Caracterizacion-de-compuestos-antimicrobianos-tipo-bacteriocina-producidos-por-bacterias-acido-lacticas-aisladas-de-insectos-comestibles

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
CARACTERIZACIÓN DE COMPUESTOS ANTIMICROBIANOS TIPO 
BACTERIOCINA PRODUCIDOS POR BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS 
AISLADAS DE INSECTOS COMESTIBLES. 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
QUÍMICO DE ALIMENTOS 
 
 
PRESENTA 
 
STEPHANIE ORTIZ CONTRERAS 
 
 
 
 
 
 CIUDAD UNIVERSITARIA, CD. MX. 2018 
 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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ii 
JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: Aleida Mina Cetina 
VOCAL: Profesor: Hugo Antonio Hernández Pérez 
SECRETARIO: Profesor: Yenizey Merit Álvarez Cisneros 
1er. SUPLENTE: Profesor: Oscar Hernández Meléndez 
2° SUPLENTE: Profesor: Carmina Montiel Pacheco 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO 132, EDIFICIO S, ÁREA DE BIOQUÍMICA DE MACROMOLÉCULAS, 
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA, UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA, 
UNIDAD IZTAPALAPA. 
 
 
ASESOR DEL TEMA: DRA. YENIZEY MERIT ÁLVAREZ CISNEROS 
 (nombre y firma) 
SUPERVISOR TÉCNICO: DRA. EDITH PONCE ALQUICIRA 
 (nombre y firma) 
SUSTENTANTE (S): STEPHANIE ORTIZ CONTRERAS 
 (nombre y firma 
 
 
 
 
 
 
 
iii 
ÍNDICE GENERAL 
Contenido Página 
RESUMEN……………………………………………………………….………………. 1 
1. INTRODUCCIÓN...…………………………………………………………….... 3 
2. ANTECEDENTES...……………………………………………………………... 4 
2.1 Insectos comestibles………………………………………………………….. 4 
2.2 Péptidos antimicrobianos de insectos………………...………………………. 5 
2.3 Microbiota presente en algunos insectos comestibles………………………... 6 
2.4 Bioconservación……………………………………………………………… 7 
2.5 Bacterias ácido lácticas……………………………………………………….. 8 
2.5.1 Clasificación de BAL y géneros representativos……………………... 9 
2.5.1.1 Fermentación láctica homofermentativas………………………... 9 
2.5.1.2 Fermentación láctica heterofermentativa………………………… 10 
2.5.2 Métodos de identificación molecular de BAL………………………... 10 
2.5.2.1 Filogenia de las BAL…………………………………………….. 11 
2.6 Compuestos antimicrobianos producidos por BAL………………….............. 12 
2.6.1 Bacteriocinas………………………………………………………… 13 
2.6.1.1 Características generales………………………………………….. 13 
2.6.1.2 Clasificación de bacteriocinas……………………………………. 14 
2.6.1.3 Mecanismo de acción…………………………………………….. 18 
2.6.1.4 Aislamiento y purificación de una bacteriocina…………………. 18 
2.7 Importancia en la industria alimentaria……………………………................. 20 
3. JUSTIFICACIÓN..……………………………………………………………….. 21 
4. HIPÓTESIS……...……………………………………………………………….. 22 
5. OBJETIVOS……..……………………………………………………………….. 22 
6. METODOLOGÍA...………………………………………………………………. 23 
6.1 Obtención de muestras de insectos…………………………………………… 24 
6.2 Preparación y dilución de muestras…………………………………………... 24 
6.3 Aislamiento de BAL a partir de insectos……………………………………... 24 
6.4 Conservas de BAL aisladas de insectos……………………………………… 24 
6.5 Cepas patógenas y de deterioro en alimentos utilizadas para la prueba de 
actividad antagónica y espectro antimicrobiano…………………………...…. 
 
25 
6.6 Pruebas de actividad antagónica…………………………………………….... 25 
6.7 Obtención del extracto libre de células a pH neutro………………………….. 26 
6.8 Espectro antimicrobiano……………………………………………………… 26 
6.9 Cuantificación de proteína……………………………………………………. 26 
6.10 Identificación molecular de BAL antagónica……………………………….. 
6.10.1 Secuenciación y comparación de bases de datos……………………... 
27 
27 
 6.11 Estabilidad del compuestos antimicrobiano…………………………………. 28 
6.11.1 Tratamiento con proteasas…………………………………………….. 28 
 6.11.2 Tratamiento en diferentes pHs………………………………………... 28 
 6.11.3 Termoestabilidad……………………………………………………... 29 
 6.12 Cinética microbiana………………………………………………………….. 29 
 6.13 Semi-purificación del extracto crudo……………………………………... 29 
 6.14 Electroforesis Tricine-SDS-PAGE……………………………………….. 30 
 
 
iv 
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………. 31 
7.1 Pruebas de actividad antagónica…………………………………………...…. 31 
7.2 Cuantificación de proteína…………………………………………………..... 31 
7.3 Pruebas de espectro antimicrobiano…………………………………...……... 34 
7.4 Identificación molecular de BAL antagónica, secuenciación y comparación de 
bases de datos……………………………………………………………… 
 
37 
7.5 Estabilidad de compuestos antimicrobianos……………………………...…... 40 
7.5.1 Tratamiento con proteasas…………………………………….……… 40 
7.5.2 Tratamiento en diferentes pHs………………………………………... 41 
7.5.3 Termoestabilidad……………………….…………………………….. 42 
7.6 Cinética microbiana…………………………………………………...……… 44 
7.7 Semi-purificación del extracto crudo y Tricine-SDS-PAGE………………… 46 
7.8 Electroforesis Tris-Tricine-SDS-PAGE……………………………………… 
8. CONCLUSIONES…………………………………………………...…………… 
47 
49 
9. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………. 50 
10. ANEXOS…………………………………………………………………………. 61 
11. PRESENTACIÓN EN EVENTOS ESPECIALIZADOS………………………... 66 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iii 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
 
 
Tabla Página 
1 Características generales de las bacteriocinas……………………………...... 14 
2 Protocolo para la preparación de geles de poli-acrilamida………………….. 30 
3 Pruebas de antagonismo de las cepas aisladas de insectos contra cepas 
patógenas y de deterioro…………………………………………………...... 
 
33 
4 Pruebas de actividad antimicrobiana, cuantificación de proteína y actividad 
específica para los extractos crudos obtenidos de la cepa aislada de 
chapulines pequeños (CP)………………………………………………….... 
 
 
34 
5 Pruebas de actividad antimicrobiana, cuantificación de proteína y actividad 
específica para los extractos crudos obtenidos de la cepa H aislada de 
hormigas chicatanas…………………………………………………………. 
 
 
35 
6 Secuencias alineadas con las cepas en estudio aisladas de chapulines y 
hormigas chicatanas, respectivamente………………………………………. 
 
39 
7 Pasos para la semi-purificación del compuesto antimicrobiano tipo 
bacteriocina producido por Enterococcus faecium CP y Pediococcus 
acidilactici H………………………………………………………………… 
 
 
47 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
iv 
 
 
ÍNDICE DE GRÁFICOS 
 
 
Gráfico Página 
1 Curva tipo para cuantificación de proteína………………………………...... 32 
2 Actividad específica del extracto crudo de Enterococcus faecium CP y 
Pediococcus acidilactici H a diferentes condiciones de pH contra Listeria 
monocytogenes 88 ……………………………………….………………….. 
 
 
42 
3 Estabilidad de los extractos con actividad antimicrobiana obtenidos de BAL 
a diferentes temperaturas………...………………………………………...... 
 
44 
4 Cinética de crecimiento de Pediococcus acidilactici H………………........... 44 
5 Cinética de crecimiento de Enterococcus faecium CP……………………..... 45 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
v 
 
ÍNDICE DE FIGURASFigura Página 
1 Modificaciones postraduccionales de la lantionina y α-metil-lantionina…… 15 
2 Estructura de diversas bacteriocinas de bacterias Gram positivas………………… 16 
3 Mecanismo de acción de varias clases de bacteriocina……………………… 19 
4 Diagrama General…………………………………………………………… 23 
5 Ejemplo de la prueba de actividad antagónica……………………………..... 25 
6 Gel de agarosa del ADN y del gen ADNr 16S…………………………….... 38 
7 Relaciones evolutivas de los taxones………………………………………... 39 
8 Evaluación de la actividad antimicrobiana contra Listeria monocytogenes 88, 
antes y después del tratamiento con proteasas…………………………... 
 
40 
9 Geles de poliacrilamida TRIS-TRICINE-SDS-PAGE y actividad 
antimicrobiana del extracto semi-purificado con acetona, obtenido a partir de 
la cepa Enterococcus faecium CP………………………………………... 
 
 
48 
10 Geles de poliacrilamida TRIS-TRICINE-SDS-PAGE y actividad 
antimicrobiana del extracto semi-purificado con acetona, obtenido a partir de 
la cepa Pediococcus acidilactici H……………………………………….. 
 
 
48 
 
 
 
 
1 
RESUMEN 
 
Los alimentos son frecuentemente contaminados por microorganismos de descomposición y 
patógenos, provocando alteraciones físicas, químicas o sensoriales, además de enfermedades 
transmitidas por alimentos (ETAs), lo cual provoca grandes pérdidas para la industria de 
alimentos. La bioconservación consiste en el empleo de microorganismos seleccionados o 
sus metabolitos para inhibir o controlar la microbiota alterante. El estudio de bacterias ácido 
lácticas (BAL) bioprotectoras aisladas a partir de insectos comestibles es escaso en la 
bibliografía, ya que los principales alimentos en estudio son fermentados. Algunos autores 
han demostrado que algunos tipos de escarabajos, chapulines, hormigas y moscas de fruta 
son capaces de producir compuestos antimicrobianos, pero no se ha determinado si los 
compuestos son producidos por el organismo o por la microbiota de estos organismos, por 
otra parte todos los estudios reportados de compuestos antimicrobianos extraídos de insectos 
están enfocados al área farmacéutica como sustitutos de antibióticos, pero en ningún caso se 
han estudiado como conservadores naturales para implementarlos en alimentos. Por todo lo 
anterior es importante estudiar BAL productoras de compuestos antimicrobianos aisladas de 
insectos que contribuyan en la conservación de alimentos, como parte de una tecnología de 
bioconservación. 
 
El objetivo de este trabajo fue caracterizar compuestos antimicrobianos tipo bacteriocina 
producidos por BAL aisladas de insectos comestibles endémicos de México. Para cumplir 
dicho objetivo, se realizó la siguiente metodología: se aislaron BAL de diferentes tipos de 
insectos comestibles como chapulines (Sphenarium purpurascens) en el quinto estadio de 
ninfa (CP) y adulto (CG), jumiles (Euschistus taxcoensis), chicatanas (Atta mexicana) y 
gusanos de maguey (Comadia redtenbacheri) en medio MRS, las cuales fueron analizadas 
de acuerdo a su morfología. Se seleccionaron aquellas BAL que presentaron actividad 
antagónica contra diferentes microorganismos de deterioro y patógenos utilizando extractos 
neutros. Posteriormente se identificaron las cepas seleccionadas secuenciando el gen ADNr 
16S. Se evaluó la estabilidad de los extractos neutros a proteasas, temperatura y pHs; además 
se determinó la actividad antimicrobiana específica. Finalmente se realizó una 
semipurificación de acuerdo a la técnica de concentración de compuestos tipo bacteriocina 
BLIS (Bacteriocin Like Inhibitory Substance, por sus siglas en inglés) usando solventes 
orgánicos (acetona) descrita por Chung y cols., 2011 y se analizó el tamaño del péptido 
antimicrobiano producido por las BAL mediante electroforesis tris-tricina. 
 
De un total de 40 cepas aisladas de diferentes insectos listos para consumo, únicamente 2 
cepas presentaron actividad antimicrobiana con extractos neutros, las cuales fueron aisladas 
de CP y chicatanas, respectivamente. Las secuencias obtenidas presentaron una similitud 
mayor al 99% con cepas de Enterococcus faecium (CP) y Pediococcus acidilactici (H) de 
acuerdo a la base de datos del NCBI. Los extractos en estudio presentaron una alta actividad 
contra Listeria monocytogenes y Weissellia viridens. Los extractos perdieron completamente 
 
 
2 
la actividad antimicrobiana en presencia de proteasas, lo que indica que la actividad 
antimicrobiana es de origen proteico, además presentaron la mayor actividad en pH ácidos y 
mantienen el 25% de la actividad a 90 ºC durante una hora. Se obtuvieron dos diferentes 
fracciones de cada uno de los extractos analizados (CP y H) por la técnica de precipitación 
con acetona, en la cual cada fracción obtenida está formada por un péptido antimicrobiano 
con un peso aproximadamente menor a 5kDa. Finalmente con los resultados obtenidos se 
puede concluir que el compuesto antimicrobiano producido por la cepa Enterococcus 
faecium CP (aislado de chapulines listos para consumo recolectados en el quinto estadio de 
ninfa) y Pediococcus acidilactici H (aislado de hormigas chicatanas) es de tipo bacteriocina 
o BLIS con alta actividad anti-Listerias; además de que esté es el primer trabajo que se realiza 
para identificar compuestos antimicrobianos tipo bacteriocina producidos por BAL del tracto 
gastrointestinal de insectos listos para el consumo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
1. INTRODUCCIÓN: 
La principal causa de deterioro de los alimentos es el ataque de diferentes tipos de 
microorganismos (bacterias, levaduras y mohos) y puede tener implicaciones económicas, 
tanto para los fabricantes (deterioro de materias primas y productos elaborados antes de su 
comercialización, pérdida de la imagen de marca, etc.) como para distribuidores y 
consumidores (deterioro de productos después de su adquisición y antes de su consumo) 
(Matamoros, 1998). 
El uso de antimicrobianos como conservadores es una práctica común en la industria de los 
alimentos. Por muchos años se han utilizado antimicrobianos sintetizados químicamente que 
en algunos casos han causado daño en la salud de los consumidores, si se utilizan en altas 
dosis, causando un rechazo por parte de los consumidores de productos procesados, por lo 
cual ha surgido la necesidad de buscar otras opciones. En esta búsqueda se han encontrado 
nuevos agentes antimicrobianos de origen natural, como sustitutos de los tradicionalmente 
utilizados (Nychas, 1995). 
En los últimos años, la demanda por parte del consumidor de productos mínimamente 
procesados, ha aumentado el interés de los investigadores por encontrar antimicrobianos de 
origen natural que puedan ser utilizados como bioconservadores con el fin de prolongar la 
vida útil y la seguridad para el consumidor (Blanchard, 2000). Los microorganismos más 
empleados en la bioconservación son las bacterias ácido lácticas (BAL) productoras de 
péptidos con actividad bioprotectora, ya que pueden ser incorporados como conservadores 
naturales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
2. ANTECEDENTES 
2.1 Insectos comestibles 
Los insectos suelen considerarse una molestia para los seres humanos y simples plagas para 
los cultivos y animales, sin embargo esto está lejos de la verdad ya que presentan beneficios 
en su mayoría desconocidos para el público, por ejemplo: pueden proporcionar alimentos a 
bajo costo ambiental, contribuir positivamente a los medios de subsistencia y desempeñan 
un papel fundamental en la naturaleza (FAO, 2013). Por otra parte, en su conjunto 
representan la mayor biomasa sobre la tierra y su masa corporal está constituida por un alto 
porcentaje de proteína (Arango y cols., 2005), lo que permite que sean utilizados desde hace 
miles de años como fuente de recursos para el ser humano, ya sea como alimento 
(entomofagia) o para la obtención de productos como miel, seda o pigmentos (Gomez-
Sebastián,2014). 
En México la entomofagia constituye una alternativa alimenticia prometedora para el hombre 
como lo comprueban diferentes investigaciones sobre insectos comestibles referentes a 
aspectos biogeográficos, a su biodiversidad en el mundo, a su sustentabilidad, a su 
importancia en la alimentación de los núcleos rurales, a su valor nutritivo, habiéndose 
demostrado que son una buena fuente de proteínas aunada a su calidad proteínica y a que son 
altamente digestibles. Es decir, los insectos son una excelente alternativa alimenticia para el 
hombre (Ramos-Elorduy y cols., 2001). 
Actualmente la entomofagia se practica tanto en los países desarrollados como en los 
subdesarrollados; en los primeros como una alternativa culinaria exótica y en países menos 
desarrollados y como un alimento para sobrevivir que forma parte de sus costumbres 
tradicionales (Ramos-Elorduy y cols., 2007). 
En todo el mundo se consumen más de 1.900 especies de insectos comestibles. Sin embargo, 
esta cifra sigue aumentando a medida que se llevan a cabo más estudios sobre esta cuestión, 
y la mayoría de estas especies conocidas se recogen directamente del medio natural. No 
obstante, los datos disponibles sobre las cantidades de insectos consumidos en todo el mundo 
son escasos. Según los datos disponibles, los insectos más consumidos son los escarabajos 
(coleópteros) (31%), las orugas (lepidópteros) (18%) y las abejas, avispas y hormigas 
 
 
5 
(himenópteros) (14%). Les siguen los saltamontes, las langostas y los grillos (ortópteros) 
(13%), las cigarras, los fulgoromorfos y saltahojas, las cochinillas y las chinches (hemípteros) 
(10%), las termitas (isópteros) (3%), las libélulas (odonatos) (3%), las moscas (dípteros) (2%) 
y otros órdenes (5%) (FAO, 2011). 
En general, los insectos proporcionan una valiosa fuente de proteínas, lípidos, carbohidratos 
y ciertas vitaminas y minerales. Por otra parte, la crianza de insectos implica una menor 
huella ambiental en comparación con los animales tradicionales de crianza, convirtiendo a 
los insectos comestibles en una alternativa prometedora a productos de proteína animal 
(Stoops y cols., 2016). 
Además de la entomofagia, algunos autores han enfocado el estudio de los insectos 
comestibles a la biopreservación ya que se ha reportado que algunos tipos de escarabajos, 
chapulines, hormigas y moscas de fruta son capaces de producir compuestos 
antimicrobianos, pero no se ha determinado si los compuestos son producidos por el 
organismo o por la microbiota de estos organismos, por otra parte todos los estudios 
reportados de compuestos antimicrobianos extraídos de insectos están enfocados al área 
farmacéutica como sustitutos de antibióticos, pero en ningún caso se han estudiado como 
conservadores naturales para implementarlos en alimentos. 
2.2 Péptidos antimicrobianos (PAM´s) de insectos 
Los PAMs son definidos como pequeñas moléculas anfipáticas (que poseen regiones 
hidrófobas e hidrófilas) con un peso molecular <10 kDa, cargadas positivamente con una 
composición variable de aminoácidos (de seis a 100 aminoácidos) y capaces de interaccionar 
con las membranas plasmáticas de las células sensibles. Son producidos por procariontes 
(bacterias, arqueas) y eucariontes (plantas, aves, peces, insectos, anfibios y mamíferos) como 
mecanismo de defensa (Tonarelli y cols., 2013). Las bacterias producen PAMs ribosomales 
denominados bacteriocinas (Montaño y cols., 2002; Rivas-Santiago y cols., 2006, Castrillón 
y cols., 2007; Yang y cols., 2014) 
Los PAMs estudiados en plantas, insectos y mamíferos presentan un amplio espectro de 
actividad sobre bacterias Gram positivas, Gram negativas y varios hongos (Corrales-García 
y cols., 2010). 
 
 
6 
Una gran parte de los PAMs conocidos se originan de insectos, y el número y la diversidad 
de estas moléculas en diferentes especies varía considerablemente (Mylonakis y cols., 2016). 
La actividad antibacteriana en insectos se observó por primera vez al inyectar bacterias a la 
pupa de Hyalophora cecropia las cuales producen péptidos antibacterianos de 3kDa capaces 
de inhibir el crecimiento de bacterias Gram negativas llamados cecropinas. Miembros de la 
familia de las defensinas también han sido descritos en insectos como péptidos catiónicos 
conteniendo 3 puentes disulfuros y con especificidad contra bacterias Gram+. Otros PAM 
activos contra bacterias Gram- descritos en insectos son las apidaecina, abaecina y royalisina 
de la abeja Apis mellifera o drosocina de Drosophila, los cuales tienen alto contenido de 
prolina. También se han descrito PAM de aproximadamente 20kDa y ricos en glicina 
conocidos como atacinas, sarcotoxinas y diptericinas, entre otros, los cuales actúan en 
sinergismo con otros péptidos, intensificando su acción (Montaño y cols., 2002). Desde 
entonces, los insectos han demostrado ser una importante fuente de péptidos antimicrobianos 
(Meylears y cols., 2002). 
Una gran parte de los PAM´s conocidos se originan de insectos, y el número y la diversidad 
de estas moléculas en diferentes especies varían considerablemente. Los estudios acerca de 
los PAM´s de insectos y su aplicación tecnológica está orientada hacia farmacia 
especialmente a la limitación de los antibióticos actuales, que ha sido causada por la 
emergencia y propagación de patógenos resistentes a múltiples fármacos. Sin embargo, la 
información de la aplicación tecnológica con énfasis en los alimentos es escasa en la literatura 
(Mylonakis y cols., 2016). 
 
2.3 Microbiota presente en algunos insectos comestibles 
Durante un estudio realizado por Garofalo y cols. (2017), se determinó la microbiota presente 
en diferentes insectos comestibles como grillos, larvas de gusano y langostas donde se 
encontró la presencia de bacterias intestinales, deteriorantes de alimentos, patógenas como 
Listeria sp., Staphylococcus sp., Clostridium sp. y Bacillus sp. ( baja abundancia) y bacterias 
ácido lácticas (BAL) como Enterococcus sp. Enterococcus faecalis, Enterococcus 
haemoperoxidus, Pediococcus acidilactici, Weissella sp., entre otras. Por otra parte, Stoops 
y cols., 2016 realizaron un estudio acerca de la microbiota de chapulines, en el que se 
 
 
7 
identificaron algunas BAL como Weissella sp., Lactococcus sp., y Enterococcus sp., con lo 
que se determinó que las BAL y las enterobacterias constituían más del 80% de la microbiota. 
A diferencia de lo que se sabe sobre las propiedades nutricionales de los insectos comestibles, 
la investigación orientada hacia la seguridad alimentaria y vida útil son consideradas nuevas 
líneas de investigación en las cuales aún existen muchas incógnitas y puntos de interés (Van 
der Spiegel y cols., 2013; Stoops y cols., 2016). 
En los últimos años, ha habido una explosión de investigación básica y aplicada en las 
bacteriocinas provenientes de BAL, principalmente debido a su posible aplicación como 
bioconservadores en alimentos y productos alimenticios para inhibir el crecimiento de 
patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos, especialmente Listeria 
monocytogenes. 
Actualmente todas las revisiones bibliográficas de bacteriocinas se centran en bacterias 
aisladas de productos fermentados; y por otra parte, es importante buscar nuevas fuentes de 
aislamiento de BAL productoras de compuestos antimicrobianos. Los insectos pueden ser 
utilizados como fuente alterna de microorganismos productores de bacteriocinas, partiendo 
de la gran diversidad microbiana que estos presentan. 
2.4 Bioconservación 
Los agentes antimicrobianos también considerados como aditivos alimentarios son 
compuestos químicos añadidos para controlar los microorganismos de deterioro deseados. 
La bioconservación es un método que puede satisfacer las demandas de los 
consumidores, ya que su objetivo es extender la vida de anaquel y la seguridad de un 
alimento a través del uso de microbióta natural o controlada (microorganismos nopatógenos) y/o sus compuestos (Stiles, 1996; Parada y cols., 2007). 
Para conciliar las demandas de los consumidores con los estándares de seguridad 
necesarios, se han empezado a sustituír los métodos tradicionales para controlar la 
descomposición y los riesgos microbiológicos en los alimentos a partir de las 
combinaciones de tecnologías innovadoras que incluyen sistemas biológicos 
antimicrobianos como las bacterias ácido lácticas (BAL) y/o sus bacteriocinas (De La 
Fuente, 2009), ya que las propiedades antagonistas de estos microorganismos asociadas 
 
 
8 
a su historial de uso en productos fermentados tradicionales, los hacen muy atractivos 
para ser utilizados como bioconservadores (Parada y cols., 2007). 
En las últimas dos décadas se ha incrementado la investigación sobre el estudio y la 
incorporación de compuestos antimicrobianos (bacteriocinas) producidos por BAL como 
conservadores naturales (bioconservación) para retardan o inactivar el crecimiento 
microbiano y por lo tanto detener el deterioro de la calidad y mantener así la seguridad del 
alimento (Rodríguez Sauceda, 2011). 
La presión pública para la disminución del uso de conservadores químicos en la industria 
alimentaria ha llevado a la búsqueda de antimicrobianos alternativos de origen natural, tales 
como extractos de plantas (Soriano del Castillo, 2007), y bacteriocinas como la nisina. 
2.5 Bacterias ácido lácticas. 
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son un grupo de microorganismos conformado por d
 iferentes géneros con características morfológicas, fisiológicas y metabólicas 
comunes. Tienen forma de cocos y bacilos Gram positivos, no esporulados, no móviles, 
anaerobios, anaerobios facultativos, microaerofílicos o aerotolerantes. Bioquímicamente son 
catalasa, oxidasa y bencidina negativas, no reducen los nitratos a nitritos, y se caracterizan 
por tener la capacidad de convertir las azucares fermentables en ácido láctico. Este grupo de 
microorganismos son ácido-tolerantes, algunos miembros pueden crecer a pH de 3.2, sin 
embargo, la mayoría se desarrollan a pH entre 4 y 4.5 (Montiel-Pineda, 2014). Son mesófilos 
con una temperatura óptima de crecimiento entre 30 °C y 40 °C, pero algunas cepas son 
capaces de crecer a temperaturas inferiores a 5 °C o superiores a 45 °C (Kocková y cols., 
2011). 
Son muy exigentes en su nutrición al requerir una gran cantidad de factores nutritivos 
(aminoácidos, bases nitrogenadas, algunas vitaminas principalmente del grupo B y fuentes 
de carbono) y obtienen su energia del metabolismo de los azucares, por lo que su desarrollo 
está restringido a ambientes ricos en azúcares (Mora y García., 2007). El hábitat de estos 
microorganismos se encuentra en productos como: leche, carne y los productos fermentados, 
así como en las verduras y bebidas fermentadas que inhiben el crecimiento de 
microorganismos patógenos y deteriorantes, manteniendo la calidad nutritiva y mejorando la 
 
 
9 
vida útil de los alimentos, así como las propiedades organolépticas de sabor y textura (Parada 
y cols., 2007). 
Otro nicho de las BAL es el sistema gastrointestinal de los animales y humanos, en el cual 
son parte de la microbióta intestinal ayudando a la regulación del metabolismo y evitan el 
crecimiento de microorganismos patógenos por sus propiedades antagónicas. 
2.5.1 Clasificación de las BAL y géneros representativos. 
Según el criterio taxonómico genético hay 12 géneros de BAL que comprende Lactobacillus, 
Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, Vagococcus, 
Aerococcus, Alloicoccus, Tetragenococcus, Carnobacteriían y Weissella (Suarez-Murcia, 
2008). 
Las BAL pueden clasificarse por un criterio taxonómico fenotípico que incluye la apariencia 
morfológica en bacilos (Lactobacillus y Carnobacterium) y cocos (los demás géneros). La 
siguiente característica importante utilizada en la diferenciación de los géneros de las BAL 
es el modo de fermentación de la glucosa. Bajo estas condiciones se dividen en dos grupos 
(I) homofermentativas y (II) heterofermentativas (Halasz, 2009). 
2.5.1.1 Fermentación láctica homofermentativas 
Las bacterias homofermentativas poseen las enzimas aldolasa y hexosa isomerasa, pero 
carecen de fosfocetolasa. Se caracterizan por la capacidad de transformar la glucosa por la 
vía Embden–Meyerhof-Parnas (EMP), para producir dos moléculas de lactato por una 
molécula de glucosa. En algunos casos se transforma la fructosa para obtener ácido láctico, 
con producción nula o mínima de otros productos secundarios. Dentro de esta clasificación 
se encuentran los géneros Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus y Vagococcus (Ramírez, 
2005). 
 
El metabolismo homofermentativo se puede resumir en la siguiente reacción (Romero del 
Castillo, 2004): 
Lactosa + 4 H3PO4 + 4 ADP  4 Ácido láctico + 4 ATP + 3 H2O 
 
 
10 
 
2.5.1.2 Fermentación láctica heterofermentativa 
Las bacterias heterofermentativas no tienen fructosa-difosfato-aldolasa, pero tienen 
fosfocetolasa y por lo tanto degradan la glucosa por la vía llamada de pentosas fosfatos o de 
las hexosas fosfatos; a partir de las hexosas producen cantidades equimolares de ácido 
láctico, ácido acético, etanol, y dióxido de carbono (CO2), y degradan las pentosas para 
obtener ácido acético y ácido láctico. Dentro de este grupo se clasifican todas las especies 
de Leuconostoc, Weissella y Carnobacterium así como algunos del genero Lactobacillus 
(Ramírez, 2005). 
El metabolismo heterofermentativo se puede resumir en la siguiente reacción (Romero del 
Castillo, 2004): 
Lactosa + 2 H3PO4 + 2 ADP  2 Ácido láctico + 2 etanol + 2 CO2 + 2ATP + 2 H2O 
2.5.2 Métodos de identificación molecular de BAL 
Tradicionalmente las BAL han sido clasificadas con base en sus propiedades fenotípicas, por 
ejemplo, su morfología, modo de fermentación de la glucosa, temperatura de crecimiento, 
entre otros. Desafortunadamente, estos métodos no son muy precisos debido a la pobre 
reproducibilidad, tiempos extensos y que el potencial del genoma nunca es expresado, 
afectando a la fiabilidad de los métodos fenotípicos para la identificación del género o especie 
(Mohania y cols., 2008). 
El empleo de técnicas moleculares para la identificación de microorganismos, incluidas las 
BAL es una alternativa rápida y de mayor precisión (Forney y cols., 2004). 
El uso de marcadores moleculares, específicamente ADN ribosomal 16S, es útil para la 
identificación a nivel de especie y estimación de relaciones filogenéticas pues su función en 
la síntesis de proteínas no ha cambiado a través del tiempo en todos los procariotas y sobre 
todo por ser una región conservada a nivel evolutivo. A su vez el gen ARNr 16S es 
seleccionado para este fin 4 sobre los demás genes del operón rrn, dado que el ARNr 23S es 
altamente conservado y el ARNr 5S es muy pequeño (Vásquez., 2011) 
 
 
11 
Una amplia variedad de genes han sido utilizados como dianas moleculares en los estudios 
taxonómicos o de filogenia en las distintos géneros y distintas especies bacterianas, 
constituyendo el análisis del ARNr 16S el marcador inicial y en numerosas situaciones el 
marcador suficiente para realizar una identificación más precisa. 
El ARNr 16S es un polirribonucleótido codificado por el gen rrs o ADN ribosomal ARNr 
16S (ADN 16S) incluido en la subunidad 30S del ribosoma bacteriano. La secuencia del gen 
ARNr 16S presenta de forma aproximada 1.500 pb. 
En microbiología clínica la identificación molecular basada en ADNr 16S se utiliza 
fundamentalmente para bacterias cuya identificación mediante otro tipo de técnica resulta 
imposible, difícil o requiere mucho tiempo. 
En microbiología la identificación molecular basada en ADNr 16S se utiliza 
fundamentalmente para bacterias cuya identificación mediante otro tipo de técnica resulta 
imposible, difícil o requiere mucho tiempo. 
El método molecular de identificación bacteriana mediante secuenciación delADNr 16S 
incluye tres etapas (Rodicio y Mendoza, 2004): 
a) Amplificación por PCR del gen a partir de la muestra apropiada. 
b) Determinación de la secuencia de nucleótidos del producto de la PCR. 
 c) Análisis de la secuencia. 
2.5.2.1 Filogenia de las BAL 
Las verdaderas relaciones filogenéticas entre las bacterias se establecen mediante las 
comparaciones de las secuencias de ARN ribosomal (ARNr) (Woese, 1987). Los avances en 
las técnicas moleculares han encabezado los métodos de secuenciación de fragmentos largos 
de ARNr, primero mediante el uso de la transcriptasa inversa (Lane y cols., 1988) y por la 
secuenciación directa por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de los genes de ARNr. 
La comparación de las secuencias de los ARNr 16S (o de los genes que los codifican) permite 
establecer las relaciones filogenéticas existentes entre los organismos procariotas. Este hecho 
ha tenido una enorme repercusión en taxonomía bacteriana, dando lugar al sistema de 
 
 
12 
clasificación vigente y permitiendo la identificación rápida y precisa de las bacterias (Rodicio 
y Mendoza, 2004). 
Uno de los parámetros utilizados para caracterizar el genoma de las diferentes especies, es la 
composición global del ADN, entendida como el porcentaje de cada una de las bases 
presentes en la secuencia y expresada normalmente en porcentaje de guanina y citosina (G-
C). 
La determinación del porcentaje de G-C fue la primera técnica empleada para la clasificación 
taxonómica basada en el análisis de ADN, determinando el porcentaje de G-C con respecto 
a las bases totales. Normalmente en BAL es menor de 50%, aunque algunas especies de 
Lactobacillus tienen contenido mayores a 55% (García-Ibarra., 2007). 
Todas las bacterias ácido lácticas de importancia en el área de alimentos, por sus aplicaciones 
como cultivos iniciadores o probióticos, son miembros de la clase l Gram-positivos, y 
pertenecen al filo Actinobacteria con un contenido de alto de GC (Stackebrandt y cols., 
1988). 
2.6. Compuestos antimicrobianos producidos por BAL 
El efecto conservador de las BAL se debe a la producción de uno o más metabolitos activos, 
como ácidos orgánicos, diacetilo, acetoína, peróxido de hidrógeno, reuterina, reuterociclina, 
péptidos antifúngicos (propionato, fenil-lactato, hidroxifenil-lactato, dipéptidos cíclicos y 
ácidos grasos 3-hidroxi), bacteriocinas (nisina, reuterina, reutericyclin, pediocina, enterocina 
y otros) y sustancias inhibidoras similares a bacteriocinas (BLIS) (Helander y cols., 1997; 
Parra, 2010; Reis y cols., 2012). 
Han sido muchas las estrategias desarrolladas por la industria alimentaria para explotar 
convenientemente el potencial antimicrobiano de las bacterias lácticas en todas sus facetas. 
Actualmente, existe un creciente interés por la utilización de las bacteriocinas como agentes 
antimicrobianos. La producción de estas sustancias inhibitorias de naturaleza proteica parece 
ser un fenotipo muy extendido dentro de las bacterias lácticas y se ha establecido, en muchas 
ocasiones, su implicación directa en la inhibición específica de microorganismos patógenos 
y/o alterantes asociados a los alimentos (Martínez, 1996). 
 
 
 
13 
2.6.1 Bacteriocinas 
2.6.1.1 Características generales 
De entre todas estas sustancias antimicrobianas cabe destacar a las bacteriocinas, cuyo interés 
para la industria alimentaria se debe a que inhiben a bacterias alterantes y patógenas 
resistentes a algunos métodos de conservación tradicionales (como, por ejemplo, la 
refrigeración o la acidificación). Además, son compuestos muy atractivos desde el punto de 
vista tecnológico, dado que son efectivas a concentraciones muy bajas y no modifican las 
características organolépticas del producto (Reviriego, 2008). 
En la naturaleza existe una gran diversidad bacteriana y se estima que un 99% de las bacterias 
producen cuando menos una bacteriocina con características particulares (Tabla 1) (Dolz, 
2008). 
Dentro de las bacterias Gram positivas, las bacterias lácticas son un grupo especialmente rico 
en cepas productoras de bacteriocinas. Desde el descubrimiento de la nisina (Rogers, 1928) 
hasta nuestros días, se ha descrito la producción de bacteriocinas en organismos de todos los 
géneros de las bacterias lácticas. 
Las bacteriocinas de las BAL son péptidos que impiden el crecimiento de bacterias alterantes 
y/o patógenas en los alimentos, con la ventaja frente a los conservadores químicos, de ser 
proteínas que al biodegradarse no forman compuestos secundarios (Dolz, 2008). 
Las bacteriocinas son péptidos sintetizados por los ribosomas de las bacterias ácido lácticas, 
las cuales son inmunes a la cepa productora, debido a que sintetiza una molécula que la 
inmuniza contra la propia bacteriocina. La producción de ésta ocurre de forma natural durante 
la fase logarítmica del desarrollo bacteriano o al final de la misma, guardando relación directa 
con la biomasa producida (Feria, 2007), además se consideran compuestos termoestables, ya 
que algunas soportan hasta 121°C durante 15 minutos, son resistentes a la acción de proteasas 
y se consideran inocuas debido a su naturaleza peptídica, las bacteriocinas pueden ser 
degradadas por enzimas digestivas, resultando inocuas para el hombre y su microbiota 
intestinal. La bacteriocina nisina, producida por Lactococcus lactis, es considerada segura 
para el consumo humano (GRAS, del inglés Generally Reconized As Safe) de acuerdo a la 
Food and Drug Administration (FDA) de los EEUU, se sabe que no forman compuestos 
 
 
14 
secundarios al biodegradarse en el tracto gastrointestinal. (Mora y García., 2007; Cristóbal, 
2008; Heredia-Castro y cols., 2017). 
Tabla 1. Características generales de las bacteriocinas. 
Origen 
Origen ribosomal; péptidos extracelulares producidos por bacterias Gram positivas y 
Gram negativas. 
Efectos 
* In vitro: no tóxica para líneas celulares normales, y tóxicas para células cancerosas. 
*In vivo: no estimula el sistema inmune; no tóxico en modelos animales y humanos (se 
inactivan por proteasas digestivas) 
Espectro de acción 
*Pueden actuar contra bacterias Gram positivas y Gram negativas. 
*Algunas bacterias patógenas susceptibles son E. coli, L. monocytogenes, S. aureus, 
C. botulinum, Pseudomonas sp., E. fecalis, Salmonella sp. 
Mecanismo de acción 
*Permeabilización de la membrana (pérdida del potencial de membrana, consumo de 
reservas energéticas celulares, disminución en la síntesis de DNA, RNA y proteínas). 
*Lisis celular. 
Punto isoeléctrico De 8.1 a 10.0 
Sensibilidad a enzimas Todas son sensibles a las enzimas proteolíticas, tales como la pepsina, tripsina y pronasa. 
Sensibilidad a 
temperaturas Compuestos termoestables; la mayoría soporta 100-121ºC durante 15-30min. 
Sensibilidad a pH La mayoría son estables en el intervalo de pH de 3.0 a 9.0 
Adaptado de Heredia-Castro y cols., 2017. 
2.6.1.2 Clasificación de las bacteriocinas 
La familia de bacteriocinas incluye una amplia variedad de péptidos y proteínas en términos 
de su tamaño, objetivos microbianos y mecanismos de acción e inmunidad, se han reportado 
diversas clasificaciones para las bacteriocinas a través de los años, pero siempre se reportan 
dos grupos principales: lantibióticos y los no lantibióticos (Beshkova y cols., 2012). 
Cotter y cols. (2005) clasificó a las bacteriocinas en tres grandes grupos: 
• Clase I Lantibióticos: la constituyen péptidos catiónicos de 19 a 38 residuos de 
aminoácidos, los cuales sufren modificaciones postraduccionales y ejercen su efecto 
 
 
15 
a nivel de la membrana y la pared celular. Las modificaciones postraduccionales que 
se les realizan son diversas, las más importantes involucran reacciones de 
deshidratación de residuos de serina y treonina, lo que da lugar a la formación de 
dehidroalanina (DHA) y dehidrobutirina (DHB), respectivamente. 
La reacción de estos aminoácidos con el grupotiol (SH) de un residuo de cisteína, 
genera un enlace tioéter generando lantionina (en el caso de Dha) y ß-metil-lantionina 
(en el caso de Dhb). 
Los lantibióticos se producen en los ribosomas como un prepéptido, que experimenta 
una modificación postraduccional (Figura 1) extensa ´para formar un péptido activo 
(Beristain-Bauza y cols., 2012). 
 
Figura 1. Modificaciones postraduccionales de la lantionina y α-metil-lantionina 
(Adaptado de Beristain-Bauza y cols., 2012) 
 
La formación de estos enlaces dentro del péptido genera una serie de estructuras 
“globulares” que son características de los lantibióticos (Figura 2). 
 
 
16 
 
Figura 2. Estructura de diversas bacteriocinas de bacterias Gram positivas. Estructura globular de 
los lantibióticos nisina (A) y mersacidina (B) (adaptado de López y cols., 2008). 
• Clase II (no lantibióticos): está formada por bacteriocinas constituidas por 30 a 60 
residuos de aminoácidos no modificados, no contienen lantionina, son estables al 
calor y al pH e inducen la formación de poros en la membrana de las células blanco 
(Beristain-Bauza y cols., 2012). Estas bacteriocinas se dividen a su vez en las 
subclases IIa, IIb, IIc y IId. La subclase IIa es la más grande de todas, contienen uno 
o dos puentes disulfuro, además de que presentan una actividad específica en contra 
de la bacteria Listeria monocytogenes. La subclase IIb está formada por bacteriocinas 
que requieren de la acción combinada de dos péptidos para tener actividad, los cuales 
no muestran actividad inhibitoria de manera individual. Las bacteriocinas que 
conforman la subclase IIc, poseen una estructura cíclica como resultado de la unión 
covalente de sus extremos carboxilo y amino terminal. La subclase IId está formada 
por un grupo variable de péptidos lineales. 
 
• Clase III (termolabiles). Llamado también “bacteriolisinas” y son péptidos más 
grandes (30 kDa) y son lábiles al calor (Abriouel y cols., 2011). 
Las clasificaciones más recientes proponen la división de las bacteriocinas han sido 
agrupadas en cinco clases según varios criterios de clasificación, como, por ejemplo: 
 
 
17 
microorganismos productores, pesos moleculares, propiedades físicas, estructuras químicas, 
modo de acción, y características genéticas y bioquímicas (Balciunas y cols., 2013; Heredia-
Castro y cols., 2017). 
La clase I o lantibióticos son péptidos de muy bajo peso molecular (<5kDa), resistentes a 
altas temperaturas y con aminoácidos no comunes en su estructura, tales como lantionina, 
metillantionina, dehidroxilamina y dehidrobutirina. 
• Tipo A: Los lantibióticos pueden encontrarse en forma lineal, como en el caso de la 
nisina, subtilina y epidermina. 
• Tipo B: Los lantibióticos tienen forma globular, como el caso de la mersacidina. 
La clase II son péptidos pequeños termoestables (<10kDa). La clase II ha sido dividida en 
cinco subclases 
• Subclase IIa, son bacteriocinas que actúan fuertemente contra Listeria, siendo la 
pediocina PA-1 la más representativa. 
• Subclase IIb son bacteriocinas formadas por dos péptidos, como la plantaricina EF. 
• Subclase IIc se encuentran las bacteriocinas que no comparten homología con 
ninguna otra bacteriocina, por ejemplo, lactococcina A 
• Subclase IId, se encuentran péptidos lineales como la lacticina Q. 
• Subclase IIe se encuentran las bacteriocinas que se formaron por la degradación 
específica de proteínas más grandes. 
La clase III son péptidos termolábiles de alto peso molecular (>30 kDa), siendo la helveticina 
la bacteriocina representativa. La clase IV son péptidos grandes y de estructura compleja, ya 
que se encuentran asociados a carbohidratos (glicoproteínas) o lípidos (lipoproteínas), siendo 
la lactocina S una de las bacteriocinas de esta clase. Por último, en la clase V se encuentran 
los péptidos con una estructura circular que no posee modificaciones post traduccionales, 
siendo la enterocina AS-48 un ejemplo de esta clase. 
 
 
 
18 
2.6.1.3 Mecanismo de acción 
La mayoría de las bacteriocinas de las BAL inhiben el crecimiento de las bacterias mediante 
la formación de poros en la membrana celular (figura 3), lo cual se inicia con la atracción de 
las bacteriocinas hacia la bacteria diana a través de fuerzas electrostáticas, debido a que las 
bacteriocinas están cargadas positivamente e interactúan con los fosfolípidos de la membrana 
de las bacterias que se encuentran cargadas negativamente. Además, la naturaleza anfipática 
de las bacteriocinas facilita aún más su distribución a lo largo de la superficie de la membrana 
celular de la bacteria (Cotter y cols., 2005). En la figura 3, se observan los diferentes 
mecanismos de acción. Las bacteriocinas de clase I pueden penetrar directamente en la 
membrana celular afectando la integridad de las células. Algunas de la clase I interactúan con 
el lípido II e inhiben la síntesis de la pared celular. Las moléculas de clase II se unen al 
receptor formador de poros como el sistema de fosfotransferasa de Manosa e inducen la 
formación de poros. Como algunas moléculas de clase II son anfifílicas por naturaleza 
pueden penetrar en la membrana celular afectando la integridad de las células. Las moléculas 
de clase III inducen directamente la lisis celular al afectar la pared celular. 
2.6.1.4 Aislamiento y purificación de bacteriocinas. 
Las bacteriocinas producidas por BAL se han estudiado ampliamente en los últimos años, 
sin embargo, hay relativamente pocos estudios que describen su estructura química debido a 
los desafíos asociados con la purificación de estos péptidos antimicrobianos. 
Se han propuesto varias estrategias para la purificación de bacteriocinas de caldos de cultivo 
complejos, utilizando sus características catiónicas e hidrofóbicas (Parada y cols., 2007), 
pero los métodos habituales para la extracción de bacteriocinas se basan en su afinidad por 
los disolventes orgánicos, su variación en la solubilidad en soluciones salinas concentradas 
y en el pH. La presencia de regiones hidrofóbicas en moléculas de bacteriocina es esencial 
para su actividad contra bacterias sensibles, ya que la inactivación de microorganismos por 
bacteriocinas depende de la interacción hidrofóbica entre las células bacterianas y las 
moléculas de bacteriocina (Parada y cols., 2007). 
 
 
 
19 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Mecanismo de acción de varias clases de bacteriocina (adaptado de Nigam y cols., 2014). 
El primer paso requerido para la purificación es la concentración del sobrenadante libre de 
células con ello se reduce el volumen y recuperar las bacteriocinas del sobrenadante, 
asumiendo un proceso de producción de bacteriocinas optimizado (Rojas y cols., 2008), por 
ejemplo las condiciones de incubación, como son la temperatura y el pH, así como la 
composición del medio ya que generalmente los medios complejos que contienen una fuente 
rica en nitrógeno son óptimos para el aumento de producción de bacteriocinas (Monroy y 
cols., 2009). Después de llevar a cabo el proceso de concentración y con ello conseguir la 
producción necesaria, se remueven las células por centrifugación y se precipita la proteína 
mediante diversos métodos i) filtración por diálisis, ii) ultrafiltración, iii) mediante la 
precipitación de sales (por ejemplo, sales de amonio) iv) precipitación por solventes 
orgánicos como el butanol o el etanol (Cintas y cols., 2001). 
Otro procedimiento está basado en la naturaleza catiónica de las bacteriocinas y su capacidad 
de adsorber de forma reversible y no específica a las células inactivadas por calor de bacterias 
Gram-positivas, el método consiste en cultivar la cepa productora en un fermentador en 
condiciones óptimas para la producción de bacteriocina y posterior inactivación de las 
células. Posteriormente el pH del cultivo se ajusta a 6.0 para permitir la adsorción de 
 
 
20 
bacteriocina y las células se cosechan y resuspenden en una soluciónsalina pH 2,0 para 
permitir la des-adsorción de las bacteriocinas de las células. La suspensión de bacteriocina, 
se concentra por liofilización y posteriormente enviado a alta presión de fase inversa 
cromatografía líquida (HPLC) la nisina y pediocina PA-1 (Yang y cols., 1992; Cintas y cols., 
2001; Deegan y cols., 2006; Simha y cols., 2012). 
2.7 Importancia en la industria alimentaria 
Las bacteriocinas cumplen un rol inhibitorio contra microorganismos patógenos presentes en 
los alimentos, además de presentar una amplia estabilidad térmica y ser activas en amplios 
intervalos de pH (Huanquilef., 2010), además debido a que son producidas por BAL son de 
gran interés en la industria alimentaria, ya que son compuestos GRAS y pueden ser usadas 
como bioconservadores, especialmente. Además, se han considerado dos importantes 
estrategias para la aplicación de las bacteriocinas en alimentos: una es la inoculación en el 
alimento de bacterias ácido lácticas que producen bacteriocinas en el alimento, y la otra es la 
adición directa de la bacteriocina purificada o semipurificada. Por ejemplo, plantaricina C 
producida por Lactobacillus plantarum, presenta actividad contra especies de Enterococcus, 
Streptococcus, Staphylococcus carnosus, Bacillus spp, Clostridium spp, pero no es activa 
contra Listeria innocua. La acidocina A de Lactobacillus acidophilus es activa contra 
especies de Enterococcus, Streptococcus y Listeria monocytogenes, pero no presenta 
actividad contra Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus (Cristóbal., 2008). 
Se ha demostrado que por sí sola, las bacteriocinas en un alimento no garantizan la seguridad 
completa, entonces, el uso de estás debe combinarse con otras tecnologías que puedan alterar 
la membrana celular para que los compuestos antimicrobianos puedan inhibir a las bacterias 
patógenas. Por ejemplo, el uso de tratamientos no térmicos como el campo eléctrico pulsado 
(PEF) es ventajoso ya que no tiene ningún efecto sobre la funcionalidad de los alimentos y 
las cualidades nutricionales. Esta técnica puede no ser financieramente viable cuando se usa 
solo, pero en niveles más bajos y combinado con otros tratamientos, como las bacteriocinas, 
puede ser altamente efectivo; además de poder combinarse con otros compuestos 
antimicrobianos como el acetato de sodio y lactato de sodio que resulta en una mayor 
inactivación de las bacterias (Zacharof y cols.,2012). 
 
 
 
21 
 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
La tendencia de consumir productos más frescos y lo más parecido a su forma natural ha 
aumentado en los últimos años, ya que el consumo de conservadores químicos se ha asociado 
a intoxicaciones, cáncer y otras enfermedades degenerativas. Esto genera la necesidad de 
buscar bioconservadores que cubran las demandas del consumidor, y proporcionen 
propiedades antimicrobianas similares a los conservadores químicos, sin poner en riesgo la 
inocuidad de los alimentos y la salud del consumidor. 
 
Actualmente las líneas de investigación en esta área se van ampliando en todo el mundo; tal 
es el caso de algunos investigadores mexicanos que han optado por aislar péptidos 
antimicrobianos a partir de insectos con el fin de identificar y aislar algún péptido 
antimicrobiano que sea óptimo para su uso terapéutico en humanos y animales (Rivas-
Santiago y cols., 2006), por lo que la mayor parte de los estudios conocidos sobre la acción 
antimicrobiana de insectos comestibles están orientados al área farmacéutica usados como 
sustitutos de antibióticos dejando así el estudio de conservadores de alimentos muy limitado 
en cuanto información. 
Además, no existen en la bibliografía trabajos relacionados con la caracterización de 
compuestos antimicrobianos (bacteriocinas) producidos por BAL de fuentes diferentes a los 
alimentos fermentados, por lo que es importantes la búsqueda de BAL de nichos diferentes, 
como pueden ser los insectos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
4. HIPOTESIS: 
Si los extractos neutros obtenidos a partir de las BAL aisladas de insectos comestibles 
producen actividad antimicrobiana, son estables a diferentes factores como pH, y 
temperatura; y son de origen proteico, entonces se puede considerar que el efecto inhibitorio 
es producido por un compuesto antimicrobiano tipo bacteriocina “BLIS”. 
5. OBJETIVOS: 
5.1 Objetivo general: 
Determinar las características bioquímicas del compuesto antimicrobiano tipo bacteriocina 
producido por bacterias ácido lácticas asiladas de insectos listos para el consumo. 
5.2 Objetivos específicos 
1. Identificar bacterias ácido lácticas con actividad antagónica aisladas de insectos. 
2. Obtener los extractos crudos de las diferentes cepas que presentan actividad 
antimicrobiana. 
3. Determinar el espectro antimicrobiano de los extractos contra las diferentes cepas 
patógenas y de deterioro 
4. Obtener la actividad específica de los extractos crudos. 
5. Determinar la estabilidad de los extractos crudos a diferentes factores como 
temperaturas, pH´s, y proteasas. 
6. Realizar una cinética microbiana para tratamiento térmico, cambio de pH y proteasas. 
7. Obtener un extracto semi-purificado y determinar mediante la técnica tricine-SDS-
PAGE el peso molecular del compuesto antimicrobiano. 
 
 
 
 
 
 
 
 
23 
 
6. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Diagrama General. 
 
 
 
 
Identificación 
molecular de BAL 
antagónica 
Electroforesis Tricine-SDS-PAGE 
Aislamiento de BAL a partir de insectos 
Pruebas de actividad antagónica 
Cepas patógenas/ 
deterioro 
Obtención del extracto crudo libre de células 
Espectro 
antimicrobiano 
Estabilidad de los compuestos 
antimicrobianos 
Tratamientos con 
proteasas 
Tratamientos en diferentes pH´s 
compuestos antimicrobianos 
Termoestabilidad 
Cinética microbiana 
Semi-purificación del extracto crudo 
 
 
24 
 
6.1 Obtención de muestras de insectos 
Se utilizaron insectos endémicos de México listos para el consumo como: chapulines 
(Sphenarium purpurascens) en el quinto estado de ninfa (CP) y adultos (CG); chicatanas 
(Atta mexicana), jumiles (Euschistus taxcoensis), gusanos de maguey rojo (Comadia 
redtenbacher) y gusano de maguey blanco (Acentrocneme hesperiaris). Todas las muestras 
fueron compradas en el mercado de carnes exóticas de San Juan, localizado en la Ciudad de 
México. Las muestras se mantuvieron en refrigeración hasta su uso. 
6.2 Preparación y dilución de muestras 
Se utilizó la metodología descrita por la NOM-110-SSA1-1994 con algunas modificaciones. 
Se pesó 3 g de cada uno de los insectos a analizar en una bolsa Ziploc y se adicionaron 27 
mL de solución salina isotónica (SSI) al 0.85% y se agitó en el homogeneizador peristáltico 
(Stomacher® 400 Circulator, E.U.A.) de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensión 
completa y homogénea. Se realizaron diluciones seriadas (10-1 a 10-5) de las cuales se 
inocularon 100 μL en agar MRS al 1.5% (p/v) y se incubó a 37 °C durante 24 h, para su 
posterior aislamiento. 
6.3 Aislamiento de BAL a partir de insectos 
Se seleccionaron las colonias que presentaban morfologías diferentes, y fueron inoculadas 
en caldo MRS para su propagación e incubadas a 37 °C durante 24 h. Posteriormente se 
sembraron mediante un estriado por agotamiento en agar MRS 1.5% (p/v) para comprobar 
homogeneidad y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Finalmente se les realizó tinción de Gram 
y se realizaron conservas. 
6.4 Conservas de BAL aisladas de insectos 
Las cepas previamente aisladas, fueron cultivadas en MRS a 37 °C durante 24 h, 
posteriormente se centrifugaron a 4000 rpm durante 15 minutos, repitiendo este 
procedimiento hasta obtener un pellet completamente blanco (eliminando en cada lavado el 
sobrenadante y re-suspendiendo el pellet en SSI). Finalmente, el pellet se resuspendió en 1 
 
 
25 
mL de medio MRS con 20% de glicerol, en un criovial de 1.5 mL estéril y seconservó en un 
ultracongelador a -80°C. 
6.5 Cepas patógenas y de deterioro en alimentos utilizadas para la prueba de actividad 
antagónica y espectro antimicrobiano 
Las cepas sensibles fueron obtenidas de la colección de cepas del Laboratorio 132, Edificio 
S, de la Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, las cuales fueron: Bacillus 
cereus, Listeria monocytogenes 88, Listeria innocua ATCC33090, Pediococcus 
pentosaceus, Weissella viridescens j1, Weissella viridescens, Lactobacillus sakei 5.4, 
Listeria monocytogenes LMB 911204/47, Listeria monocytogenes Scott A, Weissella 
viridescens sk, Micrococcus luteus. Todas las cepas sensibles fueron cultivadas en caldo TSB 
(tripticaseína soya) a 37 °C durante 18 h. 
6.6 Pruebas de actividad antagónica 
A la mitad de una caja de agar MRS al 1.5% (p/v) se inoculó en línea vertical (Figura 5) la 
cepa en estudio (obtenida del punto 6.4) y se incubó a 37 °C durante 24 h. Después del tiempo 
de incubación, en forma horizontal fueron sembradas cada una de las cepas sensibles 
(mencionadas en el punto 6.5) y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Una prueba positiva se 
observa como la inhibición parcial de la cepa sensible, a partir de este punto únicamente se 
trabajó con aquellas que dieron positivo a la prueba. 
 
Figura 5. Ejemplo de la prueba de actividad antagónica 
 
 
26 
 
 
6.7 Obtención del extracto libre de células a pH neutro 
Se realizó el crecimiento de las cepas seleccionadas en las pruebas antagónicas en 10 mL de 
caldo MRS y fueron incubadas a 37 °C durante 18 h. Posteriormente se centrifugaron a 4000 
rpm durante 10 minutos, y se recuperó el sobrenadante por decantación, el cual fue 
fraccionado en dos alícuotas: la primera se dejó en el pH obtenido de la fermentación y en la 
segunda se ajustó el pH entre 6.5 y 7.0 utilizando NaOH 0.1 M (Álvarez-Cisneros y cols., 
2010). Finalmente, se esterilizaron las diferentes fracciones por filtración utilizando 
membranas de poro de 0.22 𝜇m (Millipore, Darmstad, Alemania) y fueron almacenadas en 
refrigeración hasta su uso. El extracto libre de células estéril fue etiquetado como EC. 
6.8 Espectro antimicrobiano. 
Se utilizó la metodología descrita de actividad antimicrobiana reportada por Álvarez-
Cisneros y cols. (2010) con algunas modificaciones. En placas con agar TSB al 1.5% (p/v) 
se vertió agar TSB al 0.8% (p/v) inoculado previamente con 75 µL la cepa sensible (con una 
densidad óptica de 0.2 nm). Una vez que el agar solidificó, se realizaron pozos en los cuales 
se colocaron 75 µL de los EC. Se analizaron dos tipos de extractos: uno con pH neutro y otro 
con el pH ácido obtenido al término de la fermentación. Se incubó a 37 °C durante 18 h y 
posteriormente se revisó la formación del halo de inhibición. Los resultados fueron 
reportados como mm de inhibición/mL de extracto. Por otra parte, se determinó la actividad 
específica en mm de inhibición/µg de proteína en el extracto crudo. Los EC con pH neutro 
obtenido a partir de cepas que lograron inhibir a las bacterias sensibles, fueron conservados 
para posteriores pruebas. Para las posteriores pruebas de actividad, se utilizará como 
microorganismo sensible, aquel que presente mayor inhibición en el espectro antimicrobiano. 
6.9 Cuantificación de proteína 
La concentración de proteína de cada uno de los extractos obtenidos (pH neutro y pH ácido) 
se cuantifico con el método de Bradford utilizando un lector de placas (Synergy HT). 
Previamente se realizó una curva tipo utilizando albúmina de suero bovino (BSA) con una 
 
 
27 
concentración de 200 µg/mL. Una vez preparada esta solución se realizaron diluciones de 
10, y se obtuvo la correlación entre la concentración de BSA y absorbancia. 
6.10 Identificación molecular de BAL antagónica. 
La identificación molecular se realizó únicamente para las cepas productoras seleccionadas 
en el apartado anterior. La extracción de ADN se realizó a partir de un cultivo de 24h de la 
cepa de interés utilizando el kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega, E.U.A) y 
siguiendo las recomendaciones del proveedor. Posteriormente, el ADN fue visualizado en 
una electroforesis en gel de agarosa al 0.8% (p/v) para verificar la integridad y fue utilizado 
como molde para amplificar el ADNr 16S con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, 
por sus siglas en inglés) de acuerdo a García-Cano y cols., (2014). Los primers utilizados 
fueron: fD1 (forward) 5´CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG´3 y 
rD1 (reverse) 5´CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC´3. Para cada 
mezcla de reacción de 25 µL de PCR se utilizaron: 100 ng de ADN, 2.5 U de Pfu DNA 
polimerasa (Thermo Scientific), 0.4 mM de cada cebador, 2 mM de DNTP´s y 2.5 mM de 
MgSO4. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador (Eppendorf, 
Mastercycler, Hamburgo Alemania) con las siguientes condiciones: 1 ciclo a 94°C por 5 min, 
seguido por 35 ciclos a 95°C por 2 min, 42°C 30 seg, 72°C por 4 min y un ciclo final de 10 
minutos a 72°C. 
Terminando la reacción se corrió un gel de agarosa al 1% (p/v) para comprobar la 
amplificación del fragmento ribosomal de 1500 pb. Posteriormente se cortó la banda de 
interés y se purificó de acuerdo al manual GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Fisher 
Scientific, Massachusetts, E.U.A). 
6.10.1 Secuenciación y comparación de bases de datos 
El producto obtenido de la purificación fue secuenciado en el Laboratorio Divisional de 
Biología Molecular de la DCBS de la UAM-Iztapalapa. 
Una vez obtenidas las secuencias, se realizó un análisis mediante BLAST, el cual realiza 
comparaciones entre secuencias de ADNr 16S con las depositadas en bases de datos. Para 
este análisis se utilizó la base de datos de NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). El 
programa BLAST (blastn, “somewhat similar sequences”) despliega diferentes 
 
 
28 
alineamientos entre las secuencias introducidas y las contenidas en las bases de datos y las 
ordena de forma esquemática, representando el grado de similitud genético entre las bacterias 
comparadas. 
6.11 Estabilidad de compuestos antimicrobianos 
6.11.1 Tratamiento con proteasas. 
El objetivo de este tratamiento es conocer si el compuesto antimicrobiano presente en los 
extractos crudos es de tipo peptídico (característica principal de una bacteriocina), para lo 
cual, los EC neutros obtenidos en el apartado 6.7 fueron incubados a 37 °C con dos tipos de 
proteasas (tripsina y proteinasa K) a una concentracion de 5 mg/mL y se realizó un control 
negativo (sin enzima). Se tomaron muestras a los 30 y 60 minutos, y posteriormente los 
tratamientos se calentaron a 70 °C durante 30 minutos para inhibir la actividad enzimatica. 
Finalmente se llevo a cabo la prueba de actividad antimicrobiana (apartado 6.8) para conocer 
el efecto que tienen las proteasas sobre la actividad antimicrobiana. 
 
6.11.2 Tratamiento en diferentes pHs. 
El objetivo de este tratamiento es conocer la estabilidad del compuesto antimicrobiano 
presente en los extractos crudos ante diferentes condiciones de pH. Para esta prueba se trabajó 
con la técnica decrita por Furtado y cols., 2013 con algunas modificaciones. El pH fue 
ajustado a 3.0, 5.0, 7.0 y 8.0 con HCL 1.0 M y NaOH 1.0 M, en 10 mL de extracto libre de 
celulas. Posteriormente todos los tratamientos se esterilizaron por filtración con membranas 
de 0.22 𝜇m (Millipore, Darmstad, Alemania). Finalmente se incubaron a 37 °C durante 1 
hora y se determinó la actividad antimicrobiana con los diferentes extractos (apartado 6.8). 
Los datos obtenidos fueron analizados mediante un analisis estadistica ANOVA y una 
comparación de medias por Tukey para verificar si existen diferencias significativos entre 
los distintos tratamientos de pH. 
 
 
 
 
 
 
 
29 
6.11.3 Termoestabilidad. 
Una vez que se determinó el pH óptimo de cada uno de los diferentes extractos, se evaluó la 
estabilidad a diferentes condiciones de temperatura(37, 70 y 100°C) en diferentes intervalos 
de tiempo (15, 30 y 60 minutos). Por otra parte se evaluó el efecto de la refrigeración (4°C y 
10°C) y congelación (-20°C) durante 24 horas. Como control se utilizó el extracto sin 
tratamientos de temperatura (temperatura ambiente). Después del tratamiento térmico se 
determinó la actividad específica descrita en el punto 6.8. 
Los datos obtenidos fueron analizados mediante un analisis estadistica ANOVA y una 
comparación de medias por Tukey para verificar si existen diferencias significativos entre 
los distintos tratamientos de térmicos. 
6.12 Cinética microbiana. 
Se inocularon 20 mL de un cultivo de las cepas aisladas y seleccionadas en el apartado 5.7 
en 180 mL de caldo MRS y se incubó a 37 °C con agitación constante de 150 rpm durante 
18 h. Se tomaron alícuotas de 10 mL del cultivo cada 2 h y se determinaron las siguientes 
variables: crecimiento bacteriano (absorbancia a 600 nm), pH del cultivo y actividad 
antimicrobiana del EC neutro (mm inhibición/ mL extracto) de acuerdo al apartado 6.8. 
6.13 Semi-purificación del extracto crudo 
Se utilizó la metodología descrita por Chung y cols. (2011) con ciertas modificaciones. Las 
cepas en estudio fueron incubadas en 10 mL de caldo MRS a 37 °C durante 24 h, a cada 
extracto crudo (sin neutralizar) se le añadieron 3 volúmenes de acetona fría -20ºC (30 mL) y 
esta mezcla fue almacena durante 2 horas a -20°C. La fase líquida y la precipitada fueron 
separadas por centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos. La fase líquida fue concentrada 
en un rotavapor (Hahn Vapor, Korea) a 65 °C durante 15 minutos para eliminar la acetona. 
El precipitado fue secado a 70 °C durante 20 minutos en un horno (Felisa, México) y 
posteriormente de disolvió en 500 µL de agua estéril. Se determinó la actividad 
antimicrobiana de acuerdo al apartado 6.8 de todas las etapas de semipurificación y se calculó 
el rendimiento de la extracción. Únicamente se continuará trabajando con las fracciones que 
presenten actividad antimicrobiana. 
 
 
 
30 
6.14 Electroforesis Tricine-SDS-PAGE 
Para esta prueba se usó la técnica empleada por Haider y cols. (2012) con algunas 
modificaciones. Se preparó un gel separador de 17% y un gel concentrador del 4% (tabla 2). 
Las muestras se prepararon de la siguiente forma: 15µL de buffer de carga 2X (100 mM Tris-
HCl (pH 6.8), 1% SDS, 4% 2-mercaptoetanol, 0.02% de azul de Coomassie y 24% de 
glicerol) y 15µL de la muestra obtenida en el apartado 6.13. Todas las muestras y el control 
se calentaron a 90 °C durante 5 min y se utilizó un marcador de polipéptidos SDS-PAGE 
(Bio-Rad, E.U.A). 
Tabla 2. Protocolo para la preparación de geles de poli-acrilamida 
Porcentaje de 
acrilamida en el gel 
Solución de 
Acrilamida/bis-
acrilamida 29:1 30% 
(p/v) (mL) 
Buffer Tris 
2.5 M 
(pH 8.8) 
(mL) 
Agua 
destilada 
(mL) 
TEMED 
(µL) 
APS 30 
mg/mL 
(µL) 
Gel separador 17 5.60 4.60 0.00 6.00 100.00 
Gel concentrador 4 0.66 0.76 3.42 5.00 150.00 
 
Se colocó el gel de acrilamida en una cámara de electroforesis vertical (Mini-Protean 3Cell, 
Bio-Rad, California, E.U.A.) que contiene el amortiguador de corrida 1X (25 mM Tris, 25 
mM Tricina, 0.05% (p/v) SDS). Los diferentes tratamientos fueron inyectados en los 
diferentes pozos del gel, y la corrida se llevó a cabo a un voltaje de 80 V durante 240 minutos. 
Posteriormente el gel se dividió en dos mitades, una mitad se utilizó para identificar la banda 
del péptido con actividad antimicrobiana (Álvarez-Cisneros y cols., 2010); para lo cual se 
colocó el gel en una solución re-naturalizante (Tris-HCl 100 mM (pH 8), 1% (v/v) Tritón X-
100) por 18 h a temperatura ambiente, posteriormente se le realizaron 3 lavados con agua 
estéril y finalmente se realizó la técnica de difusión (apartado 6.8). La segunda parte del gel 
se colocó en una solución fijadora (10 % y 30 % metanol) durante 20 minutos, después se 
pasó a una solución teñidora (0.025 g de azul de coomassie en 100 mL de una solución de 
ácido acético al 10 %) durante 30 minutos y finalmente se dejó en una solución desteñidora 
(10 % de ácido acético) hasta que se visualizaran las bandas en el gel. 
 
 
31 
Finalmente, ambos geles (actividad y tinción) son comparados y analizados en un 
fotodocumentador (Gel-Doc. RT, CA, E.U.A.) con la ayuda del software Image Lab (Bio-
Rad, CA, E.U.A.). 
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
7.1 Pruebas de actividad antagónica. 
Se aislaron un total de 40 BAL de los diferentes insectos listos para consumo, de los cuales 
se realizaron pruebas antagónicas contra 22 cepas patógenas o deteriorantes. En la tabla 3 se 
observan únicamente los resultados de las BAL aisladas a partir de hormigas, chapulines 
pequeños, jumiles y gusanos de maguey que presentaron antagonismo por lo menos contra 
una cepa sensible. Las cepas en las que se observó inhibición parcial o total fueron: Listeria, 
Salmonella thyphi, Escherichia coli, Enterococcus sp., Bacillus sp., Micrococcus luteus y 
algunas BAL, sin embargo, la inhibición puede deberse a diferentes metabolitos excretados 
por las BAL, principalmente ácidos orgánicos como el ácido láctico o el ácido acético, los 
cuales tienen un amplio espectro y pueden inhibir tanto cepas Gram positivas como Gram 
negativas. La fermentación de azúcares, seguido de una disminución en el pH debido a la 
producción de ácidos orgánicos como el ácido láctico, es un factor importante para la 
inhibición del crecimiento de microorganismos patógenos, debido a que el pH bajo produce 
que los ácidos orgánicos puedan atravesar la membrana celular y alcanzar el citoplasma. 
(Parada y cols., 2007; Serna-Cock y cols., 2013). 
7.2 Cuantificación de proteína. 
La curva tipo obtenida está representada con la ecuación de la recta Absorbancia= 
[Concentración de proteína]*0.00939+0.047, con una regresión lineal de 0.98 (Gráfico 1). 
La cuantificación de proteína, solo se determinó en los extractos que dieron positivo a la 
prueba de actividad antimicrobiana (tablas 4 y 5). 
 
 
32 
 
Gráfico 1. Curva tipo para cuantificación de proteína.(Método Bradford)
 
 33 
Tabla 3. Pruebas de antagonismo de las cepas aisladas de insectos contra cepas patógenas y de deterioro. 
*Cepas proporcionadas por la Dra.Edith Ponce del área de Bioquímica de Macromoléculas 
+++ Inhibición total; ++ Inhibición parcial; -- Inhibición negativa 
 
Cepas patógenas/ Deterioro* 
Cepas productoras del compuesto antimicrobiano 
Jumil 1 Jumil 2 Jumil 3 Jumil 5 Gusanos de maguey Hormigas Chapulines pequeños 
Lactobacillus casei -- ++ ++ -- ++ ++ 
Listeria monocytogenes LM82 -- -- ++ -- ++ ++ ++ 
Weisella viridescens UAM-MGS1 ++ -- -- ++ ++ ++ -- 
Bacillus cereus -- ++ +++ +++ ++ +++ ++ 
Listeria monocytogenes LMB911204/47 -- -- -- -- +++ ++ ++ 
Salmonella thyphimorium -- -- -- -- ++ +++ ++ 
Listeria monocytogenes L88 -- -- -- ++ ++ +++ ++ 
Listeria innocua ATCC33090 -- -- -- ++ ++ ++ -- 
Enterococcus faecium UAM-MGS1 -- -- -- -- ++ +++ -- 
Listeria monocytogenes Scott A -- -- -- ++ ++ ++ -- 
Lactobacillus sakei UAM-MGCE1 -- -- -- -- ++ ++ ++ 
Clostridium sporogenes -- -- -- ++ ++ +++ -- 
Lactobacillus sakei UAM-MGS1 -- -- +++ -- ++ +++ ++ 
Pediococcus pentosaceus +++ -- -- ++ +++ ++ ++ 
Lactobacillus curvatus UAM-MGS1 -- -- ++ -- ++ ++ ++ 
Weissella viridescens UAM-MGS2 -- -- +++ ++ ++ ++ -- 
Lactobacillus sakei UAM-MGJP1 -- -- -- ++ ++ ++ -- 
Escherichia coli JM P101 -- -- -- ++ ++ ++ -- 
Weissella viridescens UAM-MGJP1 -- -- -- ++ +++ ++ ++ 
Micrococcus luteus +++ +++ -- +++ +++ +++ -- 
Staphylococcus aureus -- -- -- ++ -- -- -- 
 
 
34 
7.3 Pruebas de espectro antimicrobiano. 
Se determinó la actividad antimicrobiana de siete diferentes extractos obtenidos a partir de 
las BAL seleccionadas en el apartado 7.1 contra las cepas patógenas y de deterioro, de las 
cuales únicamente dos cepas presentaron inhibición a pH neutro, y fueron etiquetadas de 
acuerdoal insecto del que fueron aisladas como: H de hormigas chicatanas y CP de 
chapulines pequeños. En las tablas 4 y 5 se muestran los resultados de actividad 
antimicrobiana, cuantificación de proteína y actividad específica de los extractos obtenidos 
de las cepas H y CP. 
El extracto neutro obtenido de la cepa CP sólo presenta actividad antimicrobiana contra las 
cepas sensibles Bacillus cereus, Listeria monocytogenes 88, Listeria innocua y algunas BAL 
(Pediococcus pentosaceus y Weissella viridescens), por lo que se puede decir que presenta 
un espectro antimicrobiano reducido (tabla 4). 
 
Tabla 4. Pruebas de actividad antimicrobiana, cuantificación de proteína y actividad 
específica para los extractos crudos obtenidos de la cepa aislada de chapulines pequeños 
(CP). 
pH 
Cepas 
sensibles 
mm de inhibición 
Determinación de 
proteína 
Actividad 
especifica 
Promedio 
mm/75 µL 
Desviación 
Estándar. 
mm de 
inhibición/mL 
Promedio 
(µg/mL) 
Desviación 
Estándar. 
 mm de 
inhibición/
µg de 
proteína 
.N
eu
tro
 
Bacillus cereus 4.250 1.061 56.667 
307.879 7.4 
0.184 
Listeria 
monocytogenes 
88 4.500 0.707 60.000 0.195 
Listeria innocua 1.250 0.354 16.667 0.054 
Pediococcus 
pentosaceus 4.250 0.389 56.667 0.184 
Weissella 
viridescens j1 4.750 0.354 63.333 0.206 
 
En la tabla 5 se observa que el extracto neutro de la cepa H aislada de hormigas presentó el 
mayor espectro antimicrobiano entre las cepas en estudio. El extracto presentó inhibición 
contra 3 cepas de Listeria monocytogenes (47, 88 y Scott A) y diferentes géneros de bacterias 
 
 
35 
Gram-positivas (Pediococcus pentosaceus, Weissella viridescens, Micrococcus luteus y 
Bacillus cereus). 
 
Tabla 5. Pruebas de actividad antimicrobiana, cuantificación de proteína y actividad 
específica para los extractos crudos obtenidos de la cepa H aislada de hormigas chicatanas. 
pH Cepas sensibles 
mm de inhibición 
Determinación de 
proteína 
Actividad 
especifica 
Promedio 
mm/75 µL 
Desviación 
estándar 
mm de 
inhibició
n/mL 
Promedi
o 
(µg/mL) 
Desviación 
estándar. 
 mm de 
inhibición/µ
g de 
proteína 
N
eu
tro
 
Bacillus cereus 2.250 0.354 30.000 
133.660 10.223 
0.224 
Listeria monocytogenes 
47 1.000 0.000 13.333 0.100 
Listeria monocytogenes 
88 3.500 0.707 46.667 0.349 
Listeria innocua 1.250 0.354 16.667 0.125 
Listeria monocytogenes 
Scott A 2.250 0.354 30.000 0.224 
Pediococcus 
pentosaceus 2.000 0.000 26.667 0.200 
Weissella viridescens sk. 1.000 0.000 13.333 0.100 
Weissella viridescens j1 3.25 0.354 43.333 0.324 
Micrococcus luteus 1.500 0.000 20.000 0.150 
 
Bacillus cereus se ha aislado de alimentos, incluyendo vegetales frescos y vegetales 
mínimamente procesados, cereales y derivados (principalmente arroz), especias, leche cruda 
y pasterizada, derivados lácteos, carnes (crudas y derivados) y alimentos como miel, entre 
otros (Instituto Nacional de Salud, 2011). Algunos conservadores químicos como el sorbato 
de potasio en concentraciones de 0.2% (p/v) (Thomas y cols., 1993), y ácido ascórbico 
combinado con ácido cítrico o ácido láctico con pH 5.0 son utilizados en la industria para 
inhibir las esporas de B. cereus (De la Torre y cols., 2001). Se sabe que las producciones de 
ácido láctico por parte de las BAL tienen un efecto negativo en el crecimiento de B. cereus 
(Correa y cols., 2016). Los resultados obtenidos para ambos extractos indican que la cepa 
puede ser inhibido por la presencia de ácido láctico, pero la actividad se mantiene después 
 
 
36 
de neutralizar los extractos, aunque es un efecto inhibitorio menor, lo que puede indicar que 
las cepas en estudio producen algún tipo de metabolito diferente a los ácidos orgánicos. 
Por otra parte, el extracto también presenta actividad antimicrobiana contra Listeria 
monocytogenes, la cual es considerada la única especie patógena para el hombre de todas las 
especies en que se divide su género (Listeria monocytogenes L. ivanovii, L. innocua, L. 
welshimeri, L. seeligeri, y L. grayi) (Schöbitz y cols., 2009). La principal vía de adquisición 
de Listeria monocytogenes es el consumo de alimentos contaminados, pudiendo ocasionar 
cuadros clínicos muy graves como septicemia, meningitis y gastroenteritis, especialmente en 
niños, individuos inmunocomprometidos y de la tercera edad, y aborto en mujeres 
embarazadas (Vera y cols., 2013). La tasa de incidencia es de 4 a 8 casos por cada 1,000,000 
de personas, la tasa de mortalidad está entre 20 y 30% en pacientes hospitalizados; es una 
mortalidad elevada en comparación con otras enfermedades transmitidas por alimentos. 
(FAO, 2000; Torres y cols., 2004, Romero., 2017). En 2012, se reportaron 1,642 casos 
humanos confirmados de Listeriosis, un aumento del 10,5% en comparación con el 2011. La 
tasa de notificación en la Unión Europea (UE) fue de 0,41 casos por 100,000 habitantes, con 
las tasas más altas de notificación observadas en Finlandia, España y Dinamarca (1,13, 0,93 
y 0,90 casos por cada 100.000 habitantes, respectivamente). La tasa de notificación más baja 
se registró en Rumanía (0,05 casos por cada 100,000 habitantes) (EFSA, 2014, Romero., 
2017). Según lo reportado por EFSA,2013, los productos cárnicos fueron los que más casos 
positivos de L. monocytogenes obtuvieron, en mayor medida los elaborados con carne de 
cerdo y bovino (32%), seguido de pescado y productos del mar (29%), alimentos listos para 
el consumo (19%) carne de ave (13%), productos lácteos (12%), vegetales (10%), teniendo 
porcentajes muchos menores los quesos (1%). Dada la gran diversidad de alimentos 
implicados, y el carácter de L. monocytogenes de colonizar cualquier lugar, en las últimas 
décadas se han ido produciendo diferentes brotes, en el mundo (EFSA, 2014 Romero., 2017). 
En México, los estudios epidemiológicos sobre la incidencia y presencia de L. 
monocytogenes en los alimentos son escasos (Romero., 2017) 
Debido a la continua aparición de esta bacteria como en algunos alimentos (quesos frescos y 
madurados, perros calientes, paté, salami leche con chocolate pasteurizada, leche 
pasteurizada, leche no pasteurizada, mantequilla, hortalizas crudas, entre otros (FDA., 2004)) 
se ha visto la necesidad de encontrar nuevas alternativas para su tratamiento, una de ellas es 
 
 
37 
el uso de BAL, y cuyo efecto antimicrobiano podría ser potencializado, a través del uso de 
mezclas de BAL (García-Salazar y cols., 2016). Algunos de los metabolitos excretados por 
las BAL como las bacteriocinas, sobre todo la clase IIa los cuales son péptidos activos contra 
Listeria como la pediocina PA-1 y la sakacina P (producidas por Pediococcus acidilactici y 
Lactobacillus sake 706). Las bacteriocinas de esta clase se denominan “similares a la 
pediocina” (del inglés, pediocin-like). Las bacteriocinas de la clase IIa son producidas por 
numerosas BAL y constituyen, posiblemente, el grupo mejor estudiado y más interesante 
biotecnológicamente de las bacteriocinas de la clase II (Arbulu., 2017) 
Ya que los dos extractos neutros presentan la mayor actividad inhibitoria contra Listeria 
monocytogenes 88, se utilizará únicamente a esta cepa como microorganismo sensible para 
las siguientes pruebas. 
 
7.4 Identificación molecular de BAL antagónicas, secuenciación y comparación de bases 
de datos 
En la figura 6A se observa que el ADN extraído de las dos cepas en estudio se encuentra 
completamente integro, ya que presenta un tamaño por arriba de las 10000 pb; en la figura 
6B observa el fragmento amplificado por PCR del gen ADNr 16S el cual tiene un tamaño, 
de aproximadamente 1500 pb (Rodicio y Mendoza., 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
38 
Figura 6. Gel de agarosa del ADN y del gen ADNr 16S. Carril 1A y 1B: marcador de peso molecular (1 kb 
Thermo Fisher Scientific, E.U.A); carril 2A y 3A: ADN total íntegro de las BAL CP y H, respectivamente; 
carril 2B y 3B: Fragmento amplificado del gen ADNr 16S a partir del