Capacidad-proliferativa-de-los-linfocitos-t-cd4-de-memorial-central-en-pacientes-VIH-y-controles-VIH-

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1. 
 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
CAPACIDAD PROLIFERATIVA DE LOS LINFOCITOS TCD4+ DE 
MEMORIA CENTRAL EN PACIENTES VIH+ Y CONTROLES VIH- 
 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
PRESENTA 
TANIA ELIRE AGUILAR GARCÍA 
 
 
 MÉXICO, D.F.2014 
 
 
 
JURADO 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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DERECHOS RESERVADOS © 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
1. 
JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: ENRIQUE ORTEGA SOTO 
VOCAL: Profesor: ROCÍO GABRIELA TIRADO MENDOZA 
SECRETARIO: Profesor: GUSTAVO OLVERA GARCÍA 
1er. SUPLENTE: Profesor: MARIO ADÁN MORENO EUTIMIO 
2° SUPLENTE: Profesor: GIBRÁN PÉREZ MONTESINOS 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
INSITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS 
“ISMAEL COSÍO VILLEGAS” 
 
ASESOR DEL TEMA: 
 
 
GUSTAVO OLVERA GARCÍA 
 
 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
 
 
 
HÉCTOR ENRIQUE ESPINOSA ARCINIEGA 
 
 
SUSTENTANTE: 
 
 
TANIA ELIRE AGUILAR GARCÍA 
 
 
 
1. 
“LIFE IS LIKE A ROLLER COASTER, IT HAS ITS UPS AND DOWNS. BUT IT´S YOUR CHOICE 
TO SCREAM OR ENJOY THE RIDE” 
ANÓNIMO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. 
AGRADECIMIENTOS 
 
• A LA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 AL INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS “ISMAEL COSÍO 
VILLEGAS” POR BRINDARME LAS INSTALACIONES Y EL EQUIPO NECESARIO PARA 
LA REALIZACIÓN DE ESTE TRABAJO. 
 
• AL M. EN C. GUSTAVO OLVERA GARCÍA, ASESOR DE TESIS, POR SUS ENSEÑANZAS 
Y CONTRIBUCIONES ACADÉMICAS. 
 
• AL DR. ENRIQUE ESPINOSA POR SU APOYO PROFESIONAL PARA LA REALIZACIÓN DE 
ESTA TESIS. 
 
• AL DR. SANTIAGO PÉREZ PATRIGEÓN POR SU TOTAL APOYO EN LA OBTENCIÓN DE 
PACIENTES Y SU DISPOSICIÓN PARA LA ASIGNACIÓN DE LA BECA PROBEI. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. 
AGRADECIMIENTOS A TÍTULO PERSONAL 
A DIOS POR PERMITIRME CONOCER LA CIENCIA Y SUSTENTARME DÍA A 
DÍA. 
A LIDIA, POR SU TIEMPO, DEDICACIÓN Y AMOR EN CADA UNO DE LOS 
MOMENTOS DE MI VIDA. 
A RENATA, POR SU INCONDICIONAL APOYO, COMPAÑÍA Y OPTIMISMO 
ANTE CUALQUIER SITUACIÓN. 
A JAIME, POR SU APOYO ECONÓMICO Y POR LA AMBICIÓN QUE 
DEPOSITÓ EN MÍ PARA LOGRAR MIS METAS. 
A GABRIELA, MAFALDO Y EL RESTO DE MI FAMILIA POR DEPOSITAR SU 
CONFIANZA EN MÍ, POR EXIGIRME DÍA CON DÍA Y POR SER MUY 
IMPORTANTES PARA LA REALIZACIÓN DE MIS LOGROS. 
A MIS COMPAÑEROS DEL LABORATORIO: ALFREDO, RAFAEL, DANIELA Y 
DAMARIS POR AYUDARME A MEJORAR MI ASPECTO PROFESIONAL Y 
ACADÉMICO. 
A MIS AMIGOS: PAOLA, ANNIA, LIZETH, MARIEL, FANY, LORENA, 
BENJAMÍN, VÍCTOR, LUIS FERNANDO Y ENRIQUE POR ESTAR CONMIGO 
SIEMPRE EN LOS MOMENTOS QUE LOS NECESITO, POR COMPARTIR SU 
VIDA CONMIGO, POR SU TIEMPO, EL CUAL HA SIDO EXCEPCIONAL. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. 
ÍNDICE 
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS………………………………………….. 1 
1 INTRODUCCIÓN………………………………………………………… 2 
2 MARCO TEÓRICO………………………………………………………. 3 
 2.1 GENERALIDADES DEL VIH 
 2.2 CICLO DE REPLICACIÓN VIRAL 
2.3 EVOLUCIÓN CLÍNICA DE LA INFECCIÓN POR VIH 
 2.4 RESPUESTA INMUNE ANTE EL VIH 
 2.5 LINFOCITOS T CD4+ 
2.6 LINFOCITOPENIA CD4+ 
2.7 ACTIVACIÓN INMUNE CRÓNICA DURANTE LA INFECCIÓN POR VIH.. 
3 HIPÓTESIS Y JUSTIFICACIÓN…………………………………………… 17 
4 OBJETIVOS…………………………………………………………….. 17 
 3.1 OBJETIVO GENERAL 
3.2 OBJETIVOS PARTICULARES 
5 METODOLOGÍA………………………………………………………….. 18 
 5.1 SUJETOS DE ESTUDIO 
 5.2 SEPARACIÓN DE PBMC´S 
 5.3 PURIFICACIÓN DE LINFOCITOS TCD4+ DE MEMORIA CENTRAL. 
5.4 TINCIONES MULTIPARAMÉTRICAS. 
5.5 COMPENSACIÓN 
5.6 INMUNOFENOTIPIFICACIÓN EX VIVO 
5.7ACTIVACIÓN DE CÉLULAS T CD4+ DE MEMORIA CENTRAL. 
5.8 INCORPORACIÓN DE UN ANÁLOGO DE TIMIDINA (EDU) 
5.9 ANÁLISIS DE PROLIFERACIÓN (POST-ESTIMULACIÓN IN VITRO) 
5.10 ANÁLISIS DE DATOS CITOMÉTRICOS 
5.11 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
6. RESULTADOS……………………………………………………………… 23 
6.1 ESTRATEGIAS DE ANÁLISIS 
6.1.1 EVALUACIÓN DE LA PUREZA DE LT CM Y EXPRESIÓN DE CD38 
 
 
1. 
6.1.2 EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD, PROLIFERACIÓN Y 
DIFERENCIACIÓN DE LOS LT CM 
6.2 LINFOCITOS T CD4+ EN LA INFECCIÓN POR VIH 
6.2.1 LINFOCITOPENIA CD4+ 
6.3 CARGA VIRAL, CUENTA DE CÉLULAS T CD4+ Y ACTIVACIÓN INMUNE. 
6.4 VIABILIDAD, PROLIFERACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DE LT CM 
6.5 PORCENTAJE DE LINFOCITOS T CD4+ Y CAPACIDAD PROLIFERATIVA 
6.6 EXPRESIÓN DE CD38 Y SU EFECTO EN LA VIABILIDAD Y PROLIFERACIÓN DE 
LT CM. 
 
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS………………………………………….. 37 
8. CONCLUSIONES………………………………………………………. 42 
9. REFERENCIAS………………………………………………………… 43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
2. 
 
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS 
ADN: Ácido desoxirribonucleico 
APC: Aloficocianina 
APC-Cy7: Aloficocianina- R- cianina 7 
ARN: Ácido ribonucleico 
ARNm: Ácido ribonucleico mensajero 
cDCs: Células dendríticas convencionales 
CV: Carga viral. Copias de ARN de VIH/mL de sangre 
HAART: Terapia Antirretroviral altamente activa 
IFN: Interferón 
Linfocito T CD4+ de memoria central (LTCM): Célula T con fenotipo 
CD4+CD45RA- CCR7+ 
Linfocito TCD4+ de memoria efectora (LT EM): Célula T con fenotipo 
CD4+CD45RA- CCR7 
MHC: Complejo principal de histocompatibilidad 
PBMC: Células mononucleares de sangre periférica 
PBS: Amortiguador salino-fosfato 
pDCs: Células dendríticas plasmacitoides 
PD1: Proteína de muerte celular programada tipo 1 
PE: Ficoeritrina 
PerCP Cy 5.5: Proteína clorofil peridina- R- cianina 5.5 
sida: Síndrome de inmunodeficiencia adquirida 
SIV: Virus de la inmunodeficiencia en simios 
SRA: Síndrome retroviral agudo 
TCR: Receptor de la célula T 
TNF: Factor de necrosis tumoral 
VIH: Virus de la inmunodeficiencia humana 
 
 
 
 
2 
2. 
1. INTRODUCCIÓN 
 
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente etiológico del síndrome 
de inmunodeficiencia adquirida (sida) que es la manifestación final de la pérdida 
progresiva de células T CD4+ que ocurre durante la infección. El mecanismo por 
el cual,en individuos infectados, ocurre la muerte de células TCD4+ no se conoce 
plenamente(1). 
Uno de los posibles mecanismos involucrados en el desarrollo de la patogénesis 
de la infección es la pérdida de la capacidad proliferativa de los linfocitos TCD4+. 
Desde el inicio de la infección por VIH ocurre una disminución en ambas 
subpoblaciones de memoria de linfocitos T CD4+ (linfocitos T de memoria central y 
linfocitos T de memoria efectora), no obstante, la disminución más drástica ocurre 
en los linfocitos T de memoria efectora (LT EM) que puede ser mayor al 95%(2). 
Los linfocitos T CD4+ de memoria central (LT CM) tienen la capacidad de 
restablecer su población, además de diferenciarse y dar lugar a linfocitos TCD4+ 
de memoria efectora (3). 
Hay suficiente evidencia que muestra que los LT CM, mediante su expansión y 
diferenciación, mantienen un mínimo de LT EM en los tejidos periféricos que son 
capaces de preservar el estado asintomático de la infección por VIH, limitando las 
infecciones oportunistas(4,5). 
Durante la infección por VIH es posible que factores como la activación crónica 
limiten la capacidad de los LT CM para reabastecer la población de LT EM. Hasta 
el momento no se sabe si la pérdida del pool de LT EM está influenciada por la 
disminución en la capacidad de proliferación y diferenciación de los LT CM a LTEM o si se debe a la pérdida de autorenovación de los LT CM 
En este trabajo se estudiaron a los LT CM de pacientes infectados con VIH y 
controles VIH-. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC´s) 
por gradiente deFicoll, se purificaron LT CM y se activaron en presencia de un 
análogo de timidina. Posteriormente se realizaron tinciones para citometría de flujo 
para evaluar la a viabilidad, proliferación y diferenciación celular. 
 
3 
2. 
Se encontró que la capacidad proliferativa de los LT CM de personas VIH+ no 
está disminuida, no correlaciona con la expresión de CD38 y es proporcional a la 
viabilidad. Además, bajo las condiciones de cultivo y estimulación usadas, se 
encontró que la capacidad de diferenciación de LT CM a LT EM de los pacientes 
VIH+ no está alterada. 
2. MARCO TEÓRICO 
 
2.1 Generalidades del VIH 
La infección por el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) es considerada como 
unapandemia y por ende un problema de salud pública mundial. Alrededor de 35 
millones depersonas están infectadas con este virus (Fig. 1) (6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 1 Prevalencia del VIH a nivel mundial en el 2013. Figura tomada del Boletín 
ONUSIDA. Situación de la epidemia de sida, 2013. 
En el último año se reportaron 2.3 millones denuevas infecciones, lo que 
corresponde a un decremento del 33% en comparación con las nuevas 
infecciones reportadas en el 2001. Almismo tiempo el número de muertes por 
SIDA disminuyó de 2.3 a 1.6 millones(6). Se estima que en México viven 
actualmente más de 225 mil personas con VIH(7). 
 
4 
2. 
El VIH es un miembro del género Lentivirus de la familia Retroviridae. Su genoma 
se transcribe de RNA a DNA dentro de la célula a través de la enzima viral 
transcriptasa reversa(8). Existen dos tipos de VIH que se distinguen genética y 
antigénicamente: el VIH-1 y el VIH-2. Dentro del VIH-1 existen tres 
grupos:1)mayor (M) con los subtipos A, B, C, D, F, G, H, J, K, y formas 
recombinantes circulantes (CRF), como CRFAE referido como el subtipo E; 2) 
aislados (O) y 3) nuevo (N); en el caso del VIH-2 existen los subtipos A, B, C, D, 
E y F(9). 
A nivel mundial las infecciones más frecuentes se dan por elVIH-1 subtipo C 
(∼50%, África y Asia) seguido por un CRFAG (∼25% África) y B (∼12%, América 
del norte y Europa) (9). 
El blanco principal de la infección del VIH son las células que expresan en la 
superficie la molécula CD4 presente principalmente en los linfocitos T CD4+ y sus 
precursores, pero también en monocitos, macrófagos, células dendríticas y células 
de la microglía en el sistema nervioso central. (10) 
Este linfotropismo provoca una profunda inmunosupresión en el hospedador, 
debido tanto a la destrucción de linfocitos T CD4 como a distintos mecanismos de 
interferencia en el sistema inmunitario. Como consecuencia se produce la 
infección por organismos oportunistas, el desarrollo de tumores y la afectación 
neurológica, eventos que definen el sida(11). 
 
2.2 Ciclo de replicación viral 
Entrada del VIH a la célula 
La entrada del VIH en la célula se produce mediante la interacción secuencial con 
dos receptores, CD4 y los receptores de quimiocinas CCR5 o CXCR4. La 
interacción inicial se produce entre gp120 y CD4 e induce una serie de cambios 
conformacionales que exponen el dominio V3 y regiones adyacentes que forman 
el dominio de unión de la gp120 a los receptores de quimiocina(12). Esta segunda 
interacción induce nuevos cambios en la estructura de la gp41 que expone en la 
región N-terminal un dominio altamente hidrofóbico que se ancla en la membrana 
 
5 
2. 
plasmática. Durante este proceso de cierre o plegamiento la membrana plasmática 
y viral se aproximan y fusionan (11). 
Decapsidación, retrotranscripción e integración viral 
Una vez fusionadas las membranas viral y celular se produce la internalización de 
la nucleocápside y la decapsidación del genoma vírico. En este proceso, las 
proteínas de la cápside se desensamblan y liberan el genoma viral(11). 
El proceso de síntesis de ADN a partir del ARN viral es realizado por el complejo 
enzimático de la transcriptasa inversa. Sin embargo, en un linfocito en reposo la 
retrotranscipción se produce de forma incompleta y es necesario activar la célula 
infectada para que finalice.Si la activación no se produce el ARN y el ADN 
incompletamente retrotranscritos son degradados por las nucleasas celulares 
entre 3 -15 días (13). 
El ADN proviral una vez sintetizado se acopla a una serie de factores celulares y 
virales formando el complejo de preintegración. Este complejo es transportado al 
núcleo en donde se integra en el genoma de la célula huésped y constituye la 
forma proviral del VIH. El ADN integrado representa el 10% del ADN viral existente 
en linfocitos circulantes y constituye un reservorio aunque no ocurra una activación 
adecuada como se mencionó anteriormente.(14). 
 
Reactivación y replicación viral 
Después de que el ADN viral se intregra al ADN de la célula huésped, el VIH 
puede permanecer latente, replicarse de forma controlada o experimentar una 
replicación masiva e iniciar un efecto citopático en la célula infectada(11). El 
principal factor que interviene en el paso de la fase de la latencia viral a la de 
reactivación es NF -κB.NF-κB es una familia de proteínas que regulan la expresión 
de múltiples genes celulares que participan en los procesos de activación 
celulardel sistema inmune. Este factor no existe en forma activa en los linfocitos 
CD4+ en estado de reposo y es inducido en el curso de los procesos de activación 
inmunológica, lo que explica que la replicación está estrechamente relacionada 
con el estado de activación de los linfocitos infectados(14). 
 
 
6 
2. 
Elongación y síntesis de ARN y proteínas 
Una vez iniciada la síntesis del ARN viral, la expresión de la proteína viral Tat 
aumenta la tasa de transcripción del genoma del VIH y permite la elongación 
completa del ARN viral(11). El ARN del VIH se sintetiza en forma de un único 
transcrito que debe ser transportado al citosol y procesado en ARNm de distintos 
tamaños. Elprocesamiento y transporte del ARN viral son regulados por la proteína 
viral Rev. Rev también participa en el acoplamiento de los distintos ARNm a la 
maquinaria de los ribosomas que sintetizará las proteínas virales. Una vez 
sintetizadas, las proteínas virales deben ser procesadas antes de ensamblarse en 
las partículas virales maduras. En ese proceso participan proteínas del virus como 
Vif, Vpu y la proteasa viral. La maduración final y el ensamblaje correcto de las 
proteínas virales se produce durante el proceso de gemación de los viriones, éstos 
son liberados al espacio extracelular gracias al bloqueo de una proteína de 
membrana, la teterina, que actúa como un secuestrador de viriones de la 
membrana celular. La proteína Vpu disminuye la expresión de los niveles de 
teterina en la superficie celular lo que permite la liberación de los viriones al medio 
extracelular(14). 
 
Figura 2. Genoma del VIH-1. Se muestran los nueve marcos de lectura abierta – 
Gag, Env, Pol, Tat, Rev, Vpu, Vif, Vpr y Nef-. Figura tomada de L. Robinson, 
Nature Revews Inmunology, 2002(15) 
 
 
 
7 
2. 
2.3 Evolución clínica de la infección por VIH 
En la actualidad la vía de transmisión más común en todo el mundo es a través de 
las relaciones sexuales(16). El uso de agujas contaminadas para la administración 
de drogas intravenosas, el empleo de sangre o sus derivados con fines 
terapéuticos, y la transmisión durante el nacimiento o lactancia también son 
medios frecuentes de infección por VIH(16). 
La infección inicial se produce frecuentemente por la exposición a sangre,semen, 
líquido vaginal y la leche materna de un individuo infectado. El VIH se encuentra 
como partículas virales libres y en células infectadas. (17),(18) 
De dos a ocho semanas después de la infección el80% de los individuos 
experimentan fiebre alta en picos, odinofagia, cefaleas y ganglios linfáticos 
agrandados,esto se conoce como síndrome retroviral agudo (SRA) cuyos 
síntomas suelen remitir espontáneamente de una a cuatro semanas(16). 
Durante la fase aguda hay una explosión de la replicación viral, en especial en las 
células T CD4+ del intestino y una disminución en las células T CD4+ 
circulantes(19). En este momento la mayoría de los individuos también muestra 
una respuesta intensa de células T CD8+ específicas para VIH que destruyen a 
las células infectadas, seguida por la producción de anticuerpos específicos contra 
VIH (seroconversión). Se considera que las células T CD8+ son importantes para 
el control primario de la viremia ya que la respuesta específica disminuye la carga 
viral plasmática. En esta fase el número de células T CD4+ se recuperan, pero los 
niveles se mantienen por debajo de losnúmeros iniciales(20) (Fig. 2). 
Tras la infección primaria sigue un período de latencia clínica (síntomas escasos o 
nulos), durante el cual el VIH continúa su replicación mientras que las células T 
CD4+ disminuyen gradualmente en su función y su número(21). 
Diversos mecanismos tratan de explicar la depleción de las células T CD4+ 
durante la infección por VIH entre ellos se encuentran: los efectos citopáticos 
directos del virus sobre sus células T huéspedes(11),además las células 
infectadas presentan una mayor susceptibilidad a la inducción de la apoptosis(22) 
y existe la eliminación de las células T CD4+ infectadas a través de las células 
TCD8+ que reconocen los péptidos virales desplegados por las moléculas de 
 
8 
2. 
clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC); además de otros 
mecanismos indirectos que se mencionan más adelante. El período asintomático 
dura entre 2 y 15 años en ausencia de terapia antirretroviral(16). 
Finalmente, una vez que el recuento de células T CD4+ en sangre disminuye a 
menos de 250 células/microlitro comienzan a aparecer infecciones oportunistas y 
se considera que el individuo padece sida (16)(20) (Fig. 3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 3Avance de la infección por VIH. Durante la fase aguda de la infección ocurre 
un decremento de las células TCD4+ que coincide con un incremento en la 
replicación viral. Después de unas semanas de la infección se establece la 
respuesta inmune antiviral mediada por LT CD8+ y se estabiliza la población de 
células T CD4+ en circulación periférica aunque permanece debajo de los niveles 
normales, lo que determina el inicio de la fase crónica de la enfermedad. Durante 
la fase crónica de infección existe una activación inmune persistente además de 
un aumento de citocinas proinflamatorias.Finalmente cuando la cuenta de LT 
CD4+ en sangre es menor a 250 células/ µL comienza la fase de sida, 
 
9 
2. 
caracterizada por la aparición de enfermedades oportunistas. Figura modificada de 
Goulder & Watkins, Nature Revews Inmunology, 2004(23). 
 
2.4 Respuesta inmune ante el VIH 
MUCOSAS Y CÉLULAS DENDRÍTICAS 
Las células dendríticas (DCs) pueden ser clasificadas en dos clases: las DCs 
clásicas o convencionales (cDCs) y las DCs plasmacitoides (pDCs). El progenitor 
común de DCs (CDP) da origen a todos los subconjuntos de DCs que han sido 
identificados en la médula ósea.(24) 
Las cDCs se caracterizan por la expresión de CD11c y las pDCs se caracterizan 
por la expresión de CD123. Las cDCs se pueden clasificar en dos tipos de 
subpoblaciones diferentes, las CD1a+ y las CD14+. Las CD1a+ conocidas como 
células de Langerhans tienen en el citoplasma los gránulos de Birbeck y la 
langerina, y se localizan exclusivamente en la epidermis. Las células que son 
CD14+ se diferencian hacia mDC que carecen de los gránulos de Birbeck y de 
langerina, se localizan en la dermis, la submucosa y el tejido conectivo. Por otro 
lado las células dendríticas plasmacitoides(pDCs) se encuentran en circulación 
sanguínea y en órganos linfoides secundarios. (25) 
LasDCs juegan un papel muy importante en el reconocimiento, procesamiento y 
presentación de agentes externos.Las DCs forman una red con el epitelio 
escamoso, así como con aquellos epitelios que recubren la vagina, ectocervix y el 
prepucio. Las DCs extienden sus dendritas más arriba de la superficie epitelial 
(26).El VIH puede infectar a las DCs no sólo utilizando a CD4 y CCR5, también 
puede hacerlo a través de los receptores de lectina tipo C, como la langerina. De 
esta manera es pausible asumir que las DCs son los primeros tipos de leucocitos 
que con mayor frecuencia se encuentran con el VIH en las mucosas (24). 
En el ectocérvix y la vagina las capas epiteliales exteriores no contienen uniones 
estrechas entre las células y esto podría facilitar laentrada del VIH. Por el 
contrario, las células epiteliales columnares endocervicales se unen por uniones 
estrechas impermeables, en este caso y el VIH puede traspasar las células del 
epitelio columnar por transcitosis, un proceso en donde los viriones son 
 
10 
2. 
absorbidos en el lado luminal de la célula epitelial a través de una vesícula,la 
vesícula es después transportada al lado basal de la célula donde su contenido se 
libera al espacio extracelular del estroma(26). 
Las células de Langerhans tienen la capacidad de endocitar viriones HIV 
eficientemente y los transportan hacia células T CD4+ sin ser productivamente 
infectadas(27). 
Aproximadamente 10 días después del inicio de la infección elVIH y/o células 
infectadas llegan a los nódulos linfáticos locales en donde la infección se amplifica 
por infecciones productivas e inicia la diseminación sistémica. En este punto las 
DCs en los nódulos linfáticos empiezan a presentar los antígenos procesados a 
células Te inicia la respuesta inmune adaptativa hacia la infección(26). 
Las mDCs son responsables de iniciar la respuesta inmune adaptativa contra el 
VIH.En el nódulo linfático las mDCs activan a las células natural killer (NK) a 
través de la secreción de interleucina (IL) 12, IL-15 e IL-18.(26) Estas funciones de 
las mDCs están alteradas durante la infección por VIH posiblemente como una 
consecuencia directa de las interacciones de estas células con el virus o como 
resultado de mecanismos indirectos como la producción de IL-10 por los 
monocitos durante la infección. Esta disfunción podría contribuir a establecer una 
respuesta inmune adaptativa poco eficaz y a la activación inadecuada de las 
NK(28). 
Las pDCs son mediadoras de la respuesta inmune innata. Las pDCs activadas por 
HIV producen interferones tipo I que además de inhibir la replicación viral 
contribuyen a la proliferación no específica de células TCD8+. Además las pDCs 
producen quimiocinas que atraen a células T lo que facilita la diseminación viral, 
ya que actúan como una fuente proveedora de nuevas células T CD4+ que 
pueden ser infectadas por el VIH(26). Las pDCs expuestas a VIH también regulan 
positivamente al ligando inductor de apoptosis mediado por TNF (TRIAL) que 
conduce a la apoptosis de células. Finalmente las pDCs expuestas al VIH 
favorecen la producción de IL-10 por las células T reguladoras (Treg) lo que altera 
la función de las mDCs, como se mencionó anteriormente,y producen una 
alteración en la respuesta inmune adaptativa (29). 
 
11 
2. 
 
CÉLULAS B 
A pesar de que el VIH no se replica en las células B, la presencia de virus en su 
superficie puede mediar el paso del virus a las células diana, como se ha 
propuesto en DCs(26). La presencia de altos niveles de factores pro-inflamatorios 
que aparecen poco después de que se establece la infección conducen a una 
rápida desregulación de las células B en diversos tejidos, comenzando en los 
tejidos de la mucosa intestinal seguido por otros tejidos linfoides secundarios 
conforme se disemina el virus. Estas alteraciones en las células B probablemente 
contribuyena la linfocitopenia de células T CD4+, a una falta de maduración en 
células B y a un decremento en la respuesta al antígeno.(30). 
En la infección temprana por VIH la mucosa intestinal sufre numerosos cambios 
que causan la activación policlonal de células B y una pérdida de centros 
germinales, que se asocian con el aumento de la lisis folicular y la apoptosis de 
células B(26). 
En la fase crónica de infección por VIH cuando los pacientes son clínicamente 
asintomáticos, se observa hiperplasia folicular en los ganglios linfáticos 
secundarios y estos cambios reflejan un aumento de la activación y diferenciación 
de centros germinales de células B(26),26). 
En la fase tardía de la infección por el VIH, cuando los pacientes se vuelven 
sintomáticos, los tejidos linfoides secundarios se vuelven fibróticos con un 
incremento en la deposición de colágeno. Estos cambios están asociados con la 
pérdida de homeostasis y a los efectos de activación inmune en las células B, que 
culmina con una pérdida generalizada de la función inmune(26),26). 
 
CÉLULAS T 
Toma alrededor de 30 días antes de que las células T CD8+ comiencen a reducir 
significativamente la replicación viral por los efectos citolíticos directos de perforina 
y granzima sobre las célulasinfectadasy a través de efectos indirectos de citocinas 
y otros factores(31) 
 
12 
2. 
Al mismo tiempo el VIH al tener una tasa de mutación elevada selecciona las 
mutaciones convenientes para evadir la respuesta mediada reconocidos por las 
células T CD8+, en particular aquellos presentes en el virus fundador(26).Los 
cambios de epítopo son rápidamente optimizados y ocurren por tres mecanismos: 
mutaciones que afectan la unión de HLA, mutaciones que afectan el 
reconocimiento a través de TCR y mutaciones que afectan el procesamiento del 
epítopo(26).Una vez que se establece un equilibrio entre la respuesta adaptativa 
de las células T y la capacidad del VIH de evadir el sistema inmune , se establece 
el “set point”, es decir la carga viral se estabiliza después del período de la fase 
aguda (32). 
El tipo de HLA del individuo infectado es importante en la determinación de los 
epítopos inmunodominantes de células T CD8 +. Pacientes con tipos de HLA 
asociados con el reconocimiento de células T CD8+ de las regiones más 
conservadas del VIH (tales como HLA-B27 + y HLA-B57 +), logran controlar la 
replicación viral, mantienen niveles normales de células T CD4+ y no presentan 
manifestaciones clínicas de la enfermedad en ausencia de tratamiento 
antirretroviral.(26),29) 
La disfunción inmune más pronunciada en la enfermedad del VIH es la de las 
células T CD4 +. Debido a la disminución de estas células, las funciones de las 
células T cooperadorasse comprometen cada vez más durante el curso de la 
infección. 
La ineficiencia relativa de la respuesta de las células T CD8 + en contra de las 
mutantes que escapan comparada con la respuesta inicial hacia el virus fundador 
puede ser una consecuencia de la disfunción en las células T cooperadoras(26). 
Con el tiempo las células T CD8+ también se agotan debido a la exposición 
persistente del antígeno y a la activación constante(26). Algunas moléculas 
reguladoras de la activación inmune se sobreexpresan durante la infección por 
VIH, como la proteína de muerte celular programada 1 (PD1), y podrían explicar 
los fenómenos de agotamiento que se observan en la infección. 
 
 
 
13 
2. 
2.5 Linfocitos T CD4+ 
De acuerdo con su grado de diferenciación periférica, los linfocitos T han sido 
clasificados en linfocitos T naive (vírgenes), los cuales no han sido previamente 
expuestos a su antígeno específico.Después de su estimulación, los linfocitos T 
naive proliferan para generar linfocitos T efectores de vida corta con la capacidad 
de sintetizar citocinas que ejercen su actividad efectora en sitios periféricos, y 
linfocitos T de memoria. (34) 
La expresión de CCR7, un receptor de quimiocina que controla la permanencia en 
órganos linfoides secundarios, divide a los linfocitos T de memoria en dos tipos: 1) 
linfocitos T de memoria central (LT CM), células de vida larga que recirculan 
preferencialmente por órganos linfoides secundarios y con una gran capacidad de 
generar una respuesta inmune secundaria por proliferación y diferenciación a 
linfocitos T efectores; se caracterizan por expresar en su membrana CD45RO y 
CCR7 (receptor de CCL21 y CCL19) entre otras. 2) linfocitos T de memoria 
efectora (LT EM) que se encuentran principalmente en tejidos periféricos, pierden 
la expresión de CCR7 y de moléculas coestimuladoras como CD28, tienen gran 
capacidad de generar una respuesta inmune secundaria ejerciendo directa e 
inmediatamente su actividad efectora y son en gran medida responsables del 
control de las infecciones. (3) (Fig. 3) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 4 Clasificación de los linfocitos TCD4+. LT naive (CD45RA+ CCR7+), LT CM 
(CD45RA- CCR7+) y LT EM (CD45RA- CCR7-). 
Linfocitos T naive 
Estimulación 
(antígeno específico) 
LT memoria 
LT efectores 
LT CM LT EM 
Auto- renovación 
 
14 
2. 
 
2.6 Linfocitopenia CD4 
La disminución de LT CD4+ representa el marcador más importante de la infección 
por el VIH y no es debido únicamente a una destrucción de células infectadas por 
el virus, sino que participan además distintos mecanismos indirectos(11). 
 
Mecanismos de disminución de linfocitos T CD4+ 
Aunque existe un componente de secuestro de LT CD4+ en los órganos linfoides 
secundarios que no representa un daño inmunológico de la infección sino un 
respuesta normal del sistema que se localiza preferentemente donde el virus se 
acumula (11), este reclutamiento de un pequeño número de células no explica la 
linfopenia, dado que la mayor concentración de partículas virales ocurre en sitios 
efectores. 
La destrucción de linfocitos T CD4+ directamente a consecuencia de la fase lítica 
del VIH se produce de manera preferente en linfocitos T activados, que son 
especialmente susceptibles a la infección y replicación viral debido a las siguientes 
características: presentan altos niveles del correceptor CCR5 en la superficie, 
disponen de niveles elevados de nucleótidos y ATP que permiten la 
retrotranscripción completa del genoma viral y su transporte al núcleo y tienen 
activados los factores de transcripción que el VIH necesita para su replicación(11). 
Los linfocitos CD4+ infectados se vuelven blancos de los linfocitos citotóxicos al 
expresar péptidos virales en sus moléculas HLA de clase I. La pérdida de LT 
CD4+ infectados ha sido asociada a apoptosis, que incluye la maduración y 
ejecución de la caspasa 3, que conlleva a una muerte celular sin inflamación, 
fragmentación del DNA y permeabilización de la membrana(31,1)Sin embargo, la 
muerte de las células no infectadas productivamente ha sido asociada a la 
activación de la caspasa 1 que produce una forma de muerte celular altamente 
inflamatoria significativa, en donde se libera el contenido citoplasmático incluyendo 
citocinas inflamatorias, al espacio extracelular llamada piroptosis (1). 
Debido a que se ha demostrado de menos del 1% de los linfocitos T CD4+ están 
infectados por el VIH a lo largo de la infección, la disminución de estas células se 
 
15 
2. 
ha asociado a mecanismos indirectos(36). Uno de estos mecanismos indirectos 
inducidos por el VIH y que conducen a la linfocitopenia de CD4 es la activación 
inmune crónica que afecta de manera inespecífica a los linfocitos T CD4+(37). 
 
2.7 Activación inmune crónica durante la infección por VIH 
La activación inmune crónica es un rasgo característico de la enfermedad 
progresiva por VIH. Es caracterizada por una activación masiva y crónica de 
células T CD4+ infectadas con VIH y células T CD8+ específicas al virus, además 
de otras estirpes celulares incluyendo células B, NK, pDCs y monocitos(38). 
También existe una activación policlonalde células B(39), un aumento en el 
recambio de células T(40), un aumento en la frecuencia de células T con fenotipo 
activado(41) y un aumento en los niveles de citocinas proinflamatorias y 
quimiocinas(42). 
Esto ha llevado a sugerir que el daño a los componentes inmunes de la superficie 
de la mucosa gastrointestinal, junto con los daños en el microambiente del epitelio 
intestinal activan de manera general al sistema inmune durante la fase crónica de 
la infección por el VIH, a través del aumento de la translocación de productos 
microbianos a la superficie luminal. De hecho, el fenómeno de la translocación 
microbiana, definida como la translocación de los microbios y/o productos 
microbianos, se produce después de un daño en el tracto gastrointestinal. El tracto 
gastrointestinal es la fuente principal de dichos productos microbianos debido a su 
carga bacteriana masiva en comparación con otros sitios anatómicos. (43) 
Las primeras descripciones de la activación inmune crónica asociada al VIH se 
basaron en observaciones clínicas y análisis de muestras de sangre tomadas de 
individuos infectados con VIH de manera crónica. Estos análisis revelaron niveles 
aumentados de los marcadores de activación (HLA-DR, CD38) y de proliferación 
(Ki 67) en células T CD4+ y CD8+(38). El incremento en linfocitos T CD8+ HLA-
DR+ CD38+ se encuentra asociado con un decremento en las cuentas de células 
T CD4+ y el desarrollo de sida. (38). La expresión de CD38 en células T CD4+ de 
memoria central se ha asociado a un incremento en la producción de IFN-γ, yen 
una disminución en la producción de IL-2 y a una menor expresión de 
 
16 
2. 
CD154(44),(45), Esto podría limitar la co-estimulación, la proliferación y la 
supervivencia de las células T CD4+ de memoria y podría contribuir a una falta de 
control de infecciones oportunistas en pacientes VIH+. 
La activación inmune crónica también puede dar origen a una senescencia 
proliferativa a nivel de las células T de memoria central(5).y a una expansión de 
células T efectoras que se encuentra acompañada por la producción de citocinas 
pro-inflamatorias y pro-apoptóticas que cierran el círculo vicioso de mantenimiento 
de un estado de activación inmune generalizada asociada a la infección por VIH 
alterando así la homeóstasis celular(46). 
Entre los linfocitos T CD4+, se ha observado que la subpoblación de LTCM tiene 
una mejor capacidad de autorrenovarse, mayor supervivencia a largo plazo y la 
capacidad de montar respuestas efectoras eficientes después de una 
transferencia autóloga (47), como se mencionó previamente, es capaz de 
mantener la población de LT EM durante la fase crónica de la infección por VIH 
(2,4,48,49), así como, los LT CM reconstituyen su propia población cuando los 
pacientes VIH+ están bajo tratamiento antirretroviral (50). Por todo lo anterior se 
deduce que las propiedades funcionales de los LT CM son críticas para mantener 
la homeostasis de las poblaciones de memoria de los linfocitos T CD4+. 
Tomando en cuenta las alteraciones en losLT CMdurante la infección por VIH, la 
incapacidad del efecto citopático directo del VIH de explicar por si solo la evolución 
de la infección y considerando el posible papel patogénico de la activación crónica, 
nos preguntamos si los LT CM de pacientes VIH+ tienen una menor capacidad de 
proliferar y diferenciarse en comparación con los LT CM de donadores sanos. 
 
 
17 
2. 
 
3. HIPÓTESIS 
Es posible que el estado de activación inmune crónica durante la infección con 
VIH disminuirá la proliferación de los linfocitos T CD4+ de memoria central (LT 
CM), así como su diferenciación a linfocitos T CD4+ de memoria efectora (LT EM). 
 
 
4. OBJETIVOS 
 
4.1 Objetivo General 
Determinar si la capacidad proliferativa de los LT CM de personas VIH+ es menor 
en comparación con LT CM de controles VIH-. 
 
4.2 Objetivos particulares 
-Evaluar la proporción de LT CM que replican su DNA e incorporan EdU (como 
una medida proporcional a la proliferación) entre pacientes VIH+ y controles VIH -, 
después de una estimulación policlonal a través del receptor de células T. 
-Evaluar la diferenciación de LT CM a LT EM mediante fenotipificación, después 
del estímulo policlonal en ambos grupos. 
-Determinar la viabilidad de los LT CD4+ CM después del estímulo policlonal en 
ambos grupos. 
-Evaluar la expresión de CD38 en LT CM como marcador de activación crónica y 
determinar su correlación con la capacidad proliferativa en pacientes VIH+ y 
controles. 
 
 
18 
2. 
5. METODOLOGÍA 
 
5.1 Sujetos de estudio. 
Se obtuvieron muestras de 10 pacientes adultos diagnosticados con la infección 
por VIH. Los pacientes no se encontraban recibiendo tratamiento antirretroviral y 
ninguno presentó síntomas evidentes asociados a infecciones oportunistas. Como 
grupo control se estudiaron muestras provenientes de 10 donadores adultos no 
infectados por el VIH (con un intervalo de 18 – 45 años, 3 mujeres y 7 hombres). 
Todos los pacientes que decidieron participar en el estudio firmaron carta de 
consentimiento informado previamente aprobada por elComité de Ética en 
Investigación del Instituto Nacional de Ciencias Médicas “Salvador Zubirán” y por 
el Comité de Ciencia y Bioética del Instituto Nacional de Enfermedades 
Respiratorias “Ismael Cosío Villegas”. 
 
5.2 Separación de PBMC´s 
A partir de 50 a 60 mL de sangre periférica obtenida de pacientes VIH+ o a partir 
de concentrado leucocitario de donadores VIH-, se purificaron células 
mononucleares de sangre periférica (PBMCs por sus siglas en inglés) por 
gradiente de densidad (Ficoll-Paque, GE Healthcare Biosciences AB, Piscataway, 
NJ, USA). Después de recuperar las PBMCs se lavaron dos veces con medio 
RPMI 1640 (Lonza, Walkersville, MD, USA) y se cuantificaron microscópicamente 
con colorante vital azul tripano al 0.2% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). 
 
5.3 Purificación de linfocitos TCD4+ de memoria central (LT CM). 
 A partir de las PBMCs, se purificaron LTCM utilizando el sistema MACS de 
Miltenyi (Teterow, Germany) basado en la captura selectiva de poblaciones de 
células en columnas con microesferas inmunomagnéticas, de acuerdo a las 
instrucciones del fabricante.Primero las células T CD4- junto con las células T 
CD4+ naive son marcadasindirectamente con un coctel de anticuerpos 
monoclonales conjugados a biotina y microperlas antibiotina. Posteriormente se 
realiza una separación magnética (selección negativa) usando una columna de 
 
19 
2. 
separación (Miltenyi). De la fracción recolectada, las células T CD4+ de memoria 
central son marcadas con CCR7 –PE y con microperlas anti PE, y se realiza una 
segunda separación magnética (selección positiva)en una columna de separación 
(Miltenyi). 
 
5.4 Tinciones multiparamétricas. 
Para caracterizar a cada una de las subpoblaciones de linfocitos T CD4+ se 
diseñaron combinaciones de anticuerpos dirigidos contra diferentes moléculas de 
superficie celular. Cada anticuerpo está asociado de manera covalente a un 
fluorocromo o se encuentra conjugado con biotina para su posterior unión con 
estreptavidina conjugada a un fluorocromo. El empleo de múltiples fluorocromos 
permite analizar la coexpresión de varios marcadores en una misma célula al 
mismo tiempo. La selección de los fluorocromos se llevó a cabo tomando en 
cuenta el espectro de absorción y de emisión de cada fluorocromo así como los 
canales de detección del citómetro FACSCanto II (BD, San Jose, CA, USA), para 
evitar la interferencia entre las señales obtenidas. 
En la Tabla 1 se muestran los marcadores utilizados y el fluorocromo al que se 
encuentran unidos: 
Tabla 1. Anticuerpos monoclonales conjugados a fluorocromos para la 
fenotipifficacion de linfocitos T CD4+ 
Marcador Fluorocromo 
CD4 APC-Cy7 
CCR7 PE 
CD45RA APC 
CD38 Biotina- Estreptavidina- PerPCp Cy5.5 
 
5.5 Compensación 
Con la finalidad deeliminar cualquier interferencia generada por empalmes en los 
espectros de emisión y detección de señales de los fluorocromos se generó una 
matriz de compensación por cada panel de tinción en donde las señales 
interferentes fueron restadas. Cada matriz estaba constituida por monotinciones 
 
20 
2. 
realizadas en perlas de compensación CompBeads (BD) con los anticuerpos 
empleados en cada panel. Las perlas de compensación son microesferas de 
poliestireno que tienen acoplados anticuerpos dirigidos contra la cadena ligera κ 
de las inmunoglobulinas provenientes de ratón o rata. Estas perlas se tiñen 
fácilmente y proveen una señal robusta con cualquier anticuerpo de ratón o rata 
que posea la cadena ligera κ. 
 
5.6 Inmunofenotipificación ex vivo 
Se tomaron aproximadamente un millón de PBMC´s y 100 mil LT CM de la 
suspensión celular para cada tinción y se realizó un lavado que consistió en 
agregar 2 mLde PBA (buffer salino de fosfatosque contiene 0.1% de azida de 
sodio y 1% de albúmina sérica bovina), centrifugar durante 3 minutos a 2000 rpm y 
decantar el sobrenadante. Posteriormente, se incubaron las células 15 minutos a 
4°C en oscuridad, con los anticuerpos monoclonales específicos para CD4, 
CD45RA , CCR7 y CD38. Se realizó un lavado con PBA para retirar el exceso de 
anticuerpos no unidos y posteriormente se agregó la estreptavidina conjugada con 
PerCp-Cy5.5 (diluida 1:100), se incubaron las células 15 minutos a 4°C en 
oscuridad. Se realizó un lavado más con PBA y las células se resuspendieron en 
200 microlitros de parafolmadehído (PFA) al 1%. Los datos fueron adquiridos en 
un citómetro de flujo FACS-Canto II (BD). Las cantidades empleadas de 
anticuerpos fueron obtenidas al titular y calcular el mejor índice de tinción, es 
decir, las cantidades óptimas para poder distinguir una población positiva de una 
señal negativa. 
 
5.7Activación de células T CD4+ de memoria central. 
Se colocaron 50 mil LT CM en placas de 96 pozos y se cultivaron en medio RPMI 
completo (RPMI 1640 (Lonza, Walkersville, MD, USA) adicionado con 100 U/mL 
de Penicilina, 0.1 mg/ mL Estreptomicina (Penicillin/Streptomycin Lonza), 2 mM L-
glutamina (Lonza), 5 mM de amortiguador HEPES (Lonza) y 10% suero fetal 
bovino inactivado (HyClone, Logan, UT, USA) a 37°C con 5% CO2 y se les indujo a 
proliferar a través de la estimulación policlonal del receptor de células T con 
 
21 
2. 
Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28(Life technologies, USA) en una 
proporción de 1 célula por cada 0.5 perlas) en presencia de100 unidades/mLde IL-
2. Se dejó en cultivo 18 hrs, para posteriormente retirar las Dynabeads y se dejó 
en cultivo 48 horas más. 
 
5.8 Incorporación de un análogo de timidina (EdU) 
Transcurridas 36 horas de cultivo se incorporó EdU (Life technologies, USA) como 
análogo de timidina y se dejó en cultivo 18 horas más) a 37°C con 5% CO2 . En la 
tabla 2 se muestran los controles utilizados. 
 
Tabla 2. Controles usados para medir la incorporación de EdU 
 CARACTERÍSTICAS FUNCIÓN 
1 
50 mil células con el análogo de 
timidina (EdU) y sin estímulo 
Excluir el efecto de la proliferación 
celular basal. 
2 
50 mil células sin el análogo de 
timidina (EdU) y con estímulo. 
Excluir el efecto de la unión del 
fluorocromo unido a la azida con otros 
componentes del medio. 
 
5.9 Análisis de proliferación (post-estimulación in vitro) 
Los LT CM se cosecharon y se realizó un lavado con PBS. Las células se 
incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad con un 
reactivo fluorescente que evidencia la viabilidad celular (Near IR Dead Cell Stain, 
Life technologies, USA) capaz de unirse a proteínas celulares (aminas). Se realizó 
un lavado con PBS para retirar el exceso de reactivo. Posteriormente se incubaron 
las células durante 15 minutos a 4°C en la oscuridad con los anticuerpos 
monoclonales específicos para CD4 y CCR7 conjugados a fluorocromo (Tabla 3). 
Se realizó un lavado más con PBA. Luego de la fijación y permeabilización de las 
células se efectúo la reacción catalizada por el cobre entre la azida conjugada a 
Alexa Fluor-488 y el alquino presente en el análogo de timidina (EdU) para su 
detección por citometría de flujo. Los LT CM se resuspendieron en 200 microlitros 
 
22 
2. 
de PFA al 1%. Los datos fueron adquiridos en un citómetro de flujo FACS-Canto II. 
Las cantidades empleadas de anticuerpos fueron obtenidas al titular y calcular el 
mejor índice de tinción. 
En la tabla 3 se muestranlos marcadores utilizados y el fluorocromo al que se 
encuentran unidos. 
Tabla 3. Marcadores de la tinción de proliferación 
Marcador Fluorocromo 
CD4 PerCp-Cy5.5 
CCR7 APC 
LIVE/ DEAD APC-Cy7 
EdU Alexa Fluor 488 
 
5.10 Análisis de datos citométricos 
Los datos citométricos fueron analizados con el programa FlowJo 7.6.4 para 
determinar frecuencias de subpoblaciones y frecuencias de células expresadoras 
de cada marcador. 
 
5.11 Análisis estadístico. 
Debido a que los datos no seguían una distribución normal se llevó a cabo la 
prueba no paramétrica de Mann Whitney para identificar diferencias con base en 
el análisis de muestras independientes (donadores sanos y pacientes VIH+). 
Valores de p<0.05 fueron considerados estadísticamente significativos. Los datos 
fueron analizados con el programa Graph Pad Prism versión 5. 
 
 
 
23 
2. 
6. RESULTADOS 
 
6.1 Estrategias de análisis 
 
Con la finalidad de estudiar todas las variables de interés se diseñaron dos 
estrategias de análisis. La estrategia de análisises la secuencia de pasos que 
permite seleccionar las poblaciones de interés. La primera estrategianos permitió 
obtener las variables relacionadas con la purezay la expresión de CD38. La 
segunda estrategia nos permitió obtener las variables relacionadas con la 
viabilidad, proliferación y diferenciación celular. 
 
6.1.1 Evaluación de la pureza de LT CM y expresión de CD38 
Se visualizaron los datos en gráficas de puntos (Fig. 5) en las cuales se utilizaron 
los parámetros dispersión frontal (FSC) para seleccionar las células que pasaron 
de manera individual a través del láser del citómetro (singlets). Una vez 
seleccionados los singlets, se utilizaron los parámetros de FSC y de dispersión 
lateral (SSC) para seleccionar a la población de linfocitos de acuerdo a sus 
características morfológicas de tamaño relativo y granularidad celular. Una vez 
seleccionada la población de linfocitos se seleccionó la de población de células 
CD4+. El siguiente paso fue seleccionar a la población celular CD4+ con fenotipo 
de memoria central, es decir, aquellas células que no expresan el marcador 
CD45RA pero que sí expresan el marcador CCR7 . A continuación se realizó un 
histograma para la señal del marcador CD38, obteniendo el porcentaje de 
expresión(Fig. 5).Los límites para los marcadores CD45RA, CCR7 Y CD38 se 
establecieron utilizando los controles: SIN TEÑIR (PBMC´) un FMO CCR7 
(PBMC´s teñidas con anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos 
específicos dirigidos contra CD45RA, CD4 y CD38) y un FMO de CD38 (PBMC´s 
teñidas con anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromos específicos 
dirigidos contra CD45RA, CD4 y CCR7). Dado que las poblaciones se comportan 
de manera discreta y el pegado inespecífico fue despreciable, el uso de controles 
de isotipo no fue necesario. 
 
24 
2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
2. 
 
Figura 5. Células que pasaron de manera individual a través del citómetro (A), 
utilizando los parámetros de granularidad y tamaño se seleccionaron los linfocitos 
(B).Linfocitos T CD4+ antes de la purificación de linfocitos (D), y después de la 
purificación de linfocitos T CD4+ de memoria central (LTCM) (F). Los linfocitos 
fueron teñidos con anticuerpos monoclonales para CD45RA, CCR7, que separan 
cuatro subpoblaciones:CD45RA+CCR7- linfocitos T CD4+ terminalmente 
diferenciados, CD45RA+ CCR7+ linfocitos T CD4+ naive, CD45RA- CCR7+ 
LTCM, linfocitos T CD4+ de memoria efectora (LTEM). LTCM antes de la 
purificación (C), después de la purificación (E).Además se realizó una tinción con 
CD38 para medir su expresión en LT CM (G). 
 
6.1.2 Evaluación de la viabilidad, proliferación y diferenciación de los LT CM 
En un dot plot (Fig.6) en donde se utilizan los parámetros de FSC se 
seleccionaron los linfocitos que pasaron de manera individual a través del láser del 
citómetro (singlets). Una vez seleccionados los singlets se realizó un dot plot para 
la selección de los linfocitos viables, aquellos teñidos con baja intensidad en el 
canal de APC-Cy7. Posteriormente utilizando los parámetros de FCS y de SSC se 
seleccionó a la población de linfocitos de acuerdo a sus características 
morfológicas de tamaño relativo y granularidad celular. Una vez seleccionada la 
población de linfocitos, se realizó un dot plot para la selección de población de 
 
26 
2. 
células CD4+. El siguiente paso fue seleccionar a la población celular CD4+ con 
fenotipo de memoria central y/o de memoria efectora, es decir, aquellas células 
que expresan o no el marcador CCR7 , además de seleccionar aquellas que 
proliferaron, es decir, aquellas en las que se detecta la presencia de EdU. A 
continuación se realizó un histograma para la señal de detección de EdU, 
obteniendo el porcentaje de células que proliferaron. (Fig.6). Los límites para los 
gates de EdU se establecieron utilizando un control negativo (LT CM sin estímulo) 
más EdU para eliminar el efecto de la proliferación basal y un control positivo (LT 
CM con estímulo) sin EdU para excluir el efecto de cualquier unión inespecífica del 
reactivo fluorescente con otros componentes del medio. Los límites para los gates 
de CCR7 se establecieron utilizando un FMO CCR7 (LT CM teñidas con el 
anticuerpo monoclonal marcado con fluorocromo específico dirigido contra CD4, 
LIVE DEAD near IR y con el reactivo fluorescente para la detección de EdU). 
 
27 
2. 
 
 
 
Figura 6. Células que pasaron de manera individual a través del citómetro (A), 
selección de células viables (B), utilizando los parámetros de granularidad y 
tamaño se seleccionaron los linfocitos (D).Linfocitos T CD4+ de memoria 
central(C), Los linfocitos fueron teñidos con anticuerpos monoclonales para 
CCR7 , y con un reactivo flurorescente para la detección de EdU(E)Además se 
realizó un histograma para evaluarla incoporación de EdU, como medida directa 
de proliferación (F). 
 
 
28 
2. 
6.2 Linfocitos T CD4+ en la infección por VIH 
 
En la tabla 4 se muestran los datos clínicos de los diez pacientes reclutados. 
Todos los pacientes VIH+ fueron hombres, con una edad media de 30 años 
(intervalo 24-37 años) carga viral de 490,271 copias/mL de plasma ( 3,477 – 
3,500,000copias ARN viral/mL plasma) y una cuenta de linfocitos T CD4+ de 414 
células/microlitro de sangre (intervalo 194 – 679 células/microlitro de sangre). 
 
Tabla 4. Datos clínicos de los pacientes reclutados 
Paciente 
VIH+ 
SEXO EDAD 
CARGA VIRAL 
Copias ARN viral/ mL de 
plasma 
Células T 
CD4+/mL de 
sangre 
1 M 26 3,500,000 194 
2 M 25 15,255 291 
3 M 37 79,110 239 
4 M 32 575,164 653 
5 M 33 177,030 527 
6 M 36 17,000 660 
7 M 29 30,800 263 
8 M 24 3477 436 
9 M 29 8, 230 201 
10 M 29 14,600 679 
MEDIA 30 490,271 ( 3,477 – 3,500,000) 414 (194 – 679) 
 
 
6.2.1 El porcentaje de linfocitos T CD4+ es menor en pacientes VIH+ en 
comparación con donadores VIH-. 
 
En la figura 7 se observaque los pacientes VIH+ tienen una menor proporción de 
linfocitos T CD4+ en comparación con los controles VIH- (p = 0.0017). La media 
de los linfocitos T CD4+ en pacientes VIH+ fue de 22.8% mientras que en los 
 
29 
2. 
controles VIH- fue de 37.4%.Como se ha descrito previamente, una de las 
características principales de la infección por VIH es el decremento de las células 
T CD4+ (51). 
 P= 0.0017 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 7 Comparación del porcentaje de linfocitos T CD4+ entre pacientes VIH+ y 
controles VIH-.Las líneas centrales indican la media del porcentaje de linfocitos T 
CD4+ y las barras el error estándar. 
 
6.3La expresión de CD38ex vivo correlaciona positivamente con la 
proporción de linfocitos T CD4+ CM. 
 
Las cuentas de células CD4+ y la carga viral, son dos de los marcadores más 
usados para el pronóstico clínico durante la infección por VIH. Sin embargo, en 
diversos estudios se ha demostrado una escasa correlación entre la carga viral y 
el declive en la cuenta de células T CD4+. (52) . En nuestra población de estudio 
se observa que estas dos variables no correlacionan entre si (Fig. 8) como se ha 
descrito previamente en la literatura. 
 
 
 
 
V
IH
 -
V
IH
+
0
20
40
60
%
L
in
fo
c
it
o
s
 T
 C
D
4
+
 
30 
2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 8. Relación entre las cuentas de células CD4+ y el Log10 de la carga viral en 
pacientes VIH+. 
Dado que se sabe que durante la infección por VIH hay un incremento en la 
expresión de marcadores de activación en células T CD4+, como CD38, cuya 
expresión es un indicador correlativo del avance la infección, se evaluó la 
expresión de CD38 en linfocitos T CM o CD4 totales y su relación con las cuentas 
de LT CD4+ y carga viral plasmática. En la figura 9se puede observar que existe 
una tendencia en los LT CM de los pacientes VIH+ de expresar CD38en mayor 
proporción que los controles VIH- (p= 0.0726). La mediade la expresión de CD38 
en los pacientes VIH+ fue de 61.9 mientras que en los controles VIH- fue de 45.5. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 V
IH
-
V
IH
+
0
20
40
60
80
100
%
C
D
3
8
 e
x
 v
iv
o
0 2 4 6 8
0
200
400
600
800
Log10 de copias de ARN de VIH/mL de sangre
C
é
lu
la
s
 C
D
4
/m
m
3 p= 0.8104 
r = 0.0873 
 
31 
2. 
Fig 9. Comparación de la expresión de CD38 en LT CM entre pacientes VIH+ 
(cuadros rojos) y controles VIH- (círculos azules). Las líneas centrales indican la 
media del porcentaje de linfocitos T CD4+ y las barras el error estándar. 
 
Una alta frecuencia de las células que expresan marcadores de activación como 
CD38, está asociada con una progresión más rápida de la enfermedad 
independientemente de la carga viral y las cuentas de células T CD4(53). En 
nuestra muestra de estudio no observamoscorrelación entre el porcentaje de 
expresión de CD38 y la cuenta de células CD4+ (Fig. 10). Adicionalmente no 
observamos correlación entrela carga viral y la expresión de CD38 como marcador 
de activación inmune (fig. 11). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig 10. Relación entre el porcentaje de expresión de CD38 en LT CM y cuentas de 
células CD4+ en pacientes VIH+. 
 
 
 
 
 
 
 
 
0 200 400 600 800
0
20
40
60
80
100
Células CD4+/mm
3
%
 C
D
3
8
 e
x
 v
iv
o
p= 0.8413 
r = 0.0729 
0 2 4 6 8
0
20
40
60
80
100
Log10 de copias de ARN de VIH/mL de sangre
%
 C
D
3
8
 e
x
 v
iv
o
p= 0.6103 
r = 0.1843 
 
32 
2. 
Fig. 11 Relación entre el Log 10 de la carga viral y el porcentaje de expresión de 
CD38 en LT CD4+ CM en pacientes VIH+- 
 
Cuando evaluamos la expresión de CD38 en los pacientes VIH+ se puede 
observar que la proporción de CD38 aumenta entre mayor sea el porcentaje de 
linfocitos T CD4+ CM, mientras que en los controles VIH- existe una tendencia en 
la que estas variables correlacionan de manera negativa (fig. 12).Lo que podría 
indicar que en los pacientes VIH+ el aumento en la proporción de LT CM esta 
asociado con activación, a diferencia de los controles en donde se podría pensar 
que la diferencia en la proporción de los LT CM está determinada por 
homeostasis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 12 Relación entre la expresión de CD38 en LT CM y el porcentaje de 
linfocitos T CD4+ CM en pacientes VIH+ (círculos rojos) y controles VIH- (círculosazules). 
 
6.4La capacidad de proliferación de los LT CM no está alterada en pacientes 
VIH+. 
Después de la estimulación con anticuerpos específicos para CD3 y CD28 unidos 
a perlas, se realizaron comparaciones entre pacientes VIH+ y controles VIH- del 
porcentaje de viabilidad(Fig.13A), proliferación(Fig. 13B) y diferenciación(Fig. 
13C) de LT CM. Se encontró una tendencia (p=0.07) (Fig. 13A) en donde los 
pacientes VIH+ muestran un menor porcentaje de viabilidad en comparación con 
r = 0.6914 
p = 0.0268 
r = 0.5983 
p = 0.0677 
0 20 40 60
0
20
40
60
80
100
% LT CD4+ CM
%
 C
D
3
8
 e
x
 v
iv
o
0 20 40 60
0
20
40
60
80
100
% LT CD4+ CM
%
 C
D
3
8
 e
x
 v
iv
o
 
33 
2. 
los controles, dada la dispersión de los datos quizá con una n mayor podríamos 
encontrar diferencias entre grupos. En los porcentajes de proliferación y 
diferenciación no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre 
pacientes VIH+ y controles VIH-. En la figura 13B se puede notar que un subgrupo 
de pacientes tiene un porcentaje de proliferación muy por debajo de la media, sin 
embargo, no pudimos encontrar ninguna variable que caracterizara a este grupo 
de pacientes y no encontramos ningún comportamiento particular al realizar 
correlaciones de este subgrupo de pacientes con carga viral plasmática, expresión 
de CD38 o cuenta de linfocitos T CD4+. 
Se realizaron correlaciones entre el porcentaje de proliferación y viabilidad de los 
LT CM entre controles VIH-y pacientes VIH+ (Fig. 14A, B) después de la 
estimulación. Los controles VIH- presentan una proliferación constante e 
independiente del porcentaje de viabilidad, en los pacientes VIH+ existe una 
correlación positiva entre la viabilidad y la proliferación de los LT CM, lo que 
significa que la entrada a fase S medida por la incorporación de EdU (análogo de 
timidina) se refleja en el porcentaje de viabilidad de los LT CM de pacientes VIH+. 
Como un análisis adicional, se realizó la exclusión de tres pacientes VIH+ aquellos 
que presentaron el porcentaje de viabilidad y proliferación más bajos, y se realizó 
la correlación (n = 7) obteniendo un valor de p 0.4115 y un valor de r de 0.3719, 
esto indicaría una falta de correlación entre estas dos variables. Sin embargo se 
analizaron otras parámetros de estos pacientes, tales como carga viral, cuenta de 
células CD4+ y expresión de CD38 y no presentaban valores diferentes al resto de 
los pacientes, de esta forma la correlación con n= 10 debe ser tomada con 
cautela. 
A 
 
 
 
V
IH
-
V
IH
+
0
20
40
60
80
100
%
V
ia
b
il
id
a
d
p = 0.3787 
p = 0.0726 
 
34 
2. 
 B 
 
 
 
 
C 
 
 
 
 
 
 
Fig. 13 Comparación de los parámetros de viabilidad (A), proliferación por 
incorporación de EdU(B) y diferenciación (C) entre pacientes VIH+ (cuadros rojos) 
y controles VIH – (círculos azules) después de la estimulación policlonal, de LT 
CM, mediada por TCR. Las líneas centrales son medias y las barras corresponden 
al error estándar. 
 
 
 
 
 
r = 0.0917 
p = 0.7887 
r = 0.7391 
p = 0.0146 
V
IH
-
V
IH
+
0
20
40
60
80
100
%
P
ro
li
fe
ra
c
ió
n
V
IH
-
V
IH
+
0
20
40
60
80
100
%
C
C
R
7
p = 0.4179 
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
% Viabilidad
%
 P
ro
li
fe
ra
c
ió
n
40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
%Viabilidad
%
P
ro
li
fe
ra
c
ió
n
 
35 
2. 
Fig. 14Relación entre el porcentaje de viabilidad y proliferación (por incorporación 
de EdU) entre controles VIH- (círculos azules) y pacientes VIH+ (círculos rojos). 
Se realizaronlas correlaciones entre el porcentaje de linfocitos T CD4+ totales y la 
capacidad proliferativa de los LT CM en controles VIH- (Fig.15A) y pacientes VIH+ 
(Fig.15B) con el objetivo de observar si existe alguna relación entre estas 
variables. No se encontró una correlación en pacientes VIH+ ni controles VIH-, 
indicando que estas variables son independientes entre sí. 
 
 
 
 A B 
 
Fig. 15. Relación entre el porcentaje de LT CD4+ totales y el porcentaje de 
proliferación de LT CM (por incorporación de EdU)de pacientes VIH+ (círculos 
rojos) y controles VIH- (círculos azules). 
6.5No se encontró correlación ente la expresión de CD38ex vivoy la 
viabilidado proliferación de LT CM. 
Debido a que la expresión de CD38 se ha asociado a la progresión de la infección 
se realizaron las correlaciones entre el porcentaje de expresión de CD38ex vivo en 
LT CM y el porcentaje de viabilidad y proliferación en LT CM de controles VIH- 
(Fig.16A, C) y pacientes VIH+ (Fig.16B, D). No se encontró correlación entre 
estas variables en pacientes VIH+ ni controles VIH-. En este estudio se utilizó 
r = 0.0843 
p = 0.8176 
r = 0.3434 
p = 0.3314 
 
36 
2. 
CD38 como marcador de activación crónica, y se observa que su expresión 
(mayor en el caso de los pacientes VIH+) no afecta la viabilidad y la proliferación 
de los LT CM. 
A B 
 
 
 
 
 
 
 
C D 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 16Relación entre el porcentaje de expresión de CD38+ en LT CM y el 
porcentaje de viabilidad (A, B) y proliferación (por incorporación de EdU)(C , D)de 
pacientes VIH+ (círculos rojos,B y D) y controles VIH- (círculos azules A y C). 
 
 
 
 
 
r = 0.3008 
p = 0.3687 
r = 0.2904 
p = 0.4156 
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
% CD38 ex vivo
%
V
ia
b
il
id
a
d
0 20 40 60 80 100
40
60
80
100
%CD38 ex vivo
%
V
ia
b
il
id
a
d
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
%CD38 ex vivo
%
P
ro
li
fe
ra
c
ió
n
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
% CD38 ex vivo
%
P
ro
li
fe
ra
c
ió
n
r = 0.3253 
p= 0.3289 
 
r = 0.1215 
p= 0.7380 
 
 
37 
2. 
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 
 
Actualmente se considera que la activación inmune crónica tiene efectos que 
participan de manera fundamental en el decremento de células T CD4 + y en 
consecuencia al sida. Se ha observado que la activación inmune crónica persiste 
incluso en pacientes en el que la replicación viral ha sido inhibida con éxito por 
terapia antirretroviral(38). Sin embargo, la relación de causalidad entre la 
activación inmune crónica y la pérdida de células T CD4 + no se ha establecido 
claramente. 
 
En estudios anteriores se observó que la expresión de CD38 correlaciona 
directamente con el avance de la enfermedad por VIH (54)y conduce a 
alteraciones particulares en los LTCD4+ (44,45).Nosotros pensamos que existe 
una relación directa entre la expresión de CD38 en los LT CM y una alteración en 
la capacidad proliferativa y/o diferenciación, lo que podría ser una causa del 
decremento de LT EM durante la infección por VIH. Para probar esta hipótesis 
medimos la expresión de CD38 en los LT CM provenientes de pacientes VIH+ y 
controles VIH-, y observamos si existen diferencias en la viabilidad, proliferación y 
diferenciación después de la estimulación con perlas magnéticas recubiertas con 
anticuerpos agonistas contra CD3/CD28. 
 
Los porcentajes de pureza obtenidos de los LT CM de pacientes VIH+ tienen una 
media de 83.3% (65.2% – 92.7%). Como se observa en la Tabla 4 y en la Fig. 7, 
en algunos pacientes el porcentaje de linfocitos T CD4+ era muy bajo respecto a 
otras poblaciones celulares.Como se mencionó en la metodología el primer paso 
de la separación incluye la eliminación de las células CD4- y en algunos pacientes 
no seobtuvo la pureza esperada dada la baja proporción de LT CM en estos 
pacientes. No obstante, para poder incluir purezas de LT CM inferiores al 90%, se 
utilizó un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD4 conjugado a un fluorocromo 
específico, en este caso PerCp- Cy5.5, en la tinción con EdU, esto con el fin de 
0 20 40 60 80 100859095100 % Proliferación% CCR7 in vitro
0 20 40 60 80 100020406080100 % Viabilidad% Proliferación
40 60 80 100020406080100 %Viabilidad%Proliferación
 
38 
2. 
medir la proliferación sólo en células T CMque expresan los marcadores CD4 y 
CCR7. 
 
Como se mencionó anteriormente, dado el bajo conteo de células CD4+ en los 
pacientes VIH+, el número de LT CM que se podían purificar a partir de PBMC de 
pacientes VIH+ era muy limitado por lo que tuvimos que evaluar el mínimo número 
de células purificadas de las que podíamos obtener información confiable. Con 
este objetivo, se realizaron diversos experimentos (no se muestra esta 
información) en los cuales se utilizaron distintas cantidades de LT CM ( de 10, 000 
a 250, 000 LT CM) y distintos tiempos de cultivo (24 – 48 hrs) para evaluar los 
parámetros mencionados, obteniendo una respuesta satisfactoria a partir de 
cultivos y tinciones con 50, 000 LT CM y un tiempo de cultivo de 48 hrs. Y de esta 
manera pudimos obtener resultados de todos los pacientes reclutados. 
 
La infección por VIH sin tratamiento antirretroviral está asociada a una pérdida 
progresiva de células T CD4+(10).Este fenómeno fue confirmado en este 
estudio.Encontramos que la proporción de células T CD4+ en pacientes VIH+, 
respecto a los linfocitos totales, es menor que la observada en controles VIH- (Fig. 
7). Fue posible observar que los datos provenientes de pacientes VIH+ mostraban 
una mayor dispersión, lo cual sugiere diferentes grados de avance de la 
enfermedad en los pacientes, tal y como se puede observar en la cuenta de 
células T CD4+ en los individuos infectados con VIH (Tabla 4). 
 
Como se mencionó dos de los marcadores más utilizados para el pronóstico 
clínico durante la infección por VIH son las cuentas de células CD4+ y la carga 
viral. Sin embargo, en diversos estudios se ha demostrado una escasa 
correlación entre la carga viral y el declive en la cuenta de células T CD4+ (52) . 
En nuestra población de estudio se comprobó que estas dos variables no 
correlacionan entre sí (Fig. 8). 
 
 
39 
2. 
Dado que en la infección por VIH existe un estado de activación inmune crónica, y 
uno de los marcadores utilizados para evaluar esta activación es CD38, en el 
presente estudio se observó que en los pacientes VIH+ existe una tendencia de 
una mayor proporción de LT CM que expresan CD38 (Fig. 8). 
 
La evolución de la enfermedad, se ha asociado a una alta frecuencia de células 
que expresan CD38, independientemente de la carga viral y la cuenta de células T 
CD4+ presente(53). En el presente estudio no se observó una correlación entre el 
porcentaje de expresión de CD38 y la cuenta de células CD4+ (Fig. 10). Es de 
considerarse que la falta de significancia estadística se deba a que no cubrimos 
un mayor intervalo del avance de la infección, es decir, pacientes VIH+ con 
cuentas de CD4+ totales mayores y menores. Adicionalmente no observamos 
correlación entre la carga viral y la expresión de CD38 como marcador de 
activación inmune (fig. 11). 
 
Las correlaciones directa e inversa que encontramos entre el porcentaje de LT CM 
CD38+ y el porcentaje de LT CM en pacientes y controles respectivamente(Fig. 
12) nos podrían indicar que en los pacientes VIH+ la expresión de CD38+, 
derivada de la activación inmune,estimula un aumento en la proporción de LT CM. 
Por el contrario, en donadores sanos un aumento en la proporción de LT CM esta 
inversamente relacionado con la expresión de CD38. Es posible que la expresión 
de CD38 este relacionada con un incremente en la proliferación inducida por 
activación inmune y por otro lado los LT CM CD38- proliferen por fenómenos 
relacionados con homeostasis. Dado que las correlaciones no son evidencia de 
causalidad, tendríamos que purificar LT CM CD38+ y CD38- y cultivarlas bajo las 
condiciones de activación policlonal mediada por TCR y en presencia de citocinas 
homeostáticas (IL-7 e IL-15) para comprobar esta nueva hipótesis. 
 
Los LT CM proliferan in vivo en la ausencia de un antígeno y mantienen su propia 
población y abastecen a la población de linfocitos T de memoria con distintas 
funciones efectoras y capacidad de “homing”(55).En estudios anteriores se ha 
 
40 
2. 
observado que el VIH causa un aumento en la proliferación, expansión y muerte 
de células T y que este aumento en el recambio podría resultar en una 
disminución o alteración de la capacidad regenerativa del sistema inmune (56), sin 
embargo, no se sabe que población específica está involucrada en estos 
fenómenos y si los LT CM muestran estas alteraciones. 
La activación con microperlas recubiertas con anticuerpos agonistas contra CD3 y 
CD28 nos permitió establecer un ambiente de activación análogo al que se obtiene 
con una célula presentadora de antígeno y de esta manera evaluar la respuesta 
proliferativa de los LT CM a partir de un estímulo mediado por TCR.Aunque no se 
muestra en los resultados, se realizaron experimentos con una proporción de una 
célula por cada perla, en los cuales se obtenían porcentajes de proliferación 
cercanos al 90%, esta proporción de perlas podría ser la óptima para las células y 
al comparar pacientes y controles es posible que no observaramos diferencias por 
utilizar el estímulo óptimo. Por este motivo usamos una proporción de dos células 
por cada perla para poder observar posibles diferencias entre pacientes y 
controles.. 
 
En este estudio se encontró una tendencia de menor viabilidad de los LT CM de 
pacientes VIH+, lo que nos indicaría la posibilidad de que esta población celular es 
más susceptible a muerte después de un estímulo de activación. Sin embargo, 
este efecto contrasta con que la proliferación de los LT CM de pacientes VIH+ no 
se ve alterada durante la infección por VIH. (Fig. 13). Por lo tanto podemos afirmar 
que bajo las condiciones experimentales que usamos no hay diferencias en la 
capacidad de proliferación de los LT CM de los pacientes VIH+ en comparación 
con los LT CM de donadores VIH-. 
Posterior a la proliferación se evalúo la capacidad de diferenciación celular, en 
donde se observó que después de un estímulo policlonal en los LT CM 
provenientes de pacientes VIH+ comparados con LT CM de controles VIH -,, la 
diferenciación no se vio alterada (Fig. 13), el fenotipo de memoria central (CCR7+) 
permanece en ambos grupos.Cabe considerar la posibilidad de que el tiempo en el 
que se dejó en cultivo las células para observar diferenciación no haya sido el 
 
41 
2. 
óptimo. En trabajos previos de nuestro grupo y en otros (57) se ha descrito que la 
diferenciación óptima de los LT CM a LT EM se da hasta los 7 días de cultivo en 
presencia de IL-2, de esta manera tendríamos que probar la capacidad de 
diferenciación a tiempos de cultivo más largos para poder conocer si la 
diferenciación de los LT CM a LT EM en pacientes VIH+ esta alterada. En este 
caso debido a que nuestro principal objetivo era evaluar la proliferación por 
incorporación de EdU usamos los tiempos de cultivo que nos permitían observar 
claramente este fenómeno. 
 
Debido a que durante la infección por VIH se caracteriza por un estado de 
activación inmune crónica cuyo marcador principal es la expresión de CD38 en 
linfocitos T en este estudio se evalúo la influencia de la expresión de CD38 en LT 
CM sobre su viabilidad y proliferación celular y se encontró que la expresión de 
este marcador de activación crónica en LT CM no afecta estos parámetros ni en 
pacientes ni en donadores (Fig. 16). 
 
En futuros experimentos podría incluirse en la tinción con EdU, un anticuerpo 
monoclonal dirigido contra CD38 unido a un fluorocromo específico, esto con el fin 
de evaluaradicionalmente, si la expresión de CD38 aumenta después del estímulo 
recibido y evaluar si la proliferación es diferente entre de LT CM CD38+ y LT CM 
CD38- de pacientes VIH+. 
 
 
 
 
 
42 
2. 
 
 
8. CONCLUSIONES 
 
- La capacidad proliferativa de los LT CM de pacientes VIH+ no está disminuida en 
comparación con LT CM de controles VIH- después de un estímulo policlonal 
mediado por TCR. 
- La diferenciación de LT CMa LT EM después del estímulo policlonal mediado 
por TCR no se ve alterada en pacientes VIH+ comparados con controles VIH- bajo 
nuestras condiciones de activación. 
- La expresión de CD38 en los LT CM, como marcador de activación crónica, no 
correlaciona con la capacidad proliferativa o la viabilidad tanto en pacientes VIH+ 
como en controles VIH -. 
 
 
 
 
43 
2. 
 
9. REFERENCIAS 
 
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