrofulaceum o M. vaccae previo a la vacunación con BCG mostraron una
protección mayor contra tuberculosis en comparación con los controles no sensibilizados. Por el
contrario la sensibilización con M. avium disminuyó la eficacia protectora conferida por la vacuna
BCG. Demangel y col. atribuyen estas diferencias al tipo de antígenos que comparten las MNT
con la vacuna BCG y sugieren que la eficacia protectora de la vacuna BCG varía dependiendo
de la especie de micobacterias no tuberculosas a la que se está expuesto.

Actualmente se desconoce la frecuencia y distribución de las MNT en el mundo. Existen
algunos reportes en diferentes países de aislamiento e identificación de MNT en muestras
ambientales (aguas naturales, suelo, polvo casero) y en agua para uso y consumo humano [26-
30]. Aunque una amplia variedad de especies de MNT han sido aisladas de suelo y agua, no se
sabe si esta exposición elevada es provocada por las actividades humanas o bien es un reflejo
de la diferencia en la fauna microbiana de estas regiones.

13
I.2.2. Interferencia en el diagnóstico de Tuberculosis

La exposición a micobacterias ambientales también es responsable del escaso valor
predictivo de la prueba de PPD o tuberculina. La prueba de PPD o reacción a la tuberculina,
mide la respuesta de hipersensibilidad retardada al derivado proteico purificado de M.
tuberculosis y es hasta el momento la única prueba disponible para el diagnóstico de la infección
latente. Idealmente, la prueba de PPD pudiera ser usada como un marcador sugerente de
infección, desafortunadamente análisis de ensayos con BCG indican que esta no posee un valor
predictivo de protección, aún cuando la hipersensibilidad retardada y la inmunidad protectora
emergen a la par después de la primo infección con M. tuberculosis [41].

Una de las mayores limitaciones del PPD es el hecho de que es una mezcla cruda de
varios antígenos, muchos de los cuales son compartidos entre las diferentes especies de
micobacterias. Por lo tanto, un resultado positivo a la prueba puede ser consecuencia de
cualquiera de los siguientes eventos: infección con M. tuberculosis, vacunación previa con BCG
o exposición a MNT. Es muy bien conocido que la prueba de PPD tiene una baja especif icidad
en poblaciones con un alta cobertura de BCG y alta exposición a MNT [34].

En vista de estas limitaciones, se ha incrementado el interés en la búsqueda de
antígenos micobacteriales inmunodominantes para el desarrollo de nuevas vacunas y candidatos
a pruebas de inmunodiagnóstico [42] que permitan detectar la respuesta inducida
específicamente por M. tuberculosis y no por MNT.

El desarrollo de pruebas diagnósticas rápidas, sencillas y específicas es posible cuando
se identifica un epítope específico e inmunodominante [43]. Una de las técnicas más novedosas
14
que permiten identificar aquellas proteínas que son expresadas diferencialmente o modificadas
de manera específica son los mapas de expresión proteica.

I.3. Proteómica. Nuevas estrategias para el estudio de las proteínas

Los proyectos de secuenciación del genoma han contribuido enormemente al
conocimiento de las secuencias de DNA de muchos organismos. Sin embargo, la función de
muchos de los nuevos genes identificados es desconocida. Aún en los sistemas mejor
estudiados como E. coli y Saccharomyces cerevisiae, la función específica de la mitad de sus
genes es desconocida. Para afrontar este reto, se han desarrollado técnicas experimentales
denominadas colectivamente genómica funcional [44].

La proteómica es una rama de la genómica funcional y puede definirse como un estudio
a gran escala de las propiedades de las proteínas, sus niveles de expresión, modificaciones
post-traduccionales e interacciones con otras moléculas para obtener una visión global e integral
del proceso celular a nivel de proteína [44, 45]. La proteómica puede dividirse en dos áreas: los
mapas de expresión proteica y los mapas de interacción proteica.

Los mapas de interacción proteína-proteína involucran la determinación de los patrones
de interacción de las proteínas de la célula u organismo. Por ejemplo, si una proteína cuya
función es desconocida se encuentra interactuando con una serie de proteínas conocidas
involucradas en determinado proceso celular, puede inferirse que la proteína desconocida
contribuye al mismo proceso. Mientras que los mapas de expresión de proteínas involucran el
estudio cuantitativo de los cambios globales en la expresión de proteínas en las células, tejidos o
15
fluidos corporales usando electroforesis en dos dimensiones acoplado con espectrometría de
masas [44].

El principio de los mapas de expresión proteica es comparar los espectros de proteínas
expresadas en células o tejidos bajo diferentes condiciones ambientales o de diferentes estados
de enfermedad, con el objetivo de identificar proteínas que son expresadas diferencialmente o
modificadas de manera específica que permitan desarrollar reactivos diagnósticos y la
determinación de posibles blancos terapéuticos.

El estudio de las proteínas se realiza a través de una combinación de técnicas de
separación y de identificación. Los ensayos tradicionales para la separación de las proteínas
consisten en el uso de un número de pasos de purificación consecutivos, por ejemplo iso-electro
enfoque seguido por SDS-PAGE, una separación cromatográfica seguida por otra (intercambio
iónico seguido de cromatografía de fase reversa, etc.), una vez realizada la separación, las
proteínas pueden ser identificadas directamente a través de secuenciación o espectrometría de
masas o indirectamente utilizando ensayos de unión a ligandos o reactivos de afinidad [46].

El método estándar para estudiar el proteoma de una célula, tejido, órgano u organismo
es la separación de proteínas en geles de poliacrilamida de dos dimensiones (2D-GE) [47]. La
electroforesis de dos dimensiones es uno de los métodos más ampliamente usados para analizar
mezclas complejas de proteínas obtenidas a partir de células, tejidos u otras muestras
biológicas. Esta técnica separa a las proteínas de acuerdo a dos propiedades independientes: su
punto isoeléctrico (primera dimensión) y su masa molecular (segunda dimensión) [48]. Su
principal ventaja es su capacidad de separar miles de proteínas diferentes simultáneamente
16
determinando de cada una de ellas su punto isoeléctrico, peso molecular y la cantidad expresada
bajo una condición específica.

La electroforesis de dos dimensiones fue introducida por P. H. O’Farrell y J. Klose en
1975 [47], utilizando tubos de vidrio o plástico que contenían una capa delgada de gel de 13 cm
de longitud y 2.5 mm de diámetro, urea, detergentes, agentes reductores y anfolitas
acarreadoras para formar el gradiente de pH (mezcla de algunos cientos de diferentes
amortiguadores anfotéricos). Aunque se reconoció su potencial como una poderosa herramienta
de separación bioquímica,la técnica demandaba cierta destreza experimental y los patrones
obtenidos no eran muy reproducibles. El desarrollo de otras técnicas como las tiras de gradiente
de pH inmovilizado, la automatización del análisis de los geles, espectrometría de masas con
pequeñas cantidades de péptidos y proteínas, softwares más poderosos y menos costosos, la
disponibilidad de genomas de una mayor número de organismos y la disponibilidad de bases de
datos con secuencias de proteicas fue realmente lo que le permitió convertirse en uno de los
métodos principales en la proteómica [45, 48].

Actualmente la eletroforesis bidimensional ha sido ampliamente utilizada bajo distintas
aplicaciones: análisis de proteomas, diferenciación celular, detección de marcadores de
enfermedades, monitoreo terapéutico, descubrimiento de nuevos fármacos, cáncer y purificación
de proteínas a microescala.

II. JUSTIFICACIÓN

La exposición a MNT es un evento frecuente a nivel mundial sobre todo en países en
vías de desarrollo. Las investigaciones recientes señalan que la exposición a MNT es una de las
principales causas en la variación de la eficacia protectora de la vacuna M. bovis BCG así como
de la baja sensibilidad y especificidad de la prueba de intradermoreacción (PPD) debido a la
reacción cruzada que presentan antígenos de MNT con M. bovis y M. tuberculosis. Por lo tanto,
es necesario identificar proteínas con potencial para su uso en el desarrollo de vacunas y
reactivos de diagnóstico. La identificación de proteínas comunes entre diferentes especies de
MNT permitirá la detección de posibles marcadores de exposición únicamente a éstas,
resultando en un diagnóstico específico con un menor número de falsos positivos. Por otro lado,
la identificación de proteínas únicas permitirá la búsqueda de posibles candidatos de diagnóstico
de infección a nivel de especie por MNT.

III. OBJETIVOS

Objetivo general

Realizar un análisis comparativo de los proteomas de Micobacterias no tuberculosas
frecuentemente aisladas en agua para uso y consumo humano en la Zona Metropolitana de la
Ciudad de México.

Objetivos particulares

 Elaborar y analizar los mapas de expresión proteica de las especies de MNT aisladas en
la Zona Metropolitana de la Ciudad de México.
 Determinar cuáles son las proteínas de expresión común entre las diferentes especies
de MNT
 Identificar proteínas de expresión única en cada especie de MNT estudiada como
posibles marcadores de diagnóstico temprano de la enfermedad causada por estas.

IV. HIPÓTESIS

Existen diferencias entre los proteomas de las diferentes especies de MNT, siendo
mayor el número de las proteínas comunes que el de las únicas.

V. METODOLOGÍA

V.1. Selección de cepas de MNT.

Para la elaboración de los mapas proteómicos se seleccionó un aislamiento de cada una
de las cuatro especies encontradas en agua para uso y consumo humano de la Zona
Metropolitana de la Ciudad de México (M. nonchromogenicum tipo I, M. nonchromogenicum tipo
II, M. gordonae y M. peregrinum), un aislamiento recuperado en agua superficial de los Canales
de Xochimilco identificado como M. avium y una cepa de M. nonchromogenicum ATCC 19550.

V.2. Obtención de cultivos semilla.

El uso de medios de cultivo libres de proteínas es recomendable para la elaboración de
mapas proteómicos. El medio Sauton (anexo A) es uno de los medios de cultivo para
micobacterias más utilizados con este fin, debido a que contiene como única fuente de carbono
el glicerol. Todos los aislamientos de MNT en estudio habían sido recuperados, cultivados y
conservados en medios enriquecidos por lo que fue necesario realizar precultivos en medio
líquido enriquecido y en volúmenes pequeños de medio Sauton antes de poder obtener el cultivo
semilla (el cultivo a partir del cual serán obtenidos los cultivos independientes). El procedimiento
se describe a continuación:

21
Cada una de las cepas de MNT fue aislada en placas de Middlebrook 7H10 (anexo A) y
una sola colonia fue inoculada en 50 mL de medio líquido Middlebrook 7H9 (anexo A), el cultivo

fue incubado a 37ºC y con agitación constante a 150 rpm. Una vez que la D.O.600nm del cultivo
fue de 0.6, 100 µL de este cultivo fueron inoculados en 50 mL de medio Sauton e incubado bajo
las mismas condiciones hasta que su D.O.600nm fuera de 0.6. Posteriormente un volumen
adecuado (variable para cada una de las cepas) fue inoculado en 250 mL de medio Sauton,
incubado a 37ºC con agitación constante y cuando la D.O.600nm fue de 0.6 se cosechó por
centrifugación a 5000x/4ºC/20’. Se realizó una tinción de Ziehl-Neelsen (anexo B) para cada uno
de los cultivos para comprobar su pureza. El cultivo fue almacenado en alicuotas de 1 mL en
PBS con glicerol al 10% a -70°C A este último cultivo se le denominó cultivo semilla y todos los
cultivos posteriores fueron realizados a partir de este.

V.3. Elaboración de curvas de crecimiento.

Se elaboraron curvas de crecimiento por duplicado de cada una de las cepas de MNT
para determinar la fase de crecimiento media logarítmica. El inóculo inicial para cada uno de los
cultivos fue establecido en base a las características de crecimiento observadas durante la
obtención del cultivo semilla. Los cultivos fueron incubados a 37°C en agitación constante a 150
rpm y su D. O. (λ 600 nm) fue registrada cada 24 hrs. Se determinaron las UFC de cada una de los
cultivos en la fase media logarítmica de crecimiento realizando diluciones seriadas en PBS con
tween 80 (100 – 109) e inoculando 10 L de cada dilución en placas de M7H10 por triplicado. Las
placas fueron incubadas a 37ºC, 5% de CO2 y 30% humedad
22

V.4. Obtención de proteínas de extracto celular.

Se realizaron tres cultivos independientes en medio Sauton de cada una de las cepas de
MNT utilizando las condiciones de crecimiento ya estandarizadas. Una vez que los cultivos puros
alcanzaron la fase media logarítmica de crecimiento fueron cosechados por centrifugación a
5000 x g durante 20 min. a 4ºC. Los paquetes bacterianos obtenidos fueron lavados dos veces
con agua desionizada estéril, el paquete celular se resuspendió en agua a razón de 0.1 g por mL
(peso húmedo). La lisis de las bacterias se realizó por sonicación (sonicador Vibra Cell con
punta de 2 mm de diámetro), en presencia de inhibidores de proteasas: PMSF (concentración
final de 10 mM) y ETDA (1mM). Los pulsos fueron aplicados durante 1 min. a 13 watts/ 60
Amplitud con 1 min. de reposo en hielo. Finalmente la fracción soluble que contiene las
proteínas del extracto celular se separó por centrifugación a 14000 rpm durante 20 min. a 4°C y
se conservó a -70ºC.

Para determinar el número de pulsos que debían ser aplicados a las diferentes especies
de micobacterias se elaboró una curva de lisis por sonicación tomando muestras de la
suspensión celular a los 0, 3, 5, 9, 12, 15, 17 y 20 pulsos. La eficiencia de la lisis fue confirmada
por observación al microscopio de las muestras teñidas por la técnica de Ziehl-Neelsen. La
concentración de proteína en las muestras a los 12, 15, 17 y 20 pulsos fue determinada por el
método de Bradford y se visualizaron las proteínas en geles desnaturalizantes de acrilamida al
12.5% teñidos con plata para determinar las condiciones de obtención de proteínas de cada una
de las diferentes especies de MNT.
23

V.5. Electroforesis en gel de dos dimensiones (2D-GE)

Las proteínas de extracto celular fueron separadas por electroforesis bi-dimensional.
Esta técnica permite separar a las proteínas de acuerdo a dos propiedades independientes: su
punto isoeléctrico (primera dimensión)y su masa molecular (segunda dimensión). Para cada una
de las especies de MNT incluidas en el estudio se realizaron dos geles de cultivos
independientes.

Primero, se estandarizaron las siguientes condiciones de trabajo con proteínas de
extracto celular de M. nonchromogenicum ATCC 19550.

a) Intervalo de pH. Se realizaron geles de dos dimensiones como se describe
posteriormente pero con un pH de 3-10 para determinar el intervalo en el cual se
distribuye la mayoría de las proteínas. La reducción en el intervalo de pH permite una
mayor separación y resolución de los puntos (proteínas) dentro del gel de 2D.
b) Cantidad de proteína. Geles 2D con 80 y 100 g de proteína fueron elaborados bajo
las mismas condiciones.
c) Tiempo de isoelectroenfoque. Se probaron dos condiciones diferentes de
isoelectroenfoque, en la primera se aplicó un voltaje de 500 V por 1Vh, 2000 V hasta
2499 Vh y 2500 V hasta completar un tiempo total de enfoque de 52 kVh y en la segunda
previo a estas condiciones se aplicaron voltajes bajos de 100V por 30 min, seguido de
30 min a 250 V y 500 V por 30 min.
24

V.5.1.Primera dimensión

Para realizar la primera dimensión se utilizaron tiras de 11 cm con gradiente de pH
inmobilizado de 4-7 (tiras IPG pH 4-7Bio-Rad), estas fueron rehidratadas durante 17 h. con 80
µg de proteínas solubilizadas y desnaturalizadas con CHAPS 4%, urea 9 M, DTT 70 mM y buffer
IPG al 1%. Posteriormente se realizó el isoelectroenfoque (Multiphor II, Amershan-Pharmacia,
UK) a 17°C aplicando un voltaje de 500 V por 1Vh, 2000 V hasta 2499 Vh y 2500 V hasta
completar un tiempo total de enfoque de 52 kVh. Una vez concluido el isoelectroenfoque las
tiras fueron equilibradas a temperatura ambiente en Tris-HCl pH 8.8 50 mM, SDS 2% (p/v), urea
6 M, glicerol 30% (v/v) con DTT a una concentración de 15 mg/mL por 15 min seguido de 15 min
de incubación en Tris-HCl pH 8.8 50mM, SDS 2% (p/v), urea 6M, glicerol 30% (v/v) y 37.5
mg/mL de iodoacetamida.

V.5.2. Segunda dimensión

La segunda dimensión se realizó en geles de acrilamida al 12.5 % de 16 x 18 cm y 1 mm
de grosor, en una cámara vertical Hoeffer S600 (Hoeffer Scientific Instruments, USA). El voltaje
aplicado se incrementó gradualmente, es decir, 30 min a 50 V seguido de 1 h a 100 V
permaneciendo constante a 150 V por 4 horas. Una vez completada la electroforesis, los geles
se fijaron en una solución acuosa de etanol 40% y ácido acético 10% a 4°C durante toda la
noche. Los geles fueron posteriormente teñidos con nitrato de plata para la visualización de las
proteínas (anexo C).
25

V.6. Análisis de geles bidimensionales

Los geles resultantes fueron digitalizados y analizados in silico con el programa
PDQUEST 2-D v8.0 (Bio-Rad, Laboratories, Inc. USA). El análisis consistió primero en la edición
de cada una de las imágenes adquiridas de los geles teñidos con plata, en este paso se eliminan
todos los artefactos generados durante el proceso de tinción que el programa detecta como un
punto (proteína), se indican aquellos puntos que fueron omitidos y se define el diámetro real de
cada punto. Posteriormente, se comparan las imágenes y el programa crea una plantilla
conocida como gel maestro, la cual conserva la localización del punto en el gel original y obtiene
la representación gaussiana de la intensidad de cada punto detectado en las réplicas, esto es,
una representación tridimensional de la imagen original. El gel maestro puede incluir solo los
puntos comunes entre los duplicados de la muestra o todos los puntos encontrados. Para cada
una de las especies se elaboró un gel maestro a partir de los duplicados, conteniendo todas las
proteínas de extracto celular que fueron resueltas en cualquiera de los dos geles.

Los geles maestros de las diferentes especies de MNT fueron comparados entre sí para
determinar aquellas proteínas de expresión común y aquellas de expresión única para cada
especie.

V.7. Identificación de proteínas

Se seleccionaron nueve proteínas de extracto celular detectadas como comunes a todas
las cepas de MNT estudiadas y de 4-6 proteínas únicas (4 para M. nonchormogenicum tipo I, M.
26
nonchromogenicum tipo II y M. peregrinum, 6 para M. gordonae y 5 para M. avium) para
identificación por espectrometría de masas. La selección de los puntos se realizó en base a tres
criterios:
1. La proteína debía de observarse como un punto bien definido
2. Las proteínas seleccionadas debían de representar toda el área del gel, es decir, los
puntos seleccionados no se encontraban cercanos unos de otros
3. La intensidad del punto debería ser alta (fácilmente visible)

Para la identificación de las proteínas se realizaron geles con una concentración mayor
de proteínas de extracto celular de las diferentes especies de MNT con las condiciones
establecidas anteriormente. La cantidad de proteína utilizada fue establecida de acuerdo a la
concentración de proteína obtenida en el extracto celular de cada cepa, para M.
nonchromogenicum tipo I se emplearon 100 μg, 90 g para M. gordonae, 150 μg para M.
peregrinum y 130 μg en M. nonchromogenicum tipo II. Los geles fueron teñidos con silver blue
durante 16 h (anexo D) y enviados para la identificación de las proteínas de interés.
27
VI. RESULTADOS

VI.1. Caracterización macro- y microscópica de las cepas de MNT
seleccionadas.

Las características morfológicas de las colonias seleccionadas fueron evaluadas
mediante el examen visual del desarrollo en placas de agar Middlebrook 7H10. Las colonias
fueron caracterizadas de acuerdo a su tamaño, forma, elevación, margen (borde), color,
superficie, densidad y consistencia. La morfología colonial observada entre las diferentes cepas
de MNT seleccionadas fue distinta, con excepción de M. nonchromogenicum tipo I y M.
nonchromogenicum ATCC 19550, encontrándose colonias diversas principalmente cuanto a
color, forma y consistencia (Tabla 1).

Una característica microscópica común de todo el género Mycobacterium es su
ácido-alcohol resistencia, todas las cepas de MNT mostraron esta característica al ser teñidas
con la técnica de Ziehl-Neelsen confirmando su pertenencia a este género. Se encontró
diversidad morfológica entre los distintos aislamientos, con excepción de M. nonchromogenicum
tipo I y M. nonchromogenicum ATCC 19550, observándose con frecuencia bacilos largos con
agregación en cúmulos, lo cual es común en el género debido a las características de su pared
celular. Algunas diferencias microscópicas pueden orientar de manera presuntiva, la
identificación de alguna especie. Por ejemplo, es conocido que M. tuberculosis en medio líquido,
frecuentemente se observa como serpentina acordonada (factor cordón). El complejo M. avium
puede distinguirse por la apariencia microscópica de nido de pájaro, lo cual fue observado en el
aislamiento de M. avium utilizado para este estudio (Tabla 1).

Las diferentes especies de MNT fueron además caracterizadas de acuerdo a su
velocidad de crecimiento, la cual se basa en los días de incubación que un subcultivo sólido
necesita para la detección de colonias visibles macroscópicamente. Las micobacterias que
tarden más de 7 días fueron catalogadas como de crecimiento lento mientras que las que crecen
en menos de 7 días como de crecimiento rápido (Tabla 1). Todas las cepas de MNT utilizadas
fueron de crecimiento lento excepto M. peregrinum que se presentó como especie de rápido
crecimiento.

VI.2. Cultivos semilla

Los cultivos semilla fueron obtenidos para cuatro de los cinco aislamientos de MNT
provenientes de agua para uso y consumo humano de la Zona Metropolitana de la Ciudad de
México y para la cepa ATCC 19530 de M. nonchromogenicum. Las condiciones de obtención
del cultivo semilla se muestran en la tabla 2. Para las cepas de M.nonchromogenicum tipo I
ATCC 19530 y M. peregrinum no fue necesario realizar precultivos en medios líquidos
enriquecidos (M7H9), sin embargo, para las cepas M. nonchromogenicum tipo II y M. gordonae
la utilización de cultivos previos permite obtener la adaptación de la micobacteria en menor
tiempo. Lo anterior se observa en el precultivo de M. avium, en donde la ausencia de un cultivo
previo en M7H9 prolonga el tiempo de adaptación hasta 140 días, contrario a las cepas
cultivadas en medio enriquecido que alcanzan la fase logarítmica (D.O.600nm = 0.6) en 6 a 10
días.

Tabla 1. Características macro y microscópicas de los diferentes aislamientos de MNT estudiadas
Especie Origen de
aislamiento
Velocidad de
crecimiento
Morfologìa colonial Características
macroscópicas
Microscopia Características
microscópicas
M. nonchromogenicum
tipo I
Texcoco Lento

Colonias de 1-2 mm de
diámetro, circulares, convexas,
margen entero, color blanco,
mates, opaca, cremosa

Bacilos largos, delgados,
ZN(+), agregados en
cúmulos, fuertemente
teñidos
M. nonchromogenicum
tipo II
Texcoco Lento

Colonias de 1 mm de diámetro,
circulares, convexas, margen
entero, color blanco, brillantes,
translúcidas, cremosas

Bacilos cortos, rectos,
ZN(+), agregados
fuertemente en cúmulos
M. gordonae Xochimilco Lento

Colonias de 2 mm de diámetro,
circulares, convexas, margen
entero, color amarillo naranja,
brillante, opaca, cremosa.

Bacilos largos, anchos,
aguzados, ZN(+), agregados
en cúmulos pequeños
M. peregrinum México Rápido

Colonias de 2-3 mm de
diámetro, circulares,
umbonadas, margen entero,
color blanco, mate, opaca,
cremosa.
Bacilos largos, delgados,
parcialmente ZN+,
agregados en cúmulos e
hileras
M. avium Canales de
Xochimilco,
sitio Fernando
Celada*
Lento

Colonias de 2 mm de diámetro,
irregulares, elevadas, margen
ondulado, color amarillo, mate,
opaca, quebradiza.

Bacilos largos, delgados,
ligeramente curvos, ZN(+),
agregados en cúmulos laxos
que asemejan nidos de ave
M. nonchromogenicum
tipo I ATCC 19550
Suelo Lento

Colonias de 1-2 mm de
diámetro, circulares, convexas,
margen entero, color blanco,
mates, opaca, cremosa

Bacilos largos, delgados,
ZN(+), agregados en
cúmulos, fuertemente
teñidos
*Sitio ubicado en la zona de embarcaderos, aledaño a zona urbana
30

Además el inóculo utilizado para la obtención del cultivo semilla fue distinto para M.
gordonae y M. avium con respecto a las otras cepas, teniéndose que incrementar hasta más de
10 veces para alcanzar una D.O.600nm = 0.6 en un tiempo menor a 30 días.

Tabla 2. Condiciones de obtención de cultivos semilla de las diferentes MNT

ESPECIE DE MNT
Precultivo
M7H9a
(días)
Precultivo
Sautonb
(días)
Inóculo
lote
semillac
( µL)
Lote
Semillad
(días)
M. nonchromogenicum tipo I 30 --- ---- ---
M. nonchromogenicum tipo II 20 10 500 14
M. gordonae 20 8 1000* 7
M. peregrinum --- 6 500 5
M. avium --- 140 750* 25
M. nonchromogenicum tipo I ATCC 19530 --- 12 500 12
a Tiempo de crecimiento en días en medio Middlebrook 7H9 de cada una de las cepas de MNT (D.O.( λ=
600nm)=0.602 ± 0.3)
b Tiempo de crecimiento en días en 50 mL de medio Sauton de cada una de las cepa de MNT (D.O.( λ=
600nm)=0.625 ± 0.15 )
c Inóculo utilizado a partir del precultivo en Sauton para obtener una D.O.( λ= 600nm)≥0.6 en 250 mL de
medio Sauton para cada una de las cepas en un tiempo menor a 30 días, (*)el inóculo se encuentra
concentrado 10 veces con respecto al precultivo original
d Tiempo requerido para que la D.O.( = 600nm) del cultivo de cada una de las cepas de MNT en 250 mL de
medio Sauton sea de 0.69±0.07

El aislamiento de agua identificado como M. nonchromogenicum tipo I no pudo ser
crecido en medio Sauton por lo que la cepa fue excluida del estudio.

VI.3. Curvas de crecimiento
Se realizaron curvas de crecimiento de los cuatro aislamientos ambientales: M.
nonchromogenicum tipo I, M. peregrinum, M. avium y M. gordonae y de la cepa ATCC 19530 M.
nonchromogenicum (Gráfico 1). El inóculo inicial para cada uno de los cultivos fue establecido
en base a las características de crecimiento observadas durante la obtención del cultivo semilla.
31
CURVAS DE CRECIMIENTO DE MNT
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 10 20 30 40 50
Días
D
.O
.(
6
0
0
n
m
)
M. nonchromogenicum tipo I
M. nonchromogenicum tipo II
M. peregrinum
M. avium
M. gordonae

Gráfico 1. Curvas de crecimiento de las diferentes MNT estudiadas. Las curvas fueron realizadas
en medio Sauton, determinando el crecimiento por D.O. a  600 nm.

La fase logarítmica es iniciada primero por M. peregrinum, una especie de rápido
crecimiento, para el resto de las cepas, reportadas como especies de lento crecimiento esta fase
se presenta posterior al séptimo día. La fase estacionaria se observa primero en M.
nonchromogenicum tipo I ATTC 19530, seguida de M. gordonae, M. peregrinum, M. avium y
finalmente M. nonchromogenicum tipo II.

Para asegurar que todas las cepas de MNT se encontraran en una fase
metabólicamente activa, se determinó la fase media logarítmica de acuerdo a la curva de
crecimiento de cada cepa de MNT. La D.O.(600 nm) y el día en el que se presenta dicha fase se
muestran en la tabla 3, así mismo, se presenta las UFC de cada uno de los cultivos en esta fase.
32
Tabla 3. Caracterización de la fase media logarítmica de crecimiento de las diferentes
MNT estudiadas.
Fase media logarítmica
Especie D.O. (600 nm) Día UFC/mL
M. nonchromogenicum tipo II 0.992 20 3.0x107
M. gordonae 0.754 11 2.0x106
M. peregrinum 1.033 8 1.4x107
M. avium 1.400 17 1.0x107
M. nonchromogenicum tipo I ATCC 19550 1.304 10 1.3x107

El día en que se presenta la fase media logarítmica es variable, siendo menor para M.
peregrinum y más tardía para M. nonchromogenicum tipo II. Las UFC en esta fueron del mismo
orden de magnitud para todas las cepas excepto para M. gordonae.

VI.4. Proteínas de extracto celular

Se realizaron cultivos independientes de cada cepa de MNT incluida en el estudio.
Todos los cultivos fueron cosechados en la fase media logarítmica. La D.O. (600 nm) y el día en el
que fueron cosechados los cultivos se muestran en la tabla 4.

Tabla 4. Condiciones de obtención de los cultivos independientes de las diferentes MNT
estudiadas.
Fase media logarítmica de los
cultivos independientes
Especie D.O. (600 nm) Día UFC/mL
M. nonchromogenicum tipo II 1.025±0.02 20 3.4x107
M. gordonae 0.844±0.06 11 3.0x106
M. peregrinum 0.982±0.1 8 1.3x107
M. avium 1.458±0.07 18 1.2x107
M. nonchromogenicum tipo I ATCC 19550 1.223±0.1 12 2x107

33
Las proteínas de extracto celular fueron obtenidas a partir del paquete celular por
sonicación. Se determinó el número de pulsos requeridos para lisar las bacterias y obtener una
concentración mayor a 0.7 µg/µL (concentración mínima necesaria para realizar geles 2D con
80 µg de proteína). Una muestra del extracto celular fue tomada en cada pulso para ser teñida
por la técnica de Ziehl-Neelsen (figura 4-8), cuantificadas por Bradford y separada en geles de
acrilamida al 12.5%. La concentración de proteína obtenida en cada pulso para cada una de las
especies se muestra en la tabla 5.

Tabla 5. Estandarización de lisis por sonicación para la obtención de proteínas de extracto
celular de las diferentes MNT estudiadas. Cuantificación de proteínas.

Concentración de proteínas obtenida en los diferentes pulsos de sonicación

Pulso
M. gordonae
(µg/µL)
M. peregrinum
(µg/µL)
M. avium
(µg/µL)
M. nonchromogenicum
tipo II
(µg/µL)
M. nonchromogenicum
tipo I ATCC 19550
(µg/µL)
12 0.841 0.54 0.880 0.594 0.32
15 0.830 0.72 1.046 0.634 0.76
17 0.835 1.41 1.179 0.678 1.023
20 0.802 1.50 1.057 0.762 1.026En las muestras teñidas por Ziehl-Neelsen de cada pulso se observó que al incrementar
el número de pulsos, disminuye el número de bacterias y aumenta en número y tamaño los
cúmulos de proteína-restos celulares que son teñidos con el colorante de contraste (azul de
metileno). Este comportamiento fue observado en todas las cepas de MNT (figura 4-7), excepto
en M. gordonae en donde después de 12 pulsos no se observó cambio alguno (figura 8).

34
Las observaciones anteriores se correlacionan con la concentración de proteínas
obtenida en los diferentes pulsos, a mayor número de pulsos mayor concentración de proteínas.
Sin embargo para M. gordonae, la concentración de proteínas permanece constante después del
pulso 12 (Tabla 5).

Figura 4. Estandarización de lisis por sonicación para la obtención de proteínas de extracto
celular de M. nonchromogenicum ATCC 19530. Muestras de lisado celular obtenido a diferentes pulsos
de sonicación y teñidas por Ziehl-Neelsen.

PULSO 1

PULSO 3
PULSO 9

PULSO 12

PULSO 15
PULSO 17

PULSO 6
PULSO 20
35

Figura 5. Estandarización de lisis por sonicación para la obtención de proteínas de extracto
celular de M. nonchromogenicum tipo II. Muestras de lisado celular obtenido a diferentes pulsos de
sonicación y teñidas por Ziehl-Neelsen

Figura 6. Estandarización de lisis por sonicación para la obtención de proteínas de extracto celular
de M. peregrinum. Muestras de lisado celular obtenido a diferentes pulsos de sonicación (0 a 20 pulsos)
fueron teñidas por Ziehl-Neelsen.
PULSO 3 PULSO 0 PULSO 6 PULSO 9
PULSO 12 PULSO 15 PULSO 17
PULSO 0 PULSO 3
PULSO 9 PULSO 12 PULSO 15
PULSO 17
PULSO 6
PULSO 20
PULSO 20
36

Figura 7. Estandarización de lisis por sonicación para la obtención de proteínas de extracto celular
de M. avium. Muestras de lisado celular obtenido a los 0, 3, 6 9 12, 15, 17 y 20 pulsos de sonicación
fueron teñidas por la técnica Ziehl-Neelsen.

Figura 8. Estandarización de lisis por sonicación para la obtención de proteínas de extracto celular
de M. gordonae. Muestras de lisado celular obtenido a diferentes pulsos de sonicación (0-20 pulsos)
fueron teñidas por Ziehl-Neelsen.

PULSO 0 PULSO 9
PULSO 12 PULSO 15 PULSO 17
PULSO 6
PULSO 20
PULSO 3
PULSO 0 PULSO 9
PULSO 12 PULSO 15 PULSO 17
PULSO 6
PULSO 20
PULSO 3
37
Para determinar si el número de pulsos aplicados no afectó la calidad de la proteína
obtenida se realizó una electroforesis desnaturalizante en geles de 12.5% de acrilamida teñidos
con plata. Las proteínas no fueron degradadas con el incremento en el número de pulsos,
observándose bandas bien definidas en cada uno de los diferentes pulsos (figura 9).

Figura 9. SDS-PAGE de los lisados obtenidos por sonicación de las diferentes MNT
estudiadas. A) M. nonchromogenicum tipo I ATCC 19530. B) M. nonchromogenicum tipo II. C)
M. peregrinum. D) M. avium. E) M. gordonae. Las muestras se corrieron 1:1 con el buffer de
corrida en gel de acrilamida al 12.5% y se tiñeron con plata (1) Marcador de peso molecular (2)
12 pulsos, (3) 15 pulsos, (4) 17pulsos y (5) 20 pulsos.

1 2 3 4 5 A)
)
B)
)
C)
)
D)
)
E)
)
2 3 4 5 1 1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
250
150
100
75

10
250
150
100
75

10
38

De acuerdo a los resultados anteriores, se seleccionaron las siguientes condiciones de
obtención de proteínas de extracto celular:
 M. nonchromogenicum tipo I ATCC 19530 y M. avium: 17 pulsos. Un aumento
en el número de pulsos no incrementa significativamente la concentración de
proteína (Tabla 5, figura 9A y 9D).
 M. peregrinum y M. nonchromogenicum tipo II: 20 pulsos. Se obtiene una
mayor concentración de proteína y no se observa degradación de las proteínas
en estas condiciones. (Tabla 5, figura 9B y 9C).
 M. gordonae: 12 pulsos. La concentración de proteínas no se incrementa en los
pulsos posteriores. (Figura 8 y 9E, tabla 5)

Las proteínas de extracto celular para los cultivos independientes de cada una las
especies de MNT fueron obtenidas con las condiciones establecidas anteriormente. La
concentración de proteína extraída para cada uno de los cultivos de las distintas cepas de MNT
fue mayor a 0.7 µg/µL y no hubo degradación de las proteínas durante el proceso de obtención.
(Tabla 6 y anexo I)

Tabla 6. Cuantificación de proteínas de extracto celular obtenidas en los cultivos
independientes.
Especie
Peso húmedo
paquete celular
(g)
Concentració
n de proteína
(µg/µL)
M. nonchromogenicum tipo II 0.74±0.01 0.914±0.22
M. gordonae 0.83±0.02 0.735±0.09
M. new 0.69±0.02 1.55±0.20
M. avium 1.96±0.2 1.16±0.16
M. nonchromogenicum tipo I ATCC 19550 2.12±0.02 0.96±0.06
39
En la figura 10 se muestran los extractos celulares de cada una de las especies de MNT
separadas y visualizadas en un mismo gel de acrilamida al 12.5%. Al comparar el patrón de
proteínas se observa similitud entre M. nonchromogenicum tipo I ATCC 19530 y M. peregrinum y
M. gordonae y M. avium.

En los extractos celulares de M. avium y M. gordonae se observan bandas mejor
definidas en comparación con los extractos celulares de M. nonchromogenicum tipo I y II y M.
peregrinum, es decir, los extractos celulares obtenidos para estas dos cepas tienen una menor
concentración de lípidos, carbohidratos y otros componentes celulares los cuales son
considerados como contaminantes ya que disminuyen la resolución de las proteínas en los geles
de dos dimensiones.

Figura 10. SDS-PAGE de proteínas de extracto celular obtenidos por sonicación de las diferentes MNT
estudiadas. 5 µg de proteína de extracto celular fueron separados en un gel de acrilamida al 12.5%
teñido con plata.

1. Marcador de peso molecular
2. Extracto celular de M. nonchromogenicum tipo I
ATCC 19530
3. Extracto celular de M. peregrinum
4. Extracto celular de M. avium
5. Extracto celular de M. gordonae
6. Extracto celular de M. nonchromogenicum tipo II

250
150
100
75

10
1 2 3 4 5 6
40

VI.5. ELECTROFORESIS EN GEL DE DOS DIMENSIONES (2D-GE)

VI.5.1 Estandarización de las condiciones electroforéticas y de separación.

VI.5.1.1. Intervalo de pH

En el gel 2D de las proteínas de extracto celular de M. nonchromogenicum tipo I
ATCC 19530 con intervalo de pH 3-10 se observa que, al igual que en otras especies de
micobacterias, la mayoría de las proteínas se encuentran distribuidas en el intervalo de pH de 4-
7 (figura 11), por lo cual se emplearon tiras IPG con ese intervalo de pH para elaborar los
proteomas de las diferentes especies de MNT y así obtener una mejor separación de las
proteínas.

Figura 11. Estandarización de 2D-GE. Las proteínas de extracto celular de M. nonchromogenicum
ATCC 19530 fueron separadas en geles bidimensionales con un intervalo de pH de 3-10 y teñidas con
plata

34 5 6 7 8 9 10

250
150
100
75
50

10
41

VI.5.1.2. Cantidad de proteínas

Se realizaron inicialmente geles 2D con 100 µg de proteína de extracto celular,
sin embargo, debido a la abundancia de las proteínas el área del punto se volvía irregular y su
posición exacta dentro del gel era difícil de definir. Por lo tanto se disminuyó la cantidad de
proteína en los geles a 80 µg mejorando la definición de los puntos sobre todo en el área de
mayor peso molecular (figura 12).

Figura 12. Estandarización de 2D-GE. Geles bidimensionales con un intervalo de pH de 4-7 teñidos
con plata (A) 100 µg de proteínas de extracto celular de M. nonchromogenicum ATCC 19530 (B) 80 µg
de proteínas de extracto celular de M. nonchromogenicum ATCC 19530

250
150
100
75

10
4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
250
150
100
75

10
4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
A)
)
B)
)
42
VI.5.1.3. ISOELECTROENFOQUE

El voltaje completo aplicado durante el IEF es definido en intervalos de volt-hora
(Vh). Se requiere de cargas muy elevadas de Vh para que las proteínas sean
isoelectroenfocadas y de cargas aún mayores cuando la muestra contiene proteínas de
alta masa molecular o hidrofóbicas Si el Vh aplicado es insuficiente no todos los puntos
serán uniformemente distribuidos y se producirán barridos horizontales.

Para mejorar la resolución de los puntos en los geles de dos dimensiones
elaborados se incrementó el tiempo de isoloelectroenfoque. Se elaboraron al mismo
tiempo dos geles 2D con 80 µg de proteínas de extracto celular de M. peregrinum cada
uno y fueron trabajados al mismo tiempo bajo las mismas condiciones, con excepción
del tiempo de isoelectroenfoque. A uno de los geles se le aplicó un voltaje de 500 V por
1Vh, 2000 V hasta 2499 Vh y 2500 V hasta completar un tiempo total de enfoque de 52
kVh (figura 13A) y en el segundo previo a estas condiciones se aplicaron voltajes bajos
de 100V por 30 min, seguido de 30 min a 250 V y 500 V por 30 min (figura 13B).

Los resultados obtenidos con y sin la modificación anterior se muestran en la
figura 13, al hacer la comparación visual se observan puntos más definidos y con
distribución en toda el área del gel cuando se incrementa el tiempo de isoelectroenfoque.

Las condiciones establecidas para la elaboración de los geles: intervalo de pH,
cantidad de proteínas y tiempo de isoelectroenfoque permitieron obtener un mapa
proteico de 2D en el cual los puntos estaban bien definidos visualmente, no se
encontraban sobrelapados, estaban bien distribuidos en todo el gel y disminución en el
fondo de tinción y número de barridos.
43

Figura 13. Estandarización de 2D-GE. 80 µg de proteínas de extracto celular de M.
peregrinum fueron separadas en ambos geles bidimensionales con un intervalo de pH de 4-7 y
teñidos con plata. (A) Tiempo de isoelectroenfoque menor (B) Tiempo de isoelectroenque mayor

VI.5.2. Geles bidimensionales de las cepas de MNT estudiadas

Se realizaron dos geles bidimensionales de las cinco cepas de MNT con las
condiciones estandarizadas, cada uno a partir de un cultivo independiente. Las proteínas
de extracto celular separadas por electroforesis bidimensional en cada uno de los geles
fueron utilizadas para la construcción de los geles maestros, los cuales contienen todas
las proteínas detectadas en cada cultivo. En las figuras 14-18, se muestra cada uno de
los geles individuales y el gel maestro construido a partir de estos. La distribución de las
proteínas en los geles 2D y apariencia visual de estos para cada especie es similar.

A)
)
B)
)
4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
250
150
100
75

10
250
150
100
75

10
4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
44

Figura 14. Construcción del gel maestro de M. nonchromogenicum tipo I a partir de los geles 2D de cultivos independientes. (¥) Gel maestro
mostrando en verde las proteínas presentes en ambas réplicas, en azul y rojo los puntos detectados solo en uno de los geles.
250
150
100

10
4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
¥
45

Figura 15. Construcción del gel maestro de M. peregrinum a partir de los geles 2D de cultivos independientes. (¥) Gel maestro mostrando en
verde las proteínas presentes en ambas réplicas, en azul y rojo los puntos detectados solo en uno de los geles
4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
250
150
100

10
¥
46

Figura 16. Construcción del gel maestro de M. nonchromogenicum tipo II a partir de los geles 2D de cultivos independientes. (¥) Gel maestro
mostrando en verde las proteínas presentes en ambas réplicas, en azul y rojo los puntos detectados solo en uno de los geles.
4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
250
150
100
75

10
¥
47

Figura 17. Construcción del gel maestro de M. avium a partir de los geles 2D de cultivos independientes. (¥) Gel maestro mostrando en verde
las proteínas presentes en ambas réplicas, en azul y rojo los puntos detectados solo en uno de los geles.
250
150
100
75

10
D4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
¥
48
Figura 18. Construcción del gel maestro de M. gordonae a partir de los geles 2D de cultivos independientes. (¥) Gel maestro mostrando en
verde las proteínas presentes en ambas réplicas, en azul y rojo los puntos detectados solo en uno de los geles.
4 4.5 5 5.5 6 6.5 7
250
150

100

10
¥
49
VI.6. Análisis comparativo de los proteomas de las MNT estudiadas

Los geles fueron analizados con el programa PD Quest v.8.0. El número de puntos detectados
en cada uno de los geles realizados a partir de un cultivo independiente se muestra en la siguiente tabla.
Las imágenes de los geles obtenidos para cada cepa fueron normalizadas con el mismo programa para
construir el gel maestro, este contiene las proteínas presentes en ambos geles y las que fueron
detectadas solo en alguna de las réplicas. El número de puntos en el gel maestro se incrementa en
un 13 a 22% con respecto al número de puntos detectados en cada una de las réplicas
individuales (Tabla 7).

Tabla 7. Análisis de los geles de doble dimensión teñidos con plata mediante el programa PD-QUEST
v8.0
No.
puntos
M.
nonchromogenicum
tipo I
M.
nonchromogenicum
tipo II
M. peregrinum M. gordonae M. avium
Gel 1 735 807 667 987 1181
Gel 2 720 778 650 982 1092
Gel
maestro
894 935 806 1264 1486
%CV* 5.5 0.07 0.2 0.02 0.01
* El grado de variación técnica entre réplicas fue determinado mediante el cálculo del
coeficiente de variación a partir de los datos obtenidos en la normalización por número