Clonacion-expresion-y-caracterizacion-de-la-interaccion-de-materiales-celulosicos-de-la-expansina-modular-EXLX1-CBM-de-Sorangium-cellulosum-y-cuatro-variantes-truncas

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
Clonación, expresión y caracterización de la 
interacción de materiales celulósicos de la 
expansina modular Exlx1-CBM de 
Sorangium cellulosum y cuatro variantes 
truncas. 
 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 BIÓLOGO 
 P R E S E N T A : 
 
JUAN JOSÉ SALAZAR CORTÉS 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
DOCTORA, CLAUDIA MARTÍNEZ ANAYA 
 
Ciudad Universitaria, CD. MX., 2019 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
1. Datos del alumno 
Salazar 
Cortés 
Juan José 
59 74 04 93 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad de Ciencias 
Biología 
311203626 
 
2. Datos del tutor 
Dra. 
Claudia 
Martínez 
Anaya 
 
3. Datos del sinodal 1 
Dra. 
Mabel 
Rodríguez 
Gonzáles 
 
4. Datos del sinodal 2 
Dra. 
Alejandra Alicia 
Covarrubias 
Robles 
 
5. Datos del sinodal 3 
Dr. 
José Luís 
Puente 
García 
 
6. Datos del sinodal 4 
Dr. 
Saúl 
Gómez 
Manzo 
 
7. Datos del trabajo escrito 
Clonación, expresión y caracterización de la interacción de materiales celulósicos de la 
expansina modular Exlx1-CBM de Sorangium cellulosum y cuatro variantes truncas. 
74p 
2019 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos académicos. 
A la Universidad Nacional Autónoma de México, especialmente, a la Facultad de Ciencias y 
al Instituto de Biotecnología. 
Al proyecto PAPIIT (IN-211116) y al CONACYT Ciencia-Básica (252551) por el apoyo financiero 
para el proyecto del que este trabajo forma parte. 
A mi tutora, la Dra. Claudia Martínez Anaya, por su confianza y consejo en esta mi primera etapa de 
formación en la ciencia. 
Al laboratorio de Ingeniería de Proteínas del IBt., en especial, al Dr. Lorenzo Segovia. Igualmente, a 
la M. en C. Blanca Ramos, a la Dra. Mabel Rodríguez, al Dr. Omar Tovar, al M. en C. Luis Acosta, 
a la M. en C. Delia Narváez, a la M. en C. Karen Acosta, y a todos los integrantes del laboratorio, por 
su apoyo determinante en la realización de este trabajo. Así mismo, agradezco al personal 
laboratorista y de limpieza. 
A los miembros del jurado, la Dra. Mabel Rodríguez, la Dra. Alejandra Covarrubias, el Dr. José Luis 
Puente y el Dr. Saúl Gómez, por sus correcciones del trabajo. 
A los encargados de las unidades de apoyo técnico y a la unidad de cómputo del IBt. 
A la Red de Estructura, Función y Evolución de Proteínas (REFER). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos personales 
A mis padres, por el amor que siempre han manifestado. Porque llevan años luchando hasta 
el sacrificio de ellos mismos por mis hermanos y yo, por nuestro bienestar físico y mental; 
para que podamos pensar y soñar con libertad. Y porque al principio y al final de todo, son a 
ellos a quienes debo mi existencia. Gracias. 
A mis hermanos, mis dos mejores amigos. Quienes son siempre el mejor sostén en los 
momentos difíciles, quienes son la mejor compañía en los momentos de duda y los mejores 
cómplices. Agradezco la paz y la alegría que transmiten. 
A mis tías, Alejandra y Luz, mi tío Beto y mis dos pequeñas primas, Paz y Luz. Ustedes son 
quienes completan el núcleo familiar y juntos nos volvemos más fuertes. 
A mi abuelo, Benito, una persona excepcional, quien me educó en la responsabilidad, en el 
trabajo duro y la perseverancia. A quien en su memoria deposito mis logros. 
A Fernanda, la casualidad más bonita que me ha pasado. Agradezco, pues su presencia en mi 
vida no ha traído más que paz, enseñanzas invaluables y mucha felicidad. 
A mi tutora, Claudia, a quien de forma personal le agradezco el impulsarme a mejorar, el 
procurar mi crecimiento académico. También, la libertad que me ha permitido para 
desarrollar ideas. Por ser una gran guía en este proceso y, sobre todo, por convertirse en una 
amiga. 
A mis amigos “tallerines” a quienes Cuernavaca nos obligó a convivir, conocernos y afianzar 
lazos. Particularmente a Alfredo, Abraham, Paola, Raquel y Raúl (P-Chang), por la compañía 
íntima, las experiencias, la diversión y las enseñanzas; que han hecho de esta etapa una gran 
aventura. 
A todos los miembros del laboratorio 12, por crear un ambiente muy agradable que ayuda a contender 
contra las frustraciones propias del oficio y que hace más llevadera la sensación de calor en el 
laboratorio. 
A los amigos con los que compartí los estudios en la facultad. Especialmente, a Daniela, Diana, 
América, Yenny, Frida y Abraham. Gracias amigos. 
Finalmente, agradezco a las amistades que han trascendido etapas importantes de mi vida. 
Espacialmente, a mis amigos de la prepa (los del pasillo) y los de la secundaria (el cuadro base). 
Porque con su ayuda puedo recordar y afianzarme en el pasado, para nunca olvidar de dónde vengo 
y cómo fue que me convertí en quien soy. 
 
 
 
Contenido 
1. Resumen .................................................................................................................... 7 
2. Introducción .............................................................................................................. 8 
La pared celular de plantas, una estructura compleja..................................................... 8 
Estructura de la pared celular de plantas. ..................................................................... 8 
Hemicelulosa, pectina y moléculas asociadas. ............................................................. 8 
Degradación de la pared celular de plantas. ................................................................ 10 
Sorangium cellulosum .................................................................................................. 11 
Expansinas ................................................................................................................... 12 
Clasificación de las expansinas. ................................................................................ 13 
¿Cómo actúan las expansinas? .................................................................................. 13 
Expansinas bacterianas. ............................................................................................ 14 
La expansina Exlx1-CBM de Sorangium cellulosum es una proteína modular .............. 15 
Módulos de unión a carbohidratos ............................................................................. 15 
Linker ....................................................................................................................... 15 
Modificaciones en la estructura de las proteínas .......................................................... 16 
Proteínas glicosiladas ................................................................................................ 17 
3. Antecedentes ........................................................................................................... 18 
Entendiendo a las expansinas bacterianas. ................................................................... 18 
Producción y análisis previos de la proteína de Exlx1-CBM de Sorangium cellulosum. 19 
4. Justificación.............................................................................................................20 
5. Hipótesis .................................................................................................................. 21 
6. Objetivos ................................................................................................................. 21 
7. Materiales y Métodos. ............................................................................................. 22 
Amplificación del gen SocExlx1-CBM. ......................................................................... 22 
Subclonación y preparación del vector pPICZαA ......................................................... 24 
Construcción del vector de expresión para la proteína nativa SocExlx1-CBM. ............. 24 
Diseño de vectores con las versiones truncas de la expansina....................................... 25 
Transformación de células de P. pastoris X-33. ............................................................ 27 
Amplificación de genes insertados al genoma de P. pastoris X-33. ............................... 27 
Producción de proteínas y purificación por cromatografía de afinidad a iones de níquel.
 ..................................................................................................................................... 27 
Experimentos tipo Western. .......................................................................................... 28 
Ensayo de desglicosilación ........................................................................................... 28 
Ensayo de desfosforilación. .......................................................................................... 29 
Ensayos de unión a diferentes materiales celulósicos. .................................................. 29 
Ensayos de potenciación de la liberación de azúcares. ................................................. 29 
Ensayo de solubilización de polisacáridos de la pared celular...................................... 30 
Análisis in silico de Exlx1-CBM ................................................................................... 31 
8. Resultados ............................................................................................................... 31 
Diseño del vector de expresión para la proteína Exlx1-CBM de Sorangium celullosum y 
cuatro variantes truncas. .............................................................................................. 31 
Producción de la proteína Exlx1-CBM y cuatro variantes truncas. ............................... 35 
Modelo estructural de la proteína Exlx1-CBM y cuatro variantes truncas. ................... 38 
Análisis de la glicosilación de las proteínas ................................................................. 41 
Comparación de la secuencia de residuos del CBM de la expansina Exlx1 de Sornagium 
cellulosum con otros CBMs .......................................................................................... 45 
Ensayos de unión a diferentes materiales celulósicos (pull down)................................. 46 
Ensayos de potenciación de la liberación de azúcares. ................................................. 48 
Ensayo de solubilización de polisacáridos de la pared celular...................................... 51 
Perfiles de solubilización de azúcares con sustituyentes fenólicos. ............................ 52 
Ácidos ferúlicos solubilizados dosis-dependiente a 24 y 48 horas.............................. 53 
Ácidos ferúlicos solubilizados por sustrato a 24 y 48 horas. ...................................... 55 
9. Discusión de los resultados ..................................................................................... 57 
Sobre el análisis in sílico de residuos de la proteína. .................................................. 57 
Sobre los módulos en la expansina Exlx1-CBM. ....................................................... 59 
Sobre la producción de las proteínas ......................................................................... 61 
Sobre las glicosilaciones en la estructura. .................................................................. 62 
Sobre la unión ........................................................................................................... 64 
Sobre la solubilización. ............................................................................................. 66 
10. Conclusiones ........................................................................................................ 70 
11. Perspectivas ......................................................................................................... 71 
12. Referencias .......................................................................................................... 72 
7 
 
1. Resumen 
La pared celular de plantas constituye la interfase entre dos células vegetales y es un organelo 
que funciona como un sistema de comunicación entre células vegetales y que les da forma y 
rigidez. La pared celular vegetal está compuesta de una compleja red de microfibras de 
celulosa embebidas en una matriz hidratada de pectina, hemicelulosa y de proteínas. En la 
fisiología de las plantas, así como en los procesos naturales en los ecosistemas, es necesaria 
la constante remodelación de la pared celular. En este sentido, existen diversas moléculas 
que participan en estos procesos, desde el aflojamiento de las fibras, hasta la ruptura y 
liberación de los monosacáridos que forman a los polisacáridos de la pared celular. Las 
expansinas son una familia de proteínas (sin actividad enzimática) presentes en diversos 
phyla de bacterias, hongos y plantas, cuya actividad está involucrada en mecanismos de 
remodelación de la pared celular. Aunque se ha logrado dilucidar el papel que llevan a cabo 
en las plantas, su función biológica en aquellas bacterias que contienen genes homólogos, 
aún es materia de discusión, particularmente debido a que se han encontrado genes de 
expansinas en genomas de bacterias muy diferentes entre sí. El objetivo del presente trabajo 
fue analizar, a través de algunas técnicas desarrolladas en el laboratorio, la capacidad de la 
expansina multidominio SocExlx1-CBM de Sorangium cellulosum de interactuar con fibras 
de celulosa sintéticas y con tejido vegetal. La proteína nativa y de cuatro variantes truncas: 
CBM, CBM-PSL, PSL-Exlx1 y Exlx1se aislaron y expresaron en Pichia pastoris, con el fin 
de evaluar su capacidad de unión a fibras de celulosa. También se determinó la ausencia de 
función-actividad sinérgica con celulasa y, finalmente, se determinó la capacidad de 
solubilizar polisacáridos con sustituyentes ferúlicos, función que comienza a evaluarse en 
expansinas bacterianas. 
 
 
 
 
 
8 
 
2. Introducción 
La pared celular de plantas, una estructura compleja. 
La pared celular de plantas constituye la interfase entre dos células vegetales y es un organelo 
que funciona como un sistema de comunicación entre células vegetales y que les da forma y 
rigidez. La pared celular vegetal está compuesta de una compleja red de microfibras de 
celulosa embebidas en una matriz hidratada de pectina, hemicelulosa y de proteínas y 
proteoglicanos presentes en pequeñas proporciones 1,2. 
Se ha reportado ampliamente que la abundancia, composición y arquitectura de las fibras de 
la pared celular, particularmente, las fibras de polisacáridos de hemicelulosa y pectina, varían 
entre grupos taxonómicos de plantas; así como entre tejidos, incluso de una célula a otra 3,4. 
Tales variaciones están en función del ambiente en el que se encuentra el organismo, la etapa 
de desarrollo y el tipo de tejido (especialización-especificación) 1. 
Estructura de la pared celular de plantas. 
La celulosa, principal componente de la pared celular de plantas y la biomolécula orgánica 
más abundante de la biomasa terrestre, se organiza en paquetes de 18 a 36 cadenas 
estructuradas en forma de “tornillos de dos pliegues” 5,6, con niveles de cristalinidadvariable 
por zonas; así como, grados de polimerización que alcanzan hasta 10,000 monómeros en las 
paredes secundarias 7. En conjunto, forman una compleja red de microfibras, erigida por 
abundantes interaccione débiles con la hemicelulosa. 
Se ha reportado ampliamente la importancia de los polisacáridos de hemicelulosa como 
elementos que modulan la arquitectura de la pared celular. Estos polisacáridos 
(principalmente los xiloglucanos) crean sitios de estabilización (o “amalgamas”) al 
interactuar a través de enlaces débiles e inespecíficos con las fibras de celulosa 2,7,8. 
Hemicelulosa, pectina y moléculas asociadas. 
Además de las fibras de celulosa, en la pared celular abunda la hemicelulosa. Esta se divide 
en cuatro tipos: xiloglucanos (XG), xilanos, mananos y glucomananos 4. 
En gimnospermas, dicotiledóneas y monocotiledóneas no gramináceas, los polisacáridos de 
hemicelulosa más abundantes son los xiloglucanos (XG) (hasta 25%). A su vez, los 
9 
 
polisacáridos de xilano, menos abundantes, se encuentran fundamentalmente en forma de 
gluconoxilano (GX) y metilgluconoxilano (MGX) 4. 
Por otro lado, en monocotiledóneas gramináceas, los polisacáridos de xilano son los 
segundos en abundancia (hasta 50% en algunos tejidos de cereales y granos). Se encuentran 
principalmente en forma de arbinoxilano (AX), arabinogluconoxilano (AGX), 
gluconoarabinoxilano (GAX) y xilanos de alta complejidad (HX) 4,9. En contraste, los 
polisacáridos XG se encuentran en proporciones cercanas al 5% 4. 
El tercer polisacárido de la pared celular es la pectina, formada de polisacáridos muy 
heterogéneos que se encuentra principalmente en forma de homogalacturonano (HG), 
conocidos como pectina lisa; o bien, ramanogalacturonano I (RGI) y ramanogalacturonano 
II (RGII) conocidos como pectinas peludas en función a las ramificaciones que presentan; 
algunos de ellos tienen sustituyentes de ácidos ferúlicos 10. Las pectinas son las responsables 
de las propiedades porosas de las paredes celulares, así como las propiedades de adhesión 6. 
Su abundancia en paredes celulares de gimnospermas, dicotiledóneas y monocotiledóneas no 
gramináceas es mayor, en comparación a las paredes de gramináceas 7. 
Finalmente, existen otras moléculas asociadas a la pared celular de plantas, de importancia 
estructural y biológica. Ejemplo de ello son compuestos fenólicos como la lignina y ácidos 
hiroxicinámicos. La lignina es un polímero polifenólico presente en proporciones de 8 a 20% 
en la pared secundaria, capaz de crear una capa de soporte y resistencia, elemental en los 
tejidos expuestos al medio exterior 6. Por otro lado, los ácidos hiroxicinámicos, sustituyentes 
de algunos azúcares, son capaces de asociarse covalentemente (mayormente ácidos 
ferúlicos), permitiendo uniones entre polisacáridos de la misma composición o diferente 
composición 11,12. 
En conjunto, los componentes de la pared celular representan el más alto porcentaje de 
biomasa de plantas (Tabla 1) y, por lo tanto, el mayor aporte de materia orgánica en los suelos 
de ecosistemas terrestres 
10 
 
 
Tabla 1. Porcentaje de componentes de la célula vegetal. Adaptado de Paul y colaboradores, 
2015. 
Degradación de la pared celular de plantas. 
La tasa de degradación es una de los parámetro más importantes en el estudio de suelos, ya 
que es un proceso clave en la productividad de estos ecosistemas 6. Los procesos de 
degradación empiezan con la deposición de restos de plantas y otros organismos muertos, a 
los que se les conoce como producción primaria neta, en la zona superficial del suelo. Se ha 
estimado que el 50% de estos productos primarios corresponden a polímeros, como la 
celulosa, la hemicelulosa y la pectina que contienen además de los monosacáridos que los 
componen otros nutrientes esenciales que están en cantidades limitadas para el hábitat del 
suelo 6. 
Posteriormente, sobre la producción primaria actúan consorcios de organismos degradadores, 
fundamentalmente hongos y bacterias saprófitas. Se han descubierto diversas bacterias 
aeróbicas habitantes del suelo, capaces de degradar componentes de la pared celular y 
despolimerizar la celulosa, algunas de ellas pertenecen al phylum de las proteobacterias, 
Pseudomonas, Erwinia y la mixobacteria Sorangium 6,13. Como resultado de la acción de los 
microorganismos, se liberan moléculas esenciales para el mantenimiento del hábitat; el resto 
de los componentes, los de desecho o los restos de organismos no procesados, se combinan 
con minerales formando nueva materia con alto grado de C e H y bajo porcentaje de O 
(humus) 6. 
Componentes % del Total 
Ceras y pigmentos 1 
Aminoácidos, azúcares, nucleótidos etc. 5 
Almidón 2-20 
Proteínas 5-7 
Hemicelulosa 15-20 
Celulosa 4-50 
Lignina 8-20 
Componentes secunadarios 2-30 
 
11 
 
Algunas bacterias degradadoras habitantes de suelos, como Bacilllus, Cellulomonas, 
Pseudomonas, Sorangium, entre otros, son capaces de atacar parte de la lignina con el fin de 
tener acceso a los polímeros energéticos de la celulosa y hemicelulosa, pues son estos, fuente 
de carbono y energía 6,14,15 
Sorangium cellulosum 
Sorangium cellulosum es una bacteria mesófila, aeróbica de vida libre y saprófita; prominente 
habitante de la microbiota del suelo, tanto en desiertos como en suelos de cultivo, capaz de 
degradar polisacáridos como la celulosa, el xilano, la quitina y el almidón 13. 
Es una bacteria Gram negativa, perteneciente a las δ-proteobacterias y miembro del orden de 
las mixobacterias. Al igual que un gran número de mixobacterias, posee un complejo ciclo 
de vida que involucra la formación de cuerpos fructíferos o de resistencia, tanto en medio 
sólidos como en medios líquidos 13. Por lo tanto, una historia de vida que involucra la 
interacción con otro individuos de la población y una importante capacidad de producción de 
metabolitos secundarios (muchos de ellos son compuestos bioactivos) 1,14,15. A su vez, posee 
sistemas de regulación génica influenciados por señales provenientes de células vecinas 
(Quorum sensing) 15. 
 En 2007, Schneiker y colaboradores (2007) publicaron la secuencia completa del genoma 
de S. cellulosum So ce56: contabilizando un total de 13 Mpb, resultando en el genoma 
bacteriano más grande registrado hasta ahora 14,15. Se piensa que su genoma codifica para 
algo más de 10,000 genes, una cantidad mayor a los genes en algunos genomas eucariontes 
como el de Sacharomyces cerevisiae 13. A su vez, se han encontrado grupos de genes 
biosintéticos para proteínas y metabolitos de alta complejidad; así como, enzimas y genes 
que se creían exclusivos de plantas -suponiendo una transferencia horizontal a partir de estas 
13,16. 
Tanto en S. cellulosum como en una gran cantidad de bacterias que interactúan durante su 
ciclo de vida con componentes de la pared celular de plantas, se han encontrado diversidad 
de moléculas que participan en algún episodio del proceso de degradación de la pared celular 
de plantas -que incluye desde la identificación de las fibras de la pared celular, el 
aflojamiento, ruptura y liberación de los monómeros estructurales que las componen. 
12 
 
Algunas de estas pertenecen a la familia de proteínas no catalíticas conocidas como 
expansinas. 
Expansinas 
 Las expansinas se identificaron inicialmente en plantas, en el contexto del crecimiento de la 
pared celular en condiciones extracelulares de bajo pH (crecimiento ácido) 17,18. En estas 
condiciones, las expansinas provocan la relajación de la pared celular a través del 
aflojamiento de las fibras de polisacáridos, dando como resultado el deslizamiento y la 
extensión irreversible del tejido vegetal 19. Así mismo, posibilitan la incorporación de las 
cadenas de polisacáridos recién formadas, hacia la pared celular 17. Por lo tanto, están 
involucradas en procesos organogénicos, filotaxia, crecimiento de la raíz, maduración de 
frutos, penetracióndel tubo polínico, entre otros 19–21. 
Las expansinas poseen un módulo canónico compuesto de entre 210 a 275 aminoácidos, 
conformando dos dominios. El dominio 1 (D1) es homólogo al dominio catalítico de las 
glicosil hidrolasas de la familia 45 (GH45); por otro lado, el dominio 2 (D2) corresponde a 
un alérgeno: grass group-2 pollen allergen (G2As) 18. Estructuralmente, todas las expansinas 
son altamente similares en cuanto a la arquitectura del módulo expansina canónico; sin 
embargo, la composición de residuos de aminoácidos es muy diferente entre familias de 
expansinas 22, reportándose porcentajes de identidad que van del 20 al 40% 18. Así mismo, 
existen algunos residuos que se han conservado a lo largo de la evolución; por ejemplo, el 
Asp 82 y Tyr 73 en el dominio D1 de la expansina de B. subtilis los cuales se han sugerido 
son los responsables de la actividad pseudo-catalítica de las expansinas (llamado así porque 
no se ha demostrado que las expansinas modifiquen enlaces covalentes como las enzimas) 
22, medida a través de pruebas de debilitamiento en tensómetros aplicados a tejidos vegetales 
o de fibras de celulosa (el papel filtro Whatman no. 3 se usa normalmente como referencia). 
En el dominio D2 se han encontrado algunas diferencias en la composición de residuos, 
principalmente, en la cara de unión a carbohidratos 19. Sin embargo, los residuos aromáticos 
Tyr, Phe y Trp, siempre están presentes 17, por lo que se piensa que son estos residuos son 
los responsables de la unión a polisacáridos, a través de interacciones débiles 22; mientras que 
el resto dan capacidad de unión diferencial a gran variedad de polisacáridos 9. 
13 
 
Clasificación de las expansinas. 
Con los abundantes descubrimientos de genes de expansinas en diversos genomas de plantas, 
se propuso clasificarlas en una super-familia compuesta de cuatro familias: 1) α-expansinas 
(EXPA); 2) β-expansinas (EXPB); 3) expansinas tipo A (EXLA); y 4) expansinas tipo B 
(EXLB). Los dos últimos grupos corresponden a expansinas conocidas únicamente por su 
secuencia en genomas de plantas. 
Las α-expansinas se acumulan o se producen en gran cantidad de tejidos vegetales y 
constituyen la familia más abundante. Se unen principalmente a paredes enriquecidas con 
xiloglucanos, que son paredes típicas de dicotiledóneas 9,23, en un pH óptimo de 4.5 (que es 
el pH extracelular durante el crecimiento de la pared celular de plantas como respuesta a 
señales hormonales). Son capaces de aflojar y relajar las fibras de polisacáridos con gran 
eficiencia y se han visto relacionadas fundamentalmente con el crecimiento de la pared 
celular de plantas 19. 
Las β-expansinas se caracterizaron inicialmente como proteínas alergénicas de pastos del 
grupo 1; por ejemplo, en el polen de maíz (Zea mays). Son únicas de polen de la familia 
Poaceae, Ciperaceae, Juncaceae y de algunas otras monocotiledóneas 9,19. Así mismo, se 
unen a paredes enriquecidas con arabinoxilano (característico de monocotiledóneas) 23. Son 
capaces de aflojar y solubilizar polisacáridos pobremente unidos en la red de azúcares que 
representa la pared celular de plantas, específicamente, el proceso de solubilización sucede 
en la lamela media; facilitando así la penetración del tubo polínico, en un pH óptimo de 5 a 
6 19,20. Así mismo, se han encontrado genes que codifican expansinas en diversos genomas 
de organismos clasificados en diversos phyla de bacterias y hongos. La nomenclatura 
utilizada para las expansinas de microorganismos es EXLX 20. 
¿Cómo actúan las expansinas? 
No se conoce con precisión el detalle del mecanismo molecular por el que las expansinas 
provocan el aflojamiento de las fibras, siendo ésta la consecuencia de la actividad más 
estudiada para las expansinas de plantas, aunque parece claro que su blanco son las 
interacciones débiles entre los polímeros, y en específico los puentes de hidrógeno. Sin 
embargo, se ha determinado que las expansinas bacterianas tienen niveles de actividad mucho 
menores, y en ensayos in vitro con expansinas bacterianas se requieren muy altas cantidades 
14 
 
de proteína (del orden de los cientos de microgramos/mL) para provocar el aflojamiento, lo 
que ha llevado a proponer que su actividad es debida a un mecanismo no específico o 
indirecto, al funcionar como surfactantes, debido a su estructura anfipática (compuesta por 
los dos dominios canónicos); así mismo, se ha propuesto que en ensayos en los que se han 
incubado simultáneamente expansinas con celulasas para aumentar la hidrólisis de las fibras 
(sustrato), más que un efecto directo de las expansinas sobre el sustrato pudieran actuar como 
estabilizadoras de la desnaturalización de la celulasa, o disminuyendo los enlaces no 
productivos de estas celulasas a zonas de las fibras en donde no pueden hidrolizar 22,24. 
A pesar de los avances en el estudio y comprensión de la función de expansinas de plantas, 
lo correspondiente a las expansinas de bacterias u hongos es aún materia de discusión. Debido 
fundamentalmente a que las expansinas de organismos no vegetales han presentado 
comportamientos opuestos a sus homólogas en plantas, la pregunta sobre el papel biológico 
de estas proteínas en microorganismos sigue vigente. 
 
Expansinas bacterianas. 
Las expansinas de bacterias promotoras del crecimiento como Bacillus subtilis, o de 
patógenas de plantas como Pectobacterium carotovorum, Ralstonia solanacearum y 
Clavibacter michiganensis (patógenos) 22,24 han sido ampliamente estudiadas. Debido a su 
interacción con la pared celular de plantas detectados en ensayos in vitro, se ha sugerido que 
las expansinas bacterianas facilitan la colonización del tejido de plantas por un mecanismo 
parecido a las expansinas de plantas 17. Sin embargo, la evaluación de las expansinas Exlx1 
de B. subtillis y P. carotovorum, entre otras, indica que la capacidad de estas expansinas de 
relajar y aflojar la pared celular es 10 veces menor a la que presentan las α-expansinas 2,25. 
Algunos autores proponen que la capacidad de unión de las expansinas a fibras de 
polisacáridos; así como, el papel que llevan a cabo en la pared celular de plantas depende de 
las propiedades electroestáticas de las proteínas, fundamentalmente de su punto isoeléctrico 
(pI) debido a la cantidad de carga eléctrica positiva o negativa en la superficie de la proteína 
que impacta en la dinámica de interacción con los polisacáridos de la pared, quienes también 
poseen un valor de carga en las superficies de unión 22,26; al mismo tiempo, las condiciones 
de pH se vuelven determinantes. Con base en esto, se ha propuesto un sistema 
15 
 
adicional de clasificación de las expansinas bacterianas, expansinas ácidas (las que tienen 
pI<6) y expansinas básicas (con pI>8) 26. Una de las dos expansina encontrada en S. 
celullosum posee un punto isoeléctrico cercano a 5.8 26, además, cuenta con algunas 
características adicionales que la hacen sumamente interesante. 
La expansina Exlx1-CBM de Sorangium cellulosum es una proteína 
modular 
La expansina de S. cellulosum Exlx1-CBM es una proteína multidominio. Además del 
dominio canónico de las expansina (Exlx1), contiene un módulo de unión a carbohidratos 
(CBM) en el extremo N-terminal; ambos módulos se encuentran unidos por una secuencia 
conocida como linker de aproximadamente de 100 residuos, de los cuales 24 son serinas 
consecutivas 27. 
Módulos de unión a carbohidratos 
Los módulos de unión a carbohidratos (CBM) se han encontrado mayormente como módulos 
adyacentes de glicosil hidrolasas (GH), conformando cerca de 81 familias en función a su 
estructura y función, especificidad por el sustrato (en composición y arquitectura), y la fuerza 
de unión al sustrato 3.Los CBMs aumentan la concentración de dominios catalíticos sobre las 
fibras de polisacáridos 1,28; a su vez, permiten una correcta orientación hacia el sustrato. 
Además, algunos módulos soncapaces de llevar a cabo funciones disruptivas sobre la 
estructura cristalina de fibras de celulosa 3. Generalmente, los CBMs poseen residuos 
aromáticos que permiten la unión a polisacáridos 29,30; sin embargo, la topografía de los 
residuos en la estructura tridimensional parece ser determinante en el reconocimiento del 
sustrato 3. 
Como se mencionó anteriormente, en la estructura de la proteína SocExlx1-CBM, el CBM 
está en el extremo amino y se encuentra unido al módulo canónico de las expansinas, a través 
del linker, estructura peptídica que se presenta comúnmente como puente de unión entre 
dominios adyacentes. 
Linker 
Las estructuras tipo linker han sido ampliamente estudiadas, principalmente en celulasas de 
la familia Cel6A y Cel7A. Los linkers son regiones que difieren ampliamente en su 
conformación de residuos, así como en la estructura secundaria que pueden adquirir 28; sin 
16 
 
embargo, residuos de prolina e hidroxiaminoácidos (Ser/Thr) están siempre presentes 31. Se 
han encontrado primordialmente dos grupos de linkers, los enriquecidos en prolinas, muy 
abundantes en proteínas de bacterias, y los enriquecidos en Ser/Thr -conocidos como linker 
de poliserinas (PSL)27- mayormente distribuidos en eucariontes 31. Estudios de dinámica 
molecular de GHs, mayormente de la familia 7A; han mostrado que los linkers tienen 
comportamientos flexibles y estructuras desordenadas; son de longitudes que van de 14 a 158 
residuos, en el caso de las proteínas bacterianas analizadas. Los linkers pueden fungir como 
correas de torsión, resortes, estructuras de rigidez e incluso, se han encontrado involucradas 
con la protección a la proteólisis 28,31,32. 
 A su vez, se ha encontrado que las regiones peptídicas tipo linker cambian la longitud y 
rigidez, parámetros determinantes en la unión del CBM y la actividad del sitio catalítico, en 
el contexto de la interacción de las enzimas con su sustrato 28,32,33. 
En suma, la baja conservación de residuos en la secuencia de los linker registrados, así como, 
el alto número de residuos de serina, treonina, prolina y glicina han llevado a clasificarlos 
como un sub-grupo de las regiones o proteínas intrínsecamente desordenadas (RDPs o IDPs) 
31,33. 
Modificaciones en la estructura de las proteínas 
Adicionalmente, a las características estructurales de las proteínas, existen modificaciones 
que alteran o regulan algunos parámetros de su funcionalidad 34. Dichas modificaciones se 
adquieren después de su traducción, las más comunes son las fosforilaciones, glicosilaciones, 
ubiquitinaciones, entre otras. La presencia o ausencia de ciertas modificaciones depende 
fundamentalmente de la maquinaria celular del sistema. 
En bacterias se han descubierto y caracterizado, detalladamente, mecanismos de adición de 
cadenas de azúcares a diversas proteínas que suceden primordialmente en el espacio 
periplásmico 34. Debido a la gran cantidad de información genómica, se han encontrado 
grupos de bacterias de diferentes phyla que parecen poseer los complejos enzimáticos 
necesarios para la biogénesis y transferencia de glicosilaciones a proteínas que participan en 
la formación del flagelo bacteriano, la formación de la capa S, la digestión de diversos 
sustratos, o como proteínas de adhesión, entre otras funciones 34,35; lo que demuestra la 
distribución e importancia de la glicosilación como modificación proteica. 
17 
 
Se ha reportado que algunos sistemas de expresión utilizados comúnmente en la generación 
de proteínas recombinantes agregan glicosilaciones. Ejemplo de ello es la expresión de 
proteínas recombinantes en P. pastoris, en donde las proteínas obtenidas presentan 
glicosilaciones adicionales a las que tendrían en su organismo de origen 36. 
Proteínas glicosiladas 
Las glicosilaciones de proteínas se clasifican en las de tipo “O” y tipo “N”. Glicosilaciones 
tipo “O” suceden en grupos β-hidroxilo, de residuos de serina y treonina, mientras que las 
glicosilaciones tipo “N” suceden en grupos β-amino de residuos de asparagina 32. Así mismo, 
se han encontrado patrones en la configuración de residuos que acompañan residuos 
glicosilados. Las N-glicosilaciones en eucariontes y arqueas suceden bajo un patrón de 
residuos N-X-S/T; en bacterias suceden en patrones que pueden incluir algunos residuos 
extra: D/G/E-X-N-X-S/T. Por otro lado, no se ha logrado esclarecer un patrón de residuos 
que permita predecir O-glicosilaciones 34. Chauhan y colaboradores (2012) encontraron que 
en Bacteroides, las glicosilaciones suceden en regiones de proteínas con secuencias con esta 
composición D(S/T)(A/I/L/V/M/T). Adicionalmente, se ha encontrado que en procariontes, 
la adición de cadenas de azúcares sucede después de la formación de la estructura plegada de 
la proteína; por lo tanto, los glicositios deben estar accesibles en la estructura tridimensional 
de la proteína 35, comúnmente ubicándose en regiones flexibles e intra-dominios (hélices 
súper-enrolladas, láminas y hélices) 37. Actualmente, existen algoritmos de identificación de 
glicositios en proteínas de bacterias o eucariontes, disponibles de forma gratuita en servidores 
en línea; algunos de ellos son capaces de predecir glicositios, considerando la disponibilidad 
de residuos en la estructura tridimensional 37. 
Las glicosilaciones impactan en diferentes parámetros de las proteínas, dependiendo el sitio 
donde se encuentran. En algunas proteínas la presencia de glicosilaciones previene la 
formación de agregados proteicos, modula de forma alostérica la actividad enzimática (esto 
se ha visto en celulasas de la familia C7A), modifican los parámetros electrostáticos de la 
proteína, modifican la capacidad de unión al sustrato, además, previenen la formación de 
estructuras secundarias 28. 
En las regiones tipo linker, las glicosilaciones favorecen una conformación más extendida, 
logrando el mantenimiento de distancias óptimas entre los dominios 38, en algunos casos, esto 
18 
 
impacta en la actividad de las enzimas evaluadas, tales como en las glucanasas 29. En las 
regiones linker se han encontrado mayormente O-glicosilaciones 28, mientras que, en los 
CBMs se han reportado únicamente N-glicosilaciones. 
En este trabajo realizamos la caracterización de la expansina modular Exlx1-CBM de S. 
cellulosum. Utilizamos diversas técnicas de evaluación desarrolladas en el laboratorio, 
además, exploramos un nuevo método de caracterización de la actividad para esta expansina 
bacteriana. Así mismo, realizamos el aislamiento y expresión del gen para la proteína 
completa y para cuatro variantes truncas, sirviéndonos de levaduras P. pastoris X-33, como 
sistema de expresión. 
3. Antecedentes 
Entendiendo a las expansinas bacterianas. 
En el estudio de expansinas existe un ensayo recomendado para la determinación de la 
actividad de estas proteínas. Se determina de la extensibilidad de los tejidos vegetales en 
presencia de la proteína, utilizando un aparato llamado extensómetro; desafortunadamente, 
éste no está disponible comercialmente. 
Por ello, se han desarrollado diversas técnicas para la evaluación in vitro de la 
función/actividad de las expansinas; a continuación, se indican las estrategias seguidas en 
nuestro laboratorio para estudiarlas. En nuestro laboratorio se determinó (Narváez-Barragán 
D., manuscrito en preparación) que la ausencia del gen de expansina en Pectobacterium 
atrosepticum disminuye el impacto de la infección a Solanum tuberosum, evaluado a través 
de la cuantificación de la cantidad de tejido macerado después de un evento controlado de 
infección. Por lo tanto, la proteína desempeña una función durante la interacción de la 
bacteria patógena con el tejido. Por otro lado, la especie de bacterias fijadoras de nitrógeno 
Rhizobium tropici que carece de genes codificadoras de expansinas (sumamente estudiada 
por su interacción simbiótica con diversas plantas), transformadacon el gen de la expansina 
de P. carotovorum, tiene mayor capacidad de sintetizar celulosa para la formación de 
biopelículas (Luis Acosta Hernández, tesis de maestría), aunque el efecto fue muy pequeño 
y no parece haber influido sobre la capacidad de las bacterias para la formación de nódulos 
en plantas de frijol. 
19 
 
Otra manera de analizar la actividad de las expansinas es mediante ensayos in vitro en los 
que se mide la fuerza necesaria para romper una tira de papel filtro con un aparato llamado 
tensómetro (UTM Instron 5500), habiéndolo incubado en presencia de expansinas. Con este 
método se han determinado actividades significativamente menores a las reportadas para 
expansinas de plantas 20, pero el efecto existe también para las expansinas bacterianas 39. 
Usando este método, Olarte-Lozano describió la capacidad de la expansina Exlx1-CBM de 
S. cellulosum de debilitar tiras de papel filtro, al disminuir la tensión en el punto de ruptura 
doble (0.08 MPa) de los valores de actividad de las expansinas de P. carotovorum y B. subtilis 
(0.16 MPa cada una)39. Recientemente, Tovar Herrera y colaboradores (2018) descubrieron 
la capacidad de la expansina Exlx1 de P. carotovorum (pI<5) para solubilizar polisacáridos 
de la pared celular vegetal a partir de tejido vascular de Acelga (Beta vulgaris var. cicla) -
que corresponde al tejido que es blanco de infección de esta bacteria. Los polisacáridos 
liberados presentan un pico de absorción entre 310 nm y 320 nm, indicando la presencia de 
compuestos fenólicos asociados al material solubilizado. Esta actividad no parece producirse 
por todas las expansinas bacterianas, ya que EXLX1 de B. subtilis (pI>9) no presento 
evidencias de función de solubilización, bajo las condiciones evaluadas. En ambos casos las 
reacciones fueron incubadas a 48 horas. Esta función se había reportado únicamente para la 
familia β-expansina de plantas, sobre paredes celulares del estigma de maíz, aunque en este 
caso el pico de absorción se observó a 320 nm 12. Tales descubrimientos, abren un nuevo 
campo para el estudio de las expansinas procariontes. 
Considerando los datos anteriormente presentados, se intentó evaluar la capacidad de la 
expansina SocExlx1-CBM, expresada heterólogamente, para solubilizar polisacáridos de la 
pared celular. 
Producción y análisis previos de la proteína de Exlx1-CBM de Sorangium 
cellulosum. 
Considerando los dos genes encontrados en el genoma de S. cellulosum, se optó por estudiar 
la expansina Exlx1-CBM que presenta no solo el dominio canónico de las expansinas, sino 
también un módulo de unión a carbohidratos con una composición de residuos poco común 
en proteínas bacterianas. Asu vez, se realizaron análisis in silico de la secuencia de residuos 
de la expansina Exlx1-CBM de S. celullosum, anotada en la base de datos NCBI 
20 
 
(WP_012237891.1 hypothetical protein [Sorangium cellulosum]). Sin considerar el péptido 
señal nativo, se determinaron los límites en la secuencia de residuos que corresponden al 
módulo de unión a carbohidratos, al linker de poliserina (PSL) (residuo 115-226) y al 
dominio expansina (Exlx1). 
Previamente se expresó la proteína Exlx1-CBM en E. coli (Cerón-Pérez F. 2016, tesis de 
licenciatura), resultando en una proteína inestable de la proteína y de fácil degradación. Se 
propuso que la desnaturalización fue debida a un plegamiento inestable, por la falta de 
formación de los puentes disulfuro predichos en la estructura de la proteína o bien a la falta 
de modificaciones postraduccionales que se pudieran requerir y que E. coli es incapaz de 
realizar 39. 
 
Uno de los sistemas de expresión de proteínas recombinantes altamente utilizados, es el 
hongo ascomiceto, miembro de la familia Saccharomycetaceae, Pichia pastoris. Existen 
diversos protocolos que aprovechan la alta expresión de genes bajo el promotor AOX 
(promotor del gen de la enzima alcohol oxidasa), fundamental en el metabolismo de metanol 
(ya que esta levadura es un organismo metanotrófico); así mismo, la cepa X-33 se ha utilizado 
altamente por su crecimiento acelerado y alta producción de proteínas heterólogas, utilizando 
metanol como inductor indirecto de expresión 40. Así mismo, debido a que es un eucarionte, 
las proteínas producidas en P. pastoris son capaces de formar puentes disulfuro y son 
modificadas postraduccionalmente. 
4. Justificación. 
Uno de los motores que impulsa la investigación en este campo es la búsqueda y el 
esclarecimiento de los mecanismos naturales que permiten el aflojamiento y ruptura de las 
fibras de la pared celular, con el objetivo de poder implementarlos en favor del mejoramiento 
y economización de los procesos de obtención de biocombustible a partir de material 
lignocelulósico, generando procesos que signifiquen un menor impacto ambiental. El estudio 
de la función de las expansinas podrá indicar si su actividad es relevante en la utilización de 
los materiales celulósicos para la obtención de biocombustibles. 
En este sentido, la expansina codificada por la bacteria S. cellulosum es un modelo de gran 
interés, principalmente, por el contexto ecológico en el que existe la bacteria y su interacción 
21 
 
vital con la pared celular de plantas. Así mismo, la condición modular de la proteína Exlx1-
CBM permite estudiar las propiedades debidas a la presencia de un dominio CBM que podría 
ser relevante al considerar los paradigmas del estudio de las expansinas -se argumenta que la 
unión a polisacáridos de la pared celular es fundamental en el papel que estas proteínas 
pueden estar llevando a cabo. Así como aquéllas debidas al largo puente de unión tipo linker 
de poliserinas (PSL), el cual se ha visto implicado en la interacción de algunas enzimas con 
su sustrato, debido a que se modifica en función de las condiciones del medio y estas 
modificaciones pueden resultar benéficas para la actividad de estas. 
Gracias a las técnicas de ingeniería de proteínas es posible abordar preguntas sobre el aporte 
de las diferentes regiones adicionales al módulo canónico de las expansinas en su función e 
interacción con la planta. Se espera contribuir al conocimiento del papel de las regiones 
proteicas tipo linker en la estructura y función de estas proteínas. 
Considerando el bajo rendimiento en la expresión de expansinas de plantas en sistemas 
heterólogos reportado anteriormente 22, se ha propuesto que el estudio de las expansinas 
bacterianas pudiera dar una mejor idea de los mecanismos moleculares por los que llevan a 
cabo su función. En este sentido, P. pastoris se perfila como un excelente sistema para la 
expresión de la proteína Exlx1-CBM de S. cellulosum, pues promete ser el ambiente indicado 
para el correcto plegamiento de la proteína y un alto rendimiento en la producción. 
5. Hipótesis 
1. La expansina SocExlx1-CBM, y diferentes variantes truncas, se podrán expresar y 
producir en células de la levadura P. pastoris, en donde tendrán un correcto 
plegamiento. 
2. La actividad sobre polisacáridos de la expansina SocExlx1-CBM será mayor con 
respecto a las variantes carentes de CBM y PSL. 
6. Objetivos 
General: Expresar y purificar la expansina modular SocExlx1-CBM, y cuatro variantes 
truncas, para evaluar su interacción con materiales celulósicos y determinar la contribución 
del dominio CBM a la actividad de esta expansina. 
Objetivos particulares: 
22 
 
1) Clonar en el vector pPICZαA el gen de la proteína SocExlx1-CBM, y diferentes versiones 
truncas que contengan el CBM, CBM y PSL, el PSL y el módulo canónico Exlx1; así como, 
el módulo Exlx1. 
2) Transformar la cepa de P. pastoris X-33 y, expresar y purificar las diferentes proteínas por 
cromatografía de afinidad a níquel (Ni2+). 
3) Evaluar la unión a materiales celulósicos de las variantes que se logren expresar 
adecuadamente. 
4) Evaluar la capacidad de las proteínas de aumentar la liberación de azúcares en 
combinacióncon una enzima hidrolítica (sinergismo). 
5) Evaluar la capacidad de solubilizar polisacáridos de la pared celular. 
7. Materiales y Métodos. 
Amplificación del gen SocExlx1-CBM. 
Se realizó la amplificación por PCR (Tabla 2a) del gen SocExlx1-CBM desde el vector 
pET22, que había construido Olarte-Lozano (2016) en el laboratorio de Ingeniería de 
proteínas del Instituto de Biotecnología de la UNAM, usando los oligonucleótidos FwExlxl1-
CBM y RvExlx1-CBM (Tabla 3), construidos en la Unidad de Síntesis y Secuenciación de 
DNA del Instituto de Biotecnología de la UNAM; conteniendo sitios de restricción para EcoR 
I y Not I. Posteriormente, se realizó la subclonación del gen en el vector pCR2.1-TOPO 
(Invitrogen), siguiendo el protocolo del fabricante (25-0181 Versión J), específico para 
transformación por electroporación. Se utilizó una alícuota de 50 μL de células de E. coli 
DH5α electrocompetentes más 1 μL del producto de ligación pCR2.1TOPO-SocExlx1-CBM. 
Las células se electroporaron con un voltaje de 1.8 kV y se recuperaron en medio SOC 
durante 2 horas. Al finalizar, se sembró en medio LB agar conteniendo 100 μg/ml de 
ampicilina y 40 μg/mL de Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido). 
 
Tabla 2. Parámetros de reacciones de PCR realizados 
23 
 
 Desnaturalización Alineamiento Extensión Número 
de ciclos 
 T (°C) Tiempo T (°C) Tiempo T (°C) Tiempo 
a+ 95 30 seg 58-60 30 seg 72 1 min 25 
b 95 30 seg 60 30 seg 72 2 min 
30 
 
c 95 30 seg 52-62 30 seg 72 1 min 
d 95 30 seg 58-62 30 seg 72 2.5 min 
e 95 45 seg 52-56* 1 min 72 1.5 min 30 
*Las amplificaciones de los genes codificantes para las versiones conteniendo la secuencia 
del linker de poliserinas PSL, amplificaron a 56°, mientras que la versión Exlx1, amplificó a 
52°. 
+Las letras son para referir estas filas en el texto. 
 
 
 
Tabla 3. Oligonucleótidos utilizados. Se presentan los sitios de restricción de las enzimas 
Not1 y EcoR1 en letras negras. 
 
*Oligonucleótidos específicos para el vector. Kit (K1740-01; versión G) 
Nombre Secuencia 
5’AOX* 5´-gactggttccaattgacaagc-3 
3’AOX* 5´-gcaaatggcattctgacatcc-3´ 
FwExlx1-CBM EcoRI 
5’-agacagaattcgctggtgaagaagaagcg-3’ 
RvExlx1-CBM NotI 
5’-aattagcggccgcctggcaaaccggaaattg-3’ 
RvCBM Not1 
5’-aattagcggccgcggtcaccgagaccagcgt-3’ 
RvCBM-PSL Not1 
5’-aattagcggccgcaccgccaccggtcgcaac-3’ 
FwPSL-Exlx1 EcoR1 
5’-aattagaattcaaaacgggcggtggcagc-3’ 
FwExlx1 EcoR1 
5’-gattagaattccgctattttgcggccctg-3’ 
24 
 
 
Se seleccionaron ocho clonas blancas y se realizó la extracción y purificación de plásmido, 
utilizando el kit de purificación ZR Plasmid miniprep TMClasic (Zymo Research). Los 
plásmidos obtenidos se digirieron con EcoRI y NotI (Thermo Fisher Scientific), durante 1 
hora 30 minutos a 37°C. Se liberaron dos fragmentos, uno de 3,931 pb y otro de 1,250 pb, 
correspondiente al gen de interés. El último se purificó del gel de agarosa, utilizando el kit: 
High pure PCR product purification kit (Roche). 
Subclonación y preparación del vector pPICZαA 
Se eligió el uso del vector pPICZαA vector debido a que permite la fusión del gen en el C-
terminal con una región codificadora para un péptido señal de exportación, y una etiqueta 
6xHis para purificación por afinidad; además, el promotor que controla la expresión del 
producto de interés es el de la alcohol oxidasa 1 pAOX1 (Figura 1). Se transformaron células 
de E. coli JM110 por electroporación con 1.8 kV, y se recuperaron en medio SOC. Se 
sembraron en medio LB agar bajo en sales con 50 μg/mL de zeocina (Invitrogen), se realizó 
la extracción y purificación de plásmido, utilizando el Kit de purificación ZR Plasmid 
miniprep TMClasic (Zymo Research). Finalmente, se realizó la digestión con NotI y EcoRI, 
obteniendo un fragmento de 3,543 pb, que se desfosforiló utilizando la enzima CIP (alkaline 
phosphattase calf intestinal, Sigma-Aldrich). 
Construcción del vector de expresión para la proteína nativa SocExlx1-
CBM. 
Posteriormente, se realizó la ligación del vector pPICZαA, digerido y desfosforilado, con el 
gen (inserto) SocExlx1-CBM digerido con las mismas enzimas, en una relación molar 1:5, 
utilizando la enzima T4 DNA ligasa (Thermo Fisher Scientific). Se transformaron células de 
E.coli XL1Blue por electroporación con 1.8 kV y se recuperaron en medio SOC. Se 
sembraron en medio LB agar bajo en sales con 100 μg/mL de zeocina. A las clonas crecidas 
se les extrajo el plásmido y se realizó PCR (Tabla 2b) para corroborar la presencia del inserto, 
utilizando los oligonucleótidos sintetizados ad hoc que se describen en la Tabla 3. 
Finalmente, el plásmido obtenido pPICZαA-SocExlx1-CBM se mandó a secuenciar a la 
Unidad de Síntesis y Secuenciación de DNA del IBt, utilizando los oligonucleótidos 
25 
 
específicos para el plásmido (que hibridan afuera del gen): 5’AOX y 3’AOX (K1740-01; 
versión G, Invitrogen) (Tabla 3). 
 
Figura 1. pPICZ, vector de expresión y producción utilizado en este trabajo. En el esquema 
se muestran las características principales del vector utilizado; así mismo, se enuncia el 
significado de las anotaciones en la parte inferir izquierda 41. 
Diseño de vectores con las versiones truncas de la expansina. 
Se mandaron a sintetizar cuatro oligonucleótidos que hibridan al interior del gen nativo 
(Tabla 3). En la Figura 2 se muestran los sitios de hibridación y los fragmentos amplificados 
26 
 
que se obtienen. Los oligonucleótidos RvCBM y RvCBM-PSL contienen sitios de restricción 
para NotI; mientras que, FwPSL-Exlx1 y FwExlx1 contienen sitios de restricción para EcoRI. 
Para la obtención de los fragmentos se realizaron PCRs (Tabla 2c) con las siguientes 
combinaciones de oligonucleótidos. 
1. CBM: 5’AOX y RvCBM. 
2. CBM-PSL: 5’AOX y RvCBM-PSL. 
3. PSL-Exlx1: FwPSL-Exlx1 y 3’AOX. 
4. Exlx1: Fw Exlx1 y 3’AOX 
 
Figura 2. Fragmentos amplificados desde el vector pPICZαA-Exlx1-CBM. Representación 
gráfica de una sección del vector pPICZαA que contiene el gen para la proteína Exlx1-CBM. 
Se muestran los fragmentos que contienen las cuatro versiones truncas de la expansina, los 
sitios de hibridación de los oligonucleótidos, sitios de restricción y las secuencias que 
flanquean al gen insertado. 
 
Para clonar cada uno de los cuatro fragmentos en el vector pPICZαA se siguieron los mismos 
pasos que en el caso del gen que codifica la proteína completa, presentados anteriormente. 
De tal manera que se obtuvieron cuatro plásmidos con las diferentes construcciones truncas 
a evaluar: pPICZαA-CBM, pPICZαA-CBM-PSL, pPICZαA-PSL-Exlx1 y pPICZαA-Exlx1. 
Todas las construcciones obtenidas se analizaron por PCR (Tabla 2b), utilizando las mismas 
combinaciones de oligonucleótidos; además, los plásmidos se mandaron a secuenciar, 
27 
 
utilizando los oligonucleótidos 5’AOX y 3’AOX para verificar que las fusiones con el péptido 
señal y con la etiqueta 6xHis hubieran ocurrido correctamente. 
Transformación de células de P. pastoris X-33. 
Se extrajeron y purificaron los vectores obtenidos, y se linerizaron con la enzima SacI 
(Thermo Fisher Scientific). Con los plásmidos linearizados se transformaron células de P. 
pastoris X-33, previamente tratadas para hacerlas competentes a transformación por 
electroporación, según el manual de usuario EasySelect™ Pichia Expression Kit (K1740-01; 
versión G). Se utilizaron 80 μL de células competentes para la electroporación, y de 8 a 10 
μg de cada plásmido, se electroporaron con un voltaje de 2.5 kV y se recuperaron en 1 mL 
de sorbitol 1 M durante 3 horas a 30 °C. Al finalizar el tiempo de incubación se sembraron 
en medio YPD agar con 100 μg/mL de zeocina. 
Las clonas crecidas Mut+ se resembraron en YPD agar con concentraciones de Zeocina de 
100, 500, 1000 y 2000 μg/mL, con el objetivo de seleccionar las más resistentes como 
indicador de mayornúmero de copias de plásmido integrado al genoma (EasySelect™ Pichia 
Expression Kit (K1740-01; versión G)). 
Amplificación de genes insertados al genoma de P. pastoris X-33. 
Se realizaron amplificaciones directamente de las clonas. Se utilizó el protocolo reportado en 
Cöoke y colaboradores (2011); se amplificaron los genes que codifican las variantes truncas 
(Tabla 3e). En todos los casos se utilizaron los oligonucleótidos 5’AOX y 3’AOX. 
Producción de proteínas y purificación por cromatografía de afinidad a 
iones de níquel. 
La inducción de expresión de los diferentes genes y la producción de proteína se realizó 
siguiendo el protocolo presentado en el manual de usuario (EasySelect™ Pichia Expression 
Kit). Primero se inocularon medios BMGY, para tener la mayor cantidad de biomasa; 
posteriormente, se inocularon medios BMMY, para inducir la expresión, usando un valor 
constante de 0.5% de metanol durante 120 horas a 30 °C/200 rpm. Al finalizar de esta 
incubación, se centrifugaron los medios y se filtró la fracción sobrenadante través de 
membranas de 0.45 µm de PVDF (Polyvinylidene fluoride, Sigma-Aldrich). 
28 
 
Para la purificación de las diferentes proteínas se realizaron cromatografías de afinidad a 
níquel. Se utilizaron columnas HistrapTM FF crude (11-0012-38-AF, GE Healthcare Bio-
Sciences) de 5 mL. La cromatografía se realizó siguiendo el protocolo presentado en el 
manual de usuario (11-0012-38 AF), utilizando amortiguador fosfato de potasio 20 mM/NaCl 
500 mM/imidazol 10 mM pH 7.5 en un flujo constante de 2 a 3 mL/min. Las muestras se 
eluyeron a concentraciones de entre 300 a 500 mM de imidazol. 
Las fracciones obtenidas de cada proteína se concentraron utilizando tubos Vivaspin 6 de 10 
kDa de MWCO (28-9331-02 AB, GE Healthcare Bio-Sciences) hasta obtener de 2 a 3 ml de 
muestra final. Posteriormente, se lavaron con cuatro ciclos de centrifugación 6 min/6,000 
rpm con buffer 20 mM HEPES pH 7.4. Las muestras purificadas, concentradas y lavadas se 
cuantificaron utilizando el reactivo de Bradford (BioRad) extrapolando de una curva patrón 
de albúmina. Finalmente, las proteínas se analizaron en geles SDS-PAGE del 10%-15% 
teñidos con tricloroetanol. 
Se realizó una aproximación de la masa molecular experimental, a través del cálculo de Rf 
(R2= 0.97), obtenido por el análisis de los geles SDS-PAGE. 
Experimentos tipo Western. 
Las proteínas se transfirieron de los geles a membranas de PVDF Immobilon-P (IPVH00010-
Millipore), con un tiempo de transferencia de 1 h 30 min en una cámara semi-húmeda. Las 
membranas se boquearon con 50 mg/mL de leche (Svelty-Nestle) en buffer TBS-Tween 1X. 
Se utilizaron anticuerpos contra la etiqueta 6xHis en una dilución 1:3,000 (GTX115045-
GenTex) (anticuerpo primario) incubado durante 1 h 30 min. Posteriormente, se incubó con 
HRP-Goat Anti-Rabbit (656120-Invitrogen) (anticuerpo secundario) 1:5,000 durante 1 h 30 
min. Finalmente, se reveló usando sustrato Novex HRP Chromogenic (WP20004-
Invitrogen). 
Ensayo de desglicosilación 
Se utilizaron 50 μg de proteína (expansina), 45 μL de 50 mM fosfato de sodio pH 7.5 y 5 μL 
de solución desnaturalizante (0.2% SDS/100 nM β-mercaptoetanol). La reacción se hirvió 
por 11 minutos a 99 °C, posteriormente, se enfrió por 2 minutos y se le adicionó Tritón X-
100 al 15% más 2,500 U de PNGasa (Thermo Fisher Scientific). La muestra se incubó por 3 
29 
 
horas a 37 °C; al finalizar, la enzima se inactivó hirviendo la muestra 6 minutos a 99 °C. La 
muestra resultante se analizó en un gel SDS-PAGE 15%, mediante experimentos tipo 
Western. 
Adicionalmente se realizaron pruebas de bloqueo in vivo de glicosilaciones, utilizando 
tunicamicina (Sigma 77765) a una concentración final reportada por Arjmand y 
colaboradores (2011), de 2.5 μg/mL 42, en medio BMMY. 
Ensayo de desfosforilación. 
Se utilizaron 50 μg de expansina, 45 μL de buffer 50 mM TRIS-HCl/1 mM EDTA pH 8.5 y 
50,000 U de CIP (Alkaline Phosphattase Calf Intestinal). La reacción se incubó 3 horas a 37 
°C, al finalizar la enzima se inactivó hirviendo la muestra durante 6 minutos a 99 °C. La 
muestra resultante se analizó en gel SDS-PAGE 15% y por experimentos tipo Western. 
Ensayos de unión a diferentes materiales celulósicos. 
Se incubaron 5 μg de cada expansina purificada con 1 mg, 2.5 mg, 5 mg y 10 mg de Avicel 
(PH-101 Fluka) (celulosa microcristalina), en 100 μL de buffer HEPES 20 mM pH7.4 
durante 1 h 30°C; 1,000 rpm. Posteriormente, se analizó la proteína unida (que quedó en el 
pellet) y no unida (en el sobrenadante) a los sustratos en geles SDS-PAGE 10%. Por 
densitometría, utilizando el programa Fiji (ImageJ), se calculó el porcentaje de proteína unida 
al sustrato y la cantidad de proteína (nmoles) por mg de sustrato, procesando los datos para 
ajustarse a valores lineales: 1/(
𝑛𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑔
). 
Ensayos de potenciación de la liberación de azúcares. 
Se incubaron 20 μg de cada proteína con 5 mg de Avicel, 5 mg de papel filtro o 5 mg de 
BMCC, en 500 μL de buffer 50 mM acetato de sodio pH 5-7 durante 24 horas a 25 °C, 37 °C 
y 50 °C, se incluyeron ensayos control, donde no se agregó proteína. Posteriormente, se 
centrifugó y se retiró el sobrenadante, para agregar 500 μg de buffer acetato de sodio 50 mM 
pH 5.5, y 5 U de celulasa (Sigma-Aldrich), se incubó durante 4 horas a 50 °C. Finalmente, 
de cada reacción se tomaron 50 μL de sobrenadante y se agregaron 50 μL de reactivo de 
ácido dinitro salicílico (DNS), se hirvió durante 5 minutos, se diluyó con 1 mL de agua 
destilada y, finalmente, la absorbancia se leyó a 540 nm. Los datos se extrapolaron de una 
30 
 
curva de calibración de glucosa para conocer la concentración de equivalentes de glucosa 
liberados (mg/mL). 
También se midió la actividad a las siguientes condiciones de reacción: se incubaron 20 μg 
de cada proteína con 5 mg de Avicel, 5 mg de papel filtro o 5 mg de BMCC, en 100 μL de 
buffer HEPES pH 7.4 durante 20 horas a 30 °C en agitación. Así mismo, se incluyeron 
ensayos control sin proteína. Posteriormente, se centrifugó y se retiró el sobrenadante, para 
agregar 200 μL de buffer acetato de sodio 50 mM pH 5.5, más 1 U de glucanasa, y se incubó 
durante 1 hora a 50 °C; 1,000 rpm. Además, se incluyó una reacción control, donde los 
sustratos no fueron incubados con expansina. Se determinó la cantidad de azúcares reductores 
por método de DNS y extrapolación de una curva estándar. 
Ensayo de solubilización de polisacáridos de la pared celular. 
Se realizó siguiendo el método descrito en Tabuchi y colaboradores (2011), con algunas 
modificaciones propuestas por Tovar Herrera (2018). Se incubaron 50 μg, 100 μg, 250 μg ó 
500 μg de expansina con 1.5 mg de tejido vegetal macerado y seco de estigmas de maíz (Zea 
mays) y acelga (Beta vulgaris var. cicla) en 500 μL de buffer 20 mM HEPES pH 7.4; los 
sustratos utilizados se prepararon siguiendo el método desarrollado por Tovar-Herrera y 
colaboradores (2018). Las incubaciones se realizaron durante 24 y 48 horas a 30 °C a 1,000 
rpm de agitación. Se determinó la presencia de polisacáridos sustituidos con moléculas 
fenólicas solubles mediante la determinación del espectro de absorción UV-vis (290 nm-400 
nm), restando la absorbancia obtenida en muestras control de proteína sin sustrato, así como, 
los datos del tejido vegetal incubado sin proteína. Los datos se extrapolaron de una curva de 
calibración con la molécula etil 4-hidroxi-3-methoxicinamato, para determinar la 
concentración en equivalentes ferúlicos solubilizados (320 nm-325 nm) por cada mg de 
sustrato. 
Los datos resultantes se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) de una vía y una 
prueba de comparación múltiple (post hoc) de tipo Bonferroni. Se llevaron a cabo en el 
programa de análisis estadísticos Prisma 5 para Windows, versión 5.01. 
31 
 
Análisis in silico de Exlx1-CBM 
Primero se realizó un BLAST alineando la secuencia de residuosde la proteína completa 
(WP_012237891.1 hypothetical protein [Sorangium cellulosum]). Además, se realizó otro 
BLAST considerando únicamente los residuos que componen del módulo de unión a 
carbohidrato de la expansina Exlx1 de S. cellulosum con secuencias representativas de las 
diferentes familias de CBMs registrados 43. 
Así mismo, se realizó la predicción de la estructura tridimensional de la proteína EXLX1-
CBM utilizando el servidor en línea I-TASSER 44. Los modelos arrojados se analizaron con 
el programa VMD (Visual Molecular Dynamics) 45. 
Finalmente, se predijeron los O-glicositios y N- glicositios en la proteína utilizando el 
servidor en línea GlycoPP 37. 
8. Resultados 
Diseño del vector de expresión para la proteína Exlx1-CBM de Sorangium 
celullosum y cuatro variantes truncas. 
En esta tesis nos interesó indagar en aspectos funcionales de las expansinas bacterianas, a la 
luz de las técnicas aplicadas en el laboratorio. Particularmente, de la expansina modular de 
S. cellulosum; nos interesa, además, conocer la participación de los módulos adicionales. Se 
sabe que esta proteína es inestable cuando se expresa en células de E. coli, por lo que 
decidimos analizar el sistema de levaduras P. pastoris. Se clonaron diferentes versiones, 
además de la proteína completa como a continuación se indica. 
Con los oligonucleótidos FwExlxl1-CBM y RvExlx1-CBM (Tabla 3) se amplificó el gen 
Exlx1-CBM carente de la secuencia codificadora para el péptido señal nativo, desde vector 
pET22, que había construido Olarte-Lozano (2016). El fragmento obtenido se clonó en el 
vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) y transformó en E. coli DH5α. Posteriormente, se purificó 
el vector y se realizó una doble digestión con las enzimas EcoRI y NotI para subclonarlo al 
vector pPICZαA (donado por la Dra. Clarita Olvera) previamente digerido, con las mismas 
enzimas, y desfosforilado en los extremos con la enzima CIP -para evitar su re-
circularización. Finalmente, se transformaron células de E. coli XL1Blue con los plásmidos 
obtenidos. A las clonas obtenidas se les extrajo y purificó DNA plasmídico corroborando la 
32 
 
presencia y correcta ligación del inserto por PCR (Figura 3, carril 1) con los oligonucleótidos 
específicos para el inserto y por secuenciación. 
 
 
Figura 3. Gel de agarosa 0-8%. Amplificación del gen de la proteína Exlx1-CBM y las cuatro 
variantes truncas amplificadas desde los vectores pPICZαA diseñados. Se muestra el 
marcador de peso molecular y el número de bases de cada secuencia. 
 
Con el objetivo de construir las variantes del gen, y así corroborar la información obtenida 
en Cerón-Pérez (2016) 27, se realizó un BLAST de la secuencia de residuos de la expansina 
Exlx1-CBM de S. celullosum, anotada en la base de datos NCBI (WP_012237891.1 
hypothetical protein [Sorangium cellulosum]) (Figura 4). Sin considerar el péptido señal 
nativo, se determinaron los límites en la secuencia de residuos que corresponden al módulo 
de unión a carbohidratos (CBM) (residuo 1-114), al linker de poliserina (PSL) (residuo 115-
226) y al dominio de expansina (Exlx1) (residuo 227-411). Con base en esta información, se 
diseñaron oligonucleótidos que hibridan al interior del gen nativo, permitiendo amplificar la 
secuencia de nucleótidos correspondientes a las combinaciones: CBM, CBM-PSL, PSL-Exlx1 
y Exlx1 (Figura 5). 
 
33 
 
 
Figura 4. Resumen gráfico del alineamiento de la secuencia de la proteína Exlx1-CBM de 
Sorangium cellulosum. La primera región corresponde al péptido señal nativo, seguido del 
CBM (CBM_2 superfamily), PSL (135 a 255 aproximadamente) y el módulo expansina 
altamente similar al de la expansina EXLX1 (YoaJ) de Bacillus subtilis 46. 
 
Se realizaron PCRs (Tabla 2c), utilizando como templado el plásmido construido para la 
versión completa de la proteína (Figura 1), para obtener los fragmentos correspondientes a 
cada versión de la proteína y fusionarlos a sitios de restricción NotI y EcoRI. De este proceso 
se obtuvieron los fragmentos de 702 pb, correspondientes al CBM; 1,038 pb, 
correspondientes al CBM-PSL; 1,084 pb, correspondientes PSL-Exlx1, y 742 pb, 
correspondientes a la construcción Exlx1 (Figura 5). A cada producto de PCR, se le aplicaron 
los pasos realizadas en la construcción del vector con la versión completa de la proteína. De 
tal manera que se obtuvieron cuatro plásmidos pPICZαA-CBM, pPICZαA-CBM-PSL, 
pPICZαA-PSL-Exlx1 y pPICZαA-Exlx1. Así mismo, las clonas de E. coli XL1 Blue positivas 
para las diferentes transformaciones se les extrajo y purificó DNA plasmídico, y se realizó 
un PCR con los oligonucleótidos diseñados y sintetizados (Figura 3, carril 2-5). Igualmente, 
se mandaron a secuenciar los plásmidos y se corroboró la integridad de las secuencias. 
 
34 
 
 
Figura 5. Gel de agarosa 0.8%. Amplificación de fragmentos codificantes para las versiones 
truncas de la proteína, desde el vector pPICZαA-Exlx1-CBM. Se analizaron dos temperaturas 
para la amplificación de cada fragmento. Se muestra el marcador de peso molecular (M) y el 
número de bases de cada secuencia. 
 
Figura 6. Representación gráfica de las versiones truncas de la proteína Exlx1-CBM 
esperadas. En verde se presenta la región correspondiente al módulo de unión a carbohidratos 
(CBM), en amarrillo se presenta la región PSL y en rojo, la región correspondiente al módulo 
35 
 
canónico expansina (Exlx1). a) proteína nativa, b) CBM-PSL, c) CBM, d) Exlx1 y e) PSL-
Exlx1. 
 
Se lograron obtener los vectores de expresión pPICZαA conteniendo los genes que codifican 
para cada una de las proteínas a evaluar en correcta ligación y estado de la secuencia. Todos 
ellos listos para la eventual transformación de células de la levadura P. pastoris X-33. 
Producción de la proteína Exlx1-CBM y cuatro variantes truncas. 
Una vez diseñados los cinco vectores, correspondientes a cada construcción a evaluar, nos 
interesó transformar células de levadura P. pastoris X-33 y corroborar la inserción de los 
genes, para poder expresar y producir cada una de las proteínas. 
Se obtuvieron los plásmidos con el gen Exlx1-CBM y con cada una de las cuatro variantes, y 
con ellos se transformaron levaduras P. pastoris X-33 electrocompetentes. A partir de DNA 
genómico extraído de células resistentes a zeocina, se corroboró la presencia del gen que 
codifica para la proteína Exlx1-CBM (completa), CBM-PSL, PSL-Exlx1 y Exlx1 a través de 
PCR (Tabla 2c y d), con los oligos 3’AOX y 5’AOX (Figura 7). No se pudo corroborar la 
presencia del gen que codifica para la versión CBM en el genoma de P. pastoris a pesar de 
haber obtenido células resistentes a zeocina, y hasta el momento no sabemos la razón de esto. 
 
 
Figura 7. Geles de agarosa 0.8%. Productos de PCR de gDNA de las clonas de P. pastoris 
X-33 transformadas. A) Exlx1-CBM, B) CBM-PSL, PSL-Exlx1 y C) Exlx1. En cada gel se 
señala el marcador de peso molecular (M), el producto de amplificación a partir del vector 
utilizado para la transformación (Cp) y a partir de DNA genómico (A). 
A B C 
36 
 
Durante el evento de recombinación de las construcciones al genoma de la levadura pueden 
ocurrir dos tipos de inserciones, una en la que el nuevo gen se inserta delante del gen AOX1 
nativo de la levadura, siendo éste la más común; mientras que, en algunos casos el gen nuevo 
se inserta en el sitio del gen AOX1 destruyendo su función. Es por eso que después de la 
transformación, las células pueden tener dos fenotipos: el de utilización de metanol porque 
el gen AOX1 es activo y permite el rápido crecimiento de los cultivos en presencia del 
inductor que es el metanol y al que se le conoce como Mut+ (methanol utilization positive). 
Pero cuando el gen AOX1 se inactiva por la inserción del nuevo gen, las células no pueden 
metabolizar el metanol efectivamente y crecen muy lentamente, a este fenotipo se le llama 
Mut- (methanol utilization negative). Despuésde la electroporación de las células, se 
seleccionaron las clonas Mut+ resistentes a altas concentraciones (2,000 μg/mL) de zeocina. 
Para la producción de la proteína se usó el medio BMMY, durante 96 horas de incubación, 
tiempo determinado como el punto en el que se alcanza el máximo de producción- después 
de este tiempo ya no aumentó la cantidad de proteína. Debido a que el gen de la expansina 
(y sus versiones truncas) se clonaron delante de la secuencia de un péptido señal que envía a 
la proteína heteróloga hacia afuera de la célula, el sobrenadante del cultivo centrifugado se 
purificó por cromatografía de afinidad a iones de níquel. Se analizaron diferentes 
concentraciones de imidazol para la purificación de las proteínas Exlx1-CBM (completa), 
CBM-PSL, PSL-Exlx1 y Exlx1, y en todos los casos se observó que las proteínas eluyen 
entre 200 y 300 mM de imidazol (desafortunadamente, versión Exlx1 no se expresó). La 
Figura 8 muestra un ejemplo del proceso de purificación de la proteína completa, en el que 
se incluye desde el sobrenadante del cultivo crudo, el efluente de lo que no se unió a la 
columna, la proteína eluída a 200 mM de imidazol y la proteína purificada concentrada y 
libre de imidazol. Este análisis se realizó para cada una de las construcciones. A su vez, a 
través de un experimento tipo western, utilizando el anticuerpo anti-6xHis, se detectó y 
confirmó la identidad de las proteínas (Figura 9). 
Una vez que se establecieron las condiciones para la obtención de las proteínas puras, se 
determinó la capacidad de unión al material celulósico ya que esto nos habla de la actividad 
de las proteínas que a su vez se relaciona con un correcto plegamiento. Estas pruebas de 
unión consisten en la técnica de pull down con Avicel, en la que la proteína unida es “jalada” 
hacia el fondo del tubo después de centrifugar, ya que el sustrato es insoluble. La proteína 
37 
 
Exlx1-CBM y las dos variantes producidas fueron capaces de unirse al Avicel, lo que indica 
que tienen un correcto plegamiento, lo que nos hizo suponer que también podrían ser 
funcionales (Fig. 9). Sorprendentemente, en todos los casos, y especialmente para la 
construcción CBM-PSL el peso molecular observado es mucho mayor que el esperado según 
lo predicho teóricamente (Tabla 4). 
 
 
 
 
 
Figura 8. Gel desnaturalizante SDS-PAGE 10%. Purificación de la proteína Exlx1-CBM. 
Carril 1, sobrenadante del medio crudo de producción (BMMY); 2, efluente; 3, medio de 
equilibrio, resultante de purificación por cromatografía de afinidad a iones de Níquel; 4, 
proteína purificada y concentrada; y 5, proteína purificada, concentrada y lavada. 
 
Figura 9. Western Blot. Detección de la proteína Exlx1-CBM, CBM-PSL y PSL-Exlx1. Se 
realizó un western blot, para detectar los 6 residuos de histidina en las secuencias obtenidas. 
185kDa 
100kDa 
70kDa 
60kDa 
38 
 
Marcador de peso molecular (M), muestras purificadas y limpias (C); fracciones 
sobrenadante (Sn) y Pastilla (Pt), de ensayos de pull down con Avicel. 
 
Se lograron transformar células de levadura P. pastoris X-33 con los plásmidos pPICZαA-
Exlx1-CBM (proteína completa), pPICZαA-CBM-PSL, pPICZ-PSL-Exlx1 y pPICZαA-
Exlx1. A su vez, logramos corroborar la expresión y producción de las proteínas Exlx1-CBM, 
CBM-PSL y PSL-Exlx1, listas para llevar a cabo evaluaciones de la función sobre materiales 
celulósicos. 
Modelo estructural de la proteína Exlx1-CBM y cuatro variantes truncas. 
Antes de empezar las evaluaciones funcionales de la proteína, nos preguntamos cómo es la 
estructura tridimensional de la expansina modular Exlx1-CBM de S. cellulosum. Debido a la 
ausencia de reportes donde se resuelva la estructura, se decidió utilizar el servidor I-TASSER, 
numerosamente utilizado en la predicción de la estructura tridimensional de proteínas 44. Se 
realizó con el objetivo de observar la probable estructura de la proteína Exlx1-CBM 
(completa), las variantes CBM, Exlx1; así como, observar las modificaciones estructurales 
consecuencia de la expresión de la proteína con 110 residuos no plegados (PSL). Este 
servidor arroja el parámetro C-score, relativo a la de fidelidad del modelo, va de [-5,2], siendo 
2 el puntaje final de mayor fidelidad según el modelo estructural obtenido, posterior al 
ensamblado de fragmentos de la secuencia, modelados individualmente y refinados con una 
estructura de mayor similitud topológica. También, arroja el parámetro TM es una medida 
absoluta de la calidad de cada modelo final al comparar dichos modelos de la secuencia de 
interés con estructuras anotadas, un puntaje >0.5 indica correcta topología del modelo, 
mientras que <0.17 indica que las similitudes encontradas entre los modelos y las estructuras 
anotadas son aleatorias. Finalmente, ligado al puntaje TM, el servidor arroja el valor de 
cobertura (Cover) de la secuencia (va de 0 a 1), al alinear la secuencia de residuos problema 
con secuencias de proteínas depositadas en el PDB, refiriendo a las regiones en donde existe 
similitud en la secuencia de residuos. En la Figura 10 se muestran los modelos 3D de mayor 
confianza predichos en el servidor y analizados en el programa VMD 45,47. 
La estructura de la proteína Exlx1-CBM (completa) está formada por dos módulos 
independientes unidos por 110 residuos (linker) con 24 Ser consecutivas (PSL) (Fig. 10, 
39 
 
esferas azules), la predicción arrojó un C-score = -3.29 y se determinó la identidad con las 
expansinas de Bacillus subtilis (3D30) (TM-score = 0.443 Cover = 0.449), EXPB1 (Zea m 
1) de Zea mays (2HCZ) (TM-score = 0.424 Cover = 0.469) y Clavibacter michiganensis 
(4JCW) (TM-score = 0.421 Cover = 0.444). En los diez mejores modelos del análisis con la 
proteína completa no se registró similitud con ningún módulo de unión a carbohidratos. 
Cuando se alimentó al programa con la secuencia de solamente el CBM se obtuvo el modelo 
correspondiente al CBM (Fig. 10B) con C-score = -0.64, evidenciando alta confianza en la 
predicción, construido por su identidad con el módulo de unión a carbohidratos de 
Cellulomona fimi (1EXG) (TM-score = 0.720 Cover = 0.790) y el dominio de unión a 
carbohidratos de la endoglucanasa D de Clostridium cellulovorans (3ICG) (TM-score = 
0.736 Cover = 0.761). 
Así mismo, el modelo correspondiente a solamente el módulo de expansina (Fig. 10E) arrojó 
un C-score = -0.55 y se basó en la estructura de las expansinas de Clavibacter michiganensis 
(4JCW) (TM-score = 0.774 Cover = 0.804), Bacillus subtilis (3D30) (TM-score = 0.737 
Cover = 0.790), y la β-expansina EXPB1 (Zea m 1) de Zea mays (2HCZ) (TM-score = 0.716 
Cover = 0.822). 
Finalmente, los modelos correspondientes a las variantes que contiene los residuos del linker 
de poli-serinas, mostraron valores de baja confianza y evidentes variaciones estructurales. El 
modelo CBM-PSL (Fig. 10C) arrojó un C-score = -2.54 y se observa un plegamiento de los 
residuos correspondientes al CBM alterado, y también la adopción de estructuras secundarias 
en los residuos del PSL, basados en la identidad a la estructura de la quitinasa de Serratia 
marcescens 1CTN (TM-score = 0.863 Cover = 0.922), y en 5DEZ, que también es una 
quitinasa bacteriana (TM-score = 0.833 Cover = 0.914). Finalmente, el modelo PSL-Exlx1 
arrojó un C-score = -2.38. A pesar de la baja confianza en la predicción, se observa la 
estructura canónica de las expansinas, que se logró en base a la β-expansina EXPB1 (Zea m 
1) de Zea mays (2HCZ) (TM-score = 0.614 Cover = 0.672) y a las expansinas bacterianas de 
Clavibacter michiganensis (4JCW) (TM-score = 0.586 Cover = 0.607) y Bacillus Subtilis 
(3D30) (TM-score = 0.560 Cover = 0.604). 
 
 
40 
 
 
 
 
Figura 10. Modelos 3D de las expansinas estudiadas, resueltos con el servidor VMD. Los 
modelos elegidos registraron el más alto C-score (-5 a 2) según el servidor I-TASSER. En 
verde, residuos correspondientes al CBM; amarillo, PSL;