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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas “Caracterización bioquímica y estructural de los proteasomas de una línea celular de Arabidopsis thaliana bajo diferentes condiciones de estrés” TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: Maestro en Ciencias PRESENTA: BIOL. DANIEL ARISTIZÁBAL RAMÍREZ TUTOR PRINCIPAL Dr. José Fernando Lledías Martínez Instituto de Biotecnología - UNAM MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR Dr. Tomás David López Díaz Instituto de Biotecnología - UNAM Dra. Georgina Ponce Romero Instituto de Biotecnología - UNAM Cuernavaca, Morelos. Octubre, 2016 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 Este trabajo se realizó bajo la tutoría del Dr. José Fernando Lledías Martínez en el departamento de Biología Molecular de Plantas del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México y fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) a través de la beca de estudios de posgrado con número 548874 y por DGAPA – UNAM a través del apoyo a los proyectos PAPIIT IN208313 (Proteólisis regulada en la respuesta de defensa de las plantas - Dr. José Fernando Lledías Martínez) y PAPIIT IN212116 (Caracterización bioquímica y estructural de los proteasomas de plantas - Dr. José Fernando Lledías Martínez). 3 AGRADECIMIENTOS ACADÉMICOS Al Dr. Fernando Lledías por sus enseñanzas, su asesoría, su apoyo y su paciencia durante la realización de este proyecto. Al Dr. Mario Rocha Sosa (q.e.p.d.) por haberme aceptado en su laboratorio. Al Dr. Plinio Guzmán Villate y a Laura Aguilar Henonin, del Cinvestav – Irapuato, por la donación de los cultivos celulares usados para este trabajo. A los miembros del comité tutoral: Dra. Georgina Ponce y Dr. Tomás López por su acompañamiento académico a lo largo del proceso. A los miembros del jurado: Dra. Gladys Cassab López, Dr. Enrique Alejandro Reynaud Garza, Dr. Carlos Amero Tello, Dra. Claudia Díaz Camino y Dr. José Luis Reyes Taboada. Al cuarto oscuro por recibirme y soportarme durante largas tardes. A la unidad de docencia del IBT – UNAM, especialmente al Lic. J. Antonio Bolaños Guillén y a la Dra. Claudia Treviño. Al “Programa de Apoyo a los Estudios de Posgrado” (PAEP) por el apoyo para la asistencia a congresos nacionales. Al CONACyT y al PAPIIT por mi beca de maestría y la financiación de los proyectos que hicieron posible la realización de este trabajo, respectivamente. Al Instituto de Biotecnología – IBT y la Universidad Nacional Autónoma de México – UNAM. PERSONALES A mi padre y a mi madre, a quienes va dedicado este trabajo, por apoyarme y motivarme incondicionalmente. Ustedes han sido mi motor a lo largo de estos años, y durante este proceso no fue la excepción. Simplemente gracias. A mi hermano y a mi hermana por estar a mi lado en todo momento y ser mis amigos incondicionales. Este triunfo es de los cinco, familia. 4 A Andrea Camacho un “gracias totales” que lo abarca todo. A mi familia en México: Nathy, Charlie, Marianita, Danielita, Jei y Adri. Nunca terminaré de agradecerles ni podré pagarles todo lo que hicieron por mí en este tiempo. A mis “parceros” más cercanos: Checho, Chuy e Ivanito por compartir momentos memorables durante estos dos años. Grandes amigos que deja la vida. A mis compatriotas, pero sobre todo amigos: Clau, Luis Fe, Leidy, Ori y Adri. Gracias por su invaluable amistad y por hacerme sentir como si estuviera en casa. A mis amigos y compañeros de maestría, especialmente a Emma, Caro, Lula y Edgardo por su compañía y amistad durante la maestría. A mis amigos de fútbol por dos años de goles, gambetas y buena amistad: Adam, Cabo, Palens, Braulio, Perro, Pedro Arenas, Chiri, Villa y todos aquellos con los que tuve el gusto de compartir una cancha. A Paty Rueda y Fernando porque gracias a ellos conocí el IBT y pude llegar a México. A Guillermo y Rosy por su hospitalidad y generosidad. A Doña Au y su deliciosa sazón por mantenerme vivo y bien alimentado durante estos dos años. A mis compañeros de laboratorio: Viri, Alexis, Alma, Marel, Eli, Pepe por su apoyo técnico y por las incontables tardes que disfrutamos en el lab. A todas aquellas personas con las que me crucé en el camino, que de una u otra forma dejaron una huella en mí e hicieron de esta maestría una experiencia inolvidable. A todos gracias. 5 Tabla de Contenido ÍNDICE DE FIGURAS 7 ÍNDICE DE TABLAS 8 RESUMEN 9 INTRODUCCIÓN 11 EL PROTEASOMA 11 PROTEASOMA 20S 11 PROTEASOMA 26S 13 REGULADOR 19S 14 SISTEMA UBIQUITINA PROTEASOMA (SUP) 15 OTROS REGULADORES PROTEASOMALES 18 PA200 Y BLM10 18 11S O PA28 19 INMUNOPROTEASOMA 20 ECM29 21 PR500 22 PROTEÍNAS ASOCIADAS AL PROTEASOMA (PAPS) 23 ESTRÉS OXIDATIVO 25 AUMENTO DE TEMPERATURA 26 GENERALIDADES Y ANTECEDENTES EN NUESTRO LABORATORIO 28 HIPÓTESIS 29 OBJETIVO GENERAL 30 OBJETIVOS PARTICULARES 30 METODOLOGÍA 30 CULTIVO DE CÉLULAS 30 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LOS PROTEASOMAS 31 TRATAMIENTO CON PARAQUAT 32 TRATAMIENTO POR AUMENTO DE TEMPERATURA 32 SEPARACIÓN MEDIANTE BN-PAGE DE LAS DIFERENTES VERSIONES DEL PROTEASOMA 33 WESTERN BLOT 33 ELECTROELUCIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LAS MUESTRAS DE LOS TRATAMIENTOS CON PARAQUAT Y AUMENTO DE TEMPERATURA 34 ENSAYOS DE CARBONILACIÓN Y UBIQUITINACIÓN DE LAS MUESTRAS TRATADAS CON PARAQUAT Y LAS SOMETIDAS A AUMENTO DE TEMPERATURA 34 ENSAYO DE VIABILIDAD 36 6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36 EXTRACCIÓN DE PROTEASOMAS 36 SEPARACIÓN DE LAS POBLACIONES PROTEASOMALES MEDIANTE BN-PAGE EN CÉLULAS CONTROL 38 TRATAMIENTO CON PARAQUAT (ESTRÉS OXIDATIVO) 40 TRATAMIENTO POR AUMENTO DE TEMPERATURA 64 MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE PROTEASOMAS DE ALTO PESO MOLECULAR 77 CONCLUSIONES 79 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 81 7 Índice de figuras Figura 1. Proteasoma 20S. 12 Figura 2. Proteasoma 26S. 14 Figura 3. Diagrama esquemático del sistema ubiquitina-proteasoma. 17 Figura 4. Regulador Blm10 de S. cerevisiae. 19 Figura 5. Regulador 11S o PA28 de mamíferos. 20 Figura 6. Esquema del inmunoproteasoma. 21 Figura 7. Regulador Ecm29. 22 Figura 8. Extracción y enriquecimiento de proteasomas. 38 Figura 9. Separación de poblaciones proteasomales por BN-PAGE en células control. 40 Figura 10. Tinción con Azul de Coomassie y western blot. 42 Figura 11. Electroelución de la proteína usada como control de carga. 43 Figura 12. Tinción con nitrato de plata de las muestras del tratamiento con paraquat. 44 Figura 13. Tinción con Rojo Ponceau de una muestra tratada a 37oC. 46 Figura 14. Tratamientos control sin adición de paraquat. 49 Figura 15. Western blot de las células tratadas con 5 µM de paraquat a diferentes tiempos. 50 Figura 16. Western blot de las células tratadas con 50 µM de paraquat a diferentes tiempos. 52 Figura 17. Western blot de las células tratadas con 500 µM de paraquat a diferentestiempos. 53 Figura 18. Medición de marcadores de estrés. 58 Figura 19. Tinción con Azul de Coomassie y western blot. 66 Figura 20. Tinción con nitrato de plata del BN-PAGE de las muestras del tratamiento con aumento de temperatura. 68 8 Figura 21. Tratamientos control sin aumento de temperatura. 69 Figura 22. Tratamientos sometidos al aumento de temperatura. 70 Figura 23. Medición de marcadores de estrés. 72 Figura 24. Microscopía electrónica del proteasoma. 78 Índice de tablas Tabla 1. Concentraciones y tiempos de los tratamientos con paraquat. 41 Tabla 2. Determinación de cuentas viables de los cultivos en presencia de paraquat. 48 9 Resumen El proteasoma es reconocido como el complejo multicatalítico clave de la degradación no lisosomal de proteínas. Es responsable del recambio proteico intracelular y está involucrado también en varios procesos reguladores centrales que incluyen el ciclo celular, la traducción de señales, la apoptosis y la expresión génica entre otros procesos celulares (Schwartz & Ciechanover, 1999). La estructura mínima básica del proteasoma, la cual le da su definición como tal, es el centro catalítico 20S, el cual tiene forma de barril. El proteasoma 20S es capaz de degradar prácticamente cualquier proteína, sin que éstas requieran ubiquitinación ni ATP y sin que se le asocien otras partículas proteicas reguladoras. El 20S ha sido aislado de algunas plantas tales como hojas de espinaca, de semillas de chícharos secos y de hojas de trigo. Las características bioquímicas de los proteasomas aislados de estas plantas son casi idénticas a las de los proteasomas aislados de otros eucariotas. El proteasoma 20S puede unir diferentes reguladores (p.e. las partículas 19S, PA28, PA200, PR500 o Blm 10), a uno o ambos extremos, que modifican la especificidad de los sustratos a degradar y de los péptidos que se producen como resultado de esta degradación. Al unirse estas moléculas reguladoras se forman otras versiones de proteasomas, cada una con su función determinada (Iwanczyk et al., 2006). La mayoría de estudios sobre el proteasoma se han realizado en células de mamíferos y de levaduras. En estos modelos de estudio se han identificado diferentes versiones proteasomales que cumplen una función de acuerdo a las condiciones dadas en la célula en ese momento. Los estudios en células vegetales y particularmente en Arabidopsis thaliana son muy escasos. Además de esto, no hay información sobre las posibles modificaciones (estructurales y/o funcionales) que puedan experimentar los proteasomas en plantas. 10 Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue caracterizar bioquímica y estructuralmente las diferentes versiones del proteasoma de células en cultivo de A. thaliana así como las Proteínas Asociadas al Proteasoma (PAPs) que se observen en respuesta al estrés oxidativo y al estrés por aumento de temperatura. Para esto utilizamos una línea celular de A. thaliana que fue sometida a estrés oxidativo, mediante la adición de diferentes concentraciones de paraquat, y a estrés por aumento de temperatura al someterlas a 37oC. Los proteasomas de estos cultivos celulares fueron enriquecidos por ultracentrifugación diferencial para posteriormente poder establecer si las condiciones de estrés condicionaron el establecimiento o ensamble de diferentes versiones del proteasoma. Dentro de los principales resultados obtenidos para el tratamiento con estrés oxidativo está la identificación de distintas poblaciones proteasomales de alto peso molecular (mayor al 20S independiente) en los tratamientos con paraquat. La presencia de estos proteasomas de alto peso molecular coincide con el aumento de los niveles de proteínas ubiquitinadas y carboniladas, sugiriendo que éstos podrían estar cumpliendo alguna función en la regulación de estos dos procesos. El aumento de la temperatura produjo un aumento de poblaciones proteasomales de alto peso molecular. Pero a diferencia del tratamiento con paraquat, los niveles de ubiquitinación disminuyeron en todos los tiempos, mientras que el nivel de proteínas carboniladas se mantuvo prácticamente invariable. Nuestros resultados sugieren que el tratamiento con paraquat o ante un aumento de la temperatura en el cultivo se observan cambios en las poblaciones proteasomales y se evidencia la aparición de versiones de proteasoma de alto peso molecular, las cual pueden estar jugando un papel importante para responder ante estas condiciones adversas. Estos resultados apoyan lo encontrado previamente en nuestro laboratorio en otra línea celular de A. thaliana con tratamientos semejantes, lo que sugiere que ésta puede ser una respuesta general de la célula vegetal ante condiciones adversas. 11 Introducción El proteasoma El proteasoma es un complejo multienzimático encargado de la degradación no lisosomal de proteínas en la célula. Es responsable del recambio proteico intracelular y está involucrado también en varios procesos reguladores centrales que incluyen el ciclo celular, la traducción de señales, la apoptosis y la expresión génica entre otros procesos celulares (Schwartz & Ciechanover, 1999). Es una proteasa esencial en el citoplasma y núcleo de las células eucariotas, ocupa cerca del 1% de las proteínas celulares solubles (en células HeLa) (Farout & Friguet, 2006; Hendil, et al., 2002). En las células eucariotas el proteasoma es el encargado de degradar la mayoría de proteínas, y produce pequeños péptidos de 3 – 25 aminoácidos que a su vez son digeridos en aminoácidos sencillos por una proteasa llamada tripeptidil proteasa (TPP). El resto de proteínas se degradan vía lisosoma en aminoácidos sencillos. (Schreiber & Peter 2014). La degradación de proteínas vía proteasoma puede ser dependiente del ATP o independiente de éste, como veremos más adelante. Proteasoma 20S La estructura mínima básica del proteasoma, la cual le da su definición como tal, es el centro catalítico 20S que tiene una masa de 700 kDa y está presente en plantas, animales, levaduras, bacterias y archea. Este centro catalítico es donde se lleva a cabo la degradación de proteínas dañadas o mal plegadas y el control de calidad de proteínas recién sintetizadas que están involucradas en la regulación del ciclo celular, expresión 12 génica, respuesta inmune, respuesta a estrés y carcinogénesis (Jung & Grune, 2012). La partícula 20S tiene una topología de forma de barril formada por cuatro anillos apilados (dos internos β y dos exteriores α) compuesto de siete subunidades cada uno (Vierstra, 1996), cada una de las cuales tiene una masa molecular entre 20 y 30 kDa (Figura 1). a. b. Figura 1. Proteasoma 20S. a) Topología y modelo tridimensional del proteasoma 20S de Saccharomyces cerevisiae. El proteasoma consiste de dos copias de siete diferentes subunidades α y dos copias de siete diferentes subunidades β. En la sección longitudinal, los residuos de treonina en la cámara catalítica se muestran en color amarillo (Tomada de Sorokin et al., 2009). b) Puerta del proteasoma 20S eucariota. Esta imagen muestra un rearreglo estructural de los anillos alfa del 20S de C. cerevisiae sin (imagen de la izquierda) y después de la activación (imagen de la derecha). La activación puede ser inducida por la unión de una proteína sustrato, de oligopéptidos cortos o de proteínas reguladoras. Después de la activación se facilita la entrada del sustrato debido a la apertura de la puerta formada por los extremos N-terminal de los anillos alfa (Tomada de Jung & Grune, 2012). 13 Los anillos β guardan tres subunidades proteolíticamente activas diferentes: caspasa (β1), tripsina (β2), y quimotripsina (β5)(Fig. 1a) que permiten romper uniones peptídicas en el extremo C – terminal de aminoácidos ácidos, básicos e hidrofóbicos (Saeki & Tanaka, 2012); por esto la actividad proteolítica del proteasoma 20S es capaz de degradar virtualmente cualquier proteína. Estas tres subunidades (β1, β2 y β5) contienen residuos de treonina catalíticamente activos en su N – terminal por lo que tienen actividad hidrolasa N – terminal nucleófila: esto indica que el proteasoma es una treonin – proteasa (Saeki & Tanaka, 2012). Las subunidades o anillos α están encargados de regular la entrada de los sustratos a la cámara catalítica, y forman una especie de “puerta” muy angosta que está prácticamente cerrada (Fig. 1b) (Jung & Grune, 2012; Saeki & Tanaka, 2012). Esta puerta tiene una estructura ordenada formada por los residuos N – terminal de las subunidades α2, α3 y α4. La apertura de esta puerta está controlada por reguladores/activadores proteasomales que se pueden unir al 20S y de los cuales hablaremos más adelante. Proteasoma 26S Una de las versiones de proteasoma mejor estudiadas es el proteasoma 26S (Figura 2), la cual está altamente conservada y es especialmente homogénea entre los eucariotas (Pickart & Cohen, 2004; Wolf & Hilt, 2004). El proteasoma 26S es una proteasa multisubunitaria (está compuesto de al menos 33 subunidades) con masa molecular de 2.5 MDa (Schreiber & Peter, 2014), compuesta por dos subcomplejos: una partícula central o “core particle” (CP) 20S (700 kDa) donde se lleva a cabo la proteólisis, y una partícula reguladora o “regulatory particle” (RP) 19S (900 kDa) que se une a uno o ambos extremos del CP y prepara al sustrato para ser internalizado y degradado. El proteasoma 26S es muy abundante en el núcleo y el citoplasma, donde degrada principalmente proteínas reguladoras de vida corta (Schreiber & Peter, 2014). El 26S degrada, con ayuda del ATP, proteínas funcionales a las que se ha unido de forma covalente una cadena de poli- ubiquitina; por lo tanto controla negativamente la abundancia de un gran número de 14 proteínas reguladoras envueltas en cascadas de señalización y rutas metabólicas (Kurepa et al., 2009). Además, es importante en el control de calidad de proteínas ya que degrada las que están mal plegadas o desnaturalizadas por errores en el proceso de traducción. Por eso, se dice que el proteasoma 26S es el componente proteolítico del sistema ubiquitina- proteasoma (SUP) (Kurepa et al., 2009). a. b. Figura 2. Proteasoma 26S. a) Modelo 3D de baja resolución del proteasoma 26S, obtenido por microscopía electrónica (Tomada de Sorokin, 2009). b) Esquema del proteasoma 26S. Se muestran las proteínas que conforman la base (color gris) y la tapa (color verde) de la subunidad reguladora 19S. La porción cilíndrica del 20S se muestra en una conformación abierta, mostrando el arreglo de las subunidades α y β identificadas en naranja y azul respectivamente (Tomada de Díaz-Villanueva et al., 2015). Regulador 19S Uno de los reguladores/activadores proteasomales que se pueden unir al 20S es el regulador 19S, también conocido como PA700. La unión del 19S a uno o ambos extremos del 20S forman el proteasoma 26S (Schreiber & Peter, 2014; Kurepa, 2009; Glickman et al., 1998). La subunidad 19S es la mejor descrita actualmente y está formada por dos estructuras principales: la base y la tapa. La primera tiene una conformación en anillo que interacciona directamente con la superficie distal de las subunidades alfa del 20S y la tapa está formada por nueve subunidades cuya función principal es la de reconocimiento de las 15 proteínas poli-ubiquitinadas que serán translocadas a la cavidad catalítica del 20S (Fig. 2) (Jung & Grune, 2012). La base está conformada por seis subunidades con función de AAA-ATPasas (Rpt1-6) que forman un anillo y 3 subunidades sin actividad de ATPasa (Rpn1, Rpn2 y Rpn10) que al parecer funcionan como sitio de anclaje de otras proteínas (Kurepa & Smalle, 2008; Yang et al., 2004; Glickman et al., 1998). La tapa está formada por nueve subunidades no ATP- asas (Rpn3, Rpn5-9, Rpn11-12 y Rpn15) (Saeki & Tanaka, 2012; Glickman et al., 1998). La unión entre la base y la tapa está estabilizada por las subunidades Rpn10 y Rpt5 (Saeki & Tanaka, 2012; Kurepa & Smalle, 2008). Este regulador 19S realiza varias funciones: reconocimiento y unión selectiva de las proteínas a degradar, desnaturalización y desdoblamiento de las proteínas ubiquitinadas, remoción de las cadenas de poliubiquitina de las proteínas sustrato, apertura de la puerta formada por los extremos amino de las subunidades α que están en cada extremo de la partícula 20S y finalmente, el internamiento de los sustratos a la cámara proteolítica del cilindro para su degradación (Yang et al., 2004; Finley, 2002; Kohler et al., 2001). Sistema ubiquitina proteasoma (SUP) Las proteínas celulares son marcadas para degradación proteasomal a través de la ubiquitinación, es decir la unión de ubiquitinas a las proteínas blanco. La ubiquitina es una proteína de 76 aminoácidos (8 kDa) altamente conservada en eucariontes. Además de cumplir el papel en la degradación regulada de proteínas, la ubiquitina también está involucrada en el transporte vesicular, la modificación de histonas, la reparación del ADN, entre otras (Rocha, 2013; Zamudio et al., 2012). La ubiquitina puede formar un enlace peptídico con otra ubiquitina por medio de la unión covalente de la glicina del C – terminal con una lisina de la otra molécula de ubiquitina (Rocha, 2013). Como la molécula de ubiquitina tiene siete lisinas (en las posiciones 6, 11, 27, 29, 33, 48 y 63), las cadenas de ubiquitina pueden adoptar diferentes formas dependiendo de la unión de la glicina con alguna de las lisinas. Por lo tanto el destino final de las proteínas ubiquitinadas dependerá de la conformación de la cadena de ubiquitina. Las cadenas que se unen por la lisina 63 16 (K63) son dirigidas mayoritariamente a procesos de endocitosis, mientras que las unidas en la lisina 48 (K48) serán destinadas a degradación por el proteasoma 26S (Schreiber & Peter, 2014; Rocha, 2013; Zamudio et al., 2012). Existen tres tipos de ubiquitinación: monoubiquitinación, multi-monoubiquitinación y poliubiquitinación. En la monoubiquitinación, el sustrato forma un enlace covalente con una sola molécula de ubiquitina. En la multi-monoubiquitinación el sustrato forma un enlace covalente con varias moléculas de ubiquitina en distintos lugares del mismo sustrato. En la poliubiquitinación se forman polímeros de ubiquitina en donde participan las siete lisinas (pero principalmente K48 y K63) (Schreiber & Peter, 2014; Rocha, 2013; Zamudio et al., 2012). En las células eucariotas el SUP es la vía principal que dirige la degradación selectiva de las proteínas. En la célula hay esencialmente dos clases de proteínas que son marcadas para degradación dependiente de ubiquitina: proteínas mal plegadas o dañadas que son detectadas por la pérdida de su estructura terciaria y proteínas funcionales que cargan señales de degradación específicas (Kurepa & Smalle, 2008). Por lo tanto se conocen dos funciones específicas del SUP. La primera es llevar a cabo el control de calidad en la célula, incluyendo la degradación de proteínas con errores de traducción y proteínas dañadas por estrés que se podrían agregar y ser tóxicas para la célula. La segunda es la regulación celular e involucra la remoción selectiva y condicional de proteínas regulatorias. Este proceso juega un papel crítico en la regulación de una gran variedad de procesos celulares que incluye el ciclo celular, la transducción de señales, la apoptosis y la expresión génica. La función alterada del SUP ha sido implicada en enfermedades humanas como el cáncer y el Alzheimer (Gentier & van Leeuwen, 2015; Morrow et al., 2015).En la cascada de ubiquitinación, las proteínas a degradar se marcan covalentemente con una cadena de ubiquitina. La reacción enzimática (llamada ubiquitinación) comienza con la activación de una molécula de ubiquitina mediante la formación de un enlace covalente en un residuo de glicina del extremo C – terminal; la glicina se adenila (se requiere ATP). La ubiquitina activa se une a un residuo de cisteína en el extremo N - terminal de una enzima 17 activadora de la ubiquitina (E1) cuya actividad depende de ATP. Este complejo E1- ubiquitina interactúa con un residuo de cisteína de una enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) para formar el complejo E2-ubiquitina. Finalmente una ligasa de ubiquitina (E3) se une al sustrato (proteína blanco) e interactúa con el complejo E2-ubiquitina, ligando la ubiquitina a la proteína blanco. El reconocimiento del sustrato para ubiquitinación se da por la interacción de éste con E2 y E3, y da como resultado la formación de un enlace isopeptídico entre un residuo C-terminal de la ubiquitina y un residuo de lisina de la proteína blanco. Finalmente la proteína queda marcada para degradación o para cumplir otras funciones (Figura 3) (Schreiber & Peter, 2014; Rocha, 2013; Zamudio et al., 2012). En las plantas se codifican únicamente una o dos enzimas E1, mientras que hay mucha mayor variedad de E2 (36 isoformas en A. thaliana). Esto se refleja en mayor especificidad en cuanto al reconocimiento de diferentes E3. Sin embargo, la diversidad de E3 en A. thaliana es muy amplia, ya que su genoma codifica para alrededor de 1,500 de estas enzimas. Esto sugiere que las plantas utilizan el proceso de ubiquitinación para regular un gran número de procesos a lo largo de su vida (más del 5% del genoma de A. thaliana codifica para proteínas del SUP), incluyendo la regulación de la degradación mediada por el proteasoma. Figura 3. Diagrama esquemático del sistema ubiquitina-proteasoma. El SUP involucra al menos tres enzimas (E1, E2 y E3) que catalizan la adición de ubiquitina a residuos de lisina en la proteína sustrato. Los sustratos poliubiquitinados son reconocidos por el proteasoma o las proteínas asociadas a éste, la ubiquitina es 18 removida por desubiquitinasas y el sustrato es desplegado y translocado al 20S para su degradación (Tomada de Gomes, 2013). Otros reguladores proteasomales Aparte del regulador 19S se han descrito otros reguladores proteasomales que se pueden unir a uno o ambos extremos del 20S (p.e. las partículas 19S, PA28, PA200, PR500 o Blm 10, entre otras), ya sea que se una el mismo regulador a un 20S o un regulador diferente a cada extremo de un 20S, formando proteasomas homogéneos o híbridos respectivamente. En levadura, la versión dominante de proteasomas está constituida por híbridos Blm10- CP-19S y muestran actividad elevada de peptidasa, mientras que en mamíferos la versión PA28-CP-19S (también llamado inmunoproteasoma) juega un papel fundamental en la defensa inmune. A continuación se hará una breve descripción de los reguladores proteasomales descritos hasta la fecha. PA200 y Blm10 Los reguladores homólogos PA200 (mamíferos) y Blm10 (levaduras) (Figura 4a) poseen unas asas de activación que se insertan en las subunidades α del 20S e inducen un rearreglo estructural de la región de la puerta lo que permite la entrada del sustrato (López et al., 2011; Iwanczyk et al., 2006). Es decir que modulan la apertura de la puerta del 20S. Además, PA200/Blm10 cumple funciones en la espermatogénesis y la reparación del ADN (Pick & Berman, 2013). Iwanczyk et al., (2006) purificaron a Blm10 y construyeron un modelo tridimensional a partir de criomicroscopía electrónica (Fig. 4b), donde se dieron cuenta que Blm10 se une a uno o ambos extremos del 20S. Cuando Blm10 no está unido a un extremo, la puerta conformada por los anillos α permanece cerrada, mientas que en el lado donde se une a 20S la puerta se abre, elucidando el papel de este regulador en la apertura de la puerta del proteasom (Fig. 4c). Por su parte, PA200, aumenta la degradación de fragmentos de proteínas pequeñas, aunque no es capaz de degradar proteínas en su forma nativa (Jung & Grune, 2012). En 2010, Book et al. detectaron en A. thaliana una versión de proteasoma compuesta por 20S con un regulador PA200 adherido 19 a un extremo, y que puede estar involucrado en la degradación de proteínas independiente de ubiquitina. Este es uno de los muy pocos reportes de reguladores proteasomales detectados en plantas. a. d. Figura 4. Regulador Blm10 de S. cerevisiae. a) Se observa una partícula central 20S con dos reguladores Blm10 (la estructura azul claro en forma de domo a ambos extremos del 20S) unidos (Tomada de Jung & Grune, 2012). b) Corte sagital de la superficie representando el proteasoma Blm10-20S-Blm10. Las tapas color café claro (Blm10) a ambos lados del 20S permiten la formación de una cavidad interna comunicada con el centro catalítico del proteasoma (Tomada de Iwanczyk et al., 2006). c) Mapa de densidad del proteasoma Blm10-20S- Blm10 (panel izquierdo) y del proteasoma Blm10-20S (panel derecho). La densidad en el centro de los anillos alfa en contacto con Blm10 (flechas blancas) en ambos complejos es significativamente menor que en los anillos alfa libres (flecha amarilla) del complejo asimétrico (Tomada de Iwanczyk et al., 2006). d) Imagen obtenida por microscopía electrónica del proteasoma 20S unido al regulador Blm10. En el recuadro de la izquierda se observa un proteasoma 20S independiente. En el recuadro del centro se observa el complejo 20S- Blm10, mientras que en el recuadro de la derecha se observa el complejo Blm10-20S-Blm10 (Tomada de Schmidt et al., 2005). 11S o PA28 El regulador 11S en levaduras o PA28 en mamíferos (Figura 5), también conocido como REG, es un complejo multimérico, conformado por 3 subunidades, que se puede unir a 20 ambos extremos del 20S y estimular su capacidad para hidrolizar péptidos pequeños. REG α y β forman heteroheptámeros que se encuentran principalmente en el citoplasma y REGγ forma un homoheptámero localizado en el núcleo. REGαβ activa los tres sitios activos del 20S uniéndose a los anillos α y promueve la apertura del canal hacia la cámara catalítica, mientras que REGγ solo activa la subunidad β2 (tripsina). La degradación de sustratos por el complejo PA28-20S es independiente del ATP, por lo que se cree que los sustratos de este proteasoma son solo proteínas ya desnaturalizadas (Jung & Grune, 2012). REGαβ juega un papel importante en la presentación de antígenos al Complejo Mayor de Histocompatibilidad Clase 1 (MHC-I) (Pick & Berman, 2013; Rechsteiner, 2013; Cascio et al., 2002). a. b. Figura 5. Regulador 11S de levaduras o PA28 de mamíferos. a) Imagen obtenida por microscopía electrónica del proteasoma 20S unido al regulador PA28. En el recuadro de la izquierda se observa un proteasoma 20S independiente. En el recuadro del centro se observa el complejo 20S-PA28, mientras que en el recuadro de la derecha se observa el complejo PA28-20S-PA28 (Tomada de Schmidt et al., 2005). b) Se observa una partícula central 20S con dos reguladores 11S unidos a sus extremos (Tomada de Jung & Grune, 2012). Inmunoproteasoma Una versión especial del proteasoma 20S inducida por interferón - γ (IFN- γ) es el llamado inmunoproteasoma (i20S). Esta versión de proteasoma está compuesta por un regulador 19S, el 20S y un regulador 11S (se conoce como un proteasoma híbrido), o por el 20S y un regulador 11S unido a cada extremo del primero (Figura 6b). En vez de las subunidades catalíticas normales (β1, β2 y β5), el inmunoproteasoma tiene las subunidades inducibles 21 β1i, β2i y β5i (Fig. 6a) (Pick & Berman, 2013; Rechsteiner, 2013; Cascio et al., 2002). A diferencia de un 20S independiente o de un 26S,el inmunoproteasoma produce péptidos cortos (8-10 aminoácidos) y específicos para ser presentados por el MHC-I en la superficie celular durante la respuesta inmune (Jung & Grune, 2012). a. b. Figura 6. Esquema del inmunoproteasoma. a) el centro catalítico del proteasoma 20S está compuesto por dos anillos α externos y dos anillos β internos. La exposición al IFN- γ induce la síntesis de tres “inmunosubunidades” β (β1i, β2i y β5i) que son incorporadas en el nuevo proteasoma formado, reemplazando las subunidades constitutivas y conformando el inmunoproteasoma. b) el regulador inducido por IFN- γ, 11S (PA28), se puede unir en el lado libre de un complejo 19S-20S para formar un proteasoma híbrido, o se puede unir a ambos extremos de un 20S modificado para formar el inmunoproteasoma (Tomadas de McCarthy & Weinberg, 2015). Ecm29 Otro regulador asociado al proteasoma que ha sido reportado es Ecm29 (Figura 7). En levaduras Ecm29 actúa para estabilizar el proteasoma 26S aunque no se sabe si ayuda a activar la degradación de proteínas. El homólogo en humanos está asociado con membranas secretoras y endocíticas. Ecm29 reconoce los complejos 19S - 20S donde la 22 maduración del 20S está atrofiada por la ausencia de algunas subunidades β. En este caso Ecm29 actúa como proteína de andamiaje para mantener estable la asociación mientras se completa la maduración del 20S, tras lo cual Ecm29 se degrada y 19S – 20S se disocia (Rechsteiner, 2013; Lehmann et al., 2010; Leggett et al., 2002). Algo similar reportan Wang et al., (2010), quienes encontraron que Ecm29 aumenta su asociación al 19S durante un evento de estrés oxidativo en levaduras. La mutación de Ecm29 en algunas células no permitió el desensamblaje del proteasoma 26S y estas células fueron más sensibles al estrés oxidativo que las silvestres, sugiriendo que la separación de 19S y 20S es importante para la respuesta celular a este tipo de estrés. Figura 7. Regulador Ecm29. Micrografías electrónicas del regulador Ecm29 independiente y del complejo Ecm29-20S (Tomada de Leggett et al., 2002). PR500 PR500 es un complejo proteico de 500kDa detectado recientemente en plántulas de A. thaliana y en ramilletes de coliflor. Comparte al menos tres subunidades con la tapa del 19S. En plantas no estresadas PR500 se encuentra como un complejo aislado, mientras que en respuesta a un aumento de la temperatura se disgrega en sus diferentes componentes. Aun no se conoce bien su función pero algunas aproximaciones sugieren 23 que PR500 funciona como un reservorio de subunidades del 19S que se usan para acelerar la síntesis del 26S requerido para contrarrestar los efectos de la desnaturalización de proteínas por estrés. Aparte de ser un reservorio para la formación del regulador 19S, también se cree que PR500 recluta subunidades del 19S durante estrés por sequía y libera estas subunidades cuando aumentan las proteínas desnaturalizadas por otros tipos de estrés (Kurepa, 2009; Peng et al., 2001). Como podemos ver, hasta ahora son varios los reguladores proteasomales identificados en mamíferos y levaduras los cuales han sido bien caracterizados y se conoce mucho de su función. Sin embargo, en plantas apenas se han identificado dos reguladores proteasomales recientemente y su función aún no es muy conocida. El universo de los reguladores proteasomales es prácticamente un misterio en plantas, poco se conoce sobre este tema, menos aún en plantas sometidas a algún tipo de estrés. Proteínas Asociadas al Proteasoma (PAPs) Se han publicado evidencias experimentales que muestran que el proteasoma 26S se desensambla durante la degradación de un sustrato, todo ello coordinado con la hidrólisis de ATP (Babbitt, 2005). En el modelo de “masticar y escupir”, la hidrólisis controlada de ATP acoplada a la degradación de la proteína, genera una fuerza mecánica que causa un cambio conformacional en las ATPasas de la subunidad 19S. Este cambio, no sólo causa la disociación de la subunidad 19S del proteasoma 26S, sino que a su vez la subunidad 19S se disgrega en subcomplejos. Eventualmente los componentes de la subunidad 19S se reasocian y conforman nuevamente al proteasoma 26S restaurando la maquinaria para una nueva ronda de degradación. Es posible que durante la etapa de restauración, nuevos elementos o distintas proporciones de los elementos reguladores preexistentes, puedan integrarse y dar como resultado una nueva versión del proteasoma con diferente estabilidad, especificidad o actividad. Además de los reguladores/activadores arriba descritos, hay cada vez más evidencia de proteínas adicionales que interaccionan con el proteasoma e influencian su función. Se han descrito más de 300 proteínas con el nombre genérico de Proteínas Asociadas al Proteasoma (PAPs), entre las que se encuentran 24 factores transcripcionales, chaperonas, factores de elongación, receptores de cadenas de ubiquitina, enzimas deubiquitinantes, enzimas que conjugan ubiquitina (E2’s) y ligasas de ubiquitina (E3’s) entre otras (Weissman, 2001). Estas PAPs se pueden categorizar en dos grupos. El primer grupo comprende proteínas que están asociadas al sistema de ubiquitinación, tales como las enzimas desubiquitinadoras (DUB) USP14 y UCH37 y los receptores extrínsecos de ubiquitina UBL-UBA. También se incluyen muchas ligasas E3 como Hul5/KIAA10, E6AP, Parkin, Ubr1, Ufd4 y SCF (Saeki & Tanaka, 2012). También hay un grupo de receptores-lanzadera de ubiquitina ubicados en la base del 19S (asociados a Rpn1 y unidos a la DUB Ubp6) que reconocen los sustratos ubiquitinados y los lanzan hacia la cavidad del 20S. Estos receptores son Rad23, Ddi1 y Dsk2 (Lander et al, 2012). El segundo grupo incluye factores proteicos auxiliares que regulan la función proteasomal uniéndose directamente al proteasoma (Saeki & Tanaka, 2012). Un ejemplo de esos factores proteicos es Ecm29, del cual ya hablamos anteriormente. Las PAPs se asocian al proteasoma en respuesta a cambios ambientales y afectan su función, regulación, ensamblaje, estabilidad y modulación del proceso de degradación proteica (Kaake et al., 2010; Babbitt, 2005). Sabiendo que hay un gran número de PAPs hasta ahora identificadas, y que seguramente aún hay muchas por descubrir, esto sugiere que el proteasoma 26S es mucho más diverso y complejo en composición de lo que se cree. El estudio de estas PAPs puede ayudar a elucidar aún más la dinámica de este complejo proteolítico (cómo se ensamblan y estructuran las poblaciones proteasomales a lo largo de un tiempo). Aunque el papel de solo algunas de las PAPs ha sido descrito desde el punto de vista de su mecanismo, si consideramos su multiplicidad y sus propiedades tan divergentes, las PAPs conforman un grupo que sin duda resulta interesante estudiar en el contexto de la degradación de proteínas mediada por el proteasoma. Hasta ahora, este grupo relativamente nuevo de proteínas han sido aisladas y caracterizadas en Saccharomyces cerevisiae, tejidos de mamíferos o bien de cultivos de líneas celulares humanas mantenidas en condiciones estables de crecimiento. Son prácticamente nulos los reportes de las modificaciones que experimenta el proteasoma o de las diferentes proteínas que se 25 asocian a él en un modelo vegetal como Arabidopsis thaliana. Más interesante aún, resultará el estudio estructural y funcional de las diferentes versiones del proteasoma determinadas por las diversas proteínas que se asocien en las etapas del desarrollo, durante la limitación de nutrientes o bien en otras formas de tensión metabólica como la etapa estacionaria, el estrés calórico, el estrés osmótico y el estrés oxidativo entre otras. Todas estas condiciones inducen la alteración (estructural y/o química) de varias proteínas que se ve traducido en un incrementoagudo en el contenido total de proteínas ubiquitinadas y en la activación del proteasoma (Finley & Chau, 1991; Jentsch, 1992). Estrés oxidativo El estrés oxidativo es un fenómeno químicio y fisiológico que acompaña casi todos los tipos de estrés biótico y abiótico en plantas superiores (Demidchik, 2015). Se define como una perturbación en el estado redox normal de los tejidos causada por un agente biótico o abiótico; es decir cuando hay un desbalance entre las producción de especies reactivas y la defensa antioxidante. Este tipo de estrés produce especies reactivas de oxígeno, peróxidos y radicales libres que pueden destruir todos los componentes de la célula, incluyendo proteínas, lípidos y el mismo ADN (Chang et al., 2013; Yoshinaga et al., 2005; Halliwell & Whiteman, 2004). La acción del estrés oxidativo es detenida por una producción efectiva de defensas antioxidantes que incluye compuestos antioxidantes (p.e. glutatión, vitaminas A, C y E, y flavonoides) y enzimas (superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa, entre otras). Algunos antioxidantes naturales y compuestos fenólicos como el ácido gálico, el ácido elágico o el ácido tánico son responsables de la respuesta antioxidante y la remoción de los radicales libres (Chang et al., 2013; Aiken et al., 2011). El estrés oxidativo puede dañar las proteínas de diversas maneras. Una de ellas es causando la oxidación irreversible de los aminoácidos y la formación de derivados carbonilados e hidroxilados (Kurepa et al., 2008). También puede causar mal plegamiento de las proteínas, exponiendo sus aminoácidos hidrofóbicos (normalmente dirigidos hacia el interior en la estructura en las proteínas nativas). Esta exposición de los parches hidrofóbicos “marca” a las proteínas oxidadas para su degradación por el proteasoma 26 (Davies, 2001). Existen versiones encontradas acerca de la degradación de proteínas oxidadas por el proteasoma. Por un lado, se sabe que las proteínas oxidadas no necesitan una cola de poli-ubiquitina ni ATP para su degradación por el proteasoma. En este escenario el reconocimiento de las proteínas oxidadas se lleva a cabo por el proteasoma 20S libre (Kriegenburg et al., 2011; Shringarpure et al., 2003; Ferrington et al., 2001; Grune et al., 1997), ya que el dominio de unión hidrofóbico en las subunidades α exteriores del 20S reconoce e interacciona con los parches hidrofóbicos expuestos de las proteínas mal plegadas (Jung et al., 2014; Kurepa & Smalle, 2008; Davies, 2001). Cuando las células son sometidas a una condición que produzca un estado de estrés oxidativo, la actividad del proteasoma 26S se reduce y éste promueve la disociación de los complejos reguladores. En este caso, la subunidad 20S por sí sola es capaz de degradar las proteínas oxidadas por una vía independiente de ATP y de ubiquitinación (Davies, 2001; Kurepa et al., 2009). El estrés oxidativo severo inhibe la actividad del 20S. Esto hace al proteasoma 20S un elemento de estudio muy interesante e intrigante, ya que se puede estudiar bajo otras condiciones de estrés y evaluar su actividad y su conformación. El proteasoma 20S degrada proteínas y péptidos sin la necesidad de aporte energético, y se ha propuesto a esta partícula como la más importante en la degradación de proteínas oxidadas (Davies, 2001). Aparentemente solo proteínas desplegadas, proteínas pequeñas o péptidos que atraviesen sin restricción la “puerta” proteasomal serían degradados. Se asume que estas proteínas deberán ser removidas por el proteasoma para evitar daños permanentes en el sistema celular si las condiciones ambientales lo permiten, o bien adaptarse al nuevo ambiente. Si el proteasoma no remueve las proteínas alteradas, la viabilidad celular se compromete. Aumento de temperatura La respuesta celular al choque térmico es uno de los mecanismos de defensa intracelular mejor estudiado en respuesta a condiciones de estrés. La exposición de las células a diferentes tipos de estrés como aumento de temperatura, restricción calórica, metales 27 pesados, oxidativo, osmótico, entre otros, induce la respuesta celular a estrés que conduce a la expresión preferencial de proteínas de choque térmico (HSP del inglés Heat Shock Proteins) (Verbeke et al., 2001). Una respuesta ineficiente y alterada al aumento de temperatura está implicada en el crecimiento y desarrollo anormal, el envejecimiento y la apoptosis celular. El aumento de temperatura genera desnaturalización y mal plegamiento de proteínas, las cuales se pueden agregar e iniciar diferentes cascadas de señalización en respuesta al estrés. Una de estas cascadas de señalización en respuesta al aumento de temperatura es a través de los factores de transcripción de choque térmico (HSF del inglés Heat Shock transcription Factors) (Verbeke et al., 2001). Como parte de esa respuesta de choque térmico, las células expresan proteínas chaperonas, ubiquitina y algunas enzimas ubiquitinadoras que colaboran para prevenir la formación de agregados de proteínas mal plegadas. Algunas HSPs cumplen función de chaperonas y están involucradas en la renaturalización de proteínas mal plegadas. Estas chaperonas reconocen y se unen a proteínas en su conformación no nativa que están exponiendo sus parches hidrofóbicos. Al hacerlo, tratan de prevenir la agregación de estas proteínas mal plegadas durante el evento de estrés (Medicherla & Goldberg, 2008; Verbeke et al., 2001). La partícula reguladora de proteasoma, PA28, tiene actividad de chaperona y se cree que se une y captura a las proteínas mal plegadas para dirigirlas al replegamiento o a la degradación por el proteasoma (Connell et al., 2001; Luders et al., 2000). Mediante este mecanismo las chaperonas ayudan a disminuir la formación de agregados proteicos (Verbeke et al., 2001; Arrigo, 1998). Este impedimento para que se formen agregados proteicos es una ventaja para la célula y para el sistema SUP ya que éste no se bloquea y puede continuar su actividad de degradación. En levaduras ha sido bien estudiado el papel del SUP en la tolerancia al aumento de temperatura. Se ha visto que la resistencia a altas temperaturas requiere la síntesis de monómeros de ubiquitina así como de otros componentes del sistema de conjugación de ubiquitina para potenciar la actividad del proteasoma. El SUP funciona durante estrés por temperatura y degrada proteínas celulares dañadas. En plantas, el estrés por temperatura resulta en una disminución en la cantidad de monómeros de ubiquitina y en la 28 acumulación de conjugados de ubiquitina de alto peso molecular (Belknap & Garbarino, 1996). Generalidades y antecedentes en nuestro laboratorio A diferencia de otros modelos eucariotas, donde los proteasomas han sido estudiados al detalle y se conoce mucho sobre su estructura y modificaciones, en plantas los estudios sobre este complejo son escasos. Un reporte a la fecha (Book et al., 2010) da cuenta de la transcripción diferencial de los genes responsables de las subunidades de la partícula central 20S en órganos de A. thaliana tales como la raíz, las hojas de la roseta y caulinares, el tallo y la flor, lo que posiblemente se traduzca en proteasomas distintos y posiblemente especializados en la degradación de sustratos presentes solo en dichos órganos. No hay reportes de las poblaciones proteasomales asociadas a las diferentes etapas de la diferenciación celular. En nuestro laboratorio se han obtenido resultados preliminares con otro tipo celular de A. thaliana (T87), a partir de células en cultivo mantenidas en condiciones estables de crecimiento, donde se observaron al menos 10 diferentes poblaciones de proteasomas, con base a las diferencias de sus pesos moleculares. Esto se logró gracias a la aplicación y combinación de técnicas de ultracentrifugación diferencial, electroforesisen geles nativos azules (BN/PAGE), electroforesis bidimensional, western blot, espectrometría de masas y microscopía electrónica. El análisis de cada uno de los complejos por geles bidimensionales (tipo O’Farrell) reveló, como era de esperar, un “mapa de puntos”, en general muy semejante, entre las diferentes bandas originales con claras diferencias entre la abundancia relativa de algunos elementos. Estos últimos posiblemente sean las subunidades “clásicas” 20S. En algunos casos se observaron “puntos” sin contrapartes en el o los “mapas” correspondientes a otras bandas. Estos puntos, pueden corresponder a PAPs, proteínas que interaccionan de manera específica con algunos de los proteasomas. Resulta interesante observar en los geles BN, donde se resolvieron muestras provenientes de células tratadas con paraquat (un agente productor intracelular del radical superóxido) 29 o bien de células que se expusieron a alta temperatura, la aparición de bandas de alto peso molecular, no detectadas en los geles correspondientes a las células control (crecimiento estable). Como resultó para este último caso, el mapa de estas nuevas bandas, mostró un patrón general semejante al ya observado pero con claras variaciones en cuanto a la abundancia de ciertas subunidades, así como la presencia de PAPs adicionales. Mediante espectrometría de masas y western blot, se ha detectado la identidad de algunas de estas proteínas asociadas, entre ellas el factor de elongación traduccional eEF-1A y algunas formas de la tubulina, proteínas que ya han sido reportadas en asociación con los proteasomas de levaduras y de plántulas de A. thaliana (Saeki & Tanaka, 2012; Kaake et al., 2010; Leggett et al., 2002). El análisis por espectrometría de masas también reveló a las proteínas RGP1, RGP2 así como a la chaperonina HSP60 como proteínas de unión. Estas últimas no habían sido reportadas anteriormente como PAPs. Uno de los objetivos de este proyecto fue originalmente describir (estructural y funcionalmente) las diferentes PAPs y su papel en una condición especifica de crecimiento. Muchas de las PAPs, hasta ahora descritas, pertenecen a grupos de función ciertamente divergentes, la función conocida de algunas de ellas, en el marco de la degradación de las proteínas mediada por el sistema de la ubiquitina-proteasoma, está aún muy lejos de ser entendida. Una posibilidad es que el o los diferentes elementos que interaccionan con una PAP específica, además del proteasoma por supuesto, no han sido aún descritos. La diversidad en las conformaciones del proteasoma y de su composición es un campo de investigación que apenas comienza. El estudio de los proteasomas y sus PAPs, sin duda abrirá nuevas perspectivas sobre la dinámica del proteasoma. Hipótesis Las condiciones de cultivo de las células de A. thaliana condicionan la formación de las diferentes versiones del proteasoma con estructura y función definida para degradar o bien evitar la degradación de ciertos sustratos blanco. 30 Objetivo General Caracterizar bioquímica y estructuralmente las diferentes versiones del proteasoma de células en cultivo de A. thaliana así como las PAPs que se observen en respuesta al estrés oxidativo y al estrés por aumento de temperatura. Objetivos Particulares i) Separar e identificar mediante BN-PAGE y columnas de exclusión molecular las diferentes versiones del proteasoma presentes en células en cultivo de A. thaliana mantenidas en condiciones estables de crecimiento y bajo condiciones de estrés como la elevación de la temperatura del cultivo y la adición de paraquat (estrés oxidativo). ii) Analizar la dinámica ((cómo se ensamblan y estructuran las poblaciones proteasomales a lo largo de un tiempo) general de las diferentes poblaciones proteasomales en las distintas condiciones de estrés propuestas. iii) Analizar mediante SDS-PAGE las proteínas que forman parte de cada uno de los complejos. Metodología Cultivo de células Se trabajó con una línea celular de Arabidopsis thaliana que nos obsequió el Dr. Plinio Guzmán Villate, investigador del laboratorio de regulación post-transcripcional en el Cinvestav – Irapuato, quien a su vez la obtuvo de la Universidad de Cornell. A partir de un 31 inóculo de células en etapa exponencial, tomamos 5 ml de éste y adicionamos 45 ml de medio Murashige y Skoog (MS) suplementado con cinetina y ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2-4D) fresco. Los 50 ml del cultivo celular fueron mantenidos en matraces de 250 ml e incubados por una semana a 25oC con agitación a 100 rpm con periodo día/noche. Pasado este tiempo, las células se recuperaron por filtración sobre papel filtro Whatman y un embudo, eliminando el medio en un erlenmeyer. Hasta su análisis, las muestras fueron mantenidas a -70oC. Extracción y purificación de los proteasomas Para la extracción y purificación de proteasomas se utilizó el protocolo reportado por Shibatani et al., 2006, con algunas modificaciones. A 15 ml de células (de las muestras mantenidas a -70oC), en tubos Falcon de 50 ml, le fueron agregados 25 ml de buffer de purificación, compuesto de 25 mM tris(hidroximetil)aminometano hidrocloruro (Tris-HCl) pH 7.5, 1 mM 1,4-dithiothreitol (DTT), 2 mM adenosín trifostato (ATP), 0.25 M sacarosa, 1 mM cloruro de magnesio (MgCl2), 1% polivinilpolipirrolidona (PVPP) y 200 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), y el equivalente a 10 ml de perlas de vidrio. Las células fueron agitadas en vórtex durante cinco minutos, dejadas en reposo en hielo y nuevamente agitadas otros cinco minutos para terminar de romperlas. El homogenizado fue centrifugado 15 min a 16,000 x g y el sobrenadante recuperado fue ultracentrifugado durante 1:10 h a 4oC y a 70,000 x g (en rotor tipo 55.2 Ti de Beckman Coulter). El sobrenadante recuperado fue centrifugado durante 5 min a 10,000 x g para remover impurezas, organelos, desechos celulares, células no lisadas y restos de PVPP que se desprendieran del precipitado. Se recuperó el sobrenadante y se ultracentrifugó nuevamente, esta vez durante 3:30 h a 350,000 x g. Se descartó el sobrenadante y el pellet, que contiene los proteasomas enriquecidos, fue resuspendido en 1 ml de buffer POOLS (HEPES pH 7.8, 5 M NaCl, 2.5 M MgCl2, 40 mM DTT, glicerol 7.5% y 1.6 µM ATP) (modificado de Shibatani et al., 2006). Con la ayuda de un émbolo, el material no solubilizado se eliminó al centrifugar por 3 min a 16,000 x g el sobrenadante final fue almacenado en alícuotas de 200 µL a -80oC. Esta última es la fracción enriquecida en 32 proteasomas. En cada etapa del protocolo se tomó una muestra para comprobar el rendimiento de la extracción y purificación. Tratamiento con Paraquat Las células en cultivo de A. thaliana fueron tratadas con diferentes concentraciones de Paraquat (1,1´-dimethyl-4,4´-bipyridiniµM dichloride – Sigma Aldrich). A 50 ml de los cultivos celulares (5 ml de un inóculo de células en etapa exponencial y 45 ml de medio MS) mantenidos en matraces de 250 ml e incubados por una semana a 25oC con agitación a 100 rpm, se les agregó paraquat en solución para obtener concentraciones finales de 5 µM, 50 µM y 500 µM. Los tiempos de exposición a las distintas concentraciones de paraquat fueron de 30 minutos, 1 y 2 horas. En total se obtuvieron nueve muestras de cultivos celulares tratados con paraquat y dos muestras control (obtenidas al inicio y al final del tratamiento). Las células de cada cultivo se recuperaron por filtración sobre papel filtro Whatman y un embudo. Hasta su análisis las muestras fueron mantenidas a –70oC. El protocolo de extracción y enriquecimiento proteasomal fue el previamente mencionado. Tratamiento por aumento de temperatura Para este tratamiento, los 50 ml de los cultivos celulares (5ml de un inóculo de células en etapa exponencial y 45 ml de medio MS) mantenidos en matraces de 250 ml e incubados por una semana a 25oC con agitación a 100 rpm fueron sometidos a un aumento de temperatura con respecto a la usada comúnmente (25oC). Para este ensayo las células se incubaron a 37oC. Los tiempos de incubación fueron de 30 min, 1, 2 y 3 horas, tras los cuales las células fueron recuperadas por filtración sobre papel filtro Whatman y un embudo y se les aplicó el protocolo de extracción y purificación previamente mencionado. En total se obtuvieron cuatro muestras de células sometidas a estrés por temperatura y dos muestras control (inicial a las 0 h y final a las 3 h, ambos a 25oC). 33 Separación mediante BN-PAGE de las diferentes versiones del proteasoma La separación de los proteasomas por medio de electroforesis en geles nativos azules (BN-PAGE) se basa en el protocolo descrito por Wittig et al., (2006). Los BN-PAGE tienen la ventaja, frente a otros tipos de electroforesis en geles, que separan las proteínas en su estado nativo de acuerdo a su peso molecular y forma. Para que las proteínas migren en el gel, en la preparación de éste último se utiliza Coomassie G250, que se adhiere a las proteínas y les otorga carga negativa sin desnaturalizarlas; esto hace que puedan migrar. Brevemente, las muestras de proteasomas resuspendidas en buffer Pools se cargaron directamente en los pozos de los geles nativos. Los BN-PAGE se prepararon con un gradiente de acrilamida de 5-10%. El protocolo de corrida constó de tres pasos: 50 V durante 1 h, seguido de 150 V durante 16 h y finalmente 500 V durante 1 h. Se utilizan dos tipos de buffer; el superior se compone de 50 mM Tricina, 15 mM Bis-Tris pH 7 y 0.02% Coomassie G250, mientras que el inferior se compone de Bis-Tris pH 7. Este protocolo de geles nativos azules se aplicó para el análisis de todas las muestras. Western blot Al finalizar la corrida en BN-PAGE, los complejos se desnaturalizan en el mismo gel sumergiéndolo en una mezcla de agua caliente, dodecil sulfato de sodio (SDS) y β- mercaptoetanol (β-met). Los geles así tratados, se trasfirieron en cámara húmeda (Biorad) (una hora a 0.36 A de corriente) a u n a membrana de nitrocelulosa de 0.45 micras (Biorad). Una vez finalizada la transferencia, la membrana se incubó durante 5 min en tris-buffer salino con monolaurato de polioxietilen(20)sorbitano (TBS-tween). Se bloqueó la membrana durante 30 min en 20 ml de leche descremada (Svelty) 5% - TBS- tween. Después de un lavado de la membrana 5 min con TBS-tween, se incubó con un anticuerpo primario α-20S de ratón (anti ratón α 1+2+3+4+5+6. Cat ab22674 de Abcam a una dilución 1:5000) durante toda la noche a 4oC. Éste es un anticuerpo policlonal dirigido contra todas las subunidades α del cilindro central 20S. Después de tres lavados de 5 min cada uno con TBS-tween, la membrana se incubó 30 min con un anticuerpo secundario α- ratón (HRP-Goat anti-mouse IgG (H+L) Cat. 62-6520 de Zymed) a una dilución 1:5000. 34 Después de lavar la membrana tres veces durante 20 min cada lavado, con TBS-tween, se reveló en un cuarto oscuro mediante el empleo del sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Femto (Pierce) y la película radiográfica Kodak Medical X-ray film general purpose blue MXB. Electroelución de las proteínas de las muestras de los tratamientos con paraquat y aumento de temperatura Adicionalmente al western blot, los BN-PAGE se fraccionaron en ocho rebanadas horizontales de aproximadamente 0.7 cm cada una para recuperar, para su análisis posterior, las diferentes versiones del proteasoma con base a sus diferencias de peso molecular nativo. Cada rebanada se fraccionó en pedazos de 0.2 – 0.5 mm. El material resultante se colocó en las celdillas de electroelución de la cámara Little Blue Tank (ISCO) que contenían buffer de corrida de Laemmli (24mM Tris, 191mM Glicina y 3.4mM SDS) diluido 1:10. La cámara de electroelución, que consta de un rectángulo dividido a la mitad por un puente, cada lado contuvo 70 mL de buffer de corrida de Laemmli (sin diluir). La electroelución de los proteasomas de cada banda se realizó por 3 h a 3 W a 10oC. Una vez finalizada la corrida se invirtieron las cargas durante 1 min a 3 W para separar las proteínas electroeluidas que hayan quedado adheridas a las membranas de diálisis localizadas en la base de las celdillas de electroelución. Las proteínas electroeluidas fueron recuperadas (en un volumen aproximado de 200 μL) y se precipitaron con metanol y cloroformo. Las proteínas se resuspendieron en buffer de muestra de Laemmli y se analizaron de manera independiente mediante SDS.PAGE. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa para la detección del 20S por western blot, como ya se ha mencionado. Ensayos de carbonilación y ubiquitinación de las muestras tratadas con paraquat y las sometidas a aumento de temperatura 35 Los niveles de proteínas carboniladas y de conjugados de ubiquitina se reconocen ampliamente como marcadores de estrés (Wong et al., 2010; Irazusta et al., 2008; Nystrom, 2005). Para determinar dichos niveles en las células sometidas al paraquat o al aumento de temperatura, se tomó un volumen de 200 μL del extracto total de células recién lisadas (a partir de las purificaciones previamente mencionadas) de cada uno de los cultivos de los experimentos con paraquat, los sometidos a alta temperatura y los controles correspondientes. Se precipitaron las proteínas con metanol/cloroformo, se resuspendieron en buffer Laemmli y se cuantificaron por el método de Bradford. Para determinar los niveles de oxidación de las proteínas por su carbonilación, empleamos el kit OxyBlot (Cat. S7150). Merck-Millipore). Para ello, 5 μg de proteína en 10 μL se derivatizaron con 10 μL de la solución 2,4 dinitrofenilhidrazina que reacciona con los carbonilos y forma 2,4.dinitrofenilhidrazona. Se incubó 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La reacción se detuvo con 7.5 uL de la solución de neutralización y cada muestra se llevó a 50 μL con el buffer de los western blot (tris-glicina y SDS). Para determinar el nivel de carbonilos totales, cada muestra se colocó en un pozo de la cámara para slot blot (Hoefer PR 648 de Amersham Biosciences). Las muestras se filtraron al vacío sobre membranas de nitrocelulosa, cada muestra se analizó por triplicado. La membrana resultante se bloqueó con leche descremada como ya se ha indicado y se incubó con el anticuerpo primario de conejo, un anti dinitrofenilhidrazona (a una dilución 1:150). Como anticuerpo secundario empleamos un anticonejo (HRP-Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cat. 65- 6120 de Zymed) a una dilución 1:5000. Para el revelado se utilizó el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Femto (Pierce) y la película radiográfica Kodak Medical X-ray film general purpose blue MXB. El ensayo de ubiquitinación consistió prácticamente en el mismo procedimiento que el de carbonilación. La única diferencia es que las muestras no se derivatizaron y previo al western blot la membrana se fijó durante una hora con solución fijadora (25% isopropanol y 10% ácido acético). Para el western blot se utilizamos como anticuerpo primario un α- ubiquitina (Ub (F-11) Mouse monoclonal IgG. Cat. Sc271289 de Santa Cruz Biotechnology) a una dilución 1:10000 y como anticuerpo secundario empleamos un anticonejo (HRP- Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cat. 65-6120 de Zymed) a una dilución 1:5000. Para el revelado 36 se utilizó el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Femto (Pierce) y la película radiográfica Kodak Medical X-ray film general purpose blue MXB. Ensayo de viabilidad Para este ensayo se utilizaron cinco cultivos de células, dos controles (inicial y final) y tres a los que se les agregó paraquat (5 μM, 50μM y 500 μM durante dos horas). De cada cultivo se tomó 1 ml de células con medio, se centrifugó 5 min a 13,000 rpm, se descartó el sobrenadante y el pellet (las células) se resuspendió en 100 μL de medio de cultivo. Se tomaron 15 μL de células y se adicionaron 15 μL de azul de tripán sin diluir y se incubó por 2 min a temperatura ambiente. Para el conteo de células vivas se utilizó una cámara de Neubauer. Finalmente se hizo el conteo de células vivas (citoplasma transparente) y muertas (citoplasma teñido) para calcular el porcentaje de viabilidad. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Extracción de proteasomas Brevemente, células en cultivo de A. thaliana fueron recuperadas por filtración y lisadas con buffer de purificación para obtener un homogenizado total (ver Metodología). Este homogenizado fue sometido a una primera centrifugación durante 15 min a 16,000 x g, tras la cual se tomó una muestra del sobrenadante (Sn1) y del pellet (P1). Posteriormente el sobrenadante (Sn1) fue sometido a una primera ultracentrifugación durante 1:10 h a 4oC y a 70,000 x g, nuevamente se tomó una muestra del sobrenadante (Sn2) y el pellet (P2). A su vez el sobrenadante Sn2 se ultracentrifugó nuevamente, esta vez durante 3:30 h a 350,000 x g y se tomó muestra del sobrenadante (Sn3) y el pellet (P3) obtenidos. El pellet final (P3) fue resuspendido en buffer POOLS y con la ayuda de un émbolo, el material no solubilizado se eliminó al centrifugar por 3 min a 16,000 x g. Se recuperó el 37 sobrenadante final y se denominó Sn4. Este Sn4 fue la fracción final de proteasomas enriquecidos usados para todos los experimentos (Figura 8a). Las muestras Sn1, P1, Sn2, P2, Sn3, P3 y Sn4 fueron analizadas en un SDS-PAGE al 12,5% para ver la eficiencia del protocolo de enriquecimiento de los proteasomas. El gel fue transferido a una membrana de nitrocelulosa y se realizó un western blot con un anticuerpo primario anti-20S. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 8b, donde se observa el aumento de los proteasomas a medida que se avanza en el proceso de enriquecimiento. Se puede ver como en las muestras Sn1 a Sn3 la abundancia de proteasomas es baja y aumenta levemente en el P2. El P1 contiene muy poco proteasoma ya que éste es el pellet de la primera centrifugación, y lo que ahí se encuentra son organelos, desechos celulares y células no lisadas entre otros. La muestra Sn3 no contiene proteasomas, sugiriendo que éstos están todos en P3 y Sn4. Efectivamente esto se evidencia en las bandas correspondientes a P3 y Sn4, donde se observa un enriquecimiento significativo de la fracción de proteasomas reflejado en la intensidad y grosor de las bandas obtenidas en el western blot. Esta última fracción (Sn4), la cual fue resuspendida en buffer POOLS, es la más enriquecida y por lo tanto la que se analizó posteriormente por medio de los BN-PAGE y western blot, ya que es la fracción más enriquecida en subunidades alpha obtenida después de someter el P3 a centrifugación para eliminar sedimentos. 38 a. b. Figura 8. Extracción y enriquecimiento de proteasomas. a) Diagrama de flujo que representa el procedimiento de enriquecimiento de los proteasomas, indicando las diferentes fracciones que posteriormente fueron analizadas por western blot (modificado de Shibatani et al., 2006). b) Western blot en el que se observa el proceso de enriquecimiento de proteasomas a lo largo del protocolo de extracción y purificación. Se usó anticuerpo anti-20S. Las bandas que se observan en los carriles corresponden a la señal de 20S. Los carriles corresponden a: muestra del sobrenadante (Sn1) y el pellet (P1) después de la primera centrifugación; sobrenadante (Sn2) y pellet (P2) después de la primera ultracentrifugación, sobrenadante (Sn3) y pellet (P3) después de la segunda ultracentrifugación y pellet final (Sn4) resuspendido en “POOLS” después de centrifugarlo. Separación de las poblaciones proteasomales mediante BN-PAGE en células control 39 Se corrió un BN-PAGE, con gradiente del 5 – 10%, de la fracción Sn4 para que con base a sus diferencias de peso molecular se pudieran distinguir las diferentes versiones del proteasoma. Para esto, se tiñó una fracción vertical del gel con Azul de Coomassie para establecer la posición del 20S, que en este tipo de geles es la banda mayoritaria (Figura 9a); el resto del gel fue cortado horizontalmente en ocho tiras de igual ancho (siete mm) (Fig. 9a). En nuestro laboratorio sabemos que la banda mayoritaria en estos BN-PAGE es en efecto el 20S porque además de su peso molecular y la reactividad con el α-20S, tenemos datos de espectrometría de masas que así lo confirman. Estos datos los obtuvimos de cultivos de otra línea celular de A. thaliana, de los cuales tenemos evidencia adicional por imágenes de microscopía electrónica que se obtuvieron de esta banda mayoritaria (Lledías et al., sin publicar). Las proteínas contenidas en las ocho tiras del gel fueron electroeluidas, separadas en un gel SDS-PAGE y sometidas a western blot con un anticuerpo anti-20S. El resultado del western blot se puede ver en la Figura 9b, donde se evidencia la presencia de diferentes poblaciones proteasomales presentes en las diferentes fracciones del BN/PAGE. En los carriles 2 al 4 de la Fig. 9b se observa reactividad con el α-20S. Su posición en los BN-PAGE sugiere que son versiones del proteasoma con mayores pesos moleculares que el 20S solo. El carril 5 pertenece al proteasoma 20S y es la población mayoritaria presente en estas células analizadas en estas condiciones de cultivo. En los carriles 6 y 7 se observa señal con el α-20S. Dado que su localización en los geles corresponde a complejos de menor tamaño que el complejo 20S, una posibilidad es que correspondan a hemiproteasomas u otros intermediarios en la ruta de ensamblaje hacia el 20S maduro (Li et al., 2015; Lin et al., 2006; Burri et al., 2000); estos complejos también los hemos detectado en estudios previos, hechos en nuestro laboratorio, de espectrometría de masas, actividad del proteasoma y microscopía electrónica (Lledías et al., sin publicar). La presencia de proteasomas de mayor peso molecular que el 20S sugiere la interacción del 20S con una o más partículas reguladoras. 40 Figura 9. Separación de poblaciones proteasomales por BN-PAGE en células control. a) Gel nativo azul de la fracción enriquecida de proteasomas (Sn4) teñido con Azul de Coomassie. Se evidencia la presencia de varias bandas; la banda mayoritaria (rebanada 5) corresponde al proteasoma 20S. Esquema de corte de las 8 rebanadas horizontales. b) Western blot de las proteínas electroeluidas a partir de las ocho rebanadas; se usó un anticuerpo α-20S. Tratamiento con paraquat (estrés oxidativo) El paraquat es un herbicida generalista usado para controlar pastos y malezas en la agricultura (Moustaka & Moustakas, 2014). Este herbicida es absorbido por las hojas de las plantas, donde bloquea la fotosíntesis al producir radicales superóxido y otras especies reactivas de oxígeno (Moustaka & Moustakas, 2014; Yoshinaga et al., 2005). Al rebasar la capacidad antioxidante celular se genera un estado de estrés oxidativo. La unión del ión paraquat (PQ2+) con el oxígeno, ayudada por la intervención de la superóxido dismutasa, produce los radicales superóxido. Los radicales superóxido a su vez se unen con el fierro (Fe2+) en la llamada reacción “Fenton”, y producen hidroxilos (OH). El propósito de utilizar el paraquat en este proyecto es clara, ver el efecto del estrés oxidativo sobre las diferentes poblaciones de proteasomas de las células en cultivo de A. thaliana. Para ver si un estado inducido de estrés oxidativo es capaz de influir en la formación de las distintas versiones proteasomalesde células en cultivo de A. thaliana, éstas fueron incubadas con diferentes concentraciones del herbicida a tres diferentes tiempos. Se 41 evaluaron nueve tratamientos, un control inicial y un control final, para un total de 11 muestras (Tabla 1). Tratamientos con paraquat Concentración Tiempo 5 µM 30 min 1 h 2 h 50 µM 30 min 1 h 2 h 500 µM 30 min 1 h 2 h Tabla 1. Concentraciones y tiempos de los tratamientos con paraquat. Esta tabla muestra los diferentes tratamientos con paraquat usados en las células en cultivo de A.thaliana. La columna de la izquierda hace referencia a las tres concentraciones de paraquat usadas. La columna de la derecha indica los tiempos de exposición al agente oxidante para cada concentración. Con el fin de observar el patrón de bandeo y la detección de 20S por western blot (Figura 10), a cada una de las 11 muestras de células (nueve con paraquat y dos controles) se le hizo el protocolo de extracción y enriquecimiento de proteasomas. De cada purificación se tomó una alícuota de 100 µL y se le aplicó el protocolo de extracción de proteínas con metanol y cloroformo (ver Metodología). El pellet obtenido de la precipitación de proteínas fue resuspendido en 50 µL de buffer Laemmli y se cuantificó la proteína total de cada una de las muestras por el método de Lowry (Lowry et al., 1951). Los datos obtenidos de la cuantificación de proteína para las 11 muestras fueron usados para cargar la misma cantidad de proteína en los dos SDS-PAGE que se corrieron (con las 11 muestras); uno para ver el patrón de bandeo de las muestras y el otro para realizar western blot (Figura 10). 42 Figura 10. Tinción con Azul de Coomassie y western blot. Patrón de bandeo y SDS-PAGE de los tratamientos con paraquat y los controles sin paraquat teñido con Azul de Coomassie y el western blot que se hizo para detectar la presencia de 20S en todos los tratamientos (debajo del gel). En el gel teñido con azul de Coomassie (Fig. 10) se puede ver que el patrón de bandeo de las 11 muestras es prácticamente el mismo, lo cual sugiere que el método de enriquecimiento de los proteasomas además de eficiente, se centra en el mismo juego de proteínas a pesar de los diferentes tratamientos a los que fueron sometidas las células. El western blot (Fig. 10 debajo del gel) se realizó con un anticuerpo anti-20S, y las bandas de 20S obtenidas fueron cuantificadas por densitometría usando el software gratuito ImageJ, para en los siguientes experimentos cargar la misma cantidad de 20S. Esto se hizo para que en cada carril de los BN-PAGE entrara la misma cantidad de proteasomas totales y con base a ello se separaran, si fuera el caso, en las diferentes versiones. 43 Antes de evaluar cada una de las 11 muestras del tratamiento con paraquat en un BN- PAGE independiente para separar las diferentes versiones proteasomales por muestra, fue necesario establecer un control de carga para los geles y que a la vez nos sirviera como control de electroelución, electroforesis y transferencia. Todo esto para verificar que en cada carril de los geles que se corrieron entrara la misma cantidad de proteasomas totales, como se mencionó previamente, evitando sesgos en el resultado final. Se determinó la eficiencia de la electroelución, empleando una proteína abundante de bajo peso molecular presente en E. coli como control de carga. Al correr un homogenizado de E. coli en un SDS-Page, la proteína mostró una notable abundancia y además debido a su bajo peso molecular no interfiere con los pesos de las subunidades de 20S (Figura 11a, señalada en carriles 1 - 6). Con el fin de purificar esta proteína y poderla emplear como control interno de carga, se corrió un gel preparativo de este homogenizado, se cortó una rebanada de la región donde se ubicó esta proteína marcadora, se electroeluyeron las proteínas de la rebanada cortada y se corrieron en un SDS-PAGE para comprobar que la proteína elegida electroeluyó bien (Fig. 11b). Figura 11. Electroelución de la proteína usada como control de carga. a) Homogenizado de proteínas de E. coli. El gel de la izquierda (carriles 1 – 3) corresponde a una muestra de E. coli concentrada. El gel de la derecha (carriles 4 – 6) corresponde a una muestra de E. coli más diluida. La banda enmarcada en rojo en los carriles 1-6 44 fue cortada del gel y electroeluida para usar como control de carga de los siguientes experimentos. b) Proteína de E. coli electroeluida (recuadro rojo). Una vez obtenida la proteína para el control de carga, y antes de procesar cada una de las 11 muestras de paraquat por separado, se corrió un gel BN con todas las muestras y se tiñó con nitrato de plata para ver el patrón de bandeo y la homogeneidad de las muestras (Figura 12). En este gel se puede ver que el patrón de bandeo de las 11 muestras es muy similar; aparecen esencialmente las mismas bandas mayoritarias en la mitad del gel y en la parte inferior de éste. Lo anterior nos garantiza que se trabajó con muestras de proteínas muy similares y que ninguna de las muestras estaba degradada. Figura 12. Tinción con nitrato de plata de las muestras del tratamiento con paraquat. Se observa la tinción con plata de un gel nativo azul. Los carriles de los extremos corresponden al control inicial (C.I.) y al control final (C.F.). Los otros carriles corresponden a las muestras tratadas con las diferentes concentraciones de paraquat (5μM, 50μM y 500μM) a diferentes tiempos (30 min, 1 h y 2 h). La banda mayoritaria que se observa corresponde al 20S (indicada por la flecha roja). Las 88 rebanadas de los geles BN preparativos de las 11 muestras provenientes del tratamiento de las células en cultivo con paraquat (8 rebanadas por muestra) fueron electroeluidas. Se procedió a correr cada muestra de proteasomas tratada con paraquat, y los controles, en geles SDS-PAGE. Al gel de cada muestra se le hizo su respectivo western blot con anticuerpo anti-20S. 45 La utilización de la proteína bacteriana de bajo peso molecular es un parámetro que nos sirvió para ver que las diferencias que observamos entre las diferentes versiones del proteasoma son directamente atribuibles a cambios de las poblaciones y no a artificios de las técnicas de electroelución, electroforesis y transferencia. Con el fin de comprobar la eficiencia de la electroelución de las muestras, todas las membranas se tiñeron con Rojo de Ponceau y se observó la homogeneidad del control de carga en la parte inferior de éstas. En la Figura 9 se observa una membrana, de una de las muestras teñidas con rojo Ponceau, como ejemplo de la eficiencia en el control de carga de electroelución, electroforesis y transferencia. Se puede observar que en cada fracción aparecen diferentes proteínas. Este resultado no es un artificio de la técnica dado que el control de electroelución, la proteína de E. coli, muestra un nivel constante en la parte inferior de la membrana (flecha roja en la Fig. 13 que corresponde a 15 kDa). Por el contrario, las diferencias que se observan únicamente pueden atribuirse a la presencia de diferentes proteínas y complejos distribuidos a lo largo del gel con base a sus diferencias de peso molecular. 46 Figura 13. Tinción con Rojo Ponceau de una muestra tratada a 37oC. Membrana de nitrocelulosa teñida con rojo de Ponceau, donde se ven las 8 rebanadas previamente electroeluidas (carriles 1 – 8). Esta membrana corresponde a la muestra de células tratadas a 37oC durante 30 min. En el carril 5 se observan bandas entre los 20 y 30 KDa que corresponden a las diferentes subunidades del proteasoma 20S que, como se verá más adelante, corresponden a la señal del 20S en los western blot. El control de electroelución, carga y transferencia está señalado por una flecha roja y pesa alrededor
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